Method Article

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

DOI:

10.3791/62544

⸱

August 7th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika profilowania rybosomów (RIBO-seq) jest obecnie najbardziej efektywnym narzędziem do badania procesu syntezy białek in vivo. Zaletą tej metody, w porównaniu z innymi podejściami, jest jej zdolność do monitorowania translacji poprzez precyzyjne mapowanie pozycji i liczby rybosomów na transkryptie mRNA.

W tym artykule opisujemy kolejne etapy pobierania próbek i przygotowania do metody RIBO-seq u bakterii, podkreślając szczegóły istotne dla planowania i przeprowadzenia eksperymentu.

Ponieważ sekwencja RIBO opiera się na nienaruszonych rybosomach i pokrewnych mRNA, kluczowym krokiem jest szybkie zahamowanie translacji i odpowiedni rozpad komórek. Dlatego sugerujemy filtrację i błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie w celu pobrania komórek z opcjonalną obróbką wstępną chloramfenikolem w celu zatrzymania translacji u bakterii. Do rozpadu proponujemy mielenie zamrożonych komórek moździerzem i tłuczkiem w obecności tlenku glinu, aby mechanicznie rozbić ścianę komórkową. W tym protokole nie jest wymagana poduszka sacharozowa ani ultrawirowanie w gradiencie sacharozy do oczyszczania monosomu. Zamiast tego stosuje się separację mRNA za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), a następnie wycięcie śladu rybosomalnego (pasmo 28-30 nt), które daje zadowalające wyniki. To znacznie upraszcza metodę, a także skraca czas i zmniejsza wymagania sprzętowe dotyczące zabiegu. Do przygotowania biblioteki zalecamy użycie dostępnego na rynku małego zestawu RNA do sekwencjonowania Illumina firmy New England Biolabs, zgodnie z wytycznymi producenta z pewnym stopniem optymalizacji.

Powstałe biblioteki cDNA prezentują odpowiednią ilość i jakość wymaganą do sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z opisanym protokołem daje w wyniku od 2 do 10 mln unikalnie zmapowanych odczytów na próbkę, co zapewnia wystarczającą ilość danych do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest szybki i stosunkowo łatwy i można go wykonać przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika profilowania rybosomów (RIBO-seq) została opracowana w laboratorium Jonathana Weissmana na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco1. W porównaniu z innymi metodami stosowanymi do badania ekspresji genów na poziomie translacyjnym, RIBO-seq koncentruje się na każdym wiązaniu rybosomu z mRNA i dostarcza informacji o jego lokalizacji i względnej liczbie rybosomów w transkryptie. Umożliwia monitorowanie procesu syntezy białek in vivo i może zapewnić rozdzielczość i dokładność pojedynczego kodonu, umożliwiając pomiar gęstości rybosomów zarówno na pojedynczym mRNA, jak i wzdłuż całego transkryptomu w komórce. U podstaw techniki RIBO-seq leży fakt, że podczas translacji rybosom wiąże cząsteczkę mRNA, a tym samym chroni zakopany fragment transkryptu przed trawieniem rybonukleazą. Po dodaniu rybonukleazy niezabezpieczone mRNA jest trawione, a fragmenty otoczone rybosomami - zwykle o długości ~28-30 nt - pozostają nienaruszone. Fragmenty te, zwane śladami rybosomalnymi (RF), można następnie wyizolować, zsekwencjonować i zmapować na transkrypt, z którego pochodzą, co skutkuje wykryciem dokładnej pozycji rybosomów. W rzeczywistości zdolność rybosomów do ochrony fragmentów mRNA jest wykorzystywana od lat 60. XX wieku do badania miejsc wiązania rybosomalnego i inicjacji translacji (TIS)2,3,4. Jednak wraz z postępem w technologii głębokiego sekwencjonowania, RIBO-seq stał się złotym standardem w monitorowaniu translacji5, który poprzez zaangażowanie rybosomów może dostarczyć informacji o syntezie białek w całym genomie6. Profilowanie rybosomów wypełniło lukę technologiczną, która istniała między kwantyfikacją transkryptomu a proteomem6.

Aby przeprowadzić profilowanie rybosomów, musimy uzyskać lizat komórkowy organizmu, który rozwijał się w badanych warunkach. Zakłócenie tych warunków podczas pobierania i lizy komórek może dostarczyć niewiarygodnych danych. Aby temu zapobiec, powszechnie stosuje się inhibitory translacji, szybkie zbiory i błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie. Komórki mogą być lizowane przez mielenie kriogeniczne w homogenizatorze mechanicznym, takim jak młyn miksujący7,8 lub ubijacz do koralików9, oraz przez rozcieranie przez pipetę10 lub za pomocą igły11. Bufor do lizy może być dodany tuż przed lub krótko po sproszkowaniu komórek. W naszym protokole używamy ciekłego azotu do wstępnego schładzania moździerza i tłuczka, a także tlenku glinu jako łagodniejszego podejścia do rozerwania ściany komórkowej bakterii, co zapobiega ścinaniu RNA, które często występuje przy stosowaniu metod takich jak sonifikacja. Po sproszkowaniu do schłodzonej zawartości zaprawy dodajemy lodowaty bufor do lizy. Dobór odpowiedniego buforu do lizy jest ważny dla uzyskania najlepszej rozdzielczości śladów rybosomalnych. Ponieważ siła jonowa wpływa zarówno na rozmiar RF, jak i precyzję ramki odczytu, obecnie zaleca się stosowanie do lizy o niskiej sile jonowej i pojemności buforowej, nawet jeśli wydaje się, że skład buforu nie wpływa na zajętość rybosomów na mRNAs11,12. Ważnymi składnikami buforu do lizy są jony magnezu, których obecność zapobiega dysocjacji podjednostek rybosomalnych i hamuje spontaniczne zmiany konformacyjne w rybosomach bakteryjnych11,13. Jony wapnia odgrywają również znaczącą rolę i są niezbędne dla aktywności nukleazy mikrokokowej (MNazy) stosowanej w metodzie profilowania rybosomów bakteryjnych14. Dodanie 5′-[β,γ-imido]trifosforanu guanozyny (GMP-PNP), niehydrolizującego analogu GTP, wraz z chloramfenikolem hamuje translację podczas lizy15.

Gdy lizat jest otrzymywany, jest klarowany przez wirowanie i dzielony na dwie porcje, każda dla sekwencjonowania RIBO i wysokoprzepustowego sekwencjonowania mRNA (sekwencjonowanie RNA), ponieważ są one wykonywane jednocześnie (Rysunek 1). RNA-seq stanowi punkt odniesienia, który umożliwia porównanie danych zarówno z sekwencji RIBO, jak i sekwencji RNA podczas analizy danych. Badany translatom definiowany jest przez normalizację śladów rybosomalnych do obfitości mRNA16. Dane z sekwencjonowania RNA mogą również pomóc w identyfikacji artefaktów klonowania lub sekwencjonowania17.

Schemat profilowania rybosomów: trawienie kwasów nukleinowych, oczyszczanie RNA, etapy izolacji mRNA.
Rysunek 1. Schematy przygotowania próbki mRNA do sekwencji RIBO i sekwencji RNA. W celu przygotowania biblioteki RIBO-seq RNA jest trawione za pomocą MNazy (A), a następnie wybierany jest rozmiar RF o długości ~ 28-30 nt (B); dla sekwencji RNA RNA jest izolowany (C), pozbawiony rRNA (D), a powstałe mRNA jest losowo fragmentowane na fragmenty o różnej długości (E). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Początkowe etapy procedury przygotowania próbki do sekwencji RIBO i RNA różnią się nieznacznie (Rysunek 1). W celu profilowania rybosomalnego lizat musi zostać strawiony przez specyficzną endonukleazę w celu degradacji cząsteczek mRNA, które nie są chronione przez rybosomy. W standardowych protokołach otrzymane monosomy są odzyskiwane przez ultrawirowanie z poduszką sacharozową lub ultrawirowanie z gradientem sacharozy8,14. W tym artykule pokazujemy, że ten krok nie jest konieczny do wyizolowania RF wymaganego dla RIBO-seq u bakterii, podobnie jak dla komórek eukariotycznych18, oraz że wybór wielkości odpowiedniej długości fragmentów mRNA z żelu poliakrylamidowego jest wystarczający.

Dla sekwencji RNA, mRNA otrzymuje się przez zubożenie rRNA z całkowitego RNA - cząsteczki rRNA hybrydyzują z biotynylowanymi sondami oligonukleotydowymi, które wiążą się z kulkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną. Kompleksy rRNA-oligonukleotyd-kulka są następnie usuwane z próbki za pomocą magnesu, w wyniku czego powstaje próbka zubożona w rRNA19,20. Oczyszczone cząsteczki mRNA są następnie losowo fragmentowane przez hydrolizę zasadową. Uzyskane fragmenty mRNA, a także ślady rybosomalne są przekształcane w biblioteki cDNA i przygotowywane do głębokiego sekwencjonowania (Rysunek 2). Obejmuje to naprawę końcówek potrzebną po hydrolizie alkalicznej (dla mRNA) i trawieniu enzymatycznym (dla RF): defosforylacja końców 3', a następnie fosforylacja końców 5'. Kolejnymi krokami są ligacja adaptorów i odwrotna transkrypcja w celu wytworzenia insertów cDNA obramowanych sekwencjami wymaganymi do sekwencjonowania nowej generacji (NGS) przy użyciu platformy Illumina. Ostatnią fazą przygotowania biblioteki jest reakcja PCR, w której konstrukty są amplifikowane i znakowane kodami kreskowymi specyficznymi dla próbki, aby umożliwić multipleksowanie i sekwencjonowanie różnych próbek na jednym kanale. Przed sekwencjonowaniem jakość i ilość bibliotek jest oceniana za pomocą elektroforezy DNA na chipie o wysokiej czułości. Biblioteki cDNA o odpowiednich parametrach mogą być następnie łączone i sekwencjonowane. Sekwencjonowanie może być wykonywane na różnych platformach Illumina, takich jak MiSeq, NextSeq lub HighSeq, w zależności od liczby bibliotek, wymaganej długości odczytu i głębokości sekwencjonowania. Po sekwencjonowaniu przeprowadzana jest analiza bioinformatyczna.

Proces izolacji śladu; schemat sekwencjonowania mRNA; Fragmentacja mRNA, ligacja adaptera, PCR.
Rysunek 2. Przygotowanie biblioteki. Przygotowanie biblioteki obejmuje naprawę końcówek, podwiązanie adapterów, odwrotną transkrypcję i amplifikację z kodowaniem kreskowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Profilowanie rybosomów jest uniwersalną metodą, którą można łatwo modyfikować i dostosowywać zgodnie z naukowym zagadnieniem. Pierwotnie był używany w drożdżach1, ale wkrótce potem został zastosowany do komórek bakteryjnych21, a także w eukariotycznych organizmach modelowych, w tym mouse10, danio pręgowany22, fruit fly23 i Arabidopsis thaliana24. Był również używany do badania różnych typów rybosomów: cytoplazmatycznego, mitochondrialnego25,26 i chloroplast27,28. U eukariontów RIBO-seq jest powszechnie dostosowywany i udoskonalany do badania konkretnych aspektów translacji, w tym inicjacji10,11,29,30,31,32, elongation1,10,11,31,33, hamowanie rybosomów33 i zmiana konformacji33. Większość modyfikacji wiąże się z użyciem różnych inhibitorów translacji. Jednak w przypadku bakterii analogiczne badania były trudne do przeprowadzenia ze względu na niedostatek inhibitorów o wymaganym mechanizmie działania34. Najczęściej stosowanym inhibitorem translacji u bakterii jest chloramfenikol (CAM), który wiąże się z centrum transferazy peptydylotransferazy (PTC) i uniemożliwia prawidłowe pozycjonowanie aminoacylo-tRNA w miejscu A. W rezultacie, CAM zapobiega tworzeniu się wiązania peptydowego, które prowadzi do zatrzymania wydłużających się rybosomów35. Innymi przykładami inhibitorów translacji u bakterii są tetracyklina (TET)36, retapamulina (RET)34 i Onc11237, które zostały użyte do zbadania miejsc inicjacji translacji. TET, który zapobiega dostarczaniu tRNA do rybosomu poprzez bezpośrednie nakładanie się na pętlę macierzystą antykodonu tRNA w miejscu A, został pierwotnie zastosowany do weryfikacji wyników uzyskanych z leczenia CAM, ponieważ oba są antybiotykami hamującymi wydłużenie translacji38. Okazało się, że TET wykrywa główny TIS, jednak nie był w stanie ujawnić wewnętrznego TIS36. RET wiąże się w PTC rybosomu bakteryjnego i zapobiega tworzeniu się pierwszego wiązania peptydowego poprzez interferencję z elongatorem aminoacylo-tRNA w miejscu A. Zastosowanie RET powoduje zatrzymanie rybosomów zarówno w pierwotnym, jak i wewnętrznym TISs34. Onc112, peptyd przeciwdrobnoustrojowy bogaty w prolinę, wiąże się w tunelu wyjściowym i blokuje wiązanie aminoacylo-tRNA w miejscu rybosomalnym A. W rezultacie, Onc112 zapobiega wejściu kompleksów inicjujących w fazę elongacji37.

Główną informacją dostarczaną przez profilowanie rybosomów jest gęstość rybosomów i ich położenie na mRNA. Został on z powodzeniem zastosowany do zbadania zróżnicowanej ekspresji genów na poziomie translacji w różnych warunkach wzrostu1,6, pomiar efektywności translacji1,38,39 i wykrywanie zdarzeń regulacji translacji, takich jak pauza rybosomalna10. RIBO-seq pozwala również na odkrycie translacji adnotowanych ncRNA, pseudogenów i nieopisanych małych otwartych ramek odczytu (ORF), co prowadzi do identyfikacji nowych i/lub bardzo krótkich genów kodujących białka10,12,22,30,37. W takich przypadkach RIBO-seq może dostroić i poprawić adnotację genomu. Dzięki wysokiej czułości identyfikacji translacji ORF i ilościowemu charakterowi, profilowanie rybosomów może również służyć jako wskaźnik zastępczy do określania proteomu lub do wspomagania badań proteomicznych31,34,39. Mapując TIS, profilowanie rybosomów ujawnia N-końcowe wydłużone i skrócone izoformy znanych białek10,32. RIBO-seq został również przystosowany do badania współtranslacyjnego fałdowania białek14,21,24. Metoda ta umożliwia pomiar współczynników wydłużenia1,10,39 lub prędkości dekodowania poszczególnych kodonów6 oraz pomaga w opracowywaniu ilościowych modeli translacji17. Metoda profilowania rybosomów jest również w stanie dostarczyć mechanistycznego wglądu w pauzę rybosomu u bakterii7,15,17, frameshifting40, odczyt kodonu stop21, defekty zakończenia/recyklingu41,42 i zmiany konformacji rybosomalnej33 u eukariontów. Projekt RIBO-seq został również dostosowany do zbadania wpływu określonych czynników transakcyjnych na translację, takich jak miRNAs6 i białka wiążące RNA u eukariontów16,43. Należy jednak pamiętać, że projekt eksperymentalny i uzyskana rozdzielczość RIBO-seq determinują ilość informacji, które można wyodrębnić z wynikowych danych sekwencjonowania12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie próbek

  1. Przygotuj kulturę bakteryjną. Zalecamy objętość hodowli 100 ml na próbkę.
  2. Przygotuj sprzęt i odczynniki do pobierania próbek: dwie miarki na próbkę, sterylne filtry membranowe 0,45 μm z mieszanymi estrami celulozy (MCE), sterylne probówki 50 ml, ciekły azot, 50 mg/ml chloramfenikolu w etanolu 70% (obj. / obj.) (opcjonalnie). Przebić wieczko probówek o pojemności 50 ml, aby umożliwić odparowanie ciekłego azotu i zapobiec eksplozji zamkniętych probówek. Odkaż czerpaki laboratoryjnym detergentem i 70% etanolem.
  3. Rozgrzej sprzęt filtrujący i jedną z czerpaków do temperatury wzrostu kultury bakteryjnej.
    UWAGA: Zalecamy całoszklany aparat filtracyjny z lejkiem, spiekaną podstawą, kolbą do fugowania szlifowanego i zaciskiem sprężynowym Ø 47 mm.
  4. Przed pobraniem próbki dodać chloramfenikol do kultury bakteryjnej do końcowego stężenia 100 μg/ml i inkubować przez 1 minutę (opcjonalnie).
  5. Wlej ciekły azot do sterylnej probówki o pojemności 50 ml i umieść drugą czerpak w probówce, aby ostygła.
    OSTROŻNOŚĆ! Ciekły azot może spowodować eksplozję zamkniętych pojemników z powodu zmiany ciśnienia po odparowaniu. Aby temu zapobiec, konieczne jest wykonanie kilku otworów w pokrywie probówek o pojemności 50 ml, aby umożliwić odparowanie ciekłego azotu.
  6. Zbieraj komórki przez filtrację. Przerwij filtrowanie, gdy medium przejdzie przez membranę, ale nie pozwól, aby filtr całkowicie wyschł.
  7. Zbieraj granulki bakteryjne, szybko zeskrobując komórki z dysku filtra za pomocą podgrzanej czerpaki. Natychmiast umieść całą miarkę z zebranymi komórkami w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej ciekłym azotem. Zebrany pellet powinien być całkowicie pokryty ciekłym azotem.
  8. Pozwól osadowi dokładnie zamarznąć i usuń zamrożone komórki za pomocą uprzednio schłodzonej drugiej czerpaki. Zamknij przebitą pokrywę i przenieś rurkę do -80°C. PUNKT ZATRZYMANIA
    UWAGA: Szufelki należy dezynfekować po każdym pobraniu próbki.

2. Liza komórek

  1. Przygotować 0,1 M GMP-PNP w 10 mM probówkach reakcyjnych Tris pH 8, DNazy I i 1,5 ml na lizaty i przechowywać je na lodzie. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
  2. Przygotuj bufor do lizy (20 mM TRIS pH 7,6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-merkaptoetanolu, 5 mM CaCl2 i opcjonalnie 1 mM chloramfenikol). Porcję 500 μl buforu do lizy na próbkę rozlać do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie.
  3. Odkaź moździerz i tłuczek laboratoryjnym detergentem i 70% etanolem, a następnie wysusz. Ostudzić moździerz i tłuczek, wlewając do moździerza ciekły azot.
  4. Zamrożony granulat przenieść do wstępnie schłodzonego moździerza i zmielić na proszek. Za pomocą szpatułki dodaj około 1 objętość tlenku glinu i kontynuuj mielenie. Utrzymuj moździerz, tłuczek i komórki w chłodzie, wlewając w razie potrzeby ciekły azot, nie pozwól, aby zawartość moździerza się rozmroziła.
  5. Tuż przed użyciem buforu do lizy dodać GMP-PNP i DNazę I do podwielokrotności buforu do lizy do końcowego stężenia odpowiednio 2 mM i 100 U/ml. Przenieś roztwór do zaprawy z komórkami i tlenkiem glinu i kontynuuj mielenie. Pozwól lizatowi powoli się rozmrozić podczas mielenia i przenieś mieszaninę do wstępnie schłodzonej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i natychmiast umieść na lodzie.
  6. Odwirować lizaty przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty do nowych, wstępnie schłodzonych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml i przechowywać je na lodzie.
  7. Zmierz stężenie RNA w każdej próbce za pomocą NanoDrop. Roztwory próbek należy stosować w stosunku 1:10 i rozcieńczenia buforu do lizy w wodzie wolnej od nukleaz w stosunku 1:10 jako próbę ślepą.
    UWAGA: Należy pamiętać, że chloramfenikol wykazuje znaczną absorpcję przy 260 nm.
  8. Podziel każdy lizat na dwie porcje: jedną dla RIBO-seq (0,5 - 1 mg RNA) i drugą dla RNA-seq (reszta).
  9. Oczyść próbki pod kątem sekwencji RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do czyszczenia RNA zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Zalecamy stosowanie zestawu Zymo RNA Clean & Concentrate -25 (patrz Tabela Materiałów). Zalecamy również dodanie 4,5 objętości etanolu (w porównaniu z objętością próbki) do mieszanki próbki i buforu wiążącego dla śladów rybosomalnych i rozdrobnionego mRNA, w celu zwiększenia skuteczności oczyszczania krótkich fragmentów RNA.
  10. Próbki przeznaczone do sekwencjonowania RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Procedura sekwencjonowania RNA będzie kontynuowana od kroku 5.

3. Trawienie MNazy próbek do sekwencji RIBO

  1. Do 1 mg RNA dodać 3,8 μl 187,5 U/μL MNazy w 10 mM Tris pH 8 i uzupełnić buforem do lizy do całkowitej objętości 500 μL.
  2. Inkubować w temperaturze 25 °C, 300 obr./min, przez 45 minut w termomikserze.
  3. Oczyść próbki za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania RNA (jak w kroku 2.9).
  4. Przechowywać próbki do sekwencjonowania RIBO w temperaturze -80 °C (punkt STOP) lub przystąpić do wyboru wielkości.

4. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) i dobór wielkości próbek do sekwencji RIBO

  1. Przygotuj 15% żel poliakrylamid-TBE z 8 M mocznikiem i umieść go w zbiorniku z buforem TBE. Wstępny bieg przez minimum 10 minut przy stałym napięciu 200 V.
  2. Wymieszać próbki z buforem do próbek TBE-Mocznik, poddać denaturacji w temperaturze 95 °C przez 1 minutę i natychmiast umieścić je na lodzie.
  3. Wypłukać mocznik, wstrzykując bufor KZM do studzienek żelowych za pomocą strzykawki. Załaduj próbki, pozostawiając między nimi jedną przestrzeń studzienki, aby oddzielić każdą próbkę i zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Jako markery należy użyć oligonukleotydu 29 nt i mieszaniny oligonukleotydów 26 nt i 32 nt. Uruchom elektroforezę przy stałym napięciu 180 V.
  4. Przygotować sterylny bufor do inkubacji przez noc (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Po elektroforezie wybarwić żel w kąpieli SYBR Gold-bath przez około 2-3 minuty i spłukać żel wodą bez nukleaz
    6. .
  6. Za pomocą sterylnych igieł lub żyletek należy pobrać fragmenty żelu o objętości od 26 do 32 nt i umieścić fragmenty żelu w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki. Wymieniać igłę lub żyletkę między próbkami.
  7. Dodać 200 μl buforu do inkubacji przez noc do każdej probówki reakcyjnej.
  8. Próbki inkubować w temperaturze 10 °C, 1000 obr./min przez noc w termomieszalniku.
  9. Następnego dnia wyczyść próbki jak w kroku 2.9. Usuń ślady stóp w 80 μl wody wolnej od nukleaz
    10. .
  10. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C. Punkt ZATRZYMANIA. Procedura RIBO-seq będzie kontynuowana od kroku 7.

5. Oczyszczanie bakteryjnego mRNA poprzez zubożenie rRNA z próbek do sekwencjonowania RNA

  1. Usuń rRNA z próbek za pomocą bakteryjnego zestawu do oczyszczania mRNA (np. Invitrogen MICROBExpress). Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
  2. Oczyść próbki jak w kroku 2.9. Eluuj mRNA w 50 μl wody wolnej od nukleaz.
  3. Przechowywać próbki do sekwencjonowania RNA w temperaturze -80 °C (punkt STOP) lub kontynuować fragmentację alkaliczną.

6. Alkaliczna fragmentacja próbek do sekwencji RNA

  1. Przygotować alkaliczny bufor do hydrolizy (zmieszać 220 μl 0,1 MNaHCO3, 30 μL 0,1 M Na2CO3 i 1 μL 0,5 M EDTA). Zmieszać 1 objętość (50 μl) buforu alkalicznego z 1 objętością (50 μl) próbki i inkubować w temperaturze 95 °C przez 25 minut.
  2. Dodać 5 μl 3 M NaOAc pH 5,5, aby zatrzymać reakcję.
  3. Oczyścić próbki jak w kroku 2.9 i wymyć próbki w 80 μl wody wolnej od nukleaz
    4. .
  4. Możliwy punkt STOP: przechowywać próbki sekwencyjnego RNA w temperaturze -80 °C. Zalecamy jednak przejście bezpośrednio do kroku 7, aby uniknąć niepotrzebnego zamrażania i rozmrażania.

7. Defosforylacja i fosforylacja próbek zarówno dla sekwencji RNA, jak i RIBO

  1. Do każdej próbki dodać 10 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego PNK i 5 μl T4 PNK. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny w celu defosforylacji końców 3'.
  2. Dodać 3 μl 1 mM ATP i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu fosforylacji końców 5'.
  3. Oczyść próbki jak w kroku 2.9, wymyj w 30 μl wody wolnej od nukleaz.
  4. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C. Punkt ZATRZYMANIA.

8. Przygotowanie biblioteki za pomocą NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set dla Illumina

  1. Przygotuj 100-1000 ng wejściowego RNA (otrzymane fragmenty mRNA i ślady rybosomalne) w 6 μl wody wolnej od nukleaz i dodaj 1 μl adaptera 3' SR. Inkubować zgodnie z protokołem producenta.
  2. Dodać 10 μl 3' buforu reakcyjnego do ligacji (2X) i 3 μl mieszanki enzymów ligacyjnych 3' i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2,5 godziny, zamiast 1 godziny w temperaturze 25 °C, jak określa protokół producenta.
  3. Hybrydyzować Reverse Transcription Primer zgodnie z protokołem producenta ze zmodyfikowanym programem: 5 minut w temperaturze 75 °C, 30 minut w temperaturze 37 °C i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  4. Podłącz adapter 5' SR. Postępować zgodnie z protokołem producenta z jedną zmianą: inkubację należy przeprowadzać w temperaturze 37 °C przez 2,5 godziny, zamiast 1 godziny w temperaturze 25 °C.
  5. Wykonaj odwrotną transkrypcję zgodnie z protokołem producenta.
  6. Możliwy punkt STOP: inkubować próbki zawierające zsyntetyzowane cDNA w temperaturze 70 °C przez 15 minut w celu inaktywacji odwrotnej transkryptazy i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Zalecamy jednak przejście bezpośrednio do kolejnych kroków, aby uniknąć niepotrzebnego zamrażania i rozmrażania próbek.
  7. Przechowuj połowę każdej biblioteki cDNA w temperaturze -80 °C jako kopię zapasową.
  8. Wykonaj amplifikację PCR zgodnie z protokołem producenta. Użyj połowy mieszaniny reakcyjnej. Uzyskane biblioteki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Punkt STOP.

9. Wybór rozmiaru bibliotek cDNA za pomocą PAGE

  1. Przygotować 6% żel poliakrylamidowo-TBE i umieścić go w zbiorniku z buforem TBE. Wstępny bieg przez minimum 10 minut przy stałym napięciu 200 V.
  2. Wymieszaj próbki z Gel Loading Dye, Blue (6X) i załaduj je na żel. Użyj Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest jako drabiny. Na początku uruchom elektroforezę przy stałym napięciu 120 V, aby umożliwić DNA wejście do żelu, a następnie zmień napięcie na 180 V.
  3. Po zakończeniu elektroforezy należy zabarwić żel w kąpieli SYBR Gold-bath przez około 2-3 minuty i spłukać żel wodą bez nukleazy.
  4. Fragmenty żelu akcyzowego zawierające biblioteki. Dla próbek sekwencyjnych RNA należy wycisnąć akcyzę między 135-180 nt, a dla sekwencji RIBO między 135-170 nt. Użyj sterylnej igły lub żyletki i umieść wycięte fragmenty żelu w oddzielnych probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml. Pamiętaj, aby wymieniać igłę lub żyletkę między próbkami.
    UWAGA: Adaptery i kod kreskowy z zestawu NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set dla Illumina mają łącznie 119 nt, co określa dolną granicę wycinania.
  5. Do każdego wyciętego fragmentu żelu dodać 100 μl wody wolnej od nukleaz.
  6. Inkubować fragmenty żelu w temperaturze 10 °C, 450 obr./min przez noc w termomikserze.
  7. Oczyść i skoncentruj biblioteki cDNA za pomocą komercyjnego zestawu do czyszczenia DNA zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Zalecamy stosowanie zestawu Zymo DNA Clean & Concentrate -5 (patrz Tabela Materiałów).
  8. Przechowywać oczyszczone biblioteki cDNA w temperaturze -80 °C. Punkt STOP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przykładowe wyniki przedstawione tutaj zostały uzyskane w badaniu badającym regulację translacji w zarodnikujących komórkach WT Bacillus subtilis. Kultury przez noc rozcieńczano do OD600 równego 0,1 na 100 ml bogatej pożywki i inkubowano w temperaturze 37 °C z energicznym wstrząsaniem, aż OD600 osiągnął 0,5-0,6. Bogate podłoże zostało następnie zastąpione minimalnym podłożem w celu wywołania procesu zarodnikowania, a inkubację kontynuowano przez okres do czterech godzin. Komórki były zbiera...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym wyzwaniem technicznym związanym z profilowaniem rybosomów jest potrzeba szybkiego zahamowania translacji w celu uchwycenia migawki rybosomów na mRNA w określonym stanie fizjologicznym. Aby to osiągnąć, powszechnie stosuje się inhibitory translacji, szybkie zbiory i błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie. Stosowanie antybiotyków jest opcjonalne, ponieważ mogą one powodować artefakty. Chloramfenikol jest powszechnie stosowanym lekiem do zatrzymywania wydłużających się rybosomów w bakteryjnym RIBO-seq. Nie zapob...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALS pragnie podziękować za wsparcie finansowe EMBO Installation Grants IG 3914 oraz POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 realizowane w ramach programu First TEAM Fundacji na rzecz Nauki Polskiej współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10X TBE (proszek)InvitrogenAM9864
2-merkaptoetanol, 99%, czystyAcros Organics125472500
5'-trifosforan adenozyny (ATP)New England BiolabsP0756S
Tlenek glinu kalcynowany czysty rocznieChempur114560600
Chlorek wapnia dwuwodnySigma-AldrichC3881-500G
ChloramfenikolMP Biomedicals190321
DNA Clean & Koncentrator -5Zymo ResearchD4004
Dnaza I rekombinowana, wolna od rnazy
EDTAFisher ScientificE/P140/48
Alkohol etylowy Absolut 99,8%  Pure-P.A.-BasicPOCH Avantor Performance Materials Poland S.A.BA6480111
Aparat filtracyjnyVWR Collection511-0265całoszklany aparat filtracyjny, z lejkiem, spiekaną podstawą, nasadką, 47 mm i Oslash; zacisk sprężynowy i kolba do szlifowania
Żel 40 (19:1)Rotiphorese3030.1
Gel Loading Dye, niebieski, 6XNew England BiolabsE6138G
Guanozyna 5′-[β,γ-imido]trifosforan sól trisodowahydrat Sigma-AldrichG0635-25MG
labZAPA& A Biotechnology040-500
Tetrahydrat octanu magnezuSigma-AldrichM5661-250G
MCE Membrane fiterTechnologia Alfatec M47MCE45GWSwielkość porów: 0,45um
MICROBExpress Bakteryjne oczyszczanie mRNAInvitrogenAM1905
Multiplex Zestaw do przygotowania małej biblioteki RNA dla IlluminaNew England BiolabsE7300S
Woda bez nukleazAmbionAM9937
Octan potasu Bezwodny czysty PAPOCH Avantor Performance Materials Poland S.A744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI DigestNew England BiolabsE7323A
RNA Clean & Koncentrator -25Zymo ResearchR1018
Octan soduSigma-AldrichS2889-250G
Węglan soduSigma-Aldrich223530-500G
Wodorowęglan sodu czysty p.a.POCH Avantor Performance Materials Poland S.A810530115
SYBR Gold Barwnik żelowy kwasu nukleinowegoLife TechnologiesS11494
T4 Kinaza polinukleotydowaNew England BiolabsM0201L
T4 Bufor reakcyjny kinazy polinukleotydowejNew England BiolabsB0201S
Bufor do próbek TBE-mocznika (2x)InvitrogenLC6876
Tris(hydroksymetylo)aminometan, ultraczysty, 99,9%AlfaAesarJ65594
Triton X-100, 98%Acros Organics327371000
Mocznik G.R.lach:ner40096-AP0
sól disodowa Roche 4716728001 . . powiedział:

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346(2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134(2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114(2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179(2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886(2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118(2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106(2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257(2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819(2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115(2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6(2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806(2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678(2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591(2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ribosome ProfilingRIBO seq ProtocolBacterial TranslationLibrary PreparationNext Generation SequencingRibosomal FootprintsPolyacrylamide Gel ElectrophoresisTranslation InhibitionRNA SequencingBioinformatic Analysis

Related Articles