Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62544

⸱

7 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

Streszczenie

Technika profilowania rybosomów (RIBO-seq) jest obecnie najbardziej efektywnym narzędziem do badania procesu syntezy białek in vivo. Zaletą tej metody, w porównaniu z innymi podejściami, jest jej zdolność do monitorowania translacji poprzez precyzyjne mapowanie pozycji i liczby rybosomów na transkryptie mRNA.

W tym artykule opisujemy kolejne etapy pobierania próbek i przygotowania do metody RIBO-seq u bakterii, podkreślając szczegóły istotne dla planowania i przeprowadzenia eksperymentu.

Ponieważ sekwencja RIBO opiera się na nienaruszonych rybosomach i pokrewnych mRNA, kluczowym krokiem jest szybkie zahamowanie translacji i odpowiedni rozpad komórek. Dlatego sugerujemy filtrację i błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie w celu pobrania komórek z opcjonalną obróbką wstępną chloramfenikolem w celu zatrzymania translacji u bakterii. Do rozpadu proponujemy mielenie zamrożonych komórek moździerzem i tłuczkiem w obecności tlenku glinu, aby mechanicznie rozbić ścianę komórkową. W tym protokole nie jest wymagana poduszka sacharozowa ani ultrawirowanie w gradiencie sacharozy do oczyszczania monosomu. Zamiast tego stosuje się separację mRNA za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), a następnie wycięcie śladu rybosomalnego (pasmo 28-30 nt), które daje zadowalające wyniki. To znacznie upraszcza metodę, a także skraca czas i zmniejsza wymagania sprzętowe dotyczące zabiegu. Do przygotowania biblioteki zalecamy użycie dostępnego na rynku małego zestawu RNA do sekwencjonowania Illumina firmy New England Biolabs, zgodnie z wytycznymi producenta z pewnym stopniem optymalizacji.

Powstałe biblioteki cDNA prezentują odpowiednią ilość i jakość wymaganą do sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z opisanym protokołem daje w wyniku od 2 do 10 mln unikalnie zmapowanych odczytów na próbkę, co zapewnia wystarczającą ilość danych do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest szybki i stosunkowo łatwy i można go wykonać przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Wprowadzenie

Technika profilowania rybosomów (RIBO-seq) została opracowana w laboratorium Jonathana Weissmana na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco1. W porównaniu do innych metod stosowanych do badania ekspresji genów na poziomie translacyjnym, RIBO-seq skupia się na każdym rybosomie związanym z mRNA i dostarcza informacji o jego lokalizacji oraz względnej liczbie rybosomów na transkrypcie. Umożliwia ona monitorowanie procesu syntezy białek in vivo i może zapewnić rozdzielczość oraz dokładność na poziomie pojedynczego kodonu, co pozwala na pomiar gęstości rybosomów zarówno na poszczególnych cząsteczkach mRNA, jak i w obrębie całego transkryptomu w komórce. Podstawą techniki RIBO-seq jest fakt, że podczas translacji rybosom wiąże cząsteczkę mRNA, chroniąc tym samym zakryty fragment transkryptu przed trawieniem przez rybonukleazę. Po dodaniu rybonukleazy niechronione mRNA ulega trawieniu, a fragmenty otoczone przez rybosomy – zazwyczaj o długości ~28-30 nt – pozostają nienaruszone. Fragmenty te, nazywane odciskami rybosomalnymi (RF), mogą być następnie izolowane, sekwencjonowane i mapowane na transkrypty, z których pochodzą, co pozwala na wykrycie dokładnej pozycji rybosomów. W rzeczywistości zdolność rybosomów do ochrony fragmentów mRNA była wykorzystywana od lat 60. XX wieku do badania wiązania rybosomalnego i miejsc inicjacji translacji (TIS)2,3,4. Jednak dzięki postępom w technologii głębokiego sekwencjonowania, RIBO-seq stał się złotym standardem monitorowania translacji5, który dzięki angażowaniu rybosomów może dostarczyć informacji o syntezie białek w skali całego genomu6. Profilowanie rybosomów wypełniło lukę technologiczną, która istniała pomiędzy ilościowym określaniem transkryptomu a proteomu6.

Aby przeprowadzić profilowanie rybosomów, należy uzyskać lizat komórkowy organizmu, który rósł w badanych warunkach. Zaburzenie tych warunków podczas zbierania i lizy komórek może dostarczyć niewiarygodnych danych. Aby temu zapobiec, powszechnie stosuje się inhibitory translacji, szybkie zbieranie oraz błyskawiczne mrożenie w ciekłym azocie. Komórki można lizować poprzez rozcieranie kriogeniczne w homogenizatorze mechanicznym, takim jak młyn mieszalnikowy7,8 lub homogenizator kulkowy (bead beater)9, a także poprzez tryturację za pomocą pipety10 lub igły11. Bufor do lizy można dodać bezpośrednio przed lub krótko po sproszkowaniu komórek. W naszym protokole używamy ciekłego azotu do schłodzenia moździerza i tłuczka, a także tlenku glinu jako łagodniejszej metody rozbijania bakteryjnej ściany komórkowej, co zapobiega fragmentacji RNA często spotykanej przy stosowaniu metod takich jak sonikacja. Po sproszkowaniu dodajemy lodowaty bufor do lizy do schłodzonej zawartości moździerza. Wybór odpowiedniego buforu do lizy jest istotny dla uzyskania najlepszej rozdzielczości odcisków rybosomowych (ribosomal footprints). Ponieważ siła jonowa wpływa zarówno na rozmiar RF, jak i na precyzję ramki odczytu, obecnie zaleca się stosowanie buforów do lizy o niskiej sile jonowej i niskiej pojemności buforowej, nawet jeśli wydaje się, że skład buforu nie wpływa na zajętość rybosomów na mRNA11,12. Ważnymi składnikami buforu do lizy są jony magnezu, których obecność zapobiega dysocjacji podjednostek rybosomowych i hamuje spontaniczne zmiany konformacyjne w rybosomach bakteryjnych11,13. Jony wapnia również odgrywają istotną rolę i są niezbędne dla aktywności nukleazy mikrokokkowej (MNase) stosowanej w metodzie profilowania rybosomów bakteryjnych14. Dodatek guanozyno-5′-[β,γ-imido]trifosforanu (GMP-PNP), niehydrolizowalnego analogu GTP, wraz z chloramfenikolem hamuje translację podczas lizy15.

Po uzyskaniu lizatu zostaje on sklarowany poprzez wirowanie i podzielony na dwie porcje, z których każda jest przeznaczona do RIBO-seq oraz wysokoprzepustowego sekwencjonowania całkowitego mRNA (RNA-seq), ponieważ są one przeprowadzane jednocześnie (Rycina 1). RNA-seq stanowi punkt odniesienia, który umożliwia porównanie danych z obu metod – RIBO-seq i RNA-seq – podczas analizy danych. Badany translatom jest definiowany poprzez normalizację odcisków rybosomalnych (ribosomal footprints) do obfitości mRNA16. Dane z RNA-seq mogą również pomóc w identyfikacji artefaktów klonowania lub sekwencjonowania17.

Schemat profilowania rybosomów: trawienie kwasów nukleinowych, oczyszczanie mRNA, proces fragmentacji.
Rycina 1. Schematy przygotowania próbek mRNA do RIBO-seq i RNA-seq. W przypadku przygotowania biblioteki do RIBO-seq RNA poddaje się trawieniu za pomocą MNase (A), a następnie dokonuje selekcji frakcji RF o długości ~28-30 nt (B); w przypadku RNA-seq RNA jest izolowane (C), usuwa się z niego rRNA (D), a otrzymane mRNA jest losowo fragmentowane na fragmenty o różnej długości (E). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wstępne etapy procedury przygotowania próbek do RIBO-seq i RNA-seq nieco się od siebie różnią (Rysunek 1). W przypadku profilowania rybosomalnego lizat musi zostać poddany trawieniu specyficzną endonukleazą w celu degradacji cząsteczek mRNA, które nie są chronione przez rybosomy. W standardowych protokołach uzyskane monosomy odzyskuje się za pomocą ultrawirowania na poduszce sacharozowej lub ultrawirowania w gradiencie sacharozy8,14. W niniejszym artykule wykazujemy, że etap ten nie jest konieczny do wyizolowania RF wymaganych do RIBO-seq u bakterii, podobnie jak w przypadku komórek eukariotycznych18, a wystarczająca jest selekcja fragmentów mRNA o odpowiedniej długości z żelu poliakrylamidowego.

W przypadku RNA-seq mRNA uzyskuje się poprzez usunięcie rRNA z całkowitego RNA – cząsteczki rRNA hybrydyzują z biotynylowanymi sondami oligonukleotydowymi, które wiążą się z kuleczkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną. Kompleksy rRNA-oligonukleotyd-kuleczka są następnie usuwane z próbki za pomocą magnesu, co prowadzi do uzyskania próbki pozbawionej rRNA19,20. Oczyszczone cząsteczki mRNA są następnie losowo fragmentowane poprzez hydrolizę alkaliczną. Uzyskane fragmenty mRNA, jak i odciski rybosomalne (ribosomal footprints), są konwertowane na biblioteki cDNA i przygotowywane do głębokiego sekwencjonowania (Rycina 2). Proces ten obejmuje naprawę końców niezbędną po hydrolizie alkalicznej (dla mRNA) i trawieniu enzymatycznym (dla RF): defosforylację końców 3' i następującą po niej fosforylację końców 5'. Kolejnymi krokami są ligacja adapterów oraz odwrotna transkrypcja w celu stworzenia insertów cDNA ograniczonych sekwencjami wymaganymi do sekwencjonowania następnej generacji (NGS) z wykorzystaniem platformy Illumina. Ostatnią fazą przygotowania biblioteki jest reakcja PCR, w której konstrukty są amplifikowane i znakowane specyficznymi dla próbki kodami kreskowymi (barcodes), co umożliwia multipleksowanie i sekwencjonowanie różnych próbek na jednym kanale. Przed sekwencjonowaniem jakość i ilość bibliotek ocenia się za pomocą wysokoczułej elektroforezy DNA na chipie. Biblioteki cDNA o odpowiednich parametrach mogą być następnie łączone i sekwencjonowane. Sekwencjonowanie można przeprowadzić na różnych platformach Illumina, takich jak MiSeq, NextSeq lub HighSeq, w zależności od liczby bibliotek, wymaganej długości odczytu i głębokości sekwencjonowania. Po sekwencjonowaniu przeprowadza się analizę bioinformatyczną.

Proces sekwencjonowania RNA, schemat izolacji mRNA, fosforylacja, ligacja, transkrypcja, PCR.
Rycina 2Przygotowanie biblioteki. Przygotowanie biblioteki obejmuje naprawę końców, ligację adapterów, odwrotną transkrypcję oraz amplifikację z kodowaniem kreskowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Profilowanie rybosomów to uniwersalna metoda, którą można łatwo modyfikować i dostosowywać do stawianych pytań naukowych. Pierwotnie była ona stosowana u drożdży1, lecz wkrótce potem zastosowano ją w komórkach bakteryjnych21, a także w organizmach modelowych eukariotycznych, w tym u myszy10, danio pręgowanego22, muszki owocowej23 oraz Arabidopsis thaliana24. Wykorzystano ją również do badania różnych typów rybosomów: cytoplazmatycznych, mitochondrialnych25,26 i chloroplastowych27,28. U eukariotów metoda RIBO-seq jest powszechnie adaptowana i udoskonalana w celu zbadania konkretnych aspektów translacji, w tym inicjacji10,11,29,30,31,32, elongacji1,10,11,31,33, zatrzymywania się rybosomów (stalling)33 oraz zmian konformacyjnych33. Większość modyfikacji wiąże się z zastosowaniem różnych inhibitorów translacji. W przypadku bakterii analogiczne badania były jednak trudne do przeprowadzenia ze względu na niedobór inhibitorów o wymaganym mechanizmie działania34. Najczęściej stosowanym inhibitorem translacji u bakterii jest chloramfenikol (CAM), który wiąże się z centrum peptydylotransferazy (PTC) i zapobiega prawidłowemu ustawieniu aminoacylo-tRNA w miejscu A. W konsekwencji CAM zapobiega tworzeniu wiązania peptydowego, co prowadzi do zatrzymania elongujących rybosomów35. Innymi przykładami inhibitorów translacji u bakterii są tetracyklina (TET)36, retapamulina (RET)34 oraz Onc11237, które były wykorzystywane do badania miejsc inicjacji translacji. TET, która zapobiega dostarczaniu tRNA do rybosomu poprzez bezpośrednie nakładanie się na pętlę łodygi antykodonu tRNA w miejscu A, była pierwotnie stosowana w celu weryfikacji wyników uzyskanych po traktowaniu CAM, ponieważ oba te antybiotyki hamują elongację translacji38. Stwierdzono, że TET wykrywa pierwotne TIS, jednak nie była w stanie ujawnić wewnętrznych TIS36. RET wiąże się w PTC rybosomu bakteryjnego i zapobiega tworzeniu pierwszego wiązania peptydowego, interferując z aminoacylo-tRNA elongacyjną w miejscu A. Zastosowanie RET skutkuje zatrzymaniem rybosomów zarówno w pierwotnych, jak i wewnętrznych TIS34. Onc112, peptyd przeciwdrobnoustrojowy bogaty w prolinę, wiąże się w kanale wyjściowym i blokuje wiązanie aminoacylo-tRNA w rybosomalnym miejscu A. W rezultacie Onc112 zapobiega przejściu kompleksów inicjacyjnych w fazę elongacji37.

Główne informacje dostarczane przez profilowanie rybosomów to gęstość rybosomów oraz ich pozycja na mRNA. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do badania różnicowej ekspresji genów na poziomie translacji w różnych warunkach wzrostu1,6, pomiaru wydajności translacji1,38,39 oraz wykrywania zdarzeń regulacji translacji, takich jak pauza rybosomalna10. RIBO-seq pozwala również na odkrywanie translacji adnotowanych ncRNA, pseudogenów oraz nieadnotowanych krótkich ramek odczytu (ORF), co prowadzi do identyfikacji nowych i/lub bardzo krótkich genów kodujących białka10,12,22,30,37. W takich przypadkach RIBO-seq może służyć do doprecyzowania i ulepszenia adnotacji genomu. Dzięki wysokiej czułości w identyfikacji tłumaczonych ORF oraz naturze ilościowej, profilowanie rybosomów może również służyć jako substytut wyznaczania proteomu lub wsparcie dla badań proteomicznych31,34,39. Poprzez mapowanie TIS, profilowanie rybosomów ujawnia izoformy znanych białek z wydłużonym lub uciętym N-końcem10,32. RIBO-seq został również zaadaptowany do badania kotranslacyjnego fałdowania białek14,21,24. Metoda ta umożliwia pomiar tempa elongacji1,10,39 lub prędkości dekodowania poszczególnych kodonów6 i pomaga w opracowywaniu ilościowych modeli translacji17. Metoda profilowania rybosomów pozwala również na uzyskanie wglądu w mechanizmy pauzy rybosomalnej u bakterii7,15,17, przesunięć ramki odczytu40, odczytu przez kodon stop21, defektów terminacji/recyklingu41,42 oraz zmian konformacji rybosomów33 u eukariotów. RIBO-seq został także dostosowany do badania wpływu specyficznych czynników trans-działających na translację, takich jak miRNA6 oraz białka wiążące RNA u eukariotów16,43. Należy jednak pamiętać, że projekt eksperymentalny oraz uzyskana rozdzielczość RIBO-seq determinują ilość informacji, jaką można wyodrębnić z wynikowych danych sekwencjonowania12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie próbek

  1. Przygotuj kulturę bakteryjną. Zalecamy objętość hodowli 100 ml na próbkę.
  2. Przygotuj sprzęt i odczynniki do pobierania próbek: dwie miarki na próbkę, sterylne filtry membranowe 0,45 μm z mieszanymi estrami celulozy (MCE), sterylne probówki 50 ml, ciekły azot, 50 mg/ml chloramfenikolu w etanolu 70% (obj. / obj.) (opcjonalnie). Przebić wieczko probówek o pojemności 50 ml, aby umożliwić odparowanie ciekłego azotu i zapobiec eksplozji zamkniętych probówek. Odkaż czerpaki laboratoryjnym detergentem i 70% etanolem.
  3. Rozgrzej sprzęt filtrujący i jedną z czerpaków do temperatury wzrostu kultury bakteryjnej.
    UWAGA: Zalecamy całoszklany aparat filtracyjny z lejkiem, spiekaną podstawą, kolbą do fugowania szlifowanego i zaciskiem sprężynowym Ø 47 mm.
  4. Przed pobraniem próbki dodać chloramfenikol do kultury bakteryjnej do końcowego stężenia 100 μg/ml i inkubować przez 1 minutę (opcjonalnie).
  5. Wlej ciekły azot do sterylnej probówki o pojemności 50 ml i umieść drugą czerpak w probówce, aby ostygła.
    OSTROŻNOŚĆ! Ciekły azot może spowodować eksplozję zamkniętych pojemników z powodu zmiany ciśnienia po odparowaniu. Aby temu zapobiec, konieczne jest wykonanie kilku otworów w pokrywie probówek o pojemności 50 ml, aby umożliwić odparowanie ciekłego azotu.
  6. Zbieraj komórki przez filtrację. Przerwij filtrowanie, gdy medium przejdzie przez membranę, ale nie pozwól, aby filtr całkowicie wyschł.
  7. Zbieraj granulki bakteryjne, szybko zeskrobując komórki z dysku filtra za pomocą podgrzanej czerpaki. Natychmiast umieść całą miarkę z zebranymi komórkami w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej ciekłym azotem. Zebrany pellet powinien być całkowicie pokryty ciekłym azotem.
  8. Pozwól osadowi dokładnie zamarznąć i usuń zamrożone komórki za pomocą uprzednio schłodzonej drugiej czerpaki. Zamknij przebitą pokrywę i przenieś rurkę do -80°C. PUNKT ZATRZYMANIA
    UWAGA: Szufelki należy dezynfekować po każdym pobraniu próbki.

2. Liza komórek

  1. Przygotować 0,1 M GMP-PNP w 10 mM probówkach reakcyjnych Tris pH 8, DNazy I i 1,5 ml na lizaty i przechowywać je na lodzie. Schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
  2. Przygotuj bufor do lizy (20 mM TRIS pH 7,6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-merkaptoetanolu, 5 mM CaCl2 i opcjonalnie 1 mM chloramfenikol). Porcję 500 μl buforu do lizy na próbkę rozlać do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie.
  3. Odkaź moździerz i tłuczek laboratoryjnym detergentem i 70% etanolem, a następnie wysusz. Ostudzić moździerz i tłuczek, wlewając do moździerza ciekły azot.
  4. Zamrożony granulat przenieść do wstępnie schłodzonego moździerza i zmielić na proszek. Za pomocą szpatułki dodaj około 1 objętość tlenku glinu i kontynuuj mielenie. Utrzymuj moździerz, tłuczek i komórki w chłodzie, wlewając w razie potrzeby ciekły azot, nie pozwól, aby zawartość moździerza się rozmroziła.
  5. Tuż przed użyciem buforu do lizy dodać GMP-PNP i DNazę I do podwielokrotności buforu do lizy do końcowego stężenia odpowiednio 2 mM i 100 U/ml. Przenieś roztwór do zaprawy z komórkami i tlenkiem glinu i kontynuuj mielenie. Pozwól lizatowi powoli się rozmrozić podczas mielenia i przenieś mieszaninę do wstępnie schłodzonej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i natychmiast umieść na lodzie.
  6. Odwirować lizaty przy 20 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatanty do nowych, wstępnie schłodzonych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml i przechowywać je na lodzie.
  7. Zmierz stężenie RNA w każdej próbce za pomocą NanoDrop. Roztwory próbek należy stosować w stosunku 1:10 i rozcieńczenia buforu do lizy w wodzie wolnej od nukleaz w stosunku 1:10 jako próbę ślepą.
    UWAGA: Należy pamiętać, że chloramfenikol wykazuje znaczną absorpcję przy 260 nm.
  8. Podziel każdy lizat na dwie porcje: jedną dla RIBO-seq (0,5 - 1 mg RNA) i drugą dla RNA-seq (reszta).
  9. Oczyść próbki pod kątem sekwencji RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do czyszczenia RNA zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Zalecamy stosowanie zestawu Zymo RNA Clean & Concentrate -25 (patrz Tabela Materiałów). Zalecamy również dodanie 4,5 objętości etanolu (w porównaniu z objętością próbki) do mieszanki próbki i buforu wiążącego dla śladów rybosomalnych i rozdrobnionego mRNA, w celu zwiększenia skuteczności oczyszczania krótkich fragmentów RNA.
  10. Próbki przeznaczone do sekwencjonowania RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Procedura sekwencjonowania RNA będzie kontynuowana od kroku 5.

3. Trawienie MNazy próbek do sekwencji RIBO

  1. Do 1 mg RNA dodać 3,8 μl 187,5 U/μL MNazy w 10 mM Tris pH 8 i uzupełnić buforem do lizy do całkowitej objętości 500 μL.
  2. Inkubować w temperaturze 25 °C, 300 obr./min, przez 45 minut w termomikserze.
  3. Oczyść próbki za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania RNA (jak w kroku 2.9).
  4. Przechowywać próbki do sekwencjonowania RIBO w temperaturze -80 °C (punkt STOP) lub przystąpić do wyboru wielkości.

4. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) i dobór wielkości próbek do sekwencji RIBO

  1. Przygotuj 15% żel poliakrylamid-TBE z 8 M mocznikiem i umieść go w zbiorniku z buforem TBE. Wstępny bieg przez minimum 10 minut przy stałym napięciu 200 V.
  2. Wymieszać próbki z buforem do próbek TBE-Mocznik, poddać denaturacji w temperaturze 95 °C przez 1 minutę i natychmiast umieścić je na lodzie.
  3. Wypłukać mocznik, wstrzykując bufor KZM do studzienek żelowych za pomocą strzykawki. Załaduj próbki, pozostawiając między nimi jedną przestrzeń studzienki, aby oddzielić każdą próbkę i zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Jako markery należy użyć oligonukleotydu 29 nt i mieszaniny oligonukleotydów 26 nt i 32 nt. Uruchom elektroforezę przy stałym napięciu 180 V.
  4. Przygotować sterylny bufor do inkubacji przez noc (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Po elektroforezie wybarwić żel w kąpieli SYBR Gold-bath przez około 2-3 minuty i spłukać żel wodą bez nukleaz
    6. .
  6. Za pomocą sterylnych igieł lub żyletek należy pobrać fragmenty żelu o objętości od 26 do 32 nt i umieścić fragmenty żelu w oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki. Wymieniać igłę lub żyletkę między próbkami.
  7. Dodać 200 μl buforu do inkubacji przez noc do każdej probówki reakcyjnej.
  8. Próbki inkubować w temperaturze 10 °C, 1000 obr./min przez noc w termomieszalniku.
  9. Następnego dnia wyczyść próbki jak w kroku 2.9. Usuń ślady stóp w 80 μl wody wolnej od nukleaz
    10. .
  10. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C. Punkt ZATRZYMANIA. Procedura RIBO-seq będzie kontynuowana od kroku 7.

5. Oczyszczanie bakteryjnego mRNA poprzez zubożenie rRNA z próbek do sekwencjonowania RNA

  1. Usuń rRNA z próbek za pomocą bakteryjnego zestawu do oczyszczania mRNA (np. Invitrogen MICROBExpress). Postępuj zgodnie z protokołem producenta.
  2. Oczyść próbki jak w kroku 2.9. Eluuj mRNA w 50 μl wody wolnej od nukleaz.
  3. Przechowywać próbki do sekwencjonowania RNA w temperaturze -80 °C (punkt STOP) lub kontynuować fragmentację alkaliczną.

6. Alkaliczna fragmentacja próbek do sekwencji RNA

  1. Przygotować alkaliczny bufor do hydrolizy (zmieszać 220 μl 0,1 MNaHCO3, 30 μL 0,1 M Na2CO3 i 1 μL 0,5 M EDTA). Zmieszać 1 objętość (50 μl) buforu alkalicznego z 1 objętością (50 μl) próbki i inkubować w temperaturze 95 °C przez 25 minut.
  2. Dodać 5 μl 3 M NaOAc pH 5,5, aby zatrzymać reakcję.
  3. Oczyścić próbki jak w kroku 2.9 i wymyć próbki w 80 μl wody wolnej od nukleaz
    4. .
  4. Możliwy punkt STOP: przechowywać próbki sekwencyjnego RNA w temperaturze -80 °C. Zalecamy jednak przejście bezpośrednio do kroku 7, aby uniknąć niepotrzebnego zamrażania i rozmrażania.

7. Defosforylacja i fosforylacja próbek zarówno dla sekwencji RNA, jak i RIBO

  1. Do każdej próbki dodać 10 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego PNK i 5 μl T4 PNK. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny w celu defosforylacji końców 3'.
  2. Dodać 3 μl 1 mM ATP i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu fosforylacji końców 5'.
  3. Oczyść próbki jak w kroku 2.9, wymyj w 30 μl wody wolnej od nukleaz.
  4. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C. Punkt ZATRZYMANIA.

8. Przygotowanie biblioteki za pomocą NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set dla Illumina

  1. Przygotuj 100-1000 ng wejściowego RNA (otrzymane fragmenty mRNA i ślady rybosomalne) w 6 μl wody wolnej od nukleaz i dodaj 1 μl adaptera 3' SR. Inkubować zgodnie z protokołem producenta.
  2. Dodać 10 μl 3' buforu reakcyjnego do ligacji (2X) i 3 μl mieszanki enzymów ligacyjnych 3' i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2,5 godziny, zamiast 1 godziny w temperaturze 25 °C, jak określa protokół producenta.
  3. Hybrydyzować Reverse Transcription Primer zgodnie z protokołem producenta ze zmodyfikowanym programem: 5 minut w temperaturze 75 °C, 30 minut w temperaturze 37 °C i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  4. Podłącz adapter 5' SR. Postępować zgodnie z protokołem producenta z jedną zmianą: inkubację należy przeprowadzać w temperaturze 37 °C przez 2,5 godziny, zamiast 1 godziny w temperaturze 25 °C.
  5. Wykonaj odwrotną transkrypcję zgodnie z protokołem producenta.
  6. Możliwy punkt STOP: inkubować próbki zawierające zsyntetyzowane cDNA w temperaturze 70 °C przez 15 minut w celu inaktywacji odwrotnej transkryptazy i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Zalecamy jednak przejście bezpośrednio do kolejnych kroków, aby uniknąć niepotrzebnego zamrażania i rozmrażania próbek.
  7. Przechowuj połowę każdej biblioteki cDNA w temperaturze -80 °C jako kopię zapasową.
  8. Wykonaj amplifikację PCR zgodnie z protokołem producenta. Użyj połowy mieszaniny reakcyjnej. Uzyskane biblioteki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Punkt STOP.

9. Wybór rozmiaru bibliotek cDNA za pomocą PAGE

  1. Przygotować 6% żel poliakrylamidowo-TBE i umieścić go w zbiorniku z buforem TBE. Wstępny bieg przez minimum 10 minut przy stałym napięciu 200 V.
  2. Wymieszaj próbki z Gel Loading Dye, Blue (6X) i załaduj je na żel. Użyj Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest jako drabiny. Na początku uruchom elektroforezę przy stałym napięciu 120 V, aby umożliwić DNA wejście do żelu, a następnie zmień napięcie na 180 V.
  3. Po zakończeniu elektroforezy należy zabarwić żel w kąpieli SYBR Gold-bath przez około 2-3 minuty i spłukać żel wodą bez nukleazy.
  4. Fragmenty żelu akcyzowego zawierające biblioteki. Dla próbek sekwencyjnych RNA należy wycisnąć akcyzę między 135-180 nt, a dla sekwencji RIBO między 135-170 nt. Użyj sterylnej igły lub żyletki i umieść wycięte fragmenty żelu w oddzielnych probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml. Pamiętaj, aby wymieniać igłę lub żyletkę między próbkami.
    UWAGA: Adaptery i kod kreskowy z zestawu NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set dla Illumina mają łącznie 119 nt, co określa dolną granicę wycinania.
  5. Do każdego wyciętego fragmentu żelu dodać 100 μl wody wolnej od nukleaz.
  6. Inkubować fragmenty żelu w temperaturze 10 °C, 450 obr./min przez noc w termomikserze.
  7. Oczyść i skoncentruj biblioteki cDNA za pomocą komercyjnego zestawu do czyszczenia DNA zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Zalecamy stosowanie zestawu Zymo DNA Clean & Concentrate -5 (patrz Tabela Materiałów).
  8. Przechowywać oczyszczone biblioteki cDNA w temperaturze -80 °C. Punkt STOP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawione tutaj przykładowe wyniki uzyskano w badaniu nad regulacją translacji w sporulujących komórkach typu WT Bacillus subtilis. Hodowle nocne rozcieńczono do OD600 równego 0.1 w 100 mL pożywki bogatej i inkubowano w 37 °C przy intensywnym wstrząsaniu, aż OD600 osiągnęło wartość 0.5-0.6. Następnie pożywkę bogatą zastąpiono pożywką minimalną, aby indukować proces sporulacji, a inkubację kontynuowano do czterech godzin. Komórki zbierano co godzinę, zaczynając od T0 – momentu indukcji s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowym wyzwaniem technicznym związanym z profilowaniem rybosomów jest potrzeba szybkiego zahamowania translacji w celu uchwycenia migawki rybosomów na mRNA w określonym stanie fizjologicznym. Aby to osiągnąć, powszechnie stosuje się inhibitory translacji, szybkie zbiory i błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie. Stosowanie antybiotyków jest opcjonalne, ponieważ mogą one powodować artefakty. Chloramfenikol jest powszechnie stosowanym lekiem do zatrzymywania wydłużających się rybosomów w bakteryjnym RIBO-seq. Nie zapob...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

ALS pragnie podziękować za wsparcie finansowe EMBO Installation Grants IG 3914 oraz POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 realizowane w ramach programu First TEAM Fundacji na rzecz Nauki Polskiej współfinansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10X TBE (proszek)InvitrogenAM9864
2-merkaptoetanol, 99%, czystyAcros Organics125472500
5'-trifosforan adenozyny (ATP)New England BiolabsP0756S
Tlenek glinu kalcynowany czysty rocznieChempur114560600
Chlorek wapnia dwuwodnySigma-AldrichC3881-500G
ChloramfenikolMP Biomedicals190321
DNA Clean & Koncentrator -5Zymo ResearchD4004
Dnaza I rekombinowana, wolna od rnazy
EDTAFisher ScientificE/P140/48
Alkohol etylowy Absolut 99,8%  Pure-P.A.-BasicPOCH Avantor Performance Materials Poland S.A.BA6480111
Aparat filtracyjnyVWR Collection511-0265całoszklany aparat filtracyjny, z lejkiem, spiekaną podstawą, nasadką, 47 mm i Oslash; zacisk sprężynowy i kolba do szlifowania
Żel 40 (19:1)Rotiphorese3030.1
Gel Loading Dye, niebieski, 6XNew England BiolabsE6138G
Guanozyna 5′-[β,γ-imido]trifosforan sól trisodowahydrat Sigma-AldrichG0635-25MG
labZAPA& A Biotechnology040-500
Tetrahydrat octanu magnezuSigma-AldrichM5661-250G
MCE Membrane fiterTechnologia Alfatec M47MCE45GWSwielkość porów: 0,45um
MICROBExpress Bakteryjne oczyszczanie mRNAInvitrogenAM1905
Multiplex Zestaw do przygotowania małej biblioteki RNA dla IlluminaNew England BiolabsE7300S
Woda bez nukleazAmbionAM9937
Octan potasu Bezwodny czysty PAPOCH Avantor Performance Materials Poland S.A744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI DigestNew England BiolabsE7323A
RNA Clean & Koncentrator -25Zymo ResearchR1018
Octan soduSigma-AldrichS2889-250G
Węglan soduSigma-Aldrich223530-500G
Wodorowęglan sodu czysty p.a.POCH Avantor Performance Materials Poland S.A810530115
SYBR Gold Barwnik żelowy kwasu nukleinowegoLife TechnologiesS11494
T4 Kinaza polinukleotydowaNew England BiolabsM0201L
T4 Bufor reakcyjny kinazy polinukleotydowejNew England BiolabsB0201S
Bufor do próbek TBE-mocznika (2x)InvitrogenLC6876
Tris(hydroksymetylo)aminometan, ultraczysty, 99,9%AlfaAesarJ65594
Triton X-100, 98%Acros Organics327371000
Mocznik G.R.lach:ner40096-AP0
sól disodowa Roche 4716728001 . . powiedział:

Bibliografia

  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346(2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134(2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114(2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179(2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886(2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118(2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106(2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257(2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819(2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115(2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6(2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806(2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678(2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591(2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Profilowanie rybosom wprotok RIBO seqtranslacja bakteryjnasekwencjonowanie nast pnej generacjiodciski rybosomalneelektroforeza w elu poliakrylamidowyminhibicja translacjisekwencjonowanie RNAanaliza bioinformatyczna
RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.