RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

Summary

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

Abstract

Technika profilowania rybosomów (RIBO-seq) jest obecnie najbardziej efektywnym narzędziem do badania procesu syntezy białek in vivo. Zaletą tej metody, w porównaniu z innymi podejściami, jest jej zdolność do monitorowania translacji poprzez precyzyjne mapowanie pozycji i liczby rybosomów na transkryptie mRNA.

W tym artykule opisujemy kolejne etapy pobierania próbek i przygotowania do metody RIBO-seq u bakterii, podkreślając szczegóły istotne dla planowania i przeprowadzenia eksperymentu.

Ponieważ sekwencja RIBO opiera się na nienaruszonych rybosomach i pokrewnych mRNA, kluczowym krokiem jest szybkie zahamowanie translacji i odpowiedni rozpad komórek. Dlatego sugerujemy filtrację i błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie w celu pobrania komórek z opcjonalną obróbką wstępną chloramfenikolem w celu zatrzymania translacji u bakterii. Do rozpadu proponujemy mielenie zamrożonych komórek moździerzem i tłuczkiem w obecności tlenku glinu, aby mechanicznie rozbić ścianę komórkową. W tym protokole nie jest wymagana poduszka sacharozowa ani ultrawirowanie w gradiencie sacharozy do oczyszczania monosomu. Zamiast tego stosuje się separację mRNA za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), a następnie wycięcie śladu rybosomalnego (pasmo 28-30 nt), które daje zadowalające wyniki. To znacznie upraszcza metodę, a także skraca czas i zmniejsza wymagania sprzętowe dotyczące zabiegu. Do przygotowania biblioteki zalecamy użycie dostępnego na rynku małego zestawu RNA do sekwencjonowania Illumina firmy New England Biolabs, zgodnie z wytycznymi producenta z pewnym stopniem optymalizacji.

Powstałe biblioteki cDNA prezentują odpowiednią ilość i jakość wymaganą do sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z opisanym protokołem daje w wyniku od 2 do 10 mln unikalnie zmapowanych odczytów na próbkę, co zapewnia wystarczającą ilość danych do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest szybki i stosunkowo łatwy i można go wykonać przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Introduction

Technika profilowania rybosomów (RIBO-seq) została opracowana w laboratorium Jonathana Weissmana na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco¹. W porównaniu z innymi metodami stosowanymi do badania ekspresji genów na poziomie translacyjnym, RIBO-seq koncentruje się na każdym wiązaniu rybosomu z mRNA i dostarcza informacji o jego lokalizacji i względnej liczbie rybosomów w transkryptie. Umożliwia monitorowanie procesu syntezy białek in vivo i może zapewnić rozdzielczość i dokładność pojedynczego kodonu, umożliwiając pomiar gęstości rybosomów zarówno na pojedynczym mRNA, jak i wzdłuż całego transkryptomu w komórce. U podstaw techniki ....

Protocol

1. Pobieranie próbek

1. Przygotuj kulturę bakteryjną. Zalecamy objętość hodowli 100 ml na próbkę.
2. Przygotuj sprzęt i odczynniki do pobierania próbek: dwie miarki na próbkę, sterylne filtry membranowe 0,45 μm z mieszanymi estrami celulozy (MCE), sterylne probówki 50 ml, ciekły azot, 50 mg/ml chloramfenikolu w etanolu 70% (obj. / obj.) (opcjonalnie). Przebić wieczko probówek o pojemności 50 ml, aby umożliwić odparowanie ciekłego azotu i zapobiec eksplozji zamkniętych probówek. Odkaż czerpaki laboratoryjnym detergentem i 70% etanolem.
3. Rozgrzej sprzęt filtrujący i jedną z czerpaków do temperatury wzrostu kultury bakteryjnej.
   UWAGA: Zale....

Results

Przykładowe wyniki przedstawione tutaj zostały uzyskane w badaniu badającym regulację translacji w zarodnikujących komórkach WT Bacillus subtilis. Kultury przez noc rozcieńczano do OD₆₀₀ równego 0,1 na 100 ml bogatej pożywki i inkubowano w temperaturze 37 °C z energicznym wstrząsaniem, aż OD₆₀₀ osiągnął 0,5-0,6. Bogate podłoże zostało następnie zastąpione minimalnym podłożem w celu wywołania procesu zarodnikowania, a inkubację kontynuowano przez okres do czterech godzin. Komórki były zbiera.......

Discussion

Kluczowym wyzwaniem technicznym związanym z profilowaniem rybosomów jest potrzeba szybkiego zahamowania translacji w celu uchwycenia migawki rybosomów na mRNA w określonym stanie fizjologicznym. Aby to osiągnąć, powszechnie stosuje się inhibitory translacji, szybkie zbiory i błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie. Stosowanie antybiotyków jest opcjonalne, ponieważ mogą one powodować artefakty. Chloramfenikol jest powszechnie stosowanym lekiem do zatrzymywania wydłużających się rybosomów w bakteryjnym RIBO-seq. Nie zapob.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X TBE (proszek)	Invitrogen	AM9864
2-merkaptoetanol, 99%, czysty	Acros Organics	125472500
5'-trifosforan adenozyny (ATP)	New England Biolabs	P0756S
Tlenek glinu kalcynowany czysty rocznie	Chempur	114560600
Chlorek wapnia dwuwodny	Sigma-Aldrich	C3881-500G
Chloramfenikol	MP Biomedicals	190321
DNA Clean & Koncentrator -5	Zymo Research	D4004
Dnaza I rekombinowana, wolna od rnazy
EDTA	Fisher Scientific	E/P140/48
Alkohol etylowy Absolut 99,8%  Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A.	BA6480111
Aparat filtracyjny	VWR Collection	511-0265	całoszklany aparat filtracyjny, z lejkiem, spiekaną podstawą, nasadką, 47 mm i Oslash; zacisk sprężynowy i kolba do szlifowania
Żel 40 (19:1)	Rotiphorese	3030.1
Gel Loading Dye, niebieski, 6X	New England Biolabs	E6138G
Guanozyna 5′-[β,γ-imido]trifosforan sól trisodowa	hydrat Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A& A Biotechnology	040-500
Tetrahydrat octanu magnezu	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE Membrane fiter	Technologia Alfatec M47MCE45GWS		wielkość porów: 0,45um
MICROBExpress Bakteryjne oczyszczanie mRNA	Invitrogen	AM1905
Multiplex Zestaw do przygotowania małej biblioteki RNA dla Illumina	New England Biolabs	E7300S
Woda bez nukleaz	Ambion	AM9937
Octan potasu Bezwodny czysty PA	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean & Koncentrator -25	Zymo Research	R1018
Octan sodu	Sigma-Aldrich	S2889-250G
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	223530-500G
Wodorowęglan sodu czysty p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold Barwnik żelowy kwasu nukleinowego	Life Technologies	S11494
T4 Kinaza polinukleotydowa	New England Biolabs	M0201L
T4 Bufor reakcyjny kinazy polinukleotydowej	New England Biolabs	B0201S
Bufor do próbek TBE-mocznika (2x)	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroksymetylo)aminometan, ultraczysty, 99,9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100, 98%	Acros Organics	327371000
Mocznik G.R.	lach:ner	40096-AP0