Modulowanie kształtu polimeromów na bazie poliestru za pomocą ciśnienia osmotycznego

Summary

Polimeromy to samoorganizujące się pęcherzyki polimerowe, które są formowane w sferyczne kształty, aby zminimalizować energię swobodną Gibba. W przypadku dostarczania leków korzystne są bardziej wydłużone struktury. Protokół ten ustanawia metody tworzenia bardziej pręcikowatych polimeromów o wydłużonych proporcjach, wykorzystujących sól do indukowania ciśnienia osmotycznego i zmniejszania objętości pęcherzyków wewnętrznych.

Abstract

Polimeromy to związane z błoną, dwuwarstwowe pęcherzyki utworzone z amfifilowych kopolimerów blokowych, które mogą zawierać zarówno hydrofobowe, jak i hydrofilowe ładunki do zastosowań związanych z dostarczaniem leków. Pomimo swojej obietnicy, polimeromy mają ograniczone zastosowanie ze względu na ich kulisty kształt, który nie jest łatwo pobierany przez komórki, jak wykazali naukowcy zajmujący się nanocząstkami stałymi. W artykule opisano metodę opartą na soli do zwiększania proporcji sferycznych polimeromów na bazie poli(glikolu etylenowego) (PEG). Metoda ta może wydłużać polimeromy i ostatecznie kontrolować ich ostateczny kształt poprzez dodanie chlorku sodu w dializie po powstaniu. Stężenie soli można zmieniać, zgodnie z opisem w tej metodzie, w oparciu o hydrofobowość kopolimeru blokowego stosowanego jako baza dla polimeromu i docelowego kształtu. Wydłużone nanocząstki mogą lepiej celować w śródbłonek w naczyniach krwionośnych o większej średnicy, takich jak żyły, gdzie obserwuje się margines. Protokół ten może rozszerzyć zastosowania terapeutycznych nanocząstek, wykorzystując techniki wydłużania w połączeniu z podwójnym obciążeniem, długo krążącymi korzyściami polimeromów.

Introduction

Modulacja kształtu jest stosunkowo nowym i skutecznym sposobem na poprawę dostarczania leków za pośrednictwem nanocząstek. Zmiana morfologii nie tylko zwiększa powierzchnię cząstek, co z kolei pozwala na większą nośność, ale ma również implikacje dla poprawy stabilności, czasu krążenia, biodostępności, ukierunkowania molekularnego i kontrolowanego uwalniania¹. Polimersomy, nanocząstka skupiająca się w tej metodzie, mają tendencję do termodynamicznego samoorganizowania się w kulisty kształt, który okazał się niepraktyczny w wychwytywaniu komórkowym i jest łatwiejszy do wykrycia w układzie odpornościowym jako ciało obce. Możliwość wydłużenia struktury do postaci prolatu lub pręcika pozwoli nośnikowi leku uniknąć makrofagów poprzez naśladowanie komórek natywnych i skuteczniej dostarczyć go do pożądanego celu^2,3,4,5,6,7. Znaczące korzyści płynące z polimeromów, w tym związana z błoną ochrona ładunków, reagowanie błony na bodźce oraz podwójna enkapsulacja leków hydrofilowych i hydrofobowych8^,9,10, które czynią je silnymi kandydatami do dostarczania leków, są utrzymywane podczas modulacji kształtu.

Istnieje wiele różnych metod modulowania kształtów polimeromów, a każda z nich ma swoje zalety i wady. Jednak większość z tych metod dzieli się na dwie kategorie: zmiana ciśnienia osmotycznego sterowana rozpuszczalnikiem i zmiana ciśnienia osmotycznego sterowana solą¹¹. Oba podejścia mają na celu przezwyciężenie energii zginania występującej po uformowaniu polimeromów w kształt równowagi sferycznej. Wprowadzając gradient ciśnienia osmotycznego, polimeromy mogą być zmuszane do zginania się w wydłużone struktury pomimo silnych energii zginania^11,12.

Metoda oparta na rozpuszczalniku bada zmiany kształtu zainspirowane pracami Kima i van Hest¹³. Uplastycznili polimeromy w mieszaninie rozpuszczalnika organicznego i wody, aby uwięzić rozpuszczalniki organiczne w błonie pęcherzyka i wyprowadzić wodę z rdzenia pęcherzyka. W końcu wewnętrzna objętość cząstki jest tak niska, że wydłuża się. Chociaż ta metoda jest obiecująca, brakuje jej praktyczności. Metoda ta wymaga różnych rozpuszczalników dla każdego pojedynczego szkieletu polimerowego biorącego udział w modulacji. Dlatego nie ma powszechnego zastosowania do promowania zmiany kształtu. I odwrotnie, metoda oparta na soli jest jednolita i wykorzystuje jeden uniwersalny sterownik, który może wprowadzać ciśnienie osmotyczne do wielu polimeromów na bazie kopolimerów blokowych.

Ten projekt wykorzystuje metodę opartą na soli wprowadzoną przez L'Amoreaux et al¹⁴. Protokół ten obejmuje dwie rundy dializy. Jeden ma na celu oczyszczanie i zestalanie polimeromów poli(glikolu etylenowego)-b-poli(kwasu mlekowego) (PEG-PLA) poprzez usunięcie rozpuszczalnika organicznego, który mógł zostać uwięziony w dwuwarstwie podczas produkcji, a drugi sprzyja zmianie kształtu. Drugi etap dializy wprowadza roztwór NaCl o stężeniu 50 mM, który tworzy gradient ciśnienia osmotycznego w celu zmiany kształtu. Metoda ta jest wspierana przez Salva i wsp., którzy zauważają, że naprężenie hipertoniczne w roztworze spowoduje kurczenie się pęcherzyka¹⁵. Ta metoda opiera się na wcześniej opublikowanej metodzie¹⁴ przyglądającej się dwóm różnym polimeromom na bazie poliestru i różnym gradientom soli od 50 do 200 mM NaCl. Poliestry są stosowane ze względu na ich biokompatybilność i biodegradację. Gradient soli ma różny wpływ na kształt w zależności od hydrofobowości szkieletu kopolimeru blokowego. Może być używany do tworzenia prolatów, pręcików i stomatocytów. Ta metoda oparta na soli została wybrana ze względu na łatwość replikacji i wszechstronność eksperymentalną.

Protocol

1. Sferyczne tworzenie polimeromów metodą iniekcji rozpuszczalnika

1. Rozpuszczanie poliestrów w rozpuszczalniku organicznym
   UWAGA: Tylko jeden poliester powinien być rozpuszczony w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym na raz, aby utworzyć polimerosomy.
   1. Poliestry PEG-PLA lub PEG-b-poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) (PEG-PLGA) rozpuścić w dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 1,5% wagowo. W szczególności rozpuść 0,015 g wybranego poliestru w 1 ml DMSO (15 mg/ml). Całkowite rozpuszczenie polimeru może wymagać okresów do 15 minut wirowania.
2. Podczas gdy poliester rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, ustaw aparat do wstrzykiwania rozpuszczalnika zgodnie z Rysunek 1.
   1. Umieścić płytkę mieszającą bezpośrednio pod pionową pompą strzykawkową. Umieść szklaną fiolkę o pojemności 5 ml z 1 ml wody dejonizowanej typu II i miniaturowym mieszadłem na mieszadle.
   2. Wyreguluj wysokość pompy strzykawkowej tak, aby końcówka igły była całkowicie zanurzona w wodzie dejonizowanej typu II.
   3. Ustawić szybkość infuzji pompy strzykawkowej na 5 μl/min.
      UWAGA: Jeśli używana jest pompa strzykawkowa o małej objętości, adapter ze strzykawką można ustawić na stojaku pierścieniowym. Jeśli używana jest pompa strzykawkowa o dużej objętości, pompę można umieścić pionowo na podnośniku laboratoryjnym, aby wyregulować wysokość.
3. Wykonać wstrzyknięcie rozpuszczalnika, pobierając rozpuszczalnik organiczny i roztwór poliestru (krok 1.1.1) do igły 27 G o długości igły 1/2".
   1. Umieścić igłę w pompie strzykawkowej i upewnić się, że jest całkowicie zabezpieczona. Wyregulować blok popychacza tak, aby dotykał końca tłoka strzykawki.
   2. Uruchom płytkę mieszającą tak, aby woda wirowała z prędkością 100 obr./min, a następnie uruchom pompę strzykawkową.
4. Gdy pompa strzykawkowa całkowicie wprowadzi rozpuszczalnik organiczny i polimer do wody mieszającej, wyjmij z mieszadła i zakryj szklaną fiolkę.
5. Scharakteryzuj polimeromy za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS).
   1. Weź 1 ml wody, teraz z niewielkim procentem rozpuszczalnika organicznego i polimeru, i umieść w kuwecie o pojemności 1 ml.
   2. Korzystając z ustawień z Tabeli 1, wykonaj DLS, umieszczając kuwetę o pojemności 1 ml w systemie i skonfiguruj przebieg. Odczytaj i zbierz wskaźnik średnicy i polidyspersyjności (PDI) ważony intensywnością polimeromu.
      UWAGA: Plastikowa kuweta działa w tym przypadku dobrze, ponieważ ilość rozpuszczalnika organicznego jest bardzo niska. Jednak szklana kuweta sprawdzi się również, jeśli istnieją jakiekolwiek wątpliwości.
6. Potwierdź tworzenie się sferycznego polimeromu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).
   1. Zoptymalizuj protokoły TEM i SEM w oparciu o dostępny sprzęt. Reprezentatywne wyniki uzyskano przy napięciu 120 kV w TEM i 5,0 kV w SEM.
   2. Jeśli polimeromy nie są widoczne za pomocą EM, nałóż octan uranylu jako barwnik tła.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat obrazowania TEM i SEM dla modulacji kształtu polimeromów na bazie poliestru można znaleźć w reference¹⁴. Informacje na temat technik mikroskopii elektronowej dla miękkich nanocząstek są szczegółowo opisane w reference¹⁶.

2. Dializa w celu usunięcia rozpuszczalnika organicznego

1. Umyć membranę dializacyjną o natężeniu 300 kDa zgodnie z protokołami dostarczonymi przez producenta.
2. Dodać 1 ml roztworu polimeromu do zbiornika urządzenia do dializy.
3. Umieścić urządzenie do dializy w zlewce o pojemności 250 ml ze 150 ml wody dejonizowanej typu II na płytce mieszającej. Ustawić mieszadło na prędkość pozwalającą na delikatne przesuwanie urządzenia do dializy i pozostawić na noc do wymieszania.
   UWAGA: Jeśli podczas dializy powstanie wir, prędkość należy zmniejszyć.
4. Po zakończeniu dializy należy wyekstrahować 1 ml roztworu polimeromu z urządzenia do dializy. Scharakteryzować roztwór polimeromu, postępując zgodnie z krokiem 1.5.
   UWAGA: Zebranie tych informacji jest istotne dla określenia powodzenia protokołu modulacji kształtu, ponieważ powinno być w stanie zidentyfikować wzrost PDI, jeśli polimerom został wydłużony.

3. Dializa w stosunku do gradientów soli

1. Utworzyć 150 ml żądanego buforu soli o stężeniu chlorku sodu 50 mM, 100 mM lub 200 mM w oparciu o końcowe pożądane właściwości polimerowe. Ogólnie rzecz biorąc, zwiększone stężenie soli prowadzi do zwiększonego wydłużenia polimeromów.
2. Weź roztwór polimeromu, który był dializowany i scharakteryzowany, i umieść go ponownie w urządzeniu do dializy. Umieścić załadowany przyrząd do dializy w 150 ml żądanego roztworu soli i pozostawić do delikatnego mieszania przez 18 godzin
   UWAGA: Polimeromy z modulacją kształtu mogą być przechowywane i zachowują swój kształt w roztworze izotonicznym przez okres do 7 dni.

4. Charakterystyka polimerosomu z modulacją kształtu

1. Po modulacji kształtu należy przeprowadzić charakterystykę polimeromów za pomocą DLS, TEM i SEM. Jeśli polimeromy nie są widoczne za pomocą EM, nałóż octan uranylu jako barwnik tła.
2. Wykonaj pomiary DLS zgodnie z opisem w kroku 1.5, zwracając szczególną uwagę na pomiary PDI w porównaniu ze sferycznymi polimeromami, ponieważ zmiana PDI sugeruje efektywną zmianę kształtu polimeromów.
3. Należy zapewnić stosowanie odpowiednich kontroli do obrazowania, zwłaszcza polimeromów bez modulacji kształtu, aby zapewnić powodzenie metody.

Results

Tabela 2 przedstawia oczekiwane wyniki zgodnie z krokiem 1 protokołu. Należy zauważyć, że DMSO jest stosowany jako rozpuszczalnik zarówno dla PEG-PLA, jak i PEG-PLGA w tworzeniu polimeromów. Odchylenie od tego rozpuszczalnika jest możliwe, ponieważ inne rozpuszczalniki mieszające się z wodą rozpuszczą kopolimery, ale oczekuje się, że zmienią wyniki. Oczekuje się, że PDI będzie mniejsze niż 0,2, co wskazuje na powstawanie monodyspersyjnych polimeromów¹⁷. Należy zauważyć, że rosnąca...

Discussion

Systemy do samodzielnego montażu są notorycznie niekontrolowane. Ich końcowe właściwości, w tym rozmiar, kształt i struktura, zależą od właściwości hydrofobowych wybranego amfifilu i wybranego środowiska rozpuszczalnika. Amfifilowe kopolimery blokowe mają tendencję do kształtów kulistych, co minimalizuje energię swobodną Gibba i prowadzi do równowagi termodynamicznej²³, tworząc w ten sposób polimersomy. Ze względu na ich równowagę, polimeromy są znacznie trudniejsze do wydłużenia lub zmiany kształ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 * 45 fiolek z gwintem z dołączoną nakrętką	Fisherbrand	9609104000
Dimetylosulfotlenek	Fisher Chemical	D128-1
Dimetylosulfotlenek	BDH	BDH1115-1LP
Mieszadełka isoremp, płyty grzejne i mieszadła Fisher	scientific	CIC00008110V19
POMPA STRZYKAWKOWA LEGATO 130	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer	Polysciences Inc	24381-1	zwróć uwagę na masy cząsteczkowe podczas replikacji
poli(glikolu etylenowego) (2000) Blok eteru metylowego-poli(ko-glikolid laktydu) (4500)	Sigma aldrich	764825-1G	zwróć uwagę na masy cząsteczkowe podczas replikacji
Jednorazowa strzykawka/BD PrecisionGlide Kombinacja igieł, sterylna, BD medyczna	BD medyczna	BD305620	Tuberkulina
Chlorek sodu	BDH	BDH9286
Zetasizer Nano ZS	Malvern