Kwantyfikacja gęstości komórkowych i właściwości antygenowych za pomocą lewitacji magnetycznej

Summary

Ten artykuł opisuje metodę opartą na lewitacji magnetycznej, która może specyficznie wykrywać obecność antygenów, zarówno rozpuszczalnych, jak i związanych z błoną, poprzez ilościowe określanie zmian wysokości lewitacji koralików wychwytujących o stałej gęstości.

Abstract

Opisana metoda została opracowana w oparciu o zasady lewitacji magnetycznej, która rozdziela komórki i cząstki na podstawie ich gęstości i właściwości magnetycznych. Gęstość to właściwość identyfikująca typ komórki, bezpośrednio związana z jej tempem metabolizmu, różnicowaniem i statusem aktywacji. Lewitacja magnetyczna pozwala na jednoetapowe podejście do skutecznego oddzielania, obrazowania i charakteryzowania krążących komórek krwi oraz wykrywania niedokrwistości, niedokrwistości sierpowatokrwinkowej i krążących komórek nowotworowych na podstawie gęstości i właściwości magnetycznych. Podejście to jest również podatne na wykrywanie rozpuszczalnych antygenów obecnych w roztworze przy użyciu zestawów kulek o niskiej i dużej gęstości pokrytych odpowiednio przeciwciałami wychwytującymi i wykrywającymi. Jeśli antygen jest obecny w roztworze, połączy dwa zestawy kulek, generując nowy kompleks kulka-kulka, który będzie lewitował między rzędami kulek pokrytych przeciwciałem. Zwiększone stężenie docelowego antygenu w roztworze wygeneruje większą liczbę kompleksów kulka-kulka w porównaniu z niższymi stężeniami antygenu, co pozwoli na ilościowe pomiary docelowego antygenu. Lewitacja magnetyczna jest korzystna w porównaniu z innymi metodami ze względu na skrócony czas przygotowania próbki i brak zależności od klasycznych metod odczytu. Wygenerowany obraz można łatwo uchwycić i przeanalizować za pomocą standardowego mikroskopu lub urządzenia mobilnego, takiego jak smartfon lub tablet.

Introduction

Lewitacja magnetyczna to technika opracowana do rozdzielania, analizowania i identyfikowania typów komórek^1,2,3, proteins^4,5 i opioidy⁶ wyłącznie na podstawie ich specyficznej gęstości i właściwości paramagnetycznych. Gęstość komórek jest unikalną, wewnętrzną właściwością każdego typu komórki bezpośrednio związaną z jej tempem metabolizmu i statusem różnicowania^7,8,9,10

Protocol

Eksperymentalny protokół użyty w tym badaniu został zatwierdzony przez Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Konfiguracja instrumentu

UWAGA: Obrazowanie lewitujących komórek wymaga umieszczenia dwóch magnesów neodymowych ziem rzadkich namagnesowanych na osi z tym samym biegunem skierowanym do siebie w celu wytworzenia pola magnetycznego. Odległość między magnesami można dostosować w zależności od intensywności pola magnetycznego i gęstości celów. W tym przypadku magnesy są oddzielone przestrzenią o szerokości 1 mm, wystarczającą do włożenia kwadratowej szklanej rurki kapilarnej o....

Results

Lewitacja magnetyczna skupia obiekty o różnej gęstości na różnych wysokościach lewitacji, w zależności od gęstości obiektu, jego sygnatury magnetycznej, stężenia roztworu paramagnetycznego i siły pola magnetycznego wytwarzanego przez dwa silne magnesy ziem rzadkich. Ponieważ dwa magnesy są umieszczone jeden na drugim, lewitujące próbki można oglądać tylko za pomocą mikroskopu obróconego na bok (Rysunek 1). Końcowa wysokość lewitacji osiągana przez każdy typ ogniwa może być łatwo modyfikowana poprzez z.......

Discussion

Wirowanie gradientowe jest obecnie standardową techniką izolowania składników subkomórkowych na podstawie ich unikalnych gęstości. Takie podejście wymaga jednak użycia specjalistycznych pożywek gradientowych, a także sprzętu wirówkowego. Przedstawione tutaj podejście oparte na lewitacji magnetycznej pozwala na szczegółowe badanie właściwości morfologicznych i funkcjonalnych krążących komórek, przy minimalnej, jeśli w ogóle, manipulacji komórkami, zapewniając bliski dostęp in vivo do krążących komórek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydrat kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); składnik bufora aktywacyjnego
Magnesy 50x2,5x1 mm, niklowane (Ni-Cu-Ni), gatunek N52, namagnesowane o grubości 5mm (0,197")	K& J Magnetics	Niestandardowe	magnesy używane w urządzeniu do lewitacji magnetycznej
Uszczelniacz rurki kapilarnej (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Służy do zakręcania końców rurek kapilarnych
Filtry do probówek wirówkowych (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Służy do mycia koralików
Kompaktowy podnośnik laboratoryjny	Thorlabs	LJ750	Służy do regulacji urządzenia do lewitacji magnetycznej
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco	14190-144	Roztwór do zawiesin perełkowych
Etanoloamina	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Stosowany na etapie mycia koralików
Fluorescencyjna plama błony plazmatycznej (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Służy do barwienia komórek Rh+
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolin (Gd3+); roztwór magnetyczny stosowany do zawieszania komórek
HBSS++	Gibco	14025-092	Roztwór do przygotowania próbki
Ludzki kompleks C5b,6	Technologia dopełniacza, Inc	A122	Służy do generowania RBC Evs
dopełniacza	białka ludzkiego C7	A124	Służy do generowania RBC Evs
dopełniacza	ludzkiego białka C8	A125	Służy do generowania RBC Evs
Human C9	Protein Complement Technology, Inc	A126	Służy do generowania RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Służy do mocowania urządzenia do lewitacji magnetycznej do gniazd laboratoryjnych
Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); stosowany w reakcji sprzęgania przeciwciał
Normalna kontrola	IgG królikaR& D Systems	AB-105-C	Służy do powlekania kulek jako warunek kontrolny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X roztwór, pH 7,4)	Boston Bioproducts	BM-220	Składnik bufora sprzęgającego, stosowany do etapów mycia
Polisorbat 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Składnik buforu aktywacyjnego
Polistyren Karboksylowo-polimerowy	Bangs Laboratories	PC06004	Kulki o najwyższej gęstości (1,05 g/ml), używane do sprzęgania przeciwciał
Królicze przeciwciało poliklonalne RhD	Invitrogen	PA5-112694	Służy do powlekania kulek w celu detekcji czynnika Rh w czerwonych krwinkach
Mikroskop klasy badawczej	Olympus	Provis AX-70	Mikroskop służy do montażu urządzenia do lewitacji magnetycznej i oglądania lewitujących komórek
Gumowe nóżki tłumiące	Thorlabs	RDF1	Służy do podparcia stołu z płytką stykową
Kwadratowa rurka Boro	VitroTubes	8100-050	Rurka kapilarna używana do ładowania próbki do Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Stosowany w reakcji sprzężenia przeciwciał
Etap translacyjny	Thorlabs	PT1	Służy do ustawiania ostrości i skanowania rurki kapilarnej