Kwantyfikacja gęstości komórkowych i właściwości antygenowych za pomocą lewitacji magnetycznej

Summary

Ten artykuł opisuje metodę opartą na lewitacji magnetycznej, która może specyficznie wykrywać obecność antygenów, zarówno rozpuszczalnych, jak i związanych z błoną, poprzez ilościowe określanie zmian wysokości lewitacji koralików wychwytujących o stałej gęstości.

Abstract

Opisana metoda została opracowana w oparciu o zasady lewitacji magnetycznej, która rozdziela komórki i cząstki na podstawie ich gęstości i właściwości magnetycznych. Gęstość to właściwość identyfikująca typ komórki, bezpośrednio związana z jej tempem metabolizmu, różnicowaniem i statusem aktywacji. Lewitacja magnetyczna pozwala na jednoetapowe podejście do skutecznego oddzielania, obrazowania i charakteryzowania krążących komórek krwi oraz wykrywania niedokrwistości, niedokrwistości sierpowatokrwinkowej i krążących komórek nowotworowych na podstawie gęstości i właściwości magnetycznych. Podejście to jest również podatne na wykrywanie rozpuszczalnych antygenów obecnych w roztworze przy użyciu zestawów kulek o niskiej i dużej gęstości pokrytych odpowiednio przeciwciałami wychwytującymi i wykrywającymi. Jeśli antygen jest obecny w roztworze, połączy dwa zestawy kulek, generując nowy kompleks kulka-kulka, który będzie lewitował między rzędami kulek pokrytych przeciwciałem. Zwiększone stężenie docelowego antygenu w roztworze wygeneruje większą liczbę kompleksów kulka-kulka w porównaniu z niższymi stężeniami antygenu, co pozwoli na ilościowe pomiary docelowego antygenu. Lewitacja magnetyczna jest korzystna w porównaniu z innymi metodami ze względu na skrócony czas przygotowania próbki i brak zależności od klasycznych metod odczytu. Wygenerowany obraz można łatwo uchwycić i przeanalizować za pomocą standardowego mikroskopu lub urządzenia mobilnego, takiego jak smartfon lub tablet.

Introduction

Lewitacja magnetyczna to technika opracowana do rozdzielania, analizowania i identyfikowania typów komórek^1,2,3, proteins^4,5 i opioidy⁶ wyłącznie na podstawie ich specyficznej gęstości i właściwości paramagnetycznych. Gęstość komórek jest unikalną, wewnętrzną właściwością każdego typu komórki bezpośrednio związaną z jej tempem metabolizmu i statusem różnicowania^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Kwantyfikacja subtelnych i przejściowych zmian gęstości komórek w warunkach stanu stacjonarnego i podczas różnych procesów komórkowych może zapewnić niezrównany wgląd w fizjologię i patofizjologię komórki. Zmiany gęstości komórek są związane z różnicowaniem komórek^15,16, progresja cyklu komórkowego9^,17,18,19, apoptosis^20,21,22,23 i złośliwy transformation^24,25,26. W związku z tym kwantyfikacja określonych zmian gęstości komórek może być wykorzystana do różnicowania komórek różnych typów, a także do rozróżniania tego samego typu komórek przechodzących różne procesy aktywacji. Umożliwia to eksperymenty ukierunkowane na określoną subpopulację komórek, w której dynamiczne zmiany gęstości służą jako wskaźnik zmienionego metabolizmu komórkowego²⁷. Ponieważ ustalono, że komórka może zmieniać swoją gęstość w odpowiedzi na zmieniające się środowisko⁷, konieczne jest zmierzenie kinetyki komórki w stosunku do jej gęstości, aby w pełni ją zrozumieć, czego obecne metody mogą nie zapewnić¹². Z kolei lewitacja magnetyczna pozwala na dynamiczną ocenę komórek i ich właściwości²⁸.

Komórki są diamagnetyczne, co oznacza, że nie mają stałego magnetycznego momentu dipolowego. Jednak pod wpływem zewnętrznego pola magnetycznego w ogniwach generowany jest słaby magnetyczny moment dipolowy, w kierunku przeciwnym do przyłożonego pola. Tak więc, jeśli komórki są zawieszone w roztworze paramagnetycznym i wystawione na silne pionowe pole magnetyczne, będą lewitować z dala od źródła magnetycznego i zatrzymają się na wysokości, która zależy przede wszystkim od ich indywidualnej gęstości. Lewitacja diamagnetyczna obiektu ograniczonego do minimum niejednorodnego pola magnetycznego jest możliwa, gdy spełnione są dwa następujące kryteria: 1) podatność magnetyczna cząstki musi być mniejsza niż podatność otaczającego ośrodka oraz 2) siła magnetyczna musi być wystarczająco duża, aby zrównoważyć siłę wyporu cząstki. Oba kryteria mogą być spełnione poprzez zawieszenie erytrocytów w buforze magnetycznym i tworzenie silnych gradientów pola magnetycznego za pomocą małych, niedrogich, dostępnych na rynku magnesów trwałych¹. Położenie równowagi cząstki uwięzionej magnetycznie na osi wzdłuż kierunku grawitacji zależy od jej gęstości (w stosunku do gęstości bufora), podatności magnetycznej (w stosunku do podatności magnetycznej bufora) oraz sygnatury przyłożonego pola magnetycznego. Ponieważ gęstość i właściwości magnetyczne roztworu są stałe w całym systemie, wewnętrzne właściwości gęstości komórek będą głównym czynnikiem decydującym o wysokości lewitacji komórek, przy czym gęstsze komórki lewitują niżej w porównaniu z komórkami o mniejszej gęstości. Podejście to wykorzystuje zestaw dwóch gęstości referencyjnych (1,05 i 1,2 g/ml), co pozwala nam na zastosowanie precyzyjnej, ratiometrycznej analizy do pomiarów gęstości. Zmiana stężenia roztworu magnetycznego pozwala na izolację różnych populacji komórkowych, takich jak erytrocyty od krwinek białych, ponieważ gęstość krążących komórek jest specyficzna dla komórki, eliminując potrzebę stosowania protokołów izolacji lub innych manipulacji komórkami.

Większość metod wykrywania stosowanych w badaniach biologicznych opiera się na ekstrapolacji określonych zdarzeń wiązania na łatwe do ilościowego określenia sygnały liniowe. Te metody odczytu są często złożone i wymagają specjalistycznego sprzętu oraz oddanego personelu naukowego. Opisano w nim podejście mające na celu wykrycie antygenów znajdujących się na błonie komórkowej komórek lub pęcherzykach zewnątrzkomórkowych lub rozpuszczalnych w osoczu, przy użyciu jednego lub dwóch kulek pokrytych przeciwciałami. Koraliki muszą mieć różną gęstość od siebie i od gęstości badanych celów. Obecność docelowego antygenu w dowolnym płynie biologicznym jest tłumaczona na specyficzną, mierzalną zmianę wysokości lewitacji komórki dodatniej antygenowo, która jest związana ze ściegiem detekcyjnym. W przypadku rozpuszczalnych antygenów lub pęcherzyków zewnątrzkomórkowych są one związane zarówno z wychwytywaniem, jak i wykrywaniem kulek, tworząc kompleks koralik-kulka, a nie kompleks koralik-komórka. Zmiana wysokości lewitacji zależy od nowej gęstości komórki koralika lub kompleksu koralik-koralik. Oprócz zmiany wysokości lewitacji kompleksów, która wskazuje na obecność antygenu w biopłynie, liczba kompleksów zależy również od ilości celu, co sprawia, że lewitacja magnetyczna jest również ilościowym podejściem do wykrywania antygenu²⁴.

Protocol

Eksperymentalny protokół użyty w tym badaniu został zatwierdzony przez Beth Israel Deaconess Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Konfiguracja instrumentu

UWAGA: Obrazowanie lewitujących komórek wymaga umieszczenia dwóch magnesów neodymowych ziem rzadkich namagnesowanych na osi z tym samym biegunem skierowanym do siebie w celu wytworzenia pola magnetycznego. Odległość między magnesami można dostosować w zależności od intensywności pola magnetycznego i gęstości celów. W tym przypadku magnesy są oddzielone przestrzenią o szerokości 1 mm, wystarczającą do włożenia kwadratowej szklanej rurki kapilarnej o długości 50 mm 1x1 mm. Urządzenie zostało wydrukowane w 3D przy użyciu projektu AutoCAD, który jest dostępny na życzenie.

1. Połóż mikroskop na boku, idealnie poziomo.
   UWAGA: Mikroskop umieszczony w standardowej pozycji pionowej nie nadaje się bezpośrednio do obrazowania lewitujących obiektów ze względu na położenie magnesów względem kondensatora i obiektywu. Ograniczenie to można obejść, umieszczając mikroskop na boku, idealnie poziomo, co pozwala kondensatorowi skupić światło w kapilarze, a soczewce obiektywu obrazować ogniwo lewitujące między magnesami, przy zachowaniu wymagań dotyczących oświetlenia Köhlera.
2. Podeprzyj i wypoziomuj stojak na stole do krojenia chleba za pomocą 2 lub 3 podnośników laboratoryjnych.
3. Aby ograniczyć wibracje, podeprzyj stół do krojenia chleba gumowymi nóżkami tłumiącymi.
4. Usuń stolik i zastąp go kompaktowym podnośnikiem laboratoryjnym do regulacji wysokości urządzenia lewitującego (oś y) oraz dwoma jednoosiowymi stopniami translacyjnymi; jeden do regulacji ostrości (oś z), a drugi do skanowania rurki kapilarnej.
5. Przymocuj urządzenie lewitacji magnetycznej do gniazda laboratoryjnego za pomocą dwóch słupków optycznych z serii mini.

2. Wiązanie przeciwciała z mikrocząstkami/kulkami karboksylowymi (zmodyfikowane na podstawie protokołu przez PolyAn)

UWAGA: Tylko koraliki o niskiej gęstości (1,05 g/ml) muszą być powlekane do wykrywania Rh(+), ale zarówno koraliki o wysokiej, jak i niskiej gęstości są powlekane do wykrywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

1. Wyjąć 1 mg ekwiwalentu zawiesiny perełek i dodać do 0,5 ml buforu aktywacyjnego (50 mM MES (MW195.2, 9,72 mg w 1 ml)) pH 5,0 i 0,001% polisorbatu-20).
2. Dodaj 12 μl świeżo przygotowanego 1,5 M EDC (MW 191,7, 0,28755 g w 1 ml) i 12 μl 0,3 M Sulfo-NHS (MW 217,14, 0,0651 g w 1 ml) w lodowatej wodzie.
3. Umieść probówki na wytrząsarce orbitalnej i energicznie potrząsaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby aktywować grupy karboksylowe na kulkach.
4. Zatrzymaj aktywację po 1 godzinie, dodając 0,5 ml buforu sprzęgającego (10x PBS lub 0,1 M fosforanu o pH 7-9).
Granulki należy granulować
5. , odwirowując przy 20 000 x g przez 10 minut lub, jeśli kulki nie mogą być granulowane, użyć filtra probówkowego o średnicy 0,45 μm. Zassać supernatant lub przepływ.
6. Umyj koraliki 1 ml 10x PBS 3 razy, jak w kroku 2.5.
7. Obliczyć 25 μg przeciwciała na kulki mg i wymieszać pożądane przeciwciało z aktywowanymi kulkami do końcowego stężenia przeciwciał 0,7-1,0 mg / ml w 10X PBS.
8. Umieść rurki na wahaczu rurowym ustawionym na niską prędkość. Delikatnie zwiń rurki w temperaturze pokojowej przez noc w celu połączenia.
9. Powtórz krok 2.5 i umyj koraliki dwukrotnie 1 ml 10x PBS.
10. Przemyć 0,5 ml 1 M etanoloaminy (98% bulionu = 16,2 M) w buforze o pH 8,0 z 0,02% polisorbatem-20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
11. Powtórz krok 2.5 i umyj kulki raz w 1 ml DPBS. Kulki można przechowywać w 200 μl DPBS w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Pobieranie i przygotowanie krwi do wykrywania Rh(+)

1. Za pomocą nakłuwacza jednym kliknięciem nakłuj palec dawcy Rh(+) i zbierz 10 μl krwi do 1 ml DPBS.
2. Wybarwić komórki Rh+ fluorescencyjnym barwnikiem błony plazmatycznej. Opcjonalnie dodać 1 μl barwnika fluorescencyjnego do 1 ml zawiesiny komórek Rh+ (rozcieńczenie 1:1000).
3. Inkubować komórki z barwnikiem fluorescencyjnym w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
4. Granulować komórki, wirując w temperaturze 5,600 x g przez 15 s i umyć 3 razy przy użyciu 1 ml DPBS. Zawiesić w 1 ml HBSS z wapniem i magnezem (HBSS++).
5. Za pomocą nakłuwacza jednym kliknięciem nakłuć palec dawcy Rh(-) i pobrać 2 μl krwi.
   UWAGA: Jeśli przygotowujesz więcej niż 2 warunki, zbierz wystarczającą ilość krwi, aby dodać 1 μl krwi Rh(-) do każdej probówki.
6. Przygotuj niezbędne probówki doświadczalne: same kulki, kontrola IgG, próbka.
   1. Same kulki: dodać 174 μl HBSS++, 1 μl kulek kontrolnych IgG, 1 μl kulek o dużej gęstości (1,2 g/ml) i 24 μl 500 mM Gd³⁺ (60 mM).
   2. Kontrola IgG: dodać 172 μl HBSS++, 1 μl kulek kontrolnych IgG, 1 μl kulek o dużej gęstości, 1 μl krwi Rh-, 1 μl barwionej zawiesiny krwi Rh+ i 24 μl 500 mM Gd³⁺.
   3. Do probówki z próbką dodać 172 μl HBSS++, 1 μl kulek powlekanych anty-RhD, 1 μl kulek o dużej gęstości, 1 μl krwi Rh-, 1 μl barwionej zawiesiny krwi Rh(+) i 24 μl 500 mM Gd³⁺,
      UWAGA: Koraliki o dużej gęstości są dodawane do próbek Rh w celach informacyjnych.

4. Izolacja PMN w celu demonstracji separacji komórek

1. Izolacja neutrofili
   1. Pobrać 40 ml krwi żylnej do strzykawki o pojemności 60 ml zawierającej 6 ml cytrynianu sodu/kwasu cytrynowego (0,15 M, pH 5,5) i 14 ml 6% dekstranu-70.
   2. Odczekaj 50 minut, aż krew zacznie opadać.
   3. Powoli ułóż komórki kożucha na wierzchu 20 ml Ficoll-Paque, przepychając górne 18 ml przez rurkę do pobierania krwi do probówki o pojemności 50 ml, unikając zanieczyszczenia osadzonymi krwinkami czerwonymi. Zaleca się stosowanie zestawu do pobierania świeżej krwi, aby zminimalizować zanieczyszczenie resztkami erytrocytów pozostałymi w oryginalnej probówce do pobierania krwi.
   4. Osadzać komórki kożucha przez wirowanie przez 20 minut w temperaturze 3,000 x g. Neutrofile i zanieczyszczające erytrocyty będą osadzać się na dnie probówki. PBMC utworzy białą warstwę na wierzchu Ficoll-Paque.
   5. Przenieść neutrofile do nowej probówki o pojemności 50 ml.
   6. Lizować wszelkie pozostałości erytrofili przez inkubację neutrofili z 20 ml 0,2% zimnego roztworu NaCl przez 25 sekund, a następnie dodatkowe 20 ml 1,6% NaCl. Końcowe uzgodnienie NaCl powinno wynosić 0,9% (izotoniczne).
   7. Odwirować zawiesinę przez 10 minut przy 3 000 x g.
   8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić neutrofile do pożądanego stężenia.
2. Izolacja limfocytów
   1. Pokryj PBMC w RPMI 5% surowicą inaktywowaną termicznie na 6-dołkowych płytkach hodowlanych.
   2. Inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Monocyty będą przylegać do płytki, limfocyty będą swobodnie unosić się na wodzie.
   3. Usunąć bufor zawierający limfocyty i przemyć go dwukrotnie RPMI.
   4. Ponownie zawiesić limfocyty w żądanym stężeniu.
3. Oznacz erytrocyty, PMN i limfocyty.
   1. Oznacz każdy typ komórki innym barwnikiem fluorescencyjnym. Upewnij się, że każdy barwnik fluoryzuje w innym kanale. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dla każdego z wybranych barwników.

5. Wytwarzanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych RBC poprzez aktywację dopełniacza

1. Uzyskaj krew pełną przez nakłucie żyły za pomocą probówek EDTA.
2. Przepuścić krew przez filtr białych krwinek, a następnie odwirować 3 razy przy 500 x g przez 10 minut każdy, aby wyizolować czerwone krwinki. Użyj HBSS++ jako bufora myjącego.
3. Przygotować porcje 100 μl upakowanych erytrocytów w probówkach o pojemności 1,5 ml i uzupełnić objętość do 1 ml przez dodanie HBSS++.
4. Dodać C5b,6 do końcowego stężenia 0,18 μg/ml w HBSS++, a następnie wirować.
5. Umieść na wolnym wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 15 minut.
6. Dodać białko C7 do końcowego stężenia 0,2 μg/ml. Wymieszaj, delikatnie obracając rurkę kilka razy. Od tego momentu nie wiruj.
7. Umieść probówkę na wytrząsarce probówkowej ustawionej na niską prędkość na 5 minut w temperaturze pokojowej.
8. Dodaj białko C8 do końcowego stężenia 0,2 μg/ml, a białko C9 do 0,45 μg/ml. Wymieszaj, delikatnie obracając rurki kilka razy.
9. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
10. Odwirować probówkę o masie 10 000 x g przez 10 minut.
11. Zebrać supernatant zawierający EV w nowej probówce (probówkach). Nie należy usuwać supernatantu zbyt blisko osadu komórkowego.

6. Analiza komórek w urządzeniu do lewitacji magnetycznej

1. Uruchom przyrząd zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Załadować 50 μl próbki do rurki kapilarnej, aż probówka zostanie napełniona. Uszczelnij końce rurki kapilarnej uszczelniaczem kapilarnym, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
3. Załaduj rurkę kapilarną do uchwytu między górnym i dolnym magnesem. Dostosuj scenę i ostrość, aby uzyskać optymalne viewing.
   UWAGA: Komórki/kulki mogą potrzebować od 5 do 20 minut, aby osiągnąć swoją pozycję równowagi magnetycznej w oparciu o ich gęstość i stężenie Gd³⁺. Im wyższe stężenie^{Gd 3+}, tym krótszy czas.

Results

Lewitacja magnetyczna skupia obiekty o różnej gęstości na różnych wysokościach lewitacji, w zależności od gęstości obiektu, jego sygnatury magnetycznej, stężenia roztworu paramagnetycznego i siły pola magnetycznego wytwarzanego przez dwa silne magnesy ziem rzadkich. Ponieważ dwa magnesy są umieszczone jeden na drugim, lewitujące próbki można oglądać tylko za pomocą mikroskopu obróconego na bok (Rysunek 1). Końcowa wysokość lewitacji osiągana przez każdy typ ogniwa może być łatwo modyfikowana poprzez z...

Discussion

Wirowanie gradientowe jest obecnie standardową techniką izolowania składników subkomórkowych na podstawie ich unikalnych gęstości. Takie podejście wymaga jednak użycia specjalistycznych pożywek gradientowych, a także sprzętu wirówkowego. Przedstawione tutaj podejście oparte na lewitacji magnetycznej pozwala na szczegółowe badanie właściwości morfologicznych i funkcjonalnych krążących komórek, przy minimalnej, jeśli w ogóle, manipulacji komórkami, zapewniając bliski dostęp in vivo do krążących komórek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydrat kwasu 2-(N-Morfolino)etanosulfonowego	Sigma Aldrich	M-2933	(MES); składnik bufora aktywacyjnego
Magnesy 50x2,5x1 mm, niklowane (Ni-Cu-Ni), gatunek N52, namagnesowane o grubości 5mm (0,197")	K& J Magnetics	Niestandardowe	magnesy używane w urządzeniu do lewitacji magnetycznej
Uszczelniacz rurki kapilarnej (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	Służy do zakręcania końców rurek kapilarnych
Filtry do probówek wirówkowych (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	Służy do mycia koralików
Kompaktowy podnośnik laboratoryjny	Thorlabs	LJ750	Służy do regulacji urządzenia do lewitacji magnetycznej
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco	14190-144	Roztwór do zawiesin perełkowych
Etanoloamina	Sigma Aldrich	E9508-100ML	Stosowany na etapie mycia koralików
Fluorescencyjna plama błony plazmatycznej (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Służy do barwienia komórek Rh+
Gadoteridol Injection	ProHance	NDC 0270-1111-03	Gadolin (Gd3+); roztwór magnetyczny stosowany do zawieszania komórek
HBSS++	Gibco	14025-092	Roztwór do przygotowania próbki
Ludzki kompleks C5b,6	Technologia dopełniacza, Inc	A122	Służy do generowania RBC Evs
dopełniacza	białka ludzkiego C7	A124	Służy do generowania RBC Evs
dopełniacza	ludzkiego białka C8	A125	Służy do generowania RBC Evs
Human C9	Protein Complement Technology, Inc	A126	Służy do generowania RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	Służy do mocowania urządzenia do lewitacji magnetycznej do gniazd laboratoryjnych
Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); stosowany w reakcji sprzęgania przeciwciał
Normalna kontrola	IgG królikaR& D Systems	AB-105-C	Służy do powlekania kulek jako warunek kontrolny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X roztwór, pH 7,4)	Boston Bioproducts	BM-220	Składnik bufora sprzęgającego, stosowany do etapów mycia
Polisorbat 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	Składnik buforu aktywacyjnego
Polistyren Karboksylowo-polimerowy	Bangs Laboratories	PC06004	Kulki o najwyższej gęstości (1,05 g/ml), używane do sprzęgania przeciwciał
Królicze przeciwciało poliklonalne RhD	Invitrogen	PA5-112694	Służy do powlekania kulek w celu detekcji czynnika Rh w czerwonych krwinkach
Mikroskop klasy badawczej	Olympus	Provis AX-70	Mikroskop służy do montażu urządzenia do lewitacji magnetycznej i oglądania lewitujących komórek
Gumowe nóżki tłumiące	Thorlabs	RDF1	Służy do podparcia stołu z płytką stykową
Kwadratowa rurka Boro	VitroTubes	8100-050	Rurka kapilarna używana do ładowania próbki do Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	Stosowany w reakcji sprzężenia przeciwciał
Etap translacyjny	Thorlabs	PT1	Służy do ustawiania ostrości i skanowania rurki kapilarnej