Method Article

Przygotowanie tkanek ludzkich osadzonych w związku o optymalnej temperaturze skrawania do analizy metodą spektrometrii mas

DOI:

10.3791/62552

⸱

April 27th, 2021

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Lipidomics/Metabolomics Shared Resource, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Massey Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sfingolipidy to bioaktywne metabolity o ugruntowanej roli w chorobach człowieka. Scharakteryzowanie zmian w tkankach za pomocą spektrometrii mas może ujawnić role w etiologii choroby lub zidentyfikować cele terapeutyczne. Jednak związek KTT stosowany do kriokonserwacji w biorepozytoriach zakłóca spektrometrię mas. Przedstawiono metody analizy sfingolipidów w tkankach ludzkich osadzonych w OCT za pomocą LC-ESI-MS/MS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sfingolipidy to składniki komórkowe, które odgrywają dobrze ugruntowaną rolę w ludzkim metabolizmie i chorobach. Spektrometria mas może być wykorzystana do określenia, czy sfingolipidy są zmienione w chorobie i zbadania, czy sfingolipidy mogą być celowane klinicznie. Jednak odpowiednio zasilane badania prospektywne, w których pobiera się tkanki bezpośrednio z sali operacyjnej, mogą być czasochłonne, a także trudne technicznie, logistycznie i administracyjnie. Z kolei w badaniach retrospektywnych można wykorzystać kriokonserwowane próbki ludzkie, które są już dostępne, zwykle w dużych ilościach, w biorepozytoriach tkanek. Inne zalety pozyskiwania tkanek z biorepozytoriów obejmują dostęp do informacji związanych z próbkami tkanek, w tym histologii, patologii, a w niektórych przypadkach zmiennych kliniczno-patologicznych, z których wszystkie można wykorzystać do zbadania korelacji z danymi lipidomicznymi. Jednak ograniczenia techniczne związane z niezgodnością związku o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) stosowanego w kriokonserwacji i spektrometrii mas stanowią barierę techniczną dla analizy lipidów. Jednak wcześniej wykazaliśmy, że OCT można łatwo usunąć z ludzkich próbek z repozytorium biologicznego poprzez cykle płukania i wirowania bez zmiany ich zawartości sfingolipidów. Wcześniej ustaliliśmy również, że sfingolipidy w tkankach ludzkich kriokonserwowanych w OCT są stabilne przez okres do 16 lat. W tym raporcie przedstawiamy etapy i przepływ pracy w celu analizy sfingolipidów w próbkach tkanek ludzkich, które są osadzone w OCT, w tym mycie tkanek, ważenie tkanek w celu normalizacji danych, ekstrakcja lipidów, przygotowanie próbek do analizy za pomocą chromatografii cieczowej, tandemowej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą (LC-ESI-MS/MS), integracja danych spektrometrii mas, normalizacja danych i analiza danych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sfingolipidy to bioaktywne metabolity znane ze swojej roli w metabolizmie i chorobach człowieka1,2. Regulują złożone procesy komórkowe, takie jak migracja komórek, przeżycie i śmierć komórek, ruch komórek, transport pęcherzykowy, inwazja komórkowa i przerzuty, angiogeneza i produkcja cytokin1,2,3,4,5,6,7,8,9. Defekty w regulacji metabolizmu sfingolipidów przyczyniają się do inicjacji i progresji nowotworów, określają, jak agresywne są nowotwory oraz jak nowotwory reagują na terapię i rozwijają oporność na nią3,10. Dlatego, ze względu na tak szeroki wpływ na etiologię choroby, metody analityczne, które mogą precyzyjnie określić specyficzne dla choroby zmiany sfingolipidów, są ważnymi narzędziami. Spektrometria mas (MS) jest najdokładniejszą i najbardziej wiarygodną metodą analizy zmian sfingolipidów.

Ludzkie próbki, które mogą być użyte do analizy zmian sfingolipidów, można uzyskać prospektywnie z sali operacyjnej lub retrospektywnie z biorepozytoriów tkanek. Świeże tkanki z operacji są korzystne, ponieważ można je bezpośrednio analizować za pomocą stwardnienia rozsianego lub innych metod analitycznych. Jednak prospektywne pozyskiwanie tkanek wiąże się z przeszkodami administracyjnymi, technicznymi i logistycznymi, a zebranie wystarczającej liczby próbek, aby osiągnąć moc statystyczną, może być wyzwaniem. Pozyskiwanie tkanek z biorepozytoriów jest korzystne, ponieważ można je pozyskać retrospektywnie, w dużych ilościach, a biorepozytoria potwierdzają histologię i patologię, wykorzystują standardowe procedury operacyjne do kriogennego konserwowania i przechowywania tkanek oraz mogą dostarczać danych klinicznopatologicznych, które można wykorzystać do analiz korelacji. Jednakże, aby zachować cechy molekularne i strukturalne, biorepozytoria mogą kriokonserwować tkanki poprzez osadzanie ich w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), który, jak wykazaliśmy, zakłóca testy normalizacji danych i kwantyfikację sfingolipidów za pomocą chromatografii cieczowej z jonizacją elektronrozpylającą tandemową spektrometrię mas (LC-ESI-MS/MS)11. Wykazano również, że alkohol poliwinylowy i glikol polietylenowy, podstawowe składniki związku OCT, powodują tłumienie jonów na innych platformach analizy MS12,13,14,15. W związku z tym związek OCT musi zostać usunięty z tkanek przed analizą sfingolipidomiczną przez SM.

W poprzednim raporcie zatwierdziliśmy protokół usuwania związku OCT z próbek ludzkich do analizy LC-ESI-MS/MS11 oraz metodologię używaną do ważenia tkanek w celu normalizacji danych11. W tym miejscu szczegółowo opisujemy etapy protokołu usuwania związków OCT sfingolipidomicznego (sOCTrP) i pokazujemy reprezentatywne dane z guzów ludzkiego gruczolakoraka płuc i normalnych sąsiednich niezaangażowanych tkanek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdeidentyfikowane ludzkie tkanki płucne zostały pozyskane z Rdzenia Akwizycji i Analizy Tkanek i Danych Uniwersytetu Virginia Commonwealth (VCU) zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez wewnętrzną komisję rewizyjną (IRB) (#HM2471). Wykorzystanie myszy do badań i pozyskiwania tkanek myszy zostało zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (IACUC) VCU.

1. Przygotowanie materiałów

UWAGA: Te kroki powinny być wykonane dzień przed myciem chusteczek.

  1. Wstępnie oznacz i zważ 1,5 ml polipropylenowe probówki wirówkowe zwięzłymi, ale jasnymi kodami identyfikacyjnymi dla każdej próbki, która zostanie przetworzona następnego dnia. Użyj odpornego chemicznie markera permanentnego (patrz Tabela materiałów), który nie wyblaknie pod wpływem wielokrotnego obchodzenia się z tubą.
  2. Otwórz elektroniczny arkusz kalkulacyjny i oznacz kolejne kolumny następującymi nagłówkami kolumn: identyfikator rurki (ID), sama rurka, probówka z tkanką i tkanka ogółem. Wprowadź identyfikatory rur, które będą przetwarzane, w kolumnie oznaczonej jako identyfikator rury.
  3. Wstępnie skalibruj i wyzeruj wagę analityczną. Umieść czystą kolbę Erlenmeyera o pojemności 10 ml na środku płytki równoważącej (kolba będzie działać jako uchwyt na probówkę). Zamknąć drzwiczki komory ważenia i wytarować wagę za pomocą kolby.
  4. Zważ 1,5 ml probówek wirówkowych. Ostrożnie umieścić probówkę w kolbie i zamknąć drzwiczki komory ważenia. Poczekaj, aż ciężar się ustabilizuje i zapisz ciężar w samej rurze oznaczonej kolumną.
    UWAGA: Unikaj przesuwania kolby Erlenmeyera o pojemności 10 ml podczas ważenia probówek. Jeśli kolba zostanie przesunięta, ponownie wyśrodkuj kolbę i ponownie wytaruj wagę. Umieść zamknięte probówki na stojaku i przechowuj, aż będą potrzebne.
  5. Wstępnie oznacz szklane probówki i nakrętki 13 x 100 mm kodami identyfikacyjnymi i napełnij je 2 ml metanolu klasy LC-MS. Umieść je w stojaku na tubki, zakryj probówki i przechowuj w lodówce (4 °C) do czasu użycia.
    UWAGA: Użyj dozownika rozpuszczalnika od butelki (patrz Tabela materiałów). Jeśli nie jest dostępny, użyj szklanych pipet, aby uniknąć używania tworzyw sztucznych podczas dozowania rozpuszczalników organicznych.
  6. Wstępnie oznacz szklane probówki 13 x 100 mm. Przykryj i przechowuj probówki w temperaturze pokojowej.
  7. Wstępnie oznacz fiolki z automatycznym wstrzykiwaczem kodami identyfikacyjnymi. Przykryj i przechowuj fiolki z automatycznym wstrzykiwaczem w temperaturze pokojowej do czasu użycia.
  8. Przygotuj do suszenia chusteczek.
    1. Zacznij od wyczyszczenia nożyczek chirurgicznych, zanurzając je w metanolu klasy LC-MS na 5 minut, a następnie przetrzyj je czystą chusteczką laboratoryjną.
    2. Używając rękawic bezpudrowych, obracaj końcem chusteczki laboratoryjnej (patrz Tabela materiałów), aż powstanie drobno zwężający się o średnicy 30-40 mm.
    3. Za pomocą nożyczek oczyszczonych metanolem odetnij na grubym końcu. Umieść w czystym pudełku kartonowym. Wykonaj dwa razy więcej, niż będzie potrzebne do przetworzenia wszystkich próbek.
  9. Przygotuj skrócone końcówki do pipet o pojemności 1 ml. Za pomocą nożyczek chirurgicznych oczyszczonych metanolem odetnij 4-5 mm od końcówki końcówki pipety o pojemności 1 ml i umieść końcówkę z powrotem w uchwycie końcówki. Przygotuj dwa razy więcej końcówek niż próbek do przetworzenia.
    UWAGA: Będą one używane do pobierania umytych tkanek z probówek. Nie dotykaj końca końcówki.
  10. Wstępnie schłodzić sól fizjologiczną buforowaną fosforanami klasy biologii molekularnej (PBS) do temperatury 4 °C (wystarczy 0,5 l). Zostanie to wykorzystane do pobrania okazów. Dla każdej próbki, która będzie przetwarzana, należy wstępnie schłodzić (4 °C) 60 ml ultraczystej wody dejonizowanej.
  11. Przygotowanie wewnętrznych wzorców spektrometrii mas. Rozpuścić następujące lipidy w etanolu:metanolu:wodzie (7:2:1; v/v/v) w stężeniu 25 nmol/mL: d17:1-sfingozyna, (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-en-1,3-diol; D17:1-sfingozyno-1-fosforan, heptadekasfing-4-enino-1-fosforan; C12-ceramid (d18:1/C12:0), N-(dodekanoilo)-sphing-4-enina; C12-sfingomielina (d18:1/C12:0), N-(dodekanoilo)-sphing-4-enine-1-fosfocholina; C12-glukozyloceramid (d18:1/C12:0), N-(dodekanoilo)-1-β-glukozylo-sphing-4-eina; C12-laktozyloceramid (d18:1/C12:0), N-(dodekanoilo)-1-ß-laktozylo-sphing-4-en.

2. Mycie tkanek

UWAGA: Wykonanie wszystkich kroków w sekcji 1 dzień wcześniej pozwala wykwalifikowanemu badaczowi na przetworzenie do 40 próbek dziennie, a nowicjuszom ~10-15 próbek dziennie. Rozpocznij wcześnie rano i nie zatrzymuj się, dopóki nie zostaną wykonane wszystkie kroki opisane w sekcjach 2.1-3.8.

  1. W dniu, w którym tkanki będą przetwarzane, przygotuj obszar roboczy szafy bezpieczeństwa biologicznego, wyposażając ją w wirówkę, w pełni naładowany pipetor serologiczny i tackę na lód. Na wszystkich etapach opisanych w tej sekcji należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, podwójną warstwę rękawic i okulary ochronne. UWAGA: Tkanki i płyny ludzkie powinny być traktowane i traktowane jako materiały niebezpieczne biologicznie.
  2. Wstępnie schłodzić (4 °C) wahadłową wirówkę kubełkową, wszelkie adaptery potrzebne do przechowywania stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml oraz pokrywki do przechowywania biologicznego. Wstępne schładzanie (4 °C) wirówki o stałym kącie nachylenia zdolnej pomieścić 1,5 ml probówek wirówkowych.
  3. Jeśli tkanki nie są porcjowane do probówek wirówkowych z polipropylenu o pojemności 15 ml, należy użyć szpatułki oczyszczonej metanolem (czystej dla każdej nowej próbki tkanki), aby przenieść je do wstępnie oznakowanych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml. Oznacz również nakrętki o pojemności 15 ml.
    1. Umieść stojak na probówki mogący pomieścić 15 ml probówek wirówkowych w tacce na lód i napełnij tackę lodem. Rozmrozić tkanki, które będą przetwarzane tego dnia, umieszczając je w stojaku na lodzie.
      UWAGA: Należy zażądać co najmniej 3-4 mg tkanki z biorepozytorium do przetworzenia, ponieważ wcześniej wykazano, że protokoły mycia i ważenia tkanek są dokładne i wiarygodne przy tych wagach11.
  4. Przenieś tackę na lód z próbkami do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
  5. Wykonaj trzy cykle sOCTrP11, jak omówiono poniżej (tj. wykonaj kroki 2.5.1-2.5.5 trzy razy).
    1. Dodaj 10 ml lodowatej, ultraczystej wody dejonizowanej do każdej probówki i szczelnie je zakorkuj. Pozostaw probówki do inkubacji przez 10 minut.
    2. Energicznie wiruj każdą probówkę przez 10-20 s lub do momentu, gdy cała tkanka osadzona na ściankach rurki lub osad tkanki zostanie całkowicie zawieszona.
      UWAGA: W cyklach sOCTrP 2-3 bardzo ważne jest, aby osad został ponownie zawieszony, tak aby wszelkie OCT w granulkach zostały rozcieńczone w roztworze do mycia.
    3. Przenieść probówki do wstępnie schłodzonej (4 °C) wirówki z wahadłowym kubełkiem. Odwirować próbki o masie 4 000-5 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Należy unikać wytwarzania i narażenia na niebezpieczne biologicznie aerozole powstające podczas wirowania poprzez uszczelnienie nośników wirówki pokrywą zabezpieczającą przed biologią (patrz Tabela materiałów).
    4. Pobrać próbki z wirówki i przenieść do tacki na lód. Umieść tackę w komorze bezpieczeństwa biologicznego i odkręć probówki. Zachowaj czapki.
    5. Ostrożnie zassać roztwór myjący. Należy unikać zasysania materiału tkankowego w osadzie, pozostawiając ~0,5 ml supernatantu w probówce. Zakręć probówki i unikaj zanieczyszczenia krzyżowego, dopasowując oznaczone nakrętki do probówek.
      UWAGA: Roztwór płuczący (supernatant) w kroku 2.5.5 jest materiałem niebezpiecznym biologicznie; należy obchodzić się z nim i usuwać go zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego odpowiednimi dla okazów pochodzenia ludzkiego.

3. Ważenie tkanek (w celu normalizacji danych)

  1. Po ostatnim cyklu płukania sOCTrP ostrożnie odessać większość roztworu myjącego, ale nie naruszając osadu. Pozostaw ~0,5 ml roztworu do płukania w probówce.
  2. Używając skróconych końcówek pipet (przygotowanych w kroku 1.9), nabierz 500 μl lodowatego PBS i dodaj go do probówki.
    1. Za pomocą tej samej końcówki delikatnie ponownie zawiesić granulkę i pobrać całą tkankę. Należy unikać turbulentnego pipetowania, aby zmniejszyć utratę tkanek przez przyleganie do rurki i ścianek końcówki pipety.
  3. Dodaj zawieszoną tkankę do odpowiedniej, wstępnie oznakowanej i zważonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieść probówkę na lodzie. Powtórz te czynności dla wszystkich tkanek w zestawie danych.
  4. Umieścić probówki o pojemności 1,5 ml we wstępnie schłodzonej wirówce i granulować tkanki w temperaturze 7 000 x g przez 5-7 minut w temperaturze 4 °C.
    1. Wyjmij probówki i ostrożnie zassaj jak najwięcej PBS, nie naruszając osadu. Umieść probówkę z powrotem na lodzie.
  5. Wirować probówki przez dodatkowe 3 minuty przy 7 000 x g, aby upewnić się, że tkanki są dobrze granulowane. Przenieś probówki do ice.
    UWAGA: Dodatkowy etap wirowania jest ważny, aby zapobiec utracie tkanek podczas usuwania całego roztworu myjącego i odprowadzania wilgoci. W przypadku przetwarzania więcej niż pięciu próbek, po przetworzeniu co piątej próbki należy powtórzyć etap wirowania trwający 3 minuty i 7 000 x g, aby upewnić się, że tkanki pozostają granulowane.
  6. Używając przygotowanych w kroku 1.8, delikatnie usuń pozostały roztwór myjący. Użyj czystego do każdej próbki. Dopuszczalne jest delikatne przetarcie chusteczki, co pomoże usunąć większość roztworu myjącego, ale pozwoli uniknąć utraty tkanki przez przyleganie do. Zamknij rurkę i umieść ją na lodzie.
  7. Zważyć każdą probówkę w niedawno skalibrowanej, wytarowanej i wyzerowanej wadze analitycznej.
    1. Umieścić każdą probówkę w szklanej kolbie Erlenmeyera i zamknąć drzwi komory. Gdy waga się ustabilizuje, zapisz ją w kolumnie elektronicznego arkusza kalkulacyjnego oznaczonej tubką z tkanką.
    2. Po zważeniu umieść probówkę z powrotem na lodzie.
  8. Dodaj 300 μl lodowatego PBS. Używając skróconej końcówki pipety (krok 1.9), ostrożnie wyjmij całą tkankę i umieść ją we wstępnie oznakowanej szklanej probówce z zakręcaną końcówką (przygotowanej w kroku 1.5) zawierającej 2 ml lodowatego metanolu klasy LC-MS (dodaj tkankę do metanolu, a nie do boku probówki).
  9. Oblicz ilość tkanki, która została umyta, odejmując samą rurkę od wartości rurki w / tkankę. Zapisać tę liczbę w kolumnie tkanki ogółem. Całkowita wartość tkanki zostanie użyta do normalizacji danych spektrometrii mas w kroku 6.12.
  10. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do wykonania kroków 4.1-4.15.
    UWAGA: Jest to dobry punkt zatrzymania, a próbki można bezpiecznie przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C. Aby zapoznać się z innymi metodami normalizacji tkanek, takimi jak stężenie białka lub zawartość fosforanów lipidowych, zapoznaj się z Rohrbach et al.11.

4. Ekstrakcja lipidów

UWAGA: Ważne jest, aby rozpocząć te kroki rano, szczególnie gdy będzie przetwarzanych wiele próbek. Przed rozpoczęciem należy podgrzać łaźnię wodną lub inkubator do temperatury 48 °C.

  1. Pobrać z zamrażarki próbki przygotowane w kroku 3.8 oraz wzorce lipidowe MS (przygotowane w kroku 1.11). Pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową przez 20 minut.
  2. Zwirować i zanurzyć roztwór wzorca wewnętrznego w ultradźwiękowej łaźni wodnej (patrz Tabela materiałów) na 2-3 minuty lub do momentu, gdy wzorce lipidowe MS zostaną całkowicie rozpuszczone przed dozowaniem do próbek. Pozwoli to uniknąć błędów w normalizacji danych.
  3. Za pomocą pipety powtarzalnej dodać do każdej probówki 250 pmol (10 μl z roztworu o stężeniu 25 nmol/ml przygotowanego w kroku 1.11) wzorców wewnętrznej spektrometrii mas. Lekko nakręć probówki.
  4. Aby ułatwić homogenizację, należy dostosować objętość metanolu do 2 ml. Używaj wyłącznie metanolu klasy LC-MS/MS.
  5. Pracując po jednej probówce na raz, użyj homogenizatora, aby rozcierać tkankę, aż nie będą widoczne grudki (zwykle 5-20 s). Przesuwaj końcówkę homogenizatora okrężnymi ruchami i delikatnie dociśnij do ścianki rurki, aby wspomóc rozcieranie. Ponownie nakręć tubę.
    UWAGA: Upewnienie się, że wszystkie tkanki są drobno roztarte, zmaksymalizuje ekstrakcję lipidów. Nie dodawaj chloroformu do próbek przed homogenizacją, ponieważ jednorazowe końcówki homogenizatora są wykonane z tworzywa sztucznego, które rozpuści się w roztworach zawierających chloroform.
  6. Zanurz rurkę pod kątem 45° w ultradźwiękowej łaźni wodnej na 5-10 s.
    1. Jeśli po zanurzeniu w kąpieli ultradźwiękowej nie tworzą się grudki tkanki, zakryj ją i przejdź do następnej rurki.
    2. Jeśli po zanurzeniu rurki w kąpieli ultradźwiękowej utworzą się grudki tkanek, należy je ponownie homogenizować i celować w grudki.
    3. Powtarzaj ten proces (homogenizacja/zanurzenie w kąpieli ultradźwiękowej) iteracyjnie, aż wszystkie duże grudki tkanek zostaną rozbite.
  7. W dygestorii dodaj chloroform i metanol klasy LC-MS do każdej probówki (użyj dozownika od butelki), aby uzyskać stosunek 2:1:0,1 metanol:chloroform:woda. Używając czystych nakrętek, szczelnie zamknij probówki i pozostaw na blacie do końca dnia.
    1. W przypadku tkanek o masie 50 mg lub mniejszej należy użyć całkowitej objętości ekstrakcji 4 ml i dostosować przy użyciu tego stosunku (50 mg:4 ml roztworu ekstrakcyjnego) w przypadku większych próbek.
  8. Przed wyjściem wieczorem umieść szczelnie zamknięte probówki w łaźni wodnej lub inkubatorze o temperaturze 48 °C i inkubuj je przez noc.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby probówki były szczelnie zamknięte, aby proporcje rozpuszczalnika nie zmieniały się w wyniku parowania.
  9. Następnego ranka pobrać próbki z łaźni wodnej o temperaturze 48 °C i osadzać wszelkie nierozpuszczalne w rozpuszczalnikach zanieczyszczenia przez odwirowanie w temperaturze 4 000-5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  10. Pracując pod wyciągiem, ostrożnie zdekantować supernatant do wstępnie oznakowanych probówek ze szkła borokrzemianowego o wymiarach 13 x 100 mm. Przechyl rurkę 13 x 100 mm pod kątem 30-45°, aby ułatwić dekantację.
    UWAGA: W przypadku przetwarzania więcej niż 12 próbek, nie pozwól, aby probówki wirówkowe siedziały przez dłuższy czas, ponieważ granulki zmiękną, a nierozpuszczalne zanieczyszczenia zostaną przeniesione podczas wykonywania kroku 4.10. Aby tego uniknąć, wyjmij tylko 12 probówek z wirówki na raz i kontynuuj wirowanie pozostałych probówek, aż będziesz gotowy do ich zdekantacji.
  11. Przenieść probówki do koncentratora próżniowego zdolnego pomieścić probówki o wymiarach 13 x 100 mm. Odparować cały rozpuszczalnik w początkowym 1-godzinnym etapie ogrzewania (40 °C) i uruchomić w maksymalnej próżni.
  12. Wyjmij probówki z koncentratora próżniowego i dodaj 500 μl metanolu klasy LC-MS (użyj dozownika butelkowego) do każdej probówki.
  13. Ponownie zawiesić wysuszone ekstrakty lipidowe przez wirowanie przez 5-10 s, a następnie zanurzyć probówki pod kątem 45° w ultradźwiękowej łaźni wodnej na 2 minuty, obracając probówkę. Ponownie wirować przez 5 s i zanurzyć się w ultradźwiękowej kąpieli wodnej na dodatkową minutę.
    UWAGA: Jest to kluczowy krok zapewniający maksymalny odzysk wyekstrahowanych lipidów. Nie ruszaj się do przodu, dopóki cały wysuszony materiał na ściance rurki nie zostanie ponownie zawieszony.
  14. Umieścić probówki o wymiarach 13 x 100 mm w wstępnie schłodzonej (4 °C) wirówce i usunąć wszelkie nierozpuszczalne zanieczyszczenia przez odwirowanie w temperaturze 4 000-5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20-30 minut.
  15. Ostrożnie zdekantować oczyszczony supernatant do wstępnie oznakowanej fiolki z automatycznym wstrzykiwaczem. Przechylenie fiolki z automatycznym wstrzykiwaczem pod kątem 30-45° ułatwi dekantację. Upewnij się, że cała zawartość rurki 13 x 100 mm została zdekantowana do fiolki z automatycznym ładowaniem.
  16. Szczelnie zamknąć probówki i przechowywać probówki w temperaturze -80 °C do czasu analizy przez LC-ESI-MS/MS.

5. Analiza LC-ESI-MS/MS

UWAGA: Poniższa procedura wykorzystuje binarny system pomp sprzężony z automatycznym wtryskiwaczem, odgazowywaczem i systemem LC-MS/MS działającym w trybie potrójnego kwadrupolowego. Temperatura kolumny była utrzymywana za pomocą pieca kolumnowego. Szczegółowe informacje na temat używanego sprzętu można znaleźć w tabeli materiałów.

  1. Przygotować fazę ruchomą A1 (CH3OH:H2O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, z 5 mM mrówczanu amonu) i fazę ruchomą B1 (CH3OH:HCOOH, 99:1, v:v, z 5 mM mrówczanu amonu). Używaj wyłącznie rozpuszczalników, wody i odczynników klasy LC-MS.
  2. Dla każdego zestawu próbek należy przygotować cztery ślepe fiolki z automatycznym ładowaniem zawierające 500 μl metanolu klasy LC-MS.
  3. Dla każdego zestawu próbek przygotować dwie fiolki z automatycznym ładowaniem wzorca wewnętrznego (oznaczone jako IS), rozcieńczając 10 μl (łącznie 250 pmol każdy wzorzec) roztworu wzorca wewnętrznego przygotowanego w kroku 1.11 w 500 μl metanolu klasy LC-MS.
  4. Ustaw temperaturę pieca kolumnowego na 60 °C, a temperaturę źródła jonów na 500 °C.
  5. Do analizy MS/MS wykorzystaj tryb potrójnego kwadrupola spektrometru. Ustaw pierwszy kwadrupol (Q1) tak, aby przepuszczał jony prekursorowe, podczas gdy trzeci kwadrupol (Q3) przepuszczał molekularnie charakterystyczne jony produktowe (lub skan przez wiele m/z w Q1 lub Q3) za pomocą N2 do zderzeniowego indukowania dysocjacji w kwadrupolu 2 (Q2), który jest przesunięty od Q1 o 30-120 eV.
  6. Ustaw okno wykrywania wielu par monitorowania reakcji (MRM) na 120 s z czasem skanowania celu wynoszącym 1,0 s. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z listą par MRM, energii jonizacji i energii zderzeń.
  7. Do rozpuszczania sfingolipidów w etapie LC należy użyć następujących parametrów: przy natężeniu przepływu 0,7 ml / min, zrównoważyć kolumnę z odwróconymi fazami C18 o średnicy wewnętrznej 2,1 (id) x 50 mm przez 0,5 minuty z mieszaniną rozpuszczalników 95% fazy ruchomej A1 i 5% fazy ruchomej B1.
    1. Po wstrzyknięciu próbki utrzymuj stosunek faz ruchomych A1/B1 na poziomie 95/5 przez 2,25 min, a następnie gradient liniowy do 100% B1 przez 1,5 minuty, który następnie utrzymuje się na poziomie 100% B1 przez 5,5 minuty, a następnie powrót gradientu 0,5 min do 95/5 A1/B1.
    2. Po biegu należy ponownie wyrównać kolumnę mieszaniną 95/5 A1/B1 przez 0,5 minuty.
  8. W automatycznym ładowaniu próbki należy zastosować następujące ustawienia: objętość płukania, 500 μl; skok igły, 52 mm (należy go dostosować w zależności od wielkości i objętości fiolki w każdej fiolce); prędkość płukania, 35 μL/s; prędkość pobierania próbek, 5,0 μL/s; czas zanurzania płukania, 2 s; tryb płukania, przed i po aspiracji; czas płukania, 2 s.
  9. Próbki przygotowane w kroku 4.15 należy umieścić na tacy automatycznego podajnika w następującej kolejności: Puste; JEST; Pusty; próbki przygotowane w kroku 4.15; Puste, jest, puste.
  10. Przeanalizować 5-10 μl każdej próbki za pomocą LC-ESI-MS/MS. Przeanalizować tę samą objętość dla wszystkich próbek w zestawie danych.

6. Przetwarzanie, integracja i normalizacja danych

UWAGA: Chociaż poniższe kroki opisują procedurę dla konkretnego oprogramowania (patrz Tabela materiałów), podobne procedury na równoważnych instrumentach LC-MS i oprogramowaniu mogą być użyte do integracji par MRM dla analizowanych klas lipidów i odpowiadających im standardów wewnętrznych.

  1. Otwórz oprogramowanie do oceny ilościowej. Na karcie Quantitate (Określanie ilościowe) kliknij dwukrotnie Kreator kwantyfikacji. W wyskakującym okienku, w skrajnym lewym obszarze roboczym, przejdź do odpowiedniego zestawu danych i kliknij go lewym przyciskiem myszy. Dostępne przykłady zostaną wyświetlone w środkowym obszarze roboczym.
  2. Zaznacz próbki do analizy, a następnie kliknij strzałkę w prawo, aby dodać próbki do obszaru roboczego Wybrane próbki. Kliknij przycisk Dalej, aby przejść do ekranu ustawień i zapytania, na którym zwykle używane są ustawienia domyślne.
  3. Naciśnij Dalej, aby przejść do ekranu wyboru metody integracji. Należy wybrać odpowiednią metodę całkowania zawierającą pary przejść MRM dla lipidów, które mają być analizowane. Zapoznaj się z Tabelą 1, aby zapoznać się z parami przejść MRM. Hit Finish.
    UWAGA: Czasy przechowywania będą się różnić w zależności od oprzyrządowania i indywidualnych ustawień, dlatego muszą być weryfikowane dla każdej indywidualnej konfiguracji.
  4. Na pasku nawigacyjnym kliknij okienko Przegląd szczytu, aby można było sprawdzić pary MRM. Aby ułatwić przeglądanie, kliknij prawym przyciskiem myszy okienko Przegląd szczytu, zmień automatyczne powiększanie na 100% największego szczytu i okno powiększenia na 1,00–2,00 minut.
  5. Kliknij prawym przyciskiem myszy okno Quantitation Display (Wyświetlanie oceny ilościowej) i wybierz Analit oraz żądany sfingolipid do zbadania. Sprawdzić, czy w próbkach zerowych nie ma pików i czy w próbkach IS został zintegrowany prawidłowy pik
    6. .
  6. Rozpocznij integrowanie nieznanych próbek. Pracując po jednej klasie sfingolipidów na raz, sprawdź czas retencji pary MRM wzorca wewnętrznego (tj. ceramidu C12:0) i upewnij się, że oprogramowanie zintegrowało prawidłowy pik.
  7. Kontynuuj do analitów w tej samej klasie lipidów (tj. ceramid C14:0, ceramid C16:0 itp.), zaczynając od lipidu o najkrótszej długości łańcucha w klasie. Sprawdź dla każdego lipidu o długości łańcucha, czy procedura oprogramowania zintegrowała prawidłowy pik pary MRM.
  8. Po zintegrowaniu wszystkich analitów utwórz elektroniczny arkusz kalkulacyjny dla każdego analizowanego gatunku sfingolipidów (np. ceramidów, sfingomielin itp.). Oznacz nagłówki kolumn tak, aby odpowiadały kolejności analitów i długości łańcuchów w oprogramowaniu do oceny ilościowej LC-MS/MS. Dołącz również nagłówek kolumny dla identyfikatora próbki i wag normalizacji próbki określonych w kroku 3.9.
    UWAGA: Jak opisano wcześniej11, inne typowe miary normalizacji obejmują całkowitą zawartość fosforanów lipidowych lub ilość białka.
  9. Eksportuj lub kopiuj obszary pików dla wszystkich analitów i wzorców wewnętrznych do elektronicznego arkusza kalkulacyjnego.
  10. Normalizuj dane, dzieląc zintegrowany obszar piku każdego gatunku o długości łańcucha dla danej klasy sfingolipidów przez obszar piku odpowiadającego mu wzorca wewnętrznego. Na przykład ceramid C14:0, ceramid C16:0, ceramid C18:1 itp. powinny być podzielone przez wewnętrzną powierzchnię piku wzorca ceramidu C12:0.
  11. Przelicz powierzchnię piku na mole odzyskanego lipidu, mnożąc znormalizowaną powierzchnię piku (obliczoną w kroku 6.10) przez ilość wzorca wewnętrznego w pikomolach, który został dodany do próbki w kroku 4.3. W tym protokole ilość ta wynosi 250 pmol.
  12. Aby uzyskać względną ilość lipidów w każdej próbce, należy podzielić pikomole każdej długości łańcucha lipidowego przez masę tkanki określoną w kroku 3.9. To da jednostki pikomoli lipidów na mg tkanki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole szczegółowo opisujemy metodę usuwania OCT z kriokonserwowanych tkanek ludzkich i ważenia tkanek do analizy za pomocą LC-ESI-MS/MS. Materiały wymagane do tej procedury są wymienione w Tabeli materiałów. Pokazane w Rysunek 1 to wyniki typowego eksperymentu, w którym 10 ludzkich guzów gruczolakoraka płuc i 10 normalnych sąsiednich tkanek zostało przemytych w celu usunięcia OCT i przeanalizowanych przez LC-ESI-MS/MS. Co ważne, jak już wcześniej pokazaliśmy

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OCT jest powszechnym długoterminowym środkiem kriokonserwującym stosowanym w biorepozytoriach. Jednak OCT może powodować supresję jonów, gdy tkanki są analizowane przez różne platformy spektrometrii mas 12,13,14,15 lub powodować utratę sygnału, gdy próbki są analizowane przez LC-ESI-MS / MS 11. OCT w tkankach kriokonserwowanych może również zakłócać metody normalizacji t...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usługi i wsparcie projektu badawczego zostały zapewnione przez VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core oraz VCU Lipidomics and Metabolomics Core, które są częściowo wspierane przez fundusze z NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Polipropylenowe końcówki do pipet 1 mlNANASłuży do pobierania próbek
1,5 ml polipropylenowych probówek wirówkowychNANA
10 ml Kolba ErlenmeyeraVWR89091-116Służy do ważenia probówek i tkanek
AB Sciex Analyst 1.6.2SciexNAOprogramowanie do analizy i integracji danych MS
Mrówczan amonuFisher ScientificA11550Do faz ruchomych LC
Skala analitycznaNASkala z dokładnością do 0,1 mg
Dozownik butelkowySartoriusLH-723071Używany do dozowania rozpuszczalników
C12-Ceramid (d18:1/C12:0); N-(dodekanoilo)-sphing-4-eninaAvanti Polar LipidsLM2212Wzorzec wewnętrzny
C12-glukozyloceramid (d18:1/12:0); N-(dodekanoilo)-1-β-glukozylo-sphing-4-eineAvanti Polar LipidsLM2511Wzorzec wewnętrzny
C12-laktozyloceramid (d18:1/12:0); N-(dodekanoilo)-1-ß-laktozylo-sphing-4-enAvanti Polar LipidsLM2512Wzorzec wewnętrzny
C12-Sfingomielina  (d18:1/C12:0), N-(dodekanoilo)-sphing-4-enine-1-fosfocholinaAvanti Polar LipidsLM2312Wzorzec wewnętrzny
CHLOROFORM OMNISOLV 4LVWREM-CX1054-1
Pokrywki do przechowywania biologicznego ClickSealThermo Scientific75007309Aby zapobiec zagrożeniu biologicznemu podczas wirowania
ConfliktDecon Labs4101Dekontaminacja
Piec kolumnowy CTO-20A/20ACShimadzuNADo LC
d17:1-Sphingozyna;   (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diolAvanti Polar LipidsLM2000Wzorzec wewnętrzny
d17:1-sfingozyno-1-fosforan; heptadekasfing-4-enino-1-fosforanAvanti Polar LipidsLM2144Wewnętrzny wzorzec
odgazowywania DGU20A5RShimadzuNA
13x100mmVWR53283-800Rurki śrubowe 13x100 mm
Podgrzewana kąpiel wodnaNANADo ekstrakcji lipidów przez noc
Homogenizator 150Fisher Scientific15-340-167trójdzielne tkanki
Homogenizator Plastikowa jednorazowa sonda generatoraFisher Scientific15-340-177do homogenizacji
KimwipesKimtech 34120Laboratoryjna chusteczka używana do produkcji
Metanol LC-MS Grade 4LPompa binarna VWREM-MX0486-1
Nexera LC-30 ADShimadzuNADo markera permanentnego LC-MS
VWR52877-310
Zamknięcie gwintu fenolowego, Kimble Chase (nasadki do jednorazowych probówek hodowlanych)VWR89001-50213x100 mm zakrętki na rurkę
solną soli fizjologicznej z buforem fosforanowymThermo Scientific10010023Do pobierania próbek z probówek po umyciu
Pipeta RepeaterEppendorf4987000118Do dozowania wewnętrznych wzorców LC-MS
Zakrętki, niebieskie, czerwone PTFE/biały silikonVWR89239-020Nasadki na fiolki z automatycznym wtryskiwaczem
Szklane fiolki z gwintem śrubowym z naszywką identyfikacyjnąVWR46610-724Fiolki z automatycznym wtryskiwaczem
SIL-30ACShimadzuNA
SpeedVacThermo ScientificSPD2030P1220Do suszenia rozpuszczalników
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Kolumna Ascentis Express C18Sigma Aldrich581300-UDo LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS SystemSciexNADo LC-ESI-MS/MS
Ultradźwiękowa łaźnia wodnaBransonModel 2800do homogenizacji i reprodukcji wyekstrahowanych i wysuszonych lipidów
VortexerNANA DosOCTrP i ponownego zawieszania wysuszonych
lipidów VWR Probówki hodowlane Jednorazowe szkło borokrzemianoweVWR4772957213x100 Szklane probówki
Woda Hipersolve Chromanorm LC-MSVWRBDH83645.400
Jednorazowe probówki hodowlane Shimadzu NA hodowlane

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
  2. Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
  3. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
  4. Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
  5. Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
  6. Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
  7. Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
  8. Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
  9. Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
  10. Morad, S. A. F., Cabot, M. C. Advances in Cancer Research. Chalfant, C. E., Fisher, P. B. 140, Academic Press. 235-263 (2018).
  11. Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
  12. Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
  13. Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
  14. Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
  15. Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sphingolipid AnalysisMass SpectrometryOCT RemovalLipid ExtractionHuman Tissue PreparationCryopreserved TissuesLiquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryTissue BiorepositoryCeramide Quantification

Related Articles