Uzyskiwanie makrofagów z ludzkich monocytów w celu oceny częstości infekcji Leishmania braziliensis i wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza

Podsumowanie

Ten protokół opisuje proces pozyskiwania ludzkich makrofagów z monocytów do zakażenia Leishmania braziliensis. Pozwala również naukowcom ocenić wskaźnik infekcji i żywotność pasożytów, produkcję ROS za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz produkcję mediatorów stanu zapalnego w supernatantach hodowlanych w celu zbadania odpowiedzi makrofagów na zakażenie.

Streszczenie

Makrofagi są wielofunkcyjnymi komórkami niezbędnymi do funkcjonowania układu odpornościowego i główną komórką gospodarza w zakażeniu Leishmania braziliensis (Lb). Komórki te specjalizują się w rozpoznawaniu mikroorganizmów i fagocytozie, ale także aktywują inne komórki odpornościowe i prezentują antygeny, a także wspomagają stan zapalny i naprawę tkanek. W tym miejscu opisujemy protokół uzyskiwania komórek jednojądrzastych z krwi obwodowej (PBMC) zdrowych dawców w celu oddzielenia monocytów, które następnie różnicują się w makrofagi. Komórki te można następnie zainfekować in vitro w różnych stężeniach Lb, aby ocenić zdolność do kontrolowania infekcji, a także ocenić odpowiedź immunologiczną komórek gospodarza, którą można zmierzyć kilkoma metodami. PBMC najpierw wyizolowano przez odwirowanie z gradientem Ficoll-Hypaque, a następnie posiano, aby umożliwić monocytom przyleganie do płytek hodowlanych; Nieprzylegające komórki usunięto przez mycie. Następnie przylegające komórki hodowano z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) przez 7 dni w celu wywołania różnicowania makrofagów. Sugerujemy posiew 2 x 10⁶ komórek na studzienkę na płytkach 24-dołkowych w celu uzyskania 2 x 10⁵ makrofagów. W pełni zróżnicowane makrofagi mogą być następnie zakażone Lb przez 4 lub 24 godziny. Protokół ten skutkuje znacznym odsetkiem zakażonych komórek, który można ocenić za pomocą mikroskopii optycznej lub fluorescencyjnej. Oprócz wskaźnika infekcji, obciążenie pasożytami można zmierzyć, zliczając liczbę pasożytów w każdej komórce. Dalsze testy molekularne i funkcjonalne można również przeprowadzać w supernatantach hodowlanych lub w samych makrofagach, co pozwala na zastosowanie tego protokołu w różnych kontekstach, a także dostosowanie go do innych wewnątrzkomórkowych gatunków pasożytów.

Wprowadzenie

Wewnątrzkomórkowy pasożyt pierwotniaka z rodzaju Leishmania jest czynnikiem sprawczym zaniedbanego kompleksu chorobowego znanego jako leiszmanioza¹. Te choroby tropikalne mają szeroki zakres objawów klinicznych, które mogą wahać się od zmian skórnych po powikłania wynikające z trzewnej postaci choroby, które mogą być śmiertelne, jeśli nie są leczone. Leiszmanioza skórna (CL) jest najczęstszą postacią leiszmaniozy i charakteryzuje się pojedynczym lub kilkoma owrzodzonymi zmianami skórnymi z zaostrzonym przewlekłym stanem zapalnym². Rozwój choroby jest zależny od gatunku Leishmania, a także od kombinacji czynników związanych z odpowiedzią immunologiczną gospodarza, które definiują wyniki kliniczne^3,4. Leishmania braziliensis jest głównym gatunkiem wywołującym CL w Brazylii, z przypadkami zgłoszonymi we wszystkich stanach kraju⁵. Odpowiedź immunologiczna przeciwko L. braziliensis jest uważana za ochronną, ponieważ ogranicza pasożyta do miejsca inokulacji i obejmuje kilka typów komórek odpornościowych, takich jak makrofagi, neutrofile i limfocyty^4,6,7.

Makrofagi to wielofunkcyjne komórki niezbędne dla układu odpornościowego, ponieważ specjalizują się w wykrywaniu i fagocytozie mikroorganizmów, mogą prezentować antygeny i aktywować inne typy komórek. Makrofagi są w stanie regulować procesy od stanu zapalnego po naprawę tkanek i utrzymanie homeostazy^8,9. Komórki te odgrywają istotną rolę we wczesnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko pasożytom wewnątrzkomórkowym, takim jak Leishmania, będąc ważnym elementem ich eliminacji^10,11,12.

Podczas infekcji L. braziliensis, makrofagi mogą reagować za pomocą różnych mechanizmów eliminowania pasożyta, takich jak produkcja reaktywnych form tlenu (ROS) i mediatorów stanu zapalnego^13,14. Odpowiedzi immunologiczne mogą być kierowane przez produkcję cytokin prozapalnych lub przeciwzapalnych, które przyczyniają się do zaostrzenia stanu zapalnego lub procesów naprawy tkanek^6,15,16. Plastyczność makrofagów ma fundamentalne znaczenie dla immunopatogenezy CL, a także dla interakcji pasożyt-gospodarz, a komórki te są uważane za kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów choroby i rozwoju nowych podejść terapeutycznych.

Ponieważ CL jest złożoną chorobą, badania wymagają od badaczy zbadania typów komórek, które naśladują te występujące u ludzi. Odpowiedzi immunologiczne obserwowane w różnych modelach eksperymentalnych mogą się różnić i dawać wyniki, które nie odzwierciedlają odpowiedzi immunologicznej obserwowanej u naturalnie zakażonych ludzi. W związku z tym przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół został zaprojektowany, aby umożliwić badanie ludzkich makrofagów i ich odpowiedzi immunologicznych podczas CL wywołanego przez L. braziliensis.

Protokół

Instytucjonalna Komisja Rewizyjna ds. Etyki w Badaniach Naukowych na Ludziach w Instytucie Gonçalo Moniz (Oswaldo Cruz Foundation-IGM-FIOCRUZ, Salvador, Bahia-Brazylia), zatwierdziła to badanie (numer protokołu: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. Izolacja ludzkich PBMC

1. Upewnij się, że próbki krwi, gradient gęstości 1.077 g/ml (np. Ficoll-Histopaque) i roztwór soli mają temperaturę pokojową.
2. Rozcieńczyć próbki krwi roztworem soli fizjologicznej w stosunku 1:1.
3. Przenieś 10-12 ml gradientu gęstości do probówek o pojemności 50 ml.
4. Ostrożnie nałożyć do 40 ml rozcieńczonej próbki krwi na gradient gęstości. Oddziel warstwy krwi i gradientu gęstości.
5. Pierwsze odwirowanie: probówki wirówkowe zawierające warstwy gradientu krwi i gęstości o sile 400 x g przez 30 minut w temperaturze 24 °C.
   UWAGA: Wyłącz hamulec przed uruchomieniem wirówki.
6. Usunąć osocze powyżej pierścienia PBMC za pomocą pipety (warstwa kożucha znajduje się między warstwami osocza i gradientu gęstości; poniżej znajdują się czerwone krwinki/granulocyty).
7. Przenieść warstwę PBMC przypominającą chmurę (warstwę kożuchówki) za pomocą pipety do probówki o pojemności 15 ml i napełnić zimną solą fizjologiczną (przechowywaną na lodzie lub w temperaturze 4 °C).
8. Drugie odwirowanie: probówki wirówkowe o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy włączonym hamulcu.
9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad, napełniając probówkę zimną solą fizjologiczną.
10. Trzecie wirowanie: probówki wirówkowe o masie 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy włączonym hamulcu.
11. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad, napełniając probówkę zimną solą fizjologiczną.
12. Czwarte odwirowanie: odwirować probówkę o stężeniu 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy włączonym hamulcu.
13. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z 1 ml zimnego podłoża RPMI.
14. Policz komórki, aby określić liczbę uzyskanych komórek.

2. Różnicowanie na ludzkie makrofagi

UWAGA: Dla płytki 24-dołkowej oblicz ilość komórek potrzebnych do płytki 2 x 10⁶ komórek na studzienkę, co da 2 x 10⁵ makrofagów. Wydajność ta opiera się na średnio 10% monocytów w ludzkiej krwi. Alternatywnie, monocyty mogą być również uwalniane metodami nieenzymatycznymi, a następnie liczone do posiewu.

1. Na 24-dołkowej płytce umieść okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 13 mm na dnie każdej studzienki. Umieść na płytce odpowiadającą 2×10⁶ komórek w 1 ml RPMI niekompletnej na studzienkę.
   UWAGA: Ogranicz liczbę komórek w każdym dołku, ponieważ przeszacowane ilości mogą utrudnić adhezję komórek i zagrozić hodowli. Ponadto wszystkie szkiełka nakrywkowe muszą być czyste i sterylne.
2. Inkubować płytki przez 30 minut w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO_{2 w} celu uzyskania adhezji komórek.
3. Usuń supernatanty i przemyj raz 0,9% solą fizjologiczną w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie nieprzylegające komórki.
4. Po umyciu usuń sól fizjologiczną i dodaj 250 μl uzupełnionej pożywki RPMI o temperaturze pokojowej (10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 50 ng/ml M-CSF) do każdej studzienki.
5. Inkubować komórki przez 7 dni w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO_{2 .}
   1. Co dwa dni dodawaj 125 μl uzupełnionej pożywki RPMI do każdej studzienki. Pod koniec różnicowania komórek końcowa objętość wyniesie 500 μl na studzienkę.
   2. Aby przeanalizować żywotność komórek, wykonaj kolejną hodowlę równolegle na 96-dołkowej płytce (2 x 10⁵ na dołek).
   3. Po różnicowaniu do makrofagów (7 dni) dodać 20 μl odczynnika AlamarBlue.
   4. Po 7 godzinach inkubacji odczytać płytki na spektrofotometrze o długości fali 570 nm i 600 nm.

3. Kultura Leishmania i zakażenie

UWAGA: L. braziliensis promastigotes z dwóch różnych szczepów (MHOM/BR/01/BA788 i MHOM/BR88/BA-3456) zostały użyte w tym teście.

1. Policz pasożyty Lb i oblicz objętość, aby uzyskać 5 x 10^{pasożytów 5}/ml.
2. Przygotuj uzupełnioną pożywkę Schneider's Insect (10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny).
3. Inkubować pasożyty w całkowitej objętości 5 ml w inkubatorze o temperaturze 24 ºC aż do osiągnięcia fazy stacjonarnej (4 do 6 dni).
   UWAGA: Licz pasożyty każdego dnia, aby ocenić wzrost.
4. Po osiągnięciu fazy stacjonarnej odwirować kultury Leishmania w stężeniu 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4 ºC w celu usunięcia wszelkich martwych pasożytów (wytrąconych na dnie probówki).
5. Przenieść supernatant do nowej probówki i odwirować przy 1 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu odzyskania żywych pasożytów. Odrzucić supernatant.
6. Zawiesić osad z 1 ml uzupełnionej pożywki RPMI, aby policzyć pasożyty.
7. Oblicz objętość pasożytów, aby uzyskać stosunek pasożytów do komórek 10:1. Przenieś pasożyty na płytki hodowlane zawierające makrofagi uprzednio wyhodowane w uzupełnionej pożywce RPMI (~300 μL/studzienkę) w temperaturze pokojowej.
8. Usunąć supernatant z każdej studzienki zawierającej zróżnicowane makrofagi.
   UWAGA: Tak szybko, jak to możliwe, wymień pożywkę w każdym dołku, aby uniknąć spędzania komórek przez dłuższy czas bez pożywki. Sugerujemy usunięcie i wymianę pożywki w trzech studzienkach jednocześnie.
9. Przenieś obliczoną ilość Lb do każdej studzienki zawierającej zróżnicowane makrofagi.
10. Infekować komórki przez 4 lub 24 godziny w temperaturze 37 ºC poniżej 5% CO_{2 .}
    1. Po 4 godzinach przemyj makrofagi 3 razy solą fizjologiczną w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie niezinternalizowane pasożyty.
    2. Na 24-godzinny okres infekcji dodać 300 μl uzupełnionej pożywki RPMI do każdego dołka po umyciu, a następnie ponownie inkubować przez kolejne 20 godzin w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO₂ .
11. Usunąć supernatant w celu zmierzenia mediatorów stanu zapalnego za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Odwirować zebrany supernatant o stężeniu 1 800 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do nowej probówki. Ta procedura jest wykonywana w celu usunięcia wszelkich niezinternalizowanych pasożytów. Supernatanty można zamrozić i przechowywać w temperaturze -80^oC do czasu przyszłej analizy.
       UWAGA: Komórki mogą być używane do oceny wskaźnika infekcji, żywotności pasożyta lub produkcji ROS.

4. Ocena infekcji

1. Kwantyfikacja wskaźnika zakażeń
   1. Dodać 300 μl metanolu do każdego dołka po usunięciu sklarowanego osadu. Odczekaj 15 minut, aby utrwalić komórki przylegające do szkiełek nakrywkowych.
   2. Usuń szkiełka nakrywkowe ze studzienek i umieść je na podporze, aby zanurzyć je w roztworze do barwienia komórek (np. Quick Panoptic 2) na 1 minutę.
   3. Zanurz szkiełka nakrywkowe dwukrotnie w roztworze do barwienia komórek (np. Quick Panoptic 3) i poczekaj, aż wyschną.
   4. Umieść 15 μl podłoża montażowego (np. Entellan) na szkiełkach, a następnie umieść szkiełka nakrywkowe na podłożu.
      UWAGA: Wszystkie makrofagi przyczepione do szkiełek nakrywkowych powinny mieć kontakt z podłożem montażowym.
   5. Policz losowo 100 komórek pod mikroskopem optycznym, używając obiektywu 100x, aby określić ilościowo wskaźnik infekcji i liczbę zinternalizowanych amastigotów.
2. Żywotność pasożytów
   1. Po 4 godzinach infekcji 3 razy przemyć komórki solą fizjologiczną w temperaturze pokojowej.
   2. Dodać 300 μl uzupełnionej pożywki dla owadów Schneidera.
   3. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 24 ºC.
   4. Określ ilościowo wzrost pasożyta po 48, 72, 96 i 120 godzinach.

5. Ocena produkcji ROS za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

1. Po okresie infekcji usunąć supernatant i przemyć komórki 500 μl soli fizjologicznej.
2. Dodać 300 μl odczynnika do sondy fluorogenicznej (np. CellROX Green Reagent o stężeniu 5 μM) do każdego dołka.
3. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 ºC i 5% CO₂ .
4. Przemyć komórki 3x 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
5. Utrwal komórki 300 μl 3,7% formaldehydu i odstaw na 15 minut.
   UWAGA: Zmierz sygnał fluorescencji w ciągu 24 godzin.
6. Dodać 5 μl środka barwiącego DAPI (np. DAPI ProLong Gold antifade) do barwienia komórek. Umieścić szkiełko nakrywkowe tak, aby powierzchnia zawierająca makrofagi miała bezpośredni kontakt ze środkiem barwiącym DAPI.
7. Analizuj sygnał fluorescencyjny za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy długości fali wzbudzenia 485/520 nm.
8. Oblicz skorygowaną całkowitą fluorescencję komórek (CTCF) z 30 komórek dla każdego szkiełka nakrywkowego za pomocą ImageJ.
   CTCF = Gęstość zintegrowana (Obszar wybranej komórki x Średnia fluorescencja odczytów tła)

6. Analiza statystyczna

1. Użyj testu Manna-Whitneya, aby porównać dwie grupy z niesparowanymi próbkami. Wykonaj analizy statystyczne za pomocą GraphPad Prism 7.0. Rozważ różnice istotne statystycznie, gdy p < 0,05.

Wyniki

Zrozumienie interakcji między pasożytami a komórkami gospodarza jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów zaangażowanych w patogenezę wielu chorób. Choć hodowle pierwotne ludzkich komórek są rzadziej stosowane ze względu na ograniczenia hodowli komórkowej w porównaniu z liniami komórkowymi, przedstawiony w niniejszym opracowaniu protokół wykazuje stabilną i powtarzalną różnicowanie makrofagów ludzkich. Protokół ten umożliwia analizę wielu aspektów odpowiedzi immunologicznej i biologii komórki, od produkcji mediatorów sta...

Dyskusja

Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół różnicowania ludzkich monocytów w makrofagi, po którym następuje zakażenie dwoma szczepami L. braziliensis, pozwala na ocenę kilku aspektów interakcji pasożyt-komórka. Narzędzia te mogą mieć kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia pytań dotyczących CL, na które nie ma odpowiedzi. Dzięki ustanowieniu tego protokołu, nasza grupa była w stanie odkryć niektóre aspekty odpowiedzi immunologicznej makrofagów uzyskanych od osób z cukrzycą i CL¹⁴.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik do żywotności komórek AlamarBlue	Invitrogen	DAL1100
Kolba do hodowli komórkowych 25 cm²	SPL	70125
CellROX Zielony odczynnik	Invitrogen	C10444
Szkiełka nakrywkowe 13 mm	Perfecta	10210013CE
DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol)	ThermoFisher	D1306
Jednorazowa podpórka do pobierania krwi	BD Vacutainer	364815
Igła do pobierania krwi Eclipse 21 g x 1,25 cala	BD Vacutainer	368607
Entellan	Sigma Aldrich	107961
Probówki stożkowe Falcon, 15 ml	Sigma Aldrich	CLS430791-500EA
50 ml	StemCell Technologies	100-0090
Surowica bydlęca	płodu Gibco	A4766801
Formaldehyd 3,7%	Merck	252549
Szkiełko szkiełkowe  25,4x76,2mm	Perfecta	0200
Histopaque	Sigma Aldrich	10771
Zestaw ELISA dla człowieka IL-6	RD	DY206
Ludzkie białko rekombinowane M-CSF	PeproTech	300-25
Zestaw ELISA dla ludzi TNF-a	RD	DY210
Zestaw ELISA dla leukotrienu B4	Kajman
Metanol	Merck	MX0482
Penilicyna-Sreptomycyna-Glutamina (100x)	ThermoFisher	10378-016
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,2 (10x)	Gibco	70013032
Probówka plazmowa, 158 jednostek USP heparyny sodowej (powlekanej natryskowo)	BD Vacutainer	367874
Quick H& E Zestaw do barwienia (hematoksylina i eozyna)	abcam	ab245880
RPMI 1640 Medium	Gibco	11875093
Medium dla owadów Schneidera	Sigma Aldrich	S0146
Kultura tkankowa 24-dołkowa płytka	TPP	Z707791-126EA
Trypan Blue	Gibco	15250061

Probówki stożkowe , 520111