Analiza wieloczynnikowych eksperymentów sekwencyjnych RNA za pomocą DiCoExpress

Summary

DiCoExpress to narzędzie oparte na skryptach zaimplementowane w R do przeprowadzania analizy sekwencyjnej RNA, od kontroli jakości do koekspresji. DiCoExpress obsługuje kompletną i niezrównoważoną konstrukcję do 2 czynników biologicznych. Ten samouczek wideo prowadzi użytkownika przez różne funkcje DiCoExpress.

Abstract

Właściwe wykorzystanie modelowania statystycznego w analizie danych NGS wymaga zaawansowanego poziomu wiedzy. Ostatnio obserwuje się rosnący konsensus co do stosowania uogólnionych modeli liniowych do analizy różnicowej danych sekwencyjnych RNA-Seq oraz zalety modeli mieszanin do przeprowadzania analizy koekspresji. Aby zaoferować zarządzane środowisko do korzystania z tych podejść do modelowania, opracowaliśmy DiCoExpress, który zapewnia ustandaryzowany potok języka R do przeprowadzania analizy sekwencyjnej RNA. Bez szczególnej wiedzy ze strony statystyk lub programowania w języku R, początkujący mogą przeprowadzić pełną analizę sekwencyjną RNA, od kontroli jakości po koekspresję poprzez analizę różnicową opartą na kontrastach wewnątrz uogólnionego modelu liniowego. Proponuje się analizę wzbogacenia zarówno w odniesieniu do wykazów genów o zróżnicowanej ekspresji, jak i klastrów genów o współekspresji. Ten samouczek wideo został pomyślany jako protokół krok po kroku, który ma pomóc użytkownikom w pełni wykorzystać DiCoExpress i jego potencjał w zakresie wzmacniania biologicznej interpretacji eksperymentu RNA-Seq.

Introduction

Technologia sekwencjonowania RNA nowej generacji (RNA-Seq) jest teraz złotym standardem analizy transkryptomu¹. Od początków tej technologii połączone wysiłki bioinformatyków i biostatystyków zaowocowały opracowaniem licznych metod zajmujących się wszystkimi istotnymi etapami analiz transkryptomicznych, od mapowania po kwantyfikację transkryptu². Większość narzędzi dostępnych obecnie dla biologów jest opracowywana w środowisku oprogramowania R do obliczeń statystycznych i wykresów³, a wiele pakietów do analizy danych biologicznych jest dostępnych w repozytorium Bioconductor⁴. Pakiety te oferują pełną kontrolę i dostosowywanie analizy, ale kosztem szerokiego wykorzystania interfejsu wiersza poleceń. Ponieważ wielu biologów czuje się bardziej komfortowo z podejściem "wskaż i kliknij"⁵, demokratyzacja analiz RNA-Seq wymaga opracowania bardziej przyjaznych dla użytkownika interfejsów lub protokołów⁶. Na przykład, możliwe jest budowanie interfejsów internetowych pakietów R za pomocą Shiny⁷, a analiza danych wiersza poleceń jest bardziej intuicyjna dzięki interfejsowi R-studio⁸. Opracowanie dedykowanych samouczków krok po kroku może również pomóc nowemu użytkownikowi. W szczególności samouczek wideo uzupełnia klasyczny samouczek tekstowy, prowadząc do głębszego zrozumienia wszystkich etapów procedury.

Niedawno opracowaliśmy DiCoExpress⁹, narzędzie do analizy wieloczynnikowych eksperymentów RNA-Seq w R przy użyciu metod uważanych za najlepsze oparte na neutralnych badaniach porównawczych^10,11,12. Zaczynając od tabeli zliczania, DiCoExpress proponuje etap kontroli jakości danych, po którym następuje różnicowa analiza ekspresji genów (edgeR package¹³) przy użyciu uogólnionego modelu liniowego (GLM) oraz generowanie klastrów koekspresji przy użyciu modeli mieszanin Gaussa (pakiet coseq¹²). DiCoExpress obsługuje kompletne i niezrównoważone projektowanie do 2 czynników biologicznych (tj. genotypu i leczenia) oraz jednego czynnika technicznego (tj. replikacji). Oryginalność DiCoExpress polega na architekturze katalogów przechowujących i organizujących dane, skrypty i wyniki oraz na automatyzacji zapisu kontrastów, co pozwala użytkownikowi badać wiele pytań w ramach tego samego modelu statystycznego. Dołożono również starań, aby dostarczyć graficzne wyniki ilustrujące wyniki statystyczne.

Przestrzeń robocza DiCoExpress jest dostępna pod adresem https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress. Zawiera cztery katalogi, dwa pliki pdf i dwa pliki tekstowe. Katalog Data/ zawiera wejściowe zestawy danych; W przypadku tego protokołu użyjemy zestawu danych "Tutorial". Katalog Sources/ zawiera siedem funkcji R niezbędnych do przeprowadzenia analizy i nie może być modyfikowany przez użytkownika. Analiza jest uruchamiana za pomocą skryptów przechowywanych w katalogu Template_scripts/. Ten używany w tym protokole nazywa się DiCoExpress_Tutorial_JoVE.R i można go łatwo dostosować do dowolnego projektu transkryptomicznego. Wszystkie wyniki są zapisywane w katalogu Results/ i przechowywane w podkatalogu o nazwie zgodnej z projektem. Plik README.md zawiera przydatne informacje dotyczące instalacji, a wszelkie szczegółowe informacje dotyczące metody i jej zastosowania można znaleźć w pliku DiCoExpress_Reference_Manual.pdf.

Ten film instruktażowy prowadzi użytkownika przez różne funkcje DiCoExpress, mając na celu przezwyciężenie niechęci odczuwanej przez biologów korzystających z narzędzi opartych na wierszu poleceń. Przedstawiamy tutaj analizę sztucznego zestawu danych RNA-Seq opisującego ekspresję genów w trzech replikacjach biologicznych czterech genotypów, z leczeniem lub bez. Przejdziemy teraz przez różne etapy przepływu pracy DiCoExpress zilustrowane na rysunku 1. Skrypt opisany w sekcji Protokół oraz pliki wejściowe są dostępne na stronie: https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress

Przygotuj pliki danych
Cztery pliki csv przechowywane w katalogu Data/ powinny być nazwane zgodnie z nazwą projektu. W naszym przykładzie wszystkie nazwy zaczynają się od "Samouczek", a my ustawimy Project_Name = "Samouczek" w kroku 4 protokołu. Separator używany w plikach csv musi być wskazany w zmiennej Sep w kroku 4. W naszym zbiorze danych "samouczka" separatorem jest tabela. W przypadku zaawansowanych użytkowników pełny zestaw danych można zredukować do podzbioru, udostępniając listę instrukcji i nowy Project_Name za pomocą zmiennej Filter. Ta opcja pozwala uniknąć nadmiarowych kopii plików wejściowych i weryfikuje zasady FAIR¹⁴.

Spośród czterech plików csv, tylko pliki COUNTS i TARGET są obowiązkowe. Zawierają one surowe liczby dla każdego genu (tutaj Tutorial_COUNTS.csv) oraz opis projektu eksperymentalnego (tutaj Tutorial_TARGET.csv). Plik TARGET.csv opisuje każdą próbkę (jedna próbka w rzędzie) z podaniem modalności dla każdego czynnika biologicznego lub technicznego (w kolumnach). Zdecydowanie zalecamy, aby imiona wybrane dla modalności zaczynały się od litery, a nie cyfry. Nie można zmienić nazwy ostatniej kolumny ("Replikuj"). Na koniec przykładowe nazwy (pierwsza kolumna) muszą być zgodne z nazwami w nagłówkach pliku COUNTS.csv (Genotype1_control_rep1 w naszym przykładzie). Plik Enrichment.csv, w którym każdy wiersz zawiera jeden Gene_ID i jeden termin adnotacji, jest wymagany tylko wtedy, gdy użytkownik planuje uruchomić analizę wzbogacania. Jeśli jeden gen ma kilka adnotacji, będą one musiały być zapisane w różnych liniach. Plik Annotation.csv jest opcjonalny i służy do dodawania krótkiego opisu każdego genu w plikach wyjściowych. Najlepszym sposobem na uzyskanie pliku adnotacji jest pobranie informacji z dedykowanych baz danych (np. Thalemine: https://bar.utoronto.ca/thalemine/begin.do dla Arabidopsis).

Instalacja DiCoExpress
DiCoExpress wymaga określonych pakietów języka R. Użyj wiersza poleceń source(".. /Sources/Install_Packages.R") w konsoli języka R, aby sprawdzić stan instalacji wymaganego pakietu. Dla użytkowników na Linuksie innym rozwiązaniem jest zainstalowanie kontenera dedykowanego dla DiCoExpress i dostępnego pod adresem https://forgemia.inra.fr/GNet/dicoexpress/container_registry. Z definicji ten kontener zawiera DiCoExpress ze wszystkimi potrzebnymi częściami, takimi jak biblioteki i inne zależności.

Protocol

1. DiCoExpress

1. Otwórz sesję programu R Studio i ustaw katalog na Template_scripts.
2. Otwórz skrypt DiCoExpress_Tutorial.R w programie R studio.
3. Załaduj funkcje DiCoExpress w sesji języka R za pomocą następujących poleceń:
   > źródło(".. /Źródła/Load_Functions.R")
   > Load_Functions()
   > Data_Directory = ".. /Dane"
   > Results_Directory = ".. /Wyniki/"
4. Załaduj pliki danych w sesji języka R za pomocą następujących poleceń:
   > Project_Name = "Samouczek"
   > Filtr = NULL
   > Sep="\t"
   > Data_Files = Load_Data_Files(Data_Directory, Project_Name, Filtr, wrzesień)
5. Podziel Data_Files obiektu na kilka obiektów, aby łatwo nimi manipulować:
   > Project_Name = Data_Files$Project_Name
   > Cel = Data_Files$Cel
   > Raw_Counts = Data_Files$Raw_Counts
   > Adnotacja = Data_Files$Adnotacja
   > Reference_Enrichment = Data_Files$Reference_Enrichment
6. Wybierz strategię spośród "NbConditions", "NbReplicates" lub "filterByExpr" oraz próg, aby filtrować geny o niskiej ekspresji. Tutaj wybieramy
   > Filter_Strategy = "NbReplicates"
   > CPM_Cutoff = 1
7. Określ kolory grupy za pomocą polecenia
   > Color_Group = NULL
   UWAGA: Gdy jest ustawiona na NULL, R automatycznie przypisuje kolory do warunków biologicznych. W przeciwnym razie wprowadź wektor wskazujący kolor dla każdej grupy biologicznej.
8. Wybierz metodę normalizacji spośród akceptowanych przez funkcję calcNormFactors edgeR. Na przykład
   > Normalization_Method = "TMM"
9. Przeprowadź kontrolę jakości, wykonując następującą funkcję
   > Quality_Control(Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, Element docelowy, Raw_Counts, Filter_Strategy, Color_Group, CPM_Cutoff Normalization_Method)
10. Stan Replikacja = PRAWDA, jeśli dane są sparowane zgodnie ze współczynnikiem replikacji, FAŁSZ w przeciwnym razie.
11. Przypisz interakcję = PRAWDA, aby rozważyć interakcję między dwoma czynnikami biologicznymi, FAŁSZ w przeciwnym razie.
12. Określ model statystyczny za pomocą następujących poleceń
    > Model = GLM_Contrasts(Results_Directory, Project_Name, Cel, Replikacja, Interakcja)
    > GLM_Model = Model$GLM_Model
    > Kontrasty = Model$Kontrasty
13. Zdefiniuj próg współczynnika fałszywych wykryć, tutaj 0,05
    > Alpha_DiffAnalysis =0,05
14. Wykonaj analizę różnicową za pomocą następujących poleceń
    > Index_Contrast=1:nrow(Kontrasty)
    > NbGenes_Profiles = 20
    > NbGenes_Clustering = 50
    > DiffAnalysis.edgeR (Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, Element docelowy, Raw_Counts, GLM_Model, Kontrasty, Index_Contrast, Filter_Strategy, Alpha_DiffAnalysis, NbGenes_Profiles, NbGenes_Clustering, CPM_Cutoff Normalization_Method)
15. Ustal próg dla analizy wzbogacenia, tutaj 0,01
    > Alpha_Enrichment = 0,01
16. Przeprowadzić analizę wzbogacenia list genów o zróżnicowanej ekspresji (DEG)
    > Tytuł = NULL
    > Wzbogacenie(Results_Directory, Project_Name, Tytuł, Reference_Enrichment, Alpha_Enrichment)
17. Wybierz listy DEG do porównania. Na przykład,
    > Grupy = Kontrasty$Kontrasty[24:28]
18. Podaj nazwę porównania list. Ta nazwa jest używana dla katalogu, w którym zostaną zapisane pliki wyjściowe
    > Tytuł = "Interaction_with_Genotypes_1_and_2"
19. Określ akcję, która ma zostać wykonana na listach DEG, ustawiając parametr Operation na union lub intercin. Wybieramy
    > Operation = "Unia"
20. Porównaj listy stopni Celsjusza
    > Venn_IntersectUnion(Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, Tytuł, Grupy, Operacja)
21. Wykonaj analizę współwyrażeń za pomocą funkcji
    > Coexpression_coseq(Data_Directory, Results_Directory, Project_Name, tytuł, element docelowy, Raw_Counts, Color_Group)
22. Wykonaj analizę wzbogacania klastrów koekspresji
    > Wzbogacenie(Results_Directory, Project_Name, Tytuł, Reference_Enrichment, Alpha_Enrichment)
23. Wygeneruj dwa pliki dziennika zawierające wszystkie informacje niezbędne do odtworzenia analizy
    > Save_Parameters( )
    UWAGA: Wiersze poleceń używane w tym protokole są pokazane w Rysunek 2. Wiersze, które muszą zostać zmodyfikowane w celu przeanalizowania innego zestawu danych, są wyróżnione.

Results

Wszystkie wyjścia DiCoExpress są zapisywane w katalogu Tutorial/, który sam jest umieszczony w katalogu Wyniki/. W tym miejscu podajemy kilka wskazówek dotyczących oceny ogólnej jakości analizy.

Kontrola jakości
Dane wyjściowe kontroli jakości, znajdujące się w katalogu Quality_Control/, są niezbędne do sprawdzenia, czy wyniki analizy RNA-Seq są wiarygodne. Plik Data_Quality_Control.pdf zawiera kilka wykresów uzyskanych z nieprzetworzonymi i znormalizowanymi danymi, któryc...

Discussion

Ponieważ sekwencjonowanie RNA stało się wszechobecną metodą w badaniach biologicznych, istnieje ciągła potrzeba opracowywania wszechstronnych i przyjaznych dla użytkownika narzędzi analitycznych. Krytycznym krokiem w większości procesów analitycznych jest często pewna identyfikacja genów ulegających zróżnicowanej ekspresji w różnych warunkach biologicznych i/lub leczeniu¹⁵. Uzyskanie wiarygodnych wyników wymaga odpowiedniego modelowania statystycznego, co było motywacją do opracowania DiCoExpress....