Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie elektroporacji poporodowej in vivo do badania morfologii neuronów ziarnistych móżdżku i rozwoju synaps

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62568

⸱

9 czerwca 2021

 ,  , 
1Department of Neurobiology, Duke University Medical Center

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji synaptogenezy ziarnistych neuronów w móżdżku myszy w trakcie poporodowego rozwoju mózgu, kiedy te komórki udoskonalają swoje struktury synaptyczne i tworzą synapsy, aby zintegrować się z ogólnym obwodem mózgu.

Streszczenie

Neurony przechodzą dynamiczne zmiany w swojej strukturze i funkcji podczas rozwoju mózgu, aby utworzyć odpowiednie połączenia z innymi komórkami. Móżdżek gryzonia jest idealnym systemem do śledzenia rozwoju i morfogenezy pojedynczego typu komórek, neuronu ziarnistego móżdżku (CGN), w czasie. W tym przypadku elektroporację in vivo komórek progenitorowych neuronów ziarnistych w rozwijającym się móżdżku myszy wykorzystano do rzadkiego znakowania komórek do późniejszych analiz morfologicznych. Skuteczność tej techniki przejawia się w jej zdolności do prezentowania kluczowych etapów rozwoju dojrzewania CGN, ze szczególnym naciskiem na tworzenie pazurów dendrytycznych, które są wyspecjalizowanymi strukturami, w których komórki te otrzymują większość swoich danych synaptycznych. Oprócz dostarczania migawek struktur synaptycznych CGN podczas rozwoju móżdżku, technika ta może być dostosowana do genetycznego manipulowania neuronami ziarnistymi w sposób autonomiczny dla komórki w celu zbadania roli dowolnego genu zainteresowania i jego wpływu na morfologię CGN, rozwój pazurów i synaptogenezę.

Wprowadzenie

Rozwój mózgu to długotrwały proces, który rozciąga się od embriogenezy do życia pourodzeniowego. W tym czasie mózg integruje kombinację wewnętrznych i zewnętrznych bodźców, które rzeźbią okablowanie synaps między dendrytami i aksonami, aby ostatecznie kierować zachowaniem. Móżdżek gryzonia jest idealnym systemem modelowym do badania, jak rozwijają się synapsy, ponieważ rozwój pojedynczego typu neuronu, neuronu ziarnistego móżdżku (CGN), można śledzić podczas jego przejścia z komórki progenitorowej do dojrzałego neuronu. Wynika to po części z faktu, że większość kory móżdżku rozwija się po urodzeniu, co pozwala na łatwą manipulację genetyczną i znakowanie komórek po urodzeniu1.

U ssaków różnicowanie CGN rozpoczyna się pod koniec rozwoju embrionalnego, gdy podzbiór komórek proliferacyjnych w tyłomózgowiu migruje przez rombową wargę, tworząc drugorzędną strefę zarodkową na powierzchni móżdżku2,3,4. Chociaż są w pełni zaangażowane w tożsamość progenitora neuronu ziarnistego (GNP), komórki te nadal proliferują w zewnętrznej części zewnętrznej warstwy ziarnistej (EGL) aż do 14 dnia po urodzeniu (P14). Proliferacja tej warstwy powoduje masową ekspansję móżdżku, ponieważ komórki te dają początek wyłącznie CGNs5. Gdy nowonarodzone CGN opuszczą cykl komórkowy w EGL, migrują do wewnątrz w kierunku wewnętrznej warstwy ziarnistości (IGL), pozostawiając akson, który rozwidla się i przemieszcza w warstwie molekularnej móżdżku, tworząc równoległe włókna, które synapsują się na komórkach Purkinjego6. Położenie tych włókien w warstwie molekularnej zależy od czasu wyjścia z cyklu komórkowego.

CGN, które najpierw się różnicują, opuszczają swoje równoległe włókna w kierunku dolnej warstwy molekularnej, podczas gdy aksony CGN, które różnicują się później, są zgrupowane na górze7,8. Gdy ciała komórkowe CGN dotrą do IGL, zaczynają opracowywać dendryty i tworzyć synapsy z pobliskimi neuronami hamującymi i pobudzającymi. Dojrzałe drzewo dendrytyczne CGN wykazuje stereotypową architekturę z czterema głównymi procesami. W trakcie dojrzewania CGN struktury na końcu tych dendrytów tworzą pazur, który wzbogaca się o białka postsynaptyczne9,10. Te wyspecjalizowane struktury, zwane pazurami dendrytycznymi, zawierają większość synaps na neuronach ziarnistych i są ważne dla odbierania zarówno bodźców pobudzających z unerwienia włókien mszystych pochodzących z mostu, jak i hamujących wejść z lokalnych komórek Golgiego. Po pełnej konfiguracji połączenia synaptyczne CGN pozwalają tym komórkom przekazywać dane wejściowe z jąder przedmóżdżkowych do komórek Purkinjego, które wystają z kory móżdżku do głębokich jąder móżdżku.

In vivo poporodowa elektroporacja GNP jest korzystniejsza niż inne metody oparte na znakowaniu, takie jak infekcja wirusowa i generowanie transgenicznych linii myszy, ponieważ ekspresja pożądanych konstruktów może być osiągnięta na szybkiej osi czasu, a metoda jest ukierunkowana na małą populację komórek, co jest przydatne w badaniu efektów autonomicznych komórek. Metoda ta była stosowana we wcześniejszych badaniach do badania rozwoju morfologicznego CGN; Jednak badania te koncentrowały się albo na pojedynczym punkcie czasowym, albo na krótkim oknie czasowym9,10,11,12,13. Ta metoda znakowania została połączona z analizą obrazu w celu udokumentowania zmian w morfologii CGN, które zachodzą w całym przebiegu różnicowania CGN w ciągu pierwszych trzech tygodni życia pourodzeniowego. Dane te ujawniają dynamikę rozwoju dendrytów CGN, które leżą u podstaw budowy obwodów móżdżku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Duke.

1. Przygotowanie DNA do elektroporacji in vivo lub IVE (1 dzień przed operacją)

  1. Przygotować następujące materiały: oczyszczone DNA (0,5-25 µg na zwierzę), 3 M octan sodu, etanol, barwnik Fast Green, ultrazczystą wodę destylowaną, roztwór buforu fosforanowego (PBS) (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Jako DNA wykorzystano konstrukt wykazujący ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą ludzkiego promotora ubikwiny, pozyskany z Addgene (FUGW, https://www.addgene.org/14883/). Każdy konstrukt wykazujący ekspresję GFP lub innego białka fluorescencyjnego pod kontrolą promotora powszechnego powinien być odpowiedni. Specyficzne znakowanie CGN tą techniką nie zależy od konstruktu, lecz od procesu elektroporacji.
  2. Przygotować DNA do elektroporacji, mieszając pożądaną ilość DNA z 10% objętościowo 3 M octanu sodu oraz 250% objętościowo 100% lodowatego etanolu. Należy zauważyć, że DNA wytrąci się z roztworu natychmiast.
  3. Kontynuować wytrącanie mieszaniny DNA przez noc w temperaturze -20 °C lub przez godzinę w -80 °C.
  4. Odwirować wytrącone DNA w wirówce laboratoryjnej przy prędkości >16 000 × g i przemyć dwukrotnie 70% etanolem.
  5. Pozostawić osad DNA do całkowitego wyschnięcia, a następnie rozpuścić go w roztworze 1x PBS + 0,02% Fast Green.

Konfiguracja strzykawki do precyzyjnego pomiaru cieczy, wraz ze schematem dystansora igłowego dla dokładnego dozowania.
Rycina 1: Ograniczenie głębokości iniekcji do 1.5 mm przy użyciu dystansora. (A) Za pomocą żyletki odcinany jest segment o długości 11.2 mm z pipety do napełniania. (B) Dystansor jest dopasowany do końcówki strzykawki Hamilton (całkowita długość wynosi 1.27 cm lub 0.5 in) i zabezpieczony klejem lub parafilmem. Odsłonięta końcówka powinna mieć długość 1.5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Elektroporacja in vivo progenitorów neuronów ziarnistych u siedmiodniowych myszy po urodzeniu

UWAGA: Wszystkie zabiegi elektroporacji przeprowadzono w sterylnej i bardzo dobrze wentylowanej sali operacyjnej, a cały personel stosował pełne środki ochrony osobistej, w tym rękawiczki, maski ochronne, czepki, fartuchy i ochraniacze na obuwie. Alternatywnie zabiegi można przeprowadzić w wentylowanej i sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Przygotować następujące materiały: DNA do elektroporacji, małe nożyczki chirurgiczne, małą pęsetę chirurgiczną, zmodyfikowaną strzykawkę Hamiltona, aplikator z bawełnianym końcem, matę grzewczą, betadynę, 70% etanol, 1x PBS, parafilm, klej tkankowy (cyanoakrylan n-butylu), izofluran, elektroporator oraz elektrody typu pęsetowego (patrz Tabela Materiałów).
  2. Wyciąć z wysterylizowanej końcówki do nakładania próbki ogranicznik, który pasuje do strzykawki Hamiltona, aby ograniczyć głębokość wstrzyknięcia do 1,5 mm (Rysunek 1A,B). Mocować ogranicznik za pomocą kleju lub parafilmu.
  3. Zznieczulić szczurzę P7 w komorze z izofluranem przy szybkości podawania 0,8 L/min. Potwierdzić pełną narkozę, monitorując zwierzę pod kątem zmniejszenia częstotliwości oddychania oraz braku reakcji na uszczypnięcie palca stopy lub ogona (Rysunek 2A).
  4. Po pełnym znieczuleniu zwierzęcia umieścić szczurzę na podstawce z zamontowanym stożkiem nosowym, podając stałe 4% izofluranu przy szybkości 0,8 L/min. Oczyścić górną część głowy szczurzęcia 3 razy sterylnym tamponem z betadyną, a następnie 70% etanolem, naprzemiennie, aby przygotować miejsce zabiegu. Pozostawić roztwór do wyschnięcia przed kontynuacją.
  5. Używając pary wysterylizowanych nożyczek, wykonać jedno małe nacięcie obejmujące odległość od szczytu do podstawy uszu, aby odsłonić tylny mózgowie (Rysunek 2B).
  6. Zlokalizować móżdżek (Rysunek 2C), wprowadzić odsłoniętą końcówkę strzykawki Hamiltona przez czaszkę, prostopadle do mózgu, i wstrzyknąć 1,5 µL mieszaniny DNA do miąższu móżdżku, powoli naciskając tłok strzykawki. Po podaniu mieszaniny DNA powoli wycofać igłę, aby zapobiec cofaniu się płynu, i pozwolić roztworowi DNA dyfundować przez 30 s.
  7. Wyłączyć izofluran i umieścić szczurzę na macie grzewczej o temperaturze 37 °C. Przygotować elektrodę typu pęsetowego do elektroporacji, zanurzając oba końce w sterylnym 1x PBS.
    UWAGA: Zwilżenie elektrody typu pęsetowego zapobiegnie oparzeniom kontaktowym skóry szczurzęcia podczas podawania impulsów elektrycznych.
  8. Ustawić elektrodę-pęsetę nad miejscem wstrzyknięcia, tak aby biegun dodatni był skierowany w dół, a biegun ujemny znajdował się nad głową zwierzęcia (Rysunek 2D). Podać pięć impulsów elektrycznych z elektroporatora z następującymi ustawieniami: 50 ms, 130 V oraz 950 ms odstępu między impulsami.
    UWAGA: W razie potrzeby wykonać wstrzyknięcie próbne, aby upewnić się, że miejsce wstrzyknięcia znajduje się w obrębie robaka móżdżku (Rysunek 2E).
  9. Zcisnąć nacięcie i zamknąć ranę nietoksycznym klejem tkankowym cynoakrylanem n-butylu. Oczyścić ranę 70% etanolem, ponieważ nawet śladowe ilości krwi zwiększają prawdopodobieństwo infantycydy i kanibalizmu ze strony rodziców.
  10. Pozostawić zwierzę do wybudzenia na macie grzewczej o temperaturze 37 °C przed oddaniem szczurzęcia do matki. Monitorować szczurzęta co 30 min przez co najmniej 2 h po zabiegu, aby zapewnić pełny powrót do sprawności.
    UWAGA: Infantycyd ze strony jednego z rodziców jest dość powszechny. Aby zapobiec kanibalizmowi, umieścić samca w osobnej klatce przed rozpoczęciem elektroporacji i zawsze oddawać oczyszczone i wybudzone szczurzęta (t.j. bez plam krwi, w pełni mobilne) do oryginalnej klatki na oryginalną ściółkę. Szczurzęta można również przetrzeć odchodami z oryginalnej klatki, aby zminimalizować zapach krwi. Użycie matki zastępczej może być konieczne, jeśli oryginalna matka nadal kanibalizuje swoje młode.

Chirurgiczne przygotowanie myszy do znieczulenia i nacięcia z umieszczeniem elektrod, badanie lokalizacji barwnika.
Rysunek 2: In vivo elektroporacja móżdżku progenitorów neuronów ziarnistych u myszy typu dzikiego w 7. dobie po urodzeniu (P7). (ASzczenięta poddaje się znieczuleniu przy użyciu 4% izofluranu podawanego z przepływem 0,8 l/min, aby zapewnić stan znieczulenia przez cały czas trwania iniekcji roztworu DNA. Izofluran jest podawany z przepływem 0,8 l/min.BPo trzykrotnej sterylizacji myszy betadyną i 70% etanolem wykonuje się nacięcie obejmujące odległość między uszami, odsłaniając rombencephalon.C) Powiększony obraz białego oznaczenia na czaszce, stanowiącego punkt orientacyjny dla miejsca iniekcji. Konstrukt DNA należy wstrzyknąć w odległości do 1 mm powyżej oznaczenia; linie przerywane obrysowują obszar oznaczenia, a czarna strzałka wskazuje miejsce iniekcji. Grzbiety robaka móżdżku mogą być widoczne i mogą pomóc w zlokalizowaniu miejsca iniekcji. (D) Orientacja elektrod typu pęsetowego dla wydajnej elektroporacji. Biegun dodatni (+) musi być skierowany w dół, aby wciągnąć ujemnie naładowane DNA do miąższu móżdżku przed podaniem impulsów elektrycznych. (E) Wstrzyknięcie próbne 1 µL barwnika Fast Green o stężeniu 0,02% wykazuje, że iniekcja została zlokalizowana w środkowej części robaka móżdżku pomiędzy opuszkami 5 a 7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

3. Immunohistochemia elektroporowanych CGN

  1. Przygotować następujące materiały: izofluran, 1x PBS, 4% paraformaldehyd (PFA), 30% sacharoza, normalne surowica kozia, detergent niejonowy, szkiełka przedmiotowe, szkiełka nakrywkowe, lakier do paznokci, medium montażowe, barwnik jądrowy Hoechst oraz odpowiednie przeciwciała pierwotne i wtórne (patrz Tabela materiałów).
  2. Zanurzyć zwierzę doświadczalne w narkozie z użyciem izofluranu i potwierdzić pełną anestezję poprzez uciśnięcie palca u nogi oraz ogona.
  3. Przeprowadzić perfuzję transkardialną, powoli wstrzykując 1x PBS oraz 4% PFA do lewej komory serca zwierzęcia. Umożliwić odpływ krwi poprzez przecięcie żyły głównej.
  4. Utrawić mózg przez nocne zanurzenie w 4% PFA w temperaturze 4 °C. Następnego dnia szybko wypłukać mózg w 1x PBS i przenieść go do 30% sacharozy w 1x PBS w celu krioprotekcji na co najmniej 24 h.
  5. W razie potrzeby przekroić mózg na pół wzdłuż osi rostralno-kaudalnej i potwierdzić ekspresję przetransfekowanej konstrukcji reporterowej za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu sekcyjnego z obiektywem pionowym.
    UWAGA: Mózg należy trzymać zanurzony w 1x PBS w małej szalce, aby zapobiec jego wysychaniu.
  6. Zamocować mózg w mikrotomie kriostacie, wykonać sagittalne skrawki o grubości 25 µm i pozwolić im się rozprostować w mieszaninie 1x PBS i glicerolu w stosunku 1:1.
    UWAGA: Skrawki można przechowywać w tym roztworze krioprotekcyjnym w temperaturze -20 °C do długoterminowego przechowywania.
  7. Przemyć skrawki trzykrotnie w 1x PBS przez 10 min każdy w celu usunięcia krioprotektanta, a następnie zablokować tkankę w 1x PBS + 10% normalnej surowicy koziej + 0,2% detergentu niejonowego na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 1 h.
  8. Przygotować roztwór przeciwciał pierwotnych: 1x PBS, 10% normalna surowica kozia, 0,2% detergent niejonowy oraz przeciwciało anty-GFP, a następnie odwirować roztwór przez 5 min przy >16 000 × g. Inkubować skrawki w roztworze przeciwciał w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej przez 48 h.
  9. Wypłukać roztwór przeciwciał pierwotnych pięciokrotnie przez 15 min za pomocą 1x PBS + 0,2% detergentu niejonowego.
  10. Przygotować roztwór przeciwciał wtórnych: 1x PBS, 10% normalna surowica kozia, 0,2% detergent niejonowy oraz odpowiednie przeciwciało wtórne do detekcji GFP; odwirować roztwór przy >16 000 × g. Inkubować skrawki w roztworze przeciwciał na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 2-3 h. Chronić skrawki przed ekspozycją na światło, aby zapobiec blaknięciu fluorescencji.
  11. Wypłukać roztwór przeciwciał wtórnych trzykrotnie za pomocą 1x PBS + 0,2% detergentu niejonowego przez 15 min za każdym razem. Inkubować skrawki w 1x PBS + Hoechst przez 5 min w celu zabarwienia jąder komórkowych.
  12. Wypłukać roztwór Hoechst za pomocą 1x PBS + 0,2% detergentu niejonowego i zamontować na szkiełkach przedmiotowych. Przykryć skrawki medium montażowym, nałożyć szkiełka nakrywkowe i uszczelnić lakierem do paznokci, aby zapobiec parowaniu.

4. Analizy morfologiczne CGN – rekonstrukcja trójwymiarowa (3D) oraz powierzchnia i objętość komórkowa

  1. Wykonaj obrazowanie pojedynczych elektroporowanych komórek ziarnistych móżdżku (CGN) przy użyciu mikroskopu konfokalnego z obiektywem 63x i 2-krotnym powiększeniem, wykonując obrazy z serii z-stack z interwałem 0,5 µm między warstwami. Obrazuj jedną komórkę w jednym oknie obrazu, aby umożliwić łatwą analizę i rekonstrukcję obrazu.
  2. Zainstaluj wtyczkę Simple Neurite Tracer dla FIJI, korzystając z poniższego łącza (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions), aby w łatwy i wydajny sposób śledzić strukturę elektroporowanych CGN w przestrzeni trójwymiarowej (3D).
    UWAGA: Dostępna jest zaktualizowana wersja wtyczki (https://imagej.net/SNT).
  3. Przeprowadź ślepą analizę długości neurytów i tworzenia pazurków dendrytycznych za pomocą Simple Neurite Tracer. Wgraj jednokanałowe obrazy z serii z-stack elektroporowanych CGN do FIJI i kliknij Plugins | Segmentation | Simple Neurite Tracer (Rysunek 3D).
  4. Otwórz menu rozwijane i wybierz Create New 3D Viewer (Rysunek 3D).
  5. Przewiń do podstawy dendrytu, w miejscu jego połączenia z somą komórki, i rozpocznij wyznaczanie ścieżki, klikając w punkcie połączenia. Ręcznie śledź ścieżkę, klikając w sekcjach, w których sygnał wypełnienia komórki jest najsilniejszy, naciskając klawisz [y], aby utrzymać ślad. Śledź aż do końca dendrytu, jeśli nie posiada on pazurka, lub do podstawy pazurka i zatwierdź ścieżkę, naciskając klawisz [f] (Rysunek 4D).
  6. Następnie wyznacz ścieżkę pazurka, rozpoczynając od podstawy struktury i śledząc aż do końca najdłuższego neurytu. Śledź gałęzie drugorzędowe i trzeciorzędowe, przytrzymując klawisz [ctrl] w systemie Windows lub [alt] w systemie Mac OS i klikając ścieżkę. Zatwierdź ścieżkę, naciskając klawisz [f].
  7. Zauważ, że pomiary dla wyznaczonych ścieżek są widoczne w osobnym oknie; zsumuj wszystkie pomiary gałęzi pazurka (pierwotnych, wtórnych, trzeciorzędnych), aby uzyskać całkowitą długość każdego pazurka.
  8. Do analizy powierzchni i objętości komórkowej elektroporowanych CGN pobierz oprogramowanie do analizy komórkowej Imaris (https://imaris.oxinst.com/).
    UWAGA: Do rekonstrukcji komórek w 3D z obrazów z-stack w programie FIJI można również użyć dostępnych i bezpłatnych wtyczek. Dodatkowo w Simple Neurite Tracer istnieje funkcja renderowania wolumetrycznego, jednak z poniższych powodów zastosowano program Imaris.
  9. Wgraj obraz z serii z-stack elektroporowanego CGN do programu Imaris. Przejdź do zestawu narzędzi rekonstrukcji 3D, naciskając Surpass.
  10. Aby zrekonstruować CGN, naciśnij Surfaces i wybierz obszar zainteresowania, który obejmuje całą komórkę w oknie obrazu. Po zakończeniu naciśnij niebieską strzałkę w prawym dolnym rogu pod napisem Create.
  11. Jeśli obraz zawiera wiele kanałów dla różnych sygnałów, wybierz kanał zawierający elektroporowany CGN i naciśnij niebieską strzałkę.
  12. Za pomocą suwaka ustaw pożądany próg, który najdokładniej odpowiada sygnałowi elektroporowanej komórki. Powiększ obraz w pobliżu powierzchni komórki, aby dokładnie określić próg. Po zakończeniu naciśnij podwójną zieloną strzałkę, aby zrekonstruować komórkę i uzyskać wartość powierzchni oraz objętości z metadanych.

Proces obrazowania neuronów z wykorzystaniem elektroporacji i mikroskopii konfokalnej; przekrój B pokazuje warstwy komórkowe, GFP.
Rysunek 3: Analiza immunohistochemiczna i rekonstrukcja trójwymiarowa elektroporowanych neuronów ziarnistych. Myszy CD-1 w 7. dniu życia (P7) poddano elektroporacji konstruktem wykazującym ekspresję GFP. Pobrano mózgi, które poddano immunohistochemii, mikroskopii konfokalnej i rekonstrukcji 3D w celu analizy morfologicznej. (A) Harmonogram od elektroporacji do przetwarzania obrazu myszy w 10. dniu po wstrzyknięciu (10-DPI). (B) Obraz z maksymalnej projekcji strzałkowego przekroju elektroporowanego móżdżku 10-DPI; białe linie wyznaczają warstwy móżdżku, pasek skali wynosi 25 µm. (C) Obraz z maksymalnej projekcji pojedynczego elektroporowanego neuronu ziarnistego 10-DPI oraz odpowiadający mu ślad 3D, pasek skali wynosi 10 µm. (D) Rekonstrukcje 3D zostały wygenerowane przy użyciu wtyczki Simple Neurite Tracer w programie FIJI. Wszystkie pomiary zostały odrysowane w stosie z-stack, śledząc sygnał wypełnienia komórki. Pomiary trzonu i zakończeń (claw) były odrysowywane oddzielnie dla każdego dendrytu; kropkowana linia oznacza fragment dendrytu znajdujący się w aktualnej płaszczyźnie. Skróty: 3D = trójwymiarowy; GFP = zielone białko fluorescencyjne; DPI = dni po wstrzyknięciu; PSD-95 = białko gęstości postsynaptycznej 95; GNPs = progenitorzy neuronów ziarnistych; PFA = paraformaldehyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oś czasu rozwoju neuronalnego, wskaźniki dendrytów i wykresy wzrostu pazurków; mikroskopia i analiza danych.
Rycina 4: Analiza morfologii neuronów ziarnistych podczas rozwoju móżdżku. (A) Obrazy projekcji maksymalnej elektroporowanych CGN od 3-DPI do 14-DPI (wiek postnatalny P10 do P21), jądra (niebieski) i GFP (zielony); groty s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Neurony ziarniste móżdżku są najliczniejszymi neuronami w mózgu ssaków, stanowiąc prawie 60-70% całkowitej populacji neuronów w mózgu gryzoni 1,14. Móżdżek był szeroko wykorzystywany do wyjaśniania mechanizmów proliferacji komórek, migracji, tworzenia dendrytów i rozwoju synaps 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca była wspierana przez granty NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) oraz Duke University's Summer Neuroscience Program (D.G.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BetadinePurdue Produkcja67618-150-17
Cementowany 10 i mikro; Igła LHamilton1701SN (80008)33 gauge, 1,27 cm (0,5 cala), 4-punktowy styl
Kurczak anty-GFPMillipore SigmaAB16901Nasze laboratorium używa tego przeciwciała w stężeniu 1:1000
bawełnianą końcówką
Osioł anty-kurczak Cy2Jackson ImmunoResearch703-225-155Nasze laboratorium używa tego przeciwciała w stężeniu 1:500
Etanol (200 dowód)KoptecV1016
Elektroporator ECM 830BTX Aparat Harvard45-0052
Fast Green FCFSigmaF7252-5G
FUGW plazmidAddgene14883
Szkiełkaszklane VWR48311-703Superfrost plus
GlycerolSigma-AldrichG5516
Poduszka grzewczaSoftheat
Hoescht 33342 barwnik fluorescencyjnyInvitrogen62249
ImarisBitplane
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
Szkło z mikro pokrywąVWR48382-138
Lakier do paznokciSally HansenColor 109
Normalna koza surowicaGibco16210064
Związek do zatapiania O.C.T.Tissue-Tek4583
Luneta sekcyjna Olympus MVX10KońcówkaMVX10
P200Fisherbrand02-707-138Używany do dystansu igły
ParafilmBemisPM-996
PBS pH 7,4 (10x)Gibco70011-044
Prosty Neurite TracerFIJIhttps://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_
Instrukcje
SacharozaSigmaS0389
Narzędzia chirurgiczneRWD Life ScienceMałe nożyczki i pęsety
Triton X-100Roche11332481001niejonowy detergent
PęsetyBTX Aparat Harvard45-04895 mm, platynowane elektrody typu pęseta
Ultraczysta woda destylowanaInvitrogen10977-015
Nośnik montażowy VectashieldVectashieldH1000
Klej tkankowy Vetbond3M1469SB
Zeiss 780 Pionowy konfokalnyZeiss780
Aplikator z do pipet Olympus

Bibliografia

  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
  2. Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484(2018).
  3. Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
  4. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).
  5. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).
  6. Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).
  7. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).
  8. Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum. Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).
  9. Shalizi, A., et al. PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis. Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).
  10. Shalizi, A., et al. A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation. Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).
  11. Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).
  12. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070(2014).
  13. Yang, Y., et al. Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding. Science. 353 (6296), 300-305 (2016).
  14. Herculano-Houzel, S. Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12(2010).
  15. Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration. Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).
  16. Kokubo, M., et al. BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV. Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).
  17. Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning. Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).
  18. Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 15 (7), Pt 1 4970-4981 (1995).
  19. Zhou, P., et al. Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors. Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).
  20. Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo. Scientific Reports. 8 (1), 17561(2018).
  21. Ito, M. Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning. Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, Suppl 3 70-74 (1993).
  22. Jorntell, H., Hansel, C. Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).
  23. Nakanishi, S. Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum. Neuroscience. 162 (3), 723-731 (2009).
  24. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development
Posted by JoVE Editors on 4/06/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development. A figure was updated.

Figure 2 was updated from:

Surgical technique for dye injection in animal model with anesthesia setup and electrode placement.
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse surgery procedure, anesthesia, incision, electrode application steps, dye localization, experiment.
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.

Tagi

Elektroporacja in vivoneurony ziarniste m d kuformowanie si wypustek dendrytycznychmikroskopia konfokalnaledzenie neuryt wanaliza morfologicznamanipulacja genetycznaefekty autonomiczne kom rkowom d ek gryzoni

Powiązane artykuły