Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie elektroporacji poporodowej in vivo do badania morfologii neuronów ziarnistych móżdżku i rozwoju synaps

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62568

⸱

9 czerwca 2021

 ,  , 
1Department of Neurobiology, Duke University Medical Center

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji synaptogenezy ziarnistych neuronów w móżdżku myszy w trakcie poporodowego rozwoju mózgu, kiedy te komórki udoskonalają swoje struktury synaptyczne i tworzą synapsy, aby zintegrować się z ogólnym obwodem mózgu.

Streszczenie

Neurony przechodzą dynamiczne zmiany w swojej strukturze i funkcji podczas rozwoju mózgu, aby utworzyć odpowiednie połączenia z innymi komórkami. Móżdżek gryzonia jest idealnym systemem do śledzenia rozwoju i morfogenezy pojedynczego typu komórek, neuronu ziarnistego móżdżku (CGN), w czasie. W tym przypadku elektroporację in vivo komórek progenitorowych neuronów ziarnistych w rozwijającym się móżdżku myszy wykorzystano do rzadkiego znakowania komórek do późniejszych analiz morfologicznych. Skuteczność tej techniki przejawia się w jej zdolności do prezentowania kluczowych etapów rozwoju dojrzewania CGN, ze szczególnym naciskiem na tworzenie pazurów dendrytycznych, które są wyspecjalizowanymi strukturami, w których komórki te otrzymują większość swoich danych synaptycznych. Oprócz dostarczania migawek struktur synaptycznych CGN podczas rozwoju móżdżku, technika ta może być dostosowana do genetycznego manipulowania neuronami ziarnistymi w sposób autonomiczny dla komórki w celu zbadania roli dowolnego genu zainteresowania i jego wpływu na morfologię CGN, rozwój pazurów i synaptogenezę.

Wprowadzenie

Rozwój mózgu to długotrwały proces, który rozciąga się od embriogenezy do życia pourodzeniowego. W tym czasie mózg integruje kombinację wewnętrznych i zewnętrznych bodźców, które rzeźbią okablowanie synaps między dendrytami i aksonami, aby ostatecznie kierować zachowaniem. Móżdżek gryzonia jest idealnym systemem modelowym do badania, jak rozwijają się synapsy, ponieważ rozwój pojedynczego typu neuronu, neuronu ziarnistego móżdżku (CGN), można śledzić podczas jego przejścia z komórki progenitorowej do dojrzałego neuronu. Wynika to po części z faktu, że większość kory móżdżku rozwija się po urodzeniu, co pozwala na łatwą manipulację genetyczną i znakowanie komórek po urodzeniu1.

U ssaków różnicowanie CGN rozpoczyna się pod koniec rozwoju embrionalnego, gdy podzbiór komórek proliferacyjnych w tyłomózgowiu migruje przez rombową wargę, tworząc drugorzędną strefę zarodkową na powierzchni móżdżku2,3,4. Chociaż są w pełni zaangażowane w tożsamość progenitora neuronu ziarnistego (GNP), komórki te nadal proliferują w zewnętrznej części zewnętrznej warstwy ziarnistej (EGL) aż do 14 dnia po urodzeniu (P14). Proliferacja tej warstwy powoduje masową ekspansję móżdżku, ponieważ komórki te dają początek wyłącznie CGNs5. Gdy nowonarodzone CGN opuszczą cykl komórkowy w EGL, migrują do wewnątrz w kierunku wewnętrznej warstwy ziarnistości (IGL), pozostawiając akson, który rozwidla się i przemieszcza w warstwie molekularnej móżdżku, tworząc równoległe włókna, które synapsują się na komórkach Purkinjego6. Położenie tych włókien w warstwie molekularnej zależy od czasu wyjścia z cyklu komórkowego.

CGN, które najpierw się różnicują, opuszczają swoje równoległe włókna w kierunku dolnej warstwy molekularnej, podczas gdy aksony CGN, które różnicują się później, są zgrupowane na górze7,8. Gdy ciała komórkowe CGN dotrą do IGL, zaczynają opracowywać dendryty i tworzyć synapsy z pobliskimi neuronami hamującymi i pobudzającymi. Dojrzałe drzewo dendrytyczne CGN wykazuje stereotypową architekturę z czterema głównymi procesami. W trakcie dojrzewania CGN struktury na końcu tych dendrytów tworzą pazur, który wzbogaca się o białka postsynaptyczne9,10. Te wyspecjalizowane struktury, zwane pazurami dendrytycznymi, zawierają większość synaps na neuronach ziarnistych i są ważne dla odbierania zarówno bodźców pobudzających z unerwienia włókien mszystych pochodzących z mostu, jak i hamujących wejść z lokalnych komórek Golgiego. Po pełnej konfiguracji połączenia synaptyczne CGN pozwalają tym komórkom przekazywać dane wejściowe z jąder przedmóżdżkowych do komórek Purkinjego, które wystają z kory móżdżku do głębokich jąder móżdżku.

In vivo poporodowa elektroporacja GNP jest korzystniejsza niż inne metody oparte na znakowaniu, takie jak infekcja wirusowa i generowanie transgenicznych linii myszy, ponieważ ekspresja pożądanych konstruktów może być osiągnięta na szybkiej osi czasu, a metoda jest ukierunkowana na małą populację komórek, co jest przydatne w badaniu efektów autonomicznych komórek. Metoda ta była stosowana we wcześniejszych badaniach do badania rozwoju morfologicznego CGN; Jednak badania te koncentrowały się albo na pojedynczym punkcie czasowym, albo na krótkim oknie czasowym9,10,11,12,13. Ta metoda znakowania została połączona z analizą obrazu w celu udokumentowania zmian w morfologii CGN, które zachodzą w całym przebiegu różnicowania CGN w ciągu pierwszych trzech tygodni życia pourodzeniowego. Dane te ujawniają dynamikę rozwoju dendrytów CGN, które leżą u podstaw budowy obwodów móżdżku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Przygotowanie DNA do elektroporacji in vivo lub IVE (1 dzień przed zabiegiem)

  1. Zebrać następujące materiały: oczyszczone DNA (0,5-25 μg na zwierzę), 3 M octan sodu, etanol, barwnik Fast Green, ultraczysta woda destylowana, buforowy roztwór fosforanowy (PBS) (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: W przypadku DNA uzyskano konstrukt wyrażający białko zielonej fluorescencji (GFP) pod ludzkim promotorem ubikwityny z Addgene (FUGW, https://www.addgene.org/14883/). Każdy konstrukt wyrażający GFP lub inne białko fluorescencyjne pod kontrolą wszechobecnego promotora powinien działać. Etykietowanie specyficzne dla CGN za pomocą tej techniki nie jest zależne od konstrukcji, ale raczej od elektroporacji.
  2. Przygotuj DNA do elektroporacji, mieszając żądaną ilość DNA, 10% objętościowo 3 M octanu sodu i 250% objętościowo 100% lodowatego etanolu. Należy pamiętać, że DNA natychmiast wytrąci się z roztworu.
  3. Kontynuować wytrącanie mieszaniny DNA przez noc w temperaturze -20 °C lub przez godzinę w temperaturze -80 °C.
  4. Osad wytrącił DNA w wirówce stołowej o masie >16 000 × g i dwukrotnie przemył 70% etanolem.
  5. Pozostaw osad DNA do całkowitego wyschnięcia i rozpuść go w 1x PBS + 0,02% roztworze Fast Green.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Ograniczenie głębokości wtrysku do 1,5 mm za pomocą przekładki. (A) Segment o średnicy 11,2 mm jest odcinany od pipety ładującej za pomocą żyletki. (B) Przekładka jest mocowana na końcówce strzykawki Hamilton (całkowita długość wynosi 1,27 cm lub 0,5 cala) i zabezpieczona klejem lub parafilmem. Odsłonięta końcówka powinna mieć 1,5 mm długości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Elektroporacja in vivo komórek progenitorowych neuronów ziarnistych u siedmiodniowych myszy po urodzeniu

UWAGA: Wszystkie operacje elektroporacji były wykonywane w sterylnym i wysoce wentylowanym pomieszczeniu operacyjnym, a cały personel nosił kompletny sprzęt ochrony osobistej, w tym rękawice, maskę na twarz, czepek do włosów, fartuch i ochraniacze na buty. Alternatywnie operacje mogą być wykonywane w wentylowanym i sterylnym kapturze.

  1. Zbierz następujące materiały: DNA do elektroporacji, małe nożyczki chirurgiczne, małe pęsety chirurgiczne, spersonalizowana strzykawka Hamilton, aplikator z bawełnianą końcówką, poduszka grzewcza, betadyna, 70% etanol, 1x PBS, parafilm, klej tkankowy (cyjanoakrylan estru n-butylu), izofluran, elektroporator i elektrody typu pęseta (patrz tabela materiałów).
  2. Wytnij przekładkę ze wysterylizowanej końcówki ładującej, aby pasowała do strzykawki Hamiltona, aby ograniczyć głębokość wtrysku do 1,5 mm (Rysunek 1A,B). Zabezpiecz przekładkę klejem lub parafolią.
  3. Znieczulić szczenię P7 w komorze izofluranu z szybkością podawania 0,8 l/min. Potwierdź pełne znieczulenie, monitorując zwierzę pod kątem zmniejszonego oddychania i braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi lub ogona (Rysunek 2A).
  4. Gdy zwierzę zostanie w pełni znieczulone, umieść szczenięta na cokole wyposażonym w stożek nosowy, dostarczając stałe 4% izofluranu z szybkością dostarczania 0,8 l/min. Wyczyść czubek głowy szczeniaka 3 razy sterylnym wacikiem z betadyny, a następnie 70% etanolu, na przemian, aby przygotować miejsce. Poczekaj, aż roztwór wyschnie, zanim przejdziesz dalej.
  5. Używając pary wysterylizowanych nożyczek, wykonaj małe nacięcie jednym nacięciem, które rozciąga się na odległość od góry do podstawy uszu, aby odsłonić tyłomózgowie (Ryc. 2B).
  6. Zlokalizuj móżdżek (Ryc. 2C), włóż odsłoniętą końcówkę strzykawki Hamiltona przez czaszkę, prostopadle do mózgu, i wstrzyknij 1,5 μl mieszaniny DNA do miąższu móżdżku, powoli popychając tylny tłok strzykawki. Po dostarczeniu mieszaniny DNA powoli pociągnij igłę do tyłu, aby zapobiec rozlaniu wstecznemu, i pozwól roztworowi DNA dyfundować przez 30 sekund.
  7. Wyłącz izofluran i umieść szczeniaka na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C. Przygotuj elektrodę typu pęseta do elektroporacji, zanurzając oba końce w sterylnym 1x PBS.
    UWAGA: Zwilżenie elektrody typu pęseta zapobiegnie oparzeniom kontaktowym skóry szczeniaka podczas podawania impulsów elektrycznych.
  8. Ustaw elektrodę pęsety nad miejscem wstrzyknięcia, z dodatnim końcem skierowanym w dół, a ujemnym końcem nad głową zwierzęcia (Rysunek 2D). Podaj pięć impulsów elektrycznych z elektroporatora z następującymi ustawieniami: 50 ms, 130 V i interwał międzyimpulsowy 950 ms.
    UWAGA: W razie potrzeby wykonaj próbne wstrzyknięcie, aby upewnić się, że miejsce wstrzyknięcia znajduje się na robaku móżdżku (Rysunek 2E).
  9. Ściśnij nacięcie i uszczelnij ranę nietoksycznym klejem tkankowym z cyjanoakrylanu estru n-butylu. Oczyść ranę 70% etanolem, ponieważ każda śladowa ilość krwi zwiększa prawdopodobieństwo dzieciobójstwa rodziców i kanibalizmu.
  10. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C przed powrotem szczeniąt do matki. Monitoruj szczenię (młode) co 30 minut przez co najmniej 2 godziny po zabiegu, aby zapewnić pełne wyzdrowienie.
    UWAGA: Dzieciobójstwo przez któregokolwiek z rodziców jest dość powszechne. Aby zapobiec kanibalizmowi, przed rozpoczęciem elektroporacji należy umieścić buhaja w innej klatce i zawsze zwracać oczyszczone i odzyskane młode (tj. bez plam krwi, w pełni mobilne) do oryginalnej klatki na oryginalnej pościeli. Szczenięta można również przetrzeć odchodami z oryginalnej klatki, aby zminimalizować zapach krwi. Użycie matki zastępczej może być konieczne, jeśli pierwotna matka nadal kanibalizuje swoje młode.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Elektroporacja móżdżku in vivo komórek progenitorowych neuronów ziarnistych u szczeniąt myszy typu dzikiego P7. (A) Szczenięta są znieczulane 4% izofluranem podawanym z szybkością 0,8 l / min, aby zapewnić znieczulenie przez cały czas wstrzykiwania roztworu DNA. Izofluran jest dostarczany z szybkością 0,8 l/min. (B) Po 3-krotnym wysterylizowaniu myszy betadyną i 70% etanolem, wykonuje się nacięcie, które rozciąga się na odległość uszu, odsłaniając tyłomózgowie. (C) Powiększony obraz białego rozgraniczenia na czaszce, punktu orientacyjnego dla miejsca wstrzyknięcia. Konstrukt DNA powinien być wstrzyknięty w odległości nie większej niż 1 mm powyżej znaku; Linie przerywane wyznaczają granicę, a strzałka oznacza miejsce wstrzyknięcia. Grzbiety robaka móżdżku mogą być widoczne i mogą być przydatne do znalezienia miejsca wstrzyknięcia. (D) Orientacja elektrody typu pęseta dla wydajnej elektroporacji. Koniec Plus (+) musi być skierowany w dół, aby wciągnąć ujemnie naładowane DNA do miąższu móżdżku przed podaniem impulsów elektrycznych. (E) Próbne wstrzyknięcie 1 μl 0,02% barwnika Fast Green pokazuje, że wstrzyknięcie jest zlokalizowane w środku robaka móżdżku między zrazikami 5-7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Immunohistochemia elektroporowanych CGN

  1. Zbierz następujące materiały: izofluran, 1x PBS, 4% paraformaldehydu (PFA), 30% sacharozy, normalna surowica kozia, niejonowy detergent, szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe, lakier do paznokci, podłoże montażowe, barwnik jądrowy Hoechst oraz odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe i wtórne (patrz Tabela materiałów).
  2. Znieczulić zwierzę doświadczalne izofluranem i potwierdzić pełne znieczulenie za pomocą uszczypnięcia palca u nogi i ogona.
  3. Wykonaj perfuzję przezsercową, powoli wstrzykując 1x PBS i 4% PFA do lewej komory serca zwierzęcia. Pozwól krwi spłynąć ze zwierzęcia, przecinając żyłę główną.
  4. Napraw mózg na noc, zanurzając go w 4% PFA w temperaturze 4 °C. Następnego dnia szybko przepłucz mózg 1x PBS i przenieś mózg do 30% sacharozy w 1x PBS w celu krioprotekcji przez co najmniej 24 godziny.
  5. Jeśli to konieczne, przeciąć mózg na pół wzdłuż osi rostralno-ogonowej i potwierdzić ekspresję transfekowanego konstruktu reporterowego za pomocą pionowego fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego.
    UWAGA: Trzymaj mózg zanurzony w 1x PBS w małym naczyniu, aby zapobiec jego wysuszeniu.
  6. Zamontuj mózg na mikrotomie do zamrażania, pokrój 25 μm skrawki strzałkowe i pozwól skrawkom rozwinąć się w mieszaninie 1:1 1x PBS i glicerolu.
    UWAGA: Skrawki mogą być przechowywane w tym roztworze krioprotektantu w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  7. Umyj skrawki trzy razy w 1x PBS przez 10 minut każda, aby usunąć krioprotektant, i zablokuj tkankę w 1x PBS + 10% normalnej koziej surowicy + 0,2% niejonowego detergentu na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  8. Przygotuj roztwór przeciwciała pierwotnego: 1x PBS, 10% normalna surowica kozia, 0,2% detergent niejonowy i przeciwciało anty-GFP i odwiruj roztwór przez 5 minut w temperaturze >16 000 × g. Inkubować skrawki w roztworze przeciwciała w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej przez 48 godzin.
  9. Zmyj roztwór przeciwciała pierwszorzędowego przez 15 minut pięć razy 1x PBS + 0,2% niejonowy detergent.
  10. Przygotuj roztwór przeciwciał drugorzędowych: 1x PBS, 10% normalna surowica kozia, 0,2% niejonowy detergent i odpowiednie przeciwciało drugorzędowe do wykrycia GFP; odwirować roztwór o stężeniu >16 000 × g. Inkubować skrawki w roztworze przeciwciała na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 2-3 godziny. Chroń sekcje przed światłem, aby zapobiec wybielaniu.
  11. Zmyć roztwór przeciwciał wtórnych trzykrotnie 1x PBS + 0,2% detergentem niejonowym przez 15 minut za każdym razem. Inkubować skrawki w 1x PBS + Hoechst przez 5 minut w celu wybarwienia jąder.
  12. Zmyć roztwór Hoechst 1x PBS + 0,2% niejonowym detergentem i zamontować na szkiełkach podstawowych. Przykryj sekcje środkami montażowymi, nakryj szkiełka i uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci, aby zapobiec parowaniu.

4. Analizy morfologiczne CGN - trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja oraz pole i objętość komórkowa

  1. Obrazuj pojedyncze elektroporowane CGN pod mikroskopem konfokalnym przy 63-krotnym obiektywie z 2-krotnym zoomem, wykonując obrazy stosu z prędkością 0,5 μm na stos. Obraz po jednej komórce na okno obrazu, aby umożliwić łatwą analizę i rekonstrukcję obrazu.
  2. Zainstaluj wtyczkę Simple Neurite Tracer dla FIJI, korzystając z poniższego linku (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions), aby łatwo i skutecznie śledzić strukturę elektroporowanych CGN w przestrzeni trójwymiarowej (3D).
    UWAGA: Dostępna jest zaktualizowana wersja wtyczki (https://imagej.net/SNT).
  3. Analizuj długość neurytów i tworzenie się pazurów dendrytycznych w ślepy sposób za pomocą Simple Neurite Tracer. Prześlij jednokanałowe obrazy z-stack elektroporowanych CGN-ów na FIDŻI i kliknij Wtyczki | Segmentacja | Prosty Neurite Tracer (Rysunek 3D).
  4. Przejdź do menu rozwijanego i wybierz opcję Utwórz nową przeglądarkę 3D (Rysunek 3D).
  5. Przewiń do podstawy dendrytu, gdzie łączy się z somą komórkową i rozpocznij ścieżkę, klikając skrzyżowanie. Ręcznie prześledź ścieżkę, klikając sekcje, w których sygnał wypełniania komórek jest najjaśniejszy, naciskając [y], aby zachować ślad. Śledź do końca dendrytu, jeśli nie zawiera pazura lub do podstawy pazura i potwierdź ścieżkę, naciskając [f] (Rysunek 4D).
  6. Następnie obrysuj pazur, rozpoczynając ścieżkę u podstawy struktury i śledząc aż do końca najdłuższego neurytu. Śledź gałęzie drugorzędne i trzeciorzędne, przytrzymując [ctrl] w systemie Windows lub [alt] w systemie Mac OS i klikając ścieżkę. Potwierdź ścieżkę, naciskając [f].
  7. Zauważ, że pomiary dla śladów są widoczne w osobnym oknie; zsumuj wszystkie wymiary gałęzi pazurów (pierwszorzędowych, drugorzędnych, trzeciorzędowych), aby uzyskać całkowitą długość każdego pazura.
  8. Aby przeanalizować powierzchnię i objętość komórkową elektroporowanych CGN, pobierz oprogramowanie do analizy komórek Imaris (https://imaris.oxinst.com/).
    UWAGA: FIJI może być również używany do rekonstrukcji komórek w 3D z obrazów z-stack za pomocą łatwo dostępnych i bezpłatnych wtyczek. Dodatkowo w Simple Neurite Tracer dostępna jest funkcja renderowania wolumetrycznego, ale Imaris został użyty z powodów opisanych poniżej.
  9. Prześlij obraz z-stack elektroporowanego CGN na Imaris. Uzyskaj dostęp do zestawu narzędzi do rekonstrukcji 3D, naciskając przycisk Surpass.
  10. Aby zrekonstruować CGN, naciśnij przycisk Powierzchnie i wybierz obszar zainteresowania, który obejmuje całą komórkę w oknie obrazu. Po zakończeniu naciśnij niebieską strzałkę do przodu w prawym dolnym rogu w obszarze Utwórz.
  11. Jeśli obraz zawiera wiele kanałów dla różnych sygnałów, wybierz kanał zawierający elektroporowany CGN i naciśnij niebieską strzałkę do przodu.
  12. Za pomocą suwaka ustaw żądany próg, który najdokładniej pasuje do sygnału elektroporowanego ogniwa. Powiększ bliżej powierzchni komórki, aby dokładnie określić próg. Po zakończeniu naciśnij podwójną zieloną strzałkę, aby zrekonstruować komórkę i uzyskać powierzchnię oraz rozmiar woluminu z metadanych.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Analiza immunohistochemiczna i trójwymiarowa rekonstrukcja elektroporowanych neuronów ziarnistych. Myszy P7 CD-1 poddano elektroporacji konstruktem wyrażającym GFP. Mózgi pobrano i poddano immunohistochemii, mikroskopii konfokalnej i rekonstrukcji 3D w celu analizy morfologicznej. (A) Oś czasu od elektroporacji do przetwarzania obrazu przez mysz o rozdzielczości 10 DPI. (B) Maksymalny obraz projekcyjny strzałkowego przekroju móżdżku poddanego elektroporacji 10-DPI; białe linie wyznaczają warstwy móżdżku, a skala wynosi 25 μm. (C) Maksymalny obraz projekcyjny pojedynczego elektroporowanego neuronu ziarnistego 10-DPI i odpowiadającego mu śladu 3D, pasek skali wynosi 10 μm. (D) Rekonstrukcje 3D zostały wygenerowane przy użyciu wtyczki FIJI Simple Neurite Tracer. Wszystkie pomiary były śledzone przez stos z, podążając za sygnałem wypełnienia komórki. Pomiary trzonu i pazurów były śledzone oddzielnie dla każdego dendrytu; Linia przerywana oznacza część dendrytu w bieżącej płaszczyźnie. Skróty: 3D = trójwymiarowy; GFP = białko zielonej fluorescencji; DPI = dni po wstrzyknięciu; PSD-95 = białko o gęstości postsynaptycznej 95; GNP = przodkowie neuronów ziarnistych; PFA = paraformaldehyd. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 4: Analiza morfologii neuronów ziarnistych podczas rozwoju móżdżku. (A) Maksymalne obrazy projekcyjne elektroporowanych CGN od 3 DPI do 14 DPI (wiek pourodzeniowy P10 do P21), jąder (niebieski) i GFP (zielony); Groty strzałek wskazują pojedyncze dendryty, a podziałka skali wynosi 10 μm. (B) Średnia liczba dendrytów. (C) Średnia dłu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Neurony ziarniste móżdżku są najliczniejszymi neuronami w mózgu ssaków, stanowiąc prawie 60-70% całkowitej populacji neuronów w mózgu gryzoni 1,14. Móżdżek był szeroko wykorzystywany do wyjaśniania mechanizmów proliferacji komórek, migracji, tworzenia dendrytów i rozwoju synaps 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca była wspierana przez granty NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) oraz Duke University's Summer Neuroscience Program (D.G.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BetadinePurdue Produkcja67618-150-17
Cementowany 10 i mikro; Igła LHamilton1701SN (80008)33 gauge, 1,27 cm (0,5 cala), 4-punktowy styl
Kurczak anty-GFPMillipore SigmaAB16901Nasze laboratorium używa tego przeciwciała w stężeniu 1:1000
bawełnianą końcówką
Osioł anty-kurczak Cy2Jackson ImmunoResearch703-225-155Nasze laboratorium używa tego przeciwciała w stężeniu 1:500
Etanol (200 dowód)KoptecV1016
Elektroporator ECM 830BTX Aparat Harvard45-0052
Fast Green FCFSigmaF7252-5G
FUGW plazmidAddgene14883
Szkiełkaszklane VWR48311-703Superfrost plus
GlycerolSigma-AldrichG5516
Poduszka grzewczaSoftheat
Hoescht 33342 barwnik fluorescencyjnyInvitrogen62249
ImarisBitplane
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
Szkło z mikro pokrywąVWR48382-138
Lakier do paznokciSally HansenColor 109
Normalna koza surowicaGibco16210064
Związek do zatapiania O.C.T.Tissue-Tek4583
Luneta sekcyjna Olympus MVX10KońcówkaMVX10
P200Fisherbrand02-707-138Używany do dystansu igły
ParafilmBemisPM-996
PBS pH 7,4 (10x)Gibco70011-044
Prosty Neurite TracerFIJIhttps://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_
Instrukcje
SacharozaSigmaS0389
Narzędzia chirurgiczneRWD Life ScienceMałe nożyczki i pęsety
Triton X-100Roche11332481001niejonowy detergent
PęsetyBTX Aparat Harvard45-04895 mm, platynowane elektrody typu pęseta
Ultraczysta woda destylowanaInvitrogen10977-015
Nośnik montażowy VectashieldVectashieldH1000
Klej tkankowy Vetbond3M1469SB
Zeiss 780 Pionowy konfokalnyZeiss780
Aplikator z do pipet Olympus

Bibliografia

  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
  2. Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484(2018).
  3. Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
  4. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).
  5. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).
  6. Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).
  7. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).
  8. Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum. Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).
  9. Shalizi, A., et al. PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis. Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).
  10. Shalizi, A., et al. A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation. Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).
  11. Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).
  12. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070(2014).
  13. Yang, Y., et al. Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding. Science. 353 (6296), 300-305 (2016).
  14. Herculano-Houzel, S. Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12(2010).
  15. Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration. Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).
  16. Kokubo, M., et al. BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV. Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).
  17. Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning. Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).
  18. Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 15 (7), Pt 1 4970-4981 (1995).
  19. Zhou, P., et al. Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors. Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).
  20. Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo. Scientific Reports. 8 (1), 17561(2018).
  21. Ito, M. Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning. Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, Suppl 3 70-74 (1993).
  22. Jorntell, H., Hansel, C. Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).
  23. Nakanishi, S. Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum. Neuroscience. 162 (3), 723-731 (2009).
  24. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development
Posted by JoVE Editors on 4/06/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development. A figure was updated.

Figure 2 was updated from:

Surgical technique for dye injection in animal model with anesthesia setup and electrode placement.
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse surgery procedure, anesthesia, incision, electrode application steps, dye localization, experiment.
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.

Tagi

Elektroporacja in vivoneurony ziarniste m d kuformowanie si wypustek dendrytycznychmikroskopia konfokalnaledzenie neuryt wanaliza morfologicznamanipulacja genetycznaefekty autonomiczne kom rkowom d ek gryzoni

Powiązane artykuły