Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie elektroporacji poporodowej in vivo do badania morfologii neuronów ziarnistych móżdżku i rozwoju synaps

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62568

⸱

9 czerwca 2021

 ,  , 
1Department of Neurobiology, Duke University Medical Center

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji synaptogenezy ziarnistych neuronów w móżdżku myszy w trakcie poporodowego rozwoju mózgu, kiedy te komórki udoskonalają swoje struktury synaptyczne i tworzą synapsy, aby zintegrować się z ogólnym obwodem mózgu.

Streszczenie

Neurony przechodzą dynamiczne zmiany w swojej strukturze i funkcji podczas rozwoju mózgu, aby utworzyć odpowiednie połączenia z innymi komórkami. Móżdżek gryzonia jest idealnym systemem do śledzenia rozwoju i morfogenezy pojedynczego typu komórek, neuronu ziarnistego móżdżku (CGN), w czasie. W tym przypadku elektroporację in vivo komórek progenitorowych neuronów ziarnistych w rozwijającym się móżdżku myszy wykorzystano do rzadkiego znakowania komórek do późniejszych analiz morfologicznych. Skuteczność tej techniki przejawia się w jej zdolności do prezentowania kluczowych etapów rozwoju dojrzewania CGN, ze szczególnym naciskiem na tworzenie pazurów dendrytycznych, które są wyspecjalizowanymi strukturami, w których komórki te otrzymują większość swoich danych synaptycznych. Oprócz dostarczania migawek struktur synaptycznych CGN podczas rozwoju móżdżku, technika ta może być dostosowana do genetycznego manipulowania neuronami ziarnistymi w sposób autonomiczny dla komórki w celu zbadania roli dowolnego genu zainteresowania i jego wpływu na morfologię CGN, rozwój pazurów i synaptogenezę.

Wprowadzenie

Rozwój mózgu to długotrwały proces, który rozciąga się od embriogenezy do życia pourodzeniowego. W tym czasie mózg integruje kombinację wewnętrznych i zewnętrznych bodźców, które rzeźbią okablowanie synaps między dendrytami i aksonami, aby ostatecznie kierować zachowaniem. Móżdżek gryzonia jest idealnym systemem modelowym do badania, jak rozwijają się synapsy, ponieważ rozwój pojedynczego typu neuronu, neuronu ziarnistego móżdżku (CGN), można śledzić podczas jego przejścia z komórki progenitorowej do dojrzałego neuronu. Wynika to po części z faktu, że większość kory móżdżku rozwija się po urodzeniu, co pozwala na łatwą manipulację genetyczną i znakowanie komórek po urodzeniu1.

U ssaków różnicowanie CGN rozpoczyna się pod koniec rozwoju embrionalnego, gdy podzbiór komórek proliferacyjnych w tyłomózgowiu migruje przez rombową wargę, tworząc drugorzędną strefę zarodkową na powierzchni móżdżku2,3,4. Chociaż są w pełni zaangażowane w tożsamość progenitora neuronu ziarnistego (GNP), komórki te nadal proliferują w zewnętrznej części zewnętrznej warstwy ziarnistej (EGL) aż do 14 dnia po urodzeniu (P14). Proliferacja tej warstwy powoduje masową ekspansję móżdżku, ponieważ komórki te dają początek wyłącznie CGNs5. Gdy nowonarodzone CGN opuszczą cykl komórkowy w EGL, migrują do wewnątrz w kierunku wewnętrznej warstwy ziarnistości (IGL), pozostawiając akson, który rozwidla się i przemieszcza w warstwie molekularnej móżdżku, tworząc równoległe włókna, które synapsują się na komórkach Purkinjego6. Położenie tych włókien w warstwie molekularnej zależy od czasu wyjścia z cyklu komórkowego.

CGN, które najpierw się różnicują, opuszczają swoje równoległe włókna w kierunku dolnej warstwy molekularnej, podczas gdy aksony CGN, które różnicują się później, są zgrupowane na górze7,8. Gdy ciała komórkowe CGN dotrą do IGL, zaczynają opracowywać dendryty i tworzyć synapsy z pobliskimi neuronami hamującymi i pobudzającymi. Dojrzałe drzewo dendrytyczne CGN wykazuje stereotypową architekturę z czterema głównymi procesami. W trakcie dojrzewania CGN struktury na końcu tych dendrytów tworzą pazur, który wzbogaca się o białka postsynaptyczne9,10. Te wyspecjalizowane struktury, zwane pazurami dendrytycznymi, zawierają większość synaps na neuronach ziarnistych i są ważne dla odbierania zarówno bodźców pobudzających z unerwienia włókien mszystych pochodzących z mostu, jak i hamujących wejść z lokalnych komórek Golgiego. Po pełnej konfiguracji połączenia synaptyczne CGN pozwalają tym komórkom przekazywać dane wejściowe z jąder przedmóżdżkowych do komórek Purkinjego, które wystają z kory móżdżku do głębokich jąder móżdżku.

In vivo poporodowa elektroporacja GNP jest korzystniejsza niż inne metody oparte na znakowaniu, takie jak infekcja wirusowa i generowanie transgenicznych linii myszy, ponieważ ekspresja pożądanych konstruktów może być osiągnięta na szybkiej osi czasu, a metoda jest ukierunkowana na małą populację komórek, co jest przydatne w badaniu efektów autonomicznych komórek. Metoda ta była stosowana we wcześniejszych badaniach do badania rozwoju morfologicznego CGN; Jednak badania te koncentrowały się albo na pojedynczym punkcie czasowym, albo na krótkim oknie czasowym9,10,11,12,13. Ta metoda znakowania została połączona z analizą obrazu w celu udokumentowania zmian w morfologii CGN, które zachodzą w całym przebiegu różnicowania CGN w ciągu pierwszych trzech tygodni życia pourodzeniowego. Dane te ujawniają dynamikę rozwoju dendrytów CGN, które leżą u podstaw budowy obwodów móżdżku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Duke.

1. Przygotowanie DNA do elektroporacji in vivo lub IVE (1 dzień przed zabiegiem)

  1. Przygotować następujące materiały: oczyszczone DNA (0,5-25 µg na zwierzę), 3 M octan sodu, etanol, barwnik Fast Green, ultraczystą wodę destylowaną, roztwór buforu fosforanowego (PBS) (patrz:  Tabela materiałów).
    ​UWAGA: Jako DNA wykorzystano konstrukt wykazujący ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod ludzkim promotorem ubikwityny, otrzymany z Addgene (FUGW, https://www.addgene.org/14883/). Każdy konstrukt wykazujący ekspresję GFP lub innego białka fluorescencyjnego pod kontrolą promotora ubikwitarnego powinien być skuteczny. Specyficzne znakowanie CGN za pomocą tej techniki nie zależy od konstruktu, lecz od procesu elektroporacji.
  2. Przygotować DNA do elektroporacji, mieszając odpowiednią ilość DNA z 10% objętościowo 3 M octanu sodu oraz 250% objętościowo 10% lodowatego etanolu. Należy pamiętać, że DNA wytrąci się z roztworu natychmiast.
  3. Kontynuować wytrącanie mieszaniny DNA przez noc w temperaturze -20 °C lub przez godzinę w temperaturze -80 °C.
  4. Odwirować wytrącone DNA w wirówce laboratoryjnej przy siłach >16 0 × g i dwukrotnie przemyć 70% etanolem.
  5. Pozostawić granulat DNA do całkowitego wyschnięcia, a następnie rozpuścić go w roztworze 1x PBS + 0,02% Fast Green.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Ograniczenie głębokości iniekcji do 1.5 mm przy użyciu dystansera. (A) Odcinek o długości 1.2 mm zostaje odcięty z pipety do nakładania za pomocą żyletki. (B) Dystanser zostaje założony na końcówkę strzykawki Hamiltona (całkowita długość wynosi 1.27 cm lub 0.5 in) i zabezpieczony klejem lub parafilmem. Odsłonięta końcówka powinna mieć długość 1.5 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

2. In vivo elektroporacja progenitorów neuronów ziarnistych u siedmiodniowych myszy po urodzeniu

UWAGA: Wszystkie zabiegi elektroporacji przeprowadzono w sterylnej i dobrze wentylowanej sali operacyjnej, a cały personel nosił pełny zestaw środków ochrony indywidualnej, w tym rękawiczki, maseczkę ochronną, czepkek, fartuch i ochraniacze na obuwie. Alternatywnie zabiegi można przeprowadzić w wentylowanej i sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Przygotować następujące materiały: DNA do elektroporacji, małe nożyczki chirurgiczne, małą pęsetę chirurgiczną, dostosowaną strzykawkę Hamiltona, aplikator z bawełnianą końcówką, podkładkę grzewczą, betadynę, 70% etanol, 1x PBS, parafilm, klej tkankowy (cyjnoakrylan n-butylestru), izofluran, elektroporator oraz elektrody typu pęsetka (patrz Tabela materiałów).
  2. Wyciąć z wysterylizowanej końcówki do nakładania dystans do dopasowania go do strzykawki Hamiltona w celu ograniczenia głębokości wstrzyknięcia do 1,5 mm (Rysunek 1A,B). Przymocować dystans za pomocą kleju lub parafilmu.
  3. Zznieczulić szczenię P7 w komorze z izofluranem przy przepływie 0,8 L/min. Potwierdzić pełne znieczulenie, monitorując spowolnienie oddechu oraz brak reakcji na uciśnięcie palca lub ogona (Rysunek 2A).
  4. Po pełnym znieczuleniu zwierzęcia umieścić szczenię na podstawce wyposażonej w stożek nosowy, podając stałe 4% izofluranu przy przepływie 0,8 L/min. Oczyścić czubek głowy szczenięcia 3 razy za pomocą sterylnego tamponu z betadyną, a następnie 70% etanolem, naprzemiennie, aby przygotować miejsce zabiegu. Pozostawić roztwór do wyschnięcia przed kontynuacją.
  5. Używając pary wysterylizowanych nożyczek, wykonać jedno małe nacięcie obejmujące odległość od czubka do podstawy uszu, aby odsłonić tyłomózg (Rysunek 2B).
  6. Zlokalizować móżdżek (Rysunek 2C), wprowadzić odsłoniętą końcówkę strzykawki Hamiltona przez czaszkę, prostopadle do mózgu, i wstrzyknąć 1,5 µL mieszaniny DNA do miąższu móżdżku, powoli naciskając tłok strzykawki. Po podaniu mieszaniny DNA powoli wycofać igłę, aby zapobiec wyciekowi, i pozwolić roztworowi DNA dyfundować przez 30 s.
  7. Wyłączyć izofluran i umieścić szczenię na podkładce grzewczej o temperaturze 37 °C. Przygotować elektrodę typu pęsetka do elektroporacji, zanurzając oba końce w sterylnym 1x PBS.
    UWAGA: Zwilżenie elektrody typu pęsetka zapobiegnie oparzeniom kontaktowym skóry szczenięcia podczas podawania impulsów elektrycznych.
  8. Ustawić elektrodę-pęsetkę nad miejscem wstrzyknięcia, z biegunem dodatnim skierowanym w dół, a biegunem ujemnym nad głową zwierzęcia (Rysunek 2D). Podać pięć impulsów elektrycznych z elektroporatora przy następujących ustawieniach: 50 ms, 130 V oraz 950 ms odstępu między impulsami.
    UWAGA: W razie potrzeby wykonać wstrzyknięcie testowe, aby upewnić się, że miejsce wstrzyknięcia znajduje się w obrębie robaka móżdżku (Rysunek 2E).
  9. Zacisnąć nacięcie i zamknąć ranę nietoksycznym klejem tkankowym cyjnoakrylanem n-butylestru. Oczyścić ranę 70% etanolem, ponieważ jakakolwiek śladowa ilość krwi zwiększa prawdopodobieństwo infantycydy i kanibalizmu ze strony rodziców.
  10. Pozostawić zwierzę do dojścia do siebie na podkładce grzewczej o temperaturze 37 °C przed powrotem szczenięcia do matki. Monitorować szczenięt(a) co 30 min przez co najmniej 2 h po zabiegu, aby upewnić się, że w pełni odzyskały sprawność.
    ​UWAGA: Infantycyd ze strony któregokolwiek z rodziców jest dość powszechny. Aby zapobiec kanibalizmowi, należy umieścić samca w oddzielnej klatce przed rozpoczęciem elektroporacji i zawsze oddawać oczyszczone i zregenerowane szczenięta (t.j. bez plam krwi, w pełni mobilne) do oryginalnej klatki na oryginalną ściółkę. Szczenięta można również przetrzeć odchodami z oryginalnej klatki, aby zminimalizować zapach krwi. Użycie zastępczej matki może być konieczne, jeśli oryginalna matka nadal kanibalizuje swoje potomstwo.

figure-protocol-2
Rysunek 2: In vivo elektroporacja progenitorów neuronów ziarnistych w móżdżku u myszy typu dzikiego w dniu P7. (A) Myszata są znieczulane 4% isofluranem podawanym z przepływem 0.8L/min , aby zapewnić znieczulenie podczas wstrzykiwania roztworu DNA. Isofluran jest podawany z przepływem 0.8 L/min. (B) Po trzykrotnej sterylizacji myszy betadyną i 70% etanolem wykonuje się nacięcie obejmujące odległość między uszami, odsłaniając tylny mózg. (C) Powiększony obraz białego oznaczenia na czaszce, będącego punktem orientacyjnym dla miejsca iniekcji. Konstrukt DNA należy wstrzyknąć w odległości do 1 mm powyżej oznaczenia; linie przerywane obrysowują oznaczenie, a czarna strzałka wskazuje miejsce iniekcji. Grzebienie robaka móżdżku mogą być widoczne i mogą pomóc w zlokalizowaniu miejsca iniekcji. (D) Orientacja elektrod typu pęsetka dla efektywnej elektroporacji. Biegun dodatni (+) musi być skierowany w dół, aby wciągnąć ujemnie naładowane DNA do miąższu móżdżku przed podaniem impulsów elektrycznych. (E) Iniekcja testowa 1 µL 0,02% barwnika Fast Green wykazuje, że wstrzyknięcie jest zlokalizowane w środkowej części robaka móżdżku pomiędzy listkami 5-7. Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

3. Immunohistochemia elektroporowanych neuronów zbożowych (CGN)

  1. Przygotuj następujące materiały: izofluran, 1x PBS, 4% paraformaldehyd (PFA), 30% sacharozę, normalne surowicę kozią, detergent niejonowy, szkiełka przedmiotowe, szkiełka nakrywkowe, lakier do paznokci, medium montażowe, barwnik jądrowy Hoechst oraz odpowiednie przeciwciała pierwotne i wtórne (patrz  Tabela Materiałów).
  2. Znieczul zwierzę doświadczalne izofluranem i potwierdź pełną anestezję poprzez ucisk palca u stopy oraz ogona.
  3. Wykonaj perfuzję transkardialną, powoli wstrzykując 1x PBS i 4% PFA do lewej komory serca zwierzęcia. Pozwól na odpływ krwi poprzez przecięcie żyły głównej.
  4. Utrwal mózg przez noc, zanurzając go w 4% PFA w temperaturze 4 °C. Następnego dnia szybko opłucz mózg w 1x PBS i przenieś go do 30% sacharozy w 1x PBS w celu krioprotekcji na co najmniej 24 h.
  5. W razie potrzeby przetnij mózg na pół wzdłuż osi rostralno-kaudalnej i potwierdź ekspresję przetransfekowanego konstruktu reporterowego za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego.
    UWAGA: Przechowuj mózg zanurzony w 1x PBS w niewielkim naczyniu, aby zapobiec jego wyschnięciu.
  6. Zamocuj mózg w kriotomie, wykonaj sagiatalne przekroje o grubości 25 µm i pozwól sekcjom rozprostować się w mieszaninie 1x PBS i glicerolu w stosunku 1:1.
    UWAGA: Sekcje można przechowywać w tym roztworze krioprotekcyjnym w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.
  7. Przemyj sekcje trzy razy w 1x PBS przez 10 min każdorazowo, aby usunąć krioprotektant, a następnie zablokuj tkankę w 1x PBS + 10% normalnej surowicy koziej + 0,2% detergentu niejonowego na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 1 h.
  8. Przygotuj roztwór przeciwciała pierwotnego: 1x PBS, 10% normalna surowica kozia, 0,2% detergent niejonowy oraz przeciwciało anty-GFP, a następnie odwiruj roztwór przez 5 min przy >16,0 × g. Inkubuj sekcje w roztworze przeciwciał w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej przez 48 h.
  9. Wypłucz roztwór przeciwciała pierwotnego pięć razy przez 15 min, używając 1x PBS + 0,2% detergentu niejonowego.
  10. Przygotuj roztwór przeciwciała wtórnego: 1x PBS, 10% normalna surowica kozia, 0,2% detergent niejonowy oraz odpowiednie przeciwciało wtórne do detekcji GFP; odwiruj roztwór przy >16,00 × g. Inkubuj sekcje w roztworze przeciwciał na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 2-3 h. Chroń sekcje przed ekspozycją na światło, aby zapobiec wybieleniu.
  11. Wypłucz roztwór przeciwciała wtórnego trzy razy za pomocą 1x PBS + 0,2% detergentu niejonowego przez 15 min każdorazowo. Inkubuj sekcje w 1x PBS + Hoechst przez 5 min w celu zabarwienia jąder komórkowych.
  12. Wypłucz roztwór Hoechst za pomocą 1x PBS + 0,2% detergentu niejonowego i zamocuj preparaty na szkiełkach przedmiotowych. Przykryj sekcje medium montażowym, nałóż szkiełka nakrywkowe i zabezpiecz krawędzie lakierem do paznokci, aby zapobiec parowaniu.

4. Analizy morfologiczne CGN – rekonstrukcja trójwymiarowa (3D) oraz pole powierzchni i objętość komórkowa

  1. Obrazuj pojedyncze elektroporowane CGN za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 63x i 2-krotnym powiększeniem, wykonując zdjęcia w stosie z (z-stack) przy 0.5 µm na stos. Przedstawiaj jedną komórkę w jednym oknie obrazu, aby umożliwić łatką analizę i rekonstrukcję obrazów.
  2. Zainstaluj wtyczkę Simple Neurite Tracer dla FIJI, korzystając z następującego łącza (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions), aby w łatwy i wydajny sposób śledzić strukturę elektroporowanych komórek ziarnistych zwojówczoowych (CGNs) w przestrzeni trójwymiarowej (3D).
    UWAGA: Dostępna jest zaktualizowana wersja wtyczki (https://imagej.net/SNT).
  3. Analiza długości neurytów i tworzenia się kolców dendrytycznych metodą ślepej próby przy użyciu programu Simple Neurite Tracer. Prześlij jednokanałowe obrazy z-stack elektroporowanych CGN do programu FIJI, a następnie kliknij w Wtyczki | Segmentacja | Simple Neurite Tracer (Rycina 3D).
  4. Otwórz menu rozwijane i wybierz Utwórz nową przeglądarkę 3D (Rysunek 3D).
  5. Przesuń widok do podstawy dendrytu, w miejscu jego połączenia z somą komórki, i rozpocznij wyznaczanie ścieżki, klikając w punkt styku. Ręcznie śledź ścieżkę, klikając w sekcjach, w których sygnał wypełnienia komórki jest najsilniejszy, naciskając [y] aby zachować ślad. Śledź aż do końca dendrytu, jeśli nie zawiera on odnogi, lub do podstawy odnogi, a następnie potwierdź ścieżkę, naciskając [f] (Rysunek 4D).
  6. Następnie obrysuj odnóg, rozpoczynając ścieżkę u podstawy struktury i prowadząc ją aż do końca najdłuższego neurytu. Obrysuj gałęzie drugiego i trzeciego rzędu, przytrzymując klawisz [kontrola] w systemie Windows lub [alternatywa] w systemie Mac OS i klikając ścieżkę. Potwierdź ścieżkę, naciskając [f].
  7. Należy zwrócić uwagę, że pomiary śladów są widoczne w osobnym oknie; należy zsumować wszystkie pomiary odnog szczurzych (pierwotnych, wtórnych i trzeciorzędnych), aby uzyskać całkowitą długość każdego pazura.
  8. W celu analizy powierzchni oraz objętości komórkowej elektroporowanych CGN-ów należy pobrać oprogramowanie do analizy komórkowej Imaris (https://imaris.oxinst.com/).
    UWAGA: Program FIJI może być również wykorzystywany do rekonstrukcji komórek w 3D z obrazów stosu Z (z-stack) przy użyciu ogólnodostępnych i bezpłatnych wtyczek. Dodatkowo program Simple Neurite Tracer posiada funkcję renderowania wolumetrycznego, jednak z powodów opisanych poniżej zastosowano program Imaris.
  9. Prześlij obraz z-stack z elektroporowanego CGN do programu Imaris. Uzyskaj dostęp do zestawu narzędzi rekonstrukcji 3D, naciskając Prześcisnąć.
  10. Aby zrekonstruować CGN, należy nacisnąć Powierzchniei wybierz obszar zainteresowania, który obejmuje całą komórkę w oknie obrazu. Po zakończeniu naciśnij niebieską strzałkę w prawo w prawym dolnym rogu pod Utwórz.
  11. Jeśli obraz zawiera wiele kanałów dla różnych sygnałów, należy wybrać kanał zawierający elektroporowane CGN i nacisnąć niebieską strzałkę w prawo.
  12. Za pomocą suwaka ustaw pożągany próg, który najdokładniej odpowiada sygnałowi elektroporowanej komórki. Powiększ obraz powierzchni komórki, aby precyzyjnie określić wartość progu. Po zakończeniu naciśnij podwójną zieloną strzałkę, aby zrekonstruować komórkę i odczytać pole powierzchni oraz objętość z metadanych.

figure-protocol-3
Rycina 3: Analiza immunohistochemiczna i rekonstrukcja trójwymiarowa elektroporowanych neuronów ziarnistych. Myszy CD-1 w 7. dobie postnatalnej (P7) poddano elektroporacji konstruktem wykazującym ekspresję GFP. Pobrano mózgi, a następnie przeprowadzono immunohistochemię, mikroskopię konfokalną i rekonstrukcję 3D w celu analizy morfologicznej. (A) Harmonogram od momentu elektroporacji do przetwarzania obrazów u myszy 10 dni po wstrzyknięciu (10-DPI). (B) Obraz projekcji maksymalnej w przekroju strzałkowym elektroporowanego móżdżku w 10-DPI; białe linie wyznaczają warstwy móżdżku, pasek skali wynosi 25 µm. (C) Obraz projekcji maksymalnej pojedynczego elektroporowanego neuronu ziarnistego w 10-DPI oraz odpowiadający mu ślad 3D, pasek skali wynosi 10 µm. (D) Rekonstrukcje 3D zostały wygenerowane przy użyciu wtyczki Simple Neurite Tracer w programie FIJI. Wszystkie pomiary zostały wykonane na podstawie stosu obrazów w osi z, śledząc sygnał wypełniający komórkę. Pomiary szyjki i pazurka były prowadzone oddzielnie dla każdego dendrytu; linia przerywana oznacza fragment dendrytu w aktualnej płaszczyźnie. Skróty: 3D = trójwymiarowy; GFP = zielone białko fluorescencyjne; DPI = dni po wstrzyknięciu; PSD-95 = białko gęstości postsynaptycznej 95; GNPs = progenitorzy neuronów ziarnistych; PFA = paraformaldehyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rycina 4: Analiza morfologii neuronów ziarnistych podczas rozwoju móżdżku. (A) Obrazy projekcji maksymalnej elektroporowanych CGN od 3-DPI do 14-DPI (wiek postnatalny P10 do P21), jądra (niebieski) i GFP (zielony); groty strzałek wskazują poszczególne dendryty, pasek skali wynosi 10 µm. (B) Średnia liczba dendrytów. (C) Średnia długość ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Neurony ziarniste móżdżku są najliczniejszymi neuronami w mózgu ssaków, stanowiąc prawie 60-70% całkowitej populacji neuronów w mózgu gryzoni 1,14. Móżdżek był szeroko wykorzystywany do wyjaśniania mechanizmów proliferacji komórek, migracji, tworzenia dendrytów i rozwoju synaps 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca była wspierana przez granty NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) oraz Duke University's Summer Neuroscience Program (D.G.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BetadinePurdue Produkcja67618-150-17
Cementowany 10 i mikro; Igła LHamilton1701SN (80008)33 gauge, 1,27 cm (0,5 cala), 4-punktowy styl
Kurczak anty-GFPMillipore SigmaAB16901Nasze laboratorium używa tego przeciwciała w stężeniu 1:1000
bawełnianą końcówką
Osioł anty-kurczak Cy2Jackson ImmunoResearch703-225-155Nasze laboratorium używa tego przeciwciała w stężeniu 1:500
Etanol (200 dowód)KoptecV1016
Elektroporator ECM 830BTX Aparat Harvard45-0052
Fast Green FCFSigmaF7252-5G
FUGW plazmidAddgene14883
Szkiełkaszklane VWR48311-703Superfrost plus
GlycerolSigma-AldrichG5516
Poduszka grzewczaSoftheat
Hoescht 33342 barwnik fluorescencyjnyInvitrogen62249
ImarisBitplane
IsofluranePatterson Veterinary07-893-1389
Szkło z mikro pokrywąVWR48382-138
Lakier do paznokciSally HansenColor 109
Normalna koza surowicaGibco16210064
Związek do zatapiania O.C.T.Tissue-Tek4583
Luneta sekcyjna Olympus MVX10KońcówkaMVX10
P200Fisherbrand02-707-138Używany do dystansu igły
ParafilmBemisPM-996
PBS pH 7,4 (10x)Gibco70011-044
Prosty Neurite TracerFIJIhttps://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_
Instrukcje
SacharozaSigmaS0389
Narzędzia chirurgiczneRWD Life ScienceMałe nożyczki i pęsety
Triton X-100Roche11332481001niejonowy detergent
PęsetyBTX Aparat Harvard45-04895 mm, platynowane elektrody typu pęseta
Ultraczysta woda destylowanaInvitrogen10977-015
Nośnik montażowy VectashieldVectashieldH1000
Klej tkankowy Vetbond3M1469SB
Zeiss 780 Pionowy konfokalnyZeiss780
Aplikator z do pipet Olympus

Bibliografia

  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
  2. Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484(2018).
  3. Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
  4. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-408 (1995).
  5. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390 (6656), 169-172 (1997).
  6. Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129 (6), 1435-1442 (2002).
  7. Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2301-2312 (2008).
  8. Markwalter, K. H., Yang, Y., Holy, T. E., Bonni, A. Sensorimotor coding of vermal granule neurons in the developing mammalian cerebellum. Journal of Neuroscience. 39 (34), 6626-6643 (2019).
  9. Shalizi, A., et al. PIASx is a MEF2 SUMO E3 ligase that promotes postsynaptic dendritic morphogenesis. Journal of Neuroscience. 27 (37), 10037-10046 (2007).
  10. Shalizi, A., et al. A Calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls poststynaptic differentiation. Science. 311 (5763), 1012-1017 (2006).
  11. Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303 (5660), 1026-1030 (2004).
  12. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51070(2014).
  13. Yang, Y., et al. Chromatin remodeling inactivates activity genes and regulates neural coding. Science. 353 (6296), 300-305 (2016).
  14. Herculano-Houzel, S. Coordinated scaling of cortical and cerebellar numbers of neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 12(2010).
  15. Wilson, P. M., Fryer, R. H., Fang, Y., Hatten, M. E. Astn2, a novel member of the astrotactin gene family, regulates the trafficking of ASTN1 during glial-guided neuronal migration. Journal of Neuroscience. 30 (25), 8529-8540 (2010).
  16. Kokubo, M., et al. BDNF-mediated cerebellar granule cell development is impaired in mice null for CaMKK2 or CaMKIV. Journal of Neuroscience. 29 (28), 8901-8913 (2009).
  17. Schwartz, P. M., Borghesani, P. R., Levy, R. L., Pomeroy, S. L., Segal, R. A. Abnormal cerebellar development and foliation in BDNF-/- mice reveals a role for neurotrophins in CNS patterning. Neuron. 19 (2), 269-281 (1997).
  18. Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 15 (7), Pt 1 4970-4981 (1995).
  19. Zhou, P., et al. Polarized signaling endosomes coordinate BDNF-induced chemotaxis of cerebellar precursors. Neuron. 55 (1), 53-68 (2007).
  20. Dhar, M., Hantman, A. W., Nishiyama, H. Developmental pattern and structural factors of dendritic survival in cerebellar granule cells in vivo. Scientific Reports. 8 (1), 17561(2018).
  21. Ito, M. Synaptic plasticity in the cerebellar cortex and its role in motor learning. Canadian Journal of Neurological Sciences. 20, Suppl 3 70-74 (1993).
  22. Jorntell, H., Hansel, C. Synaptic memories upside down: bidirectional plasticity at cerebellar parallel fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 52 (2), 227-238 (2006).
  23. Nakanishi, S. Genetic manipulation study of information processing in the cerebellum. Neuroscience. 162 (3), 723-731 (2009).
  24. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development
Posted by JoVE Editors on 4/06/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development. A figure was updated.

Figure 2 was updated from:

Surgical technique for dye injection in animal model with anesthesia setup and electrode placement.
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse surgery procedure, anesthesia, incision, electrode application steps, dye localization, experiment.
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.

Tagi

Elektroporacja in vivoneurony ziarniste m d kuformowanie si wypustek dendrytycznychmikroskopia konfokalnaledzenie neuryt wanaliza morfologicznamanipulacja genetycznaefekty autonomiczne kom rkowom d ek gryzoni

Powiązane artykuły