Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych

Summary

Tutaj prezentujemy strategię immunofenotypowania do charakterystyki różnicowania megakariocytów i pokazujemy, jak ta strategia pozwala na sortowanie megakariocytów na różnych etapach za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją. Metodologia ta może być stosowana do pierwotnych tkanek ludzkich, ale także do megakariocytów wytwarzanych w hodowli in vitro.

Abstract

Różnicowanie megakariocytów (MK) obejmuje szereg cykli endomitotycznych, które skutkują wysoce poliploidalną (sięgającą nawet >64N) i niezwykle dużą komórką (40-60 μm). W przeciwieństwie do szybko rozwijającej się wiedzy na temat megakariopoezy na poziomie biologii komórki i molekularnym, charakterystyka megakariopoezy za pomocą cytometrii przepływowej ogranicza się do identyfikacji dojrzałych MK za pomocą markerów powierzchniowych specyficznych dla linii, podczas gdy wcześniejsze etapy różnicowania MK pozostają niezbadane. W tym miejscu przedstawiamy strategię immunofenotypowania, która pozwala na identyfikację kolejnych etapów różnicowania MK, wraz z rosnącym statusem ploidalności, w ludzkich źródłach pierwotnych lub >hodowlach in vitro z panelem integrującym specyficzne i niespecyficzne markery powierzchniowe MK. Pomimo swoich rozmiarów i kruchości, MK mogą być immunofenotypowane za pomocą wyżej wymienionego panelu i wzbogacone o sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w określonych warunkach ciśnienia i średnicy dyszy. Takie podejście ułatwia badania multiomiczne, których celem jest lepsze zrozumienie złożoności megakariopoezy i produkcji płytek krwi u ludzi. Lepsza charakterystyka megakariopoezy może mieć fundamentalne znaczenie w diagnostyce lub prognozowaniu patologii związanych z linią i nowotworów złośliwych.

Introduction

1^,2,3. W efekcie dojrzałe MK to duże komórki (40-60 μm) charakteryzujące się wysoce poliploidalnym jądrem (osiągającym nawet >64N). Ostatnie badania sugerują alternatywne drogi, dzięki którym HSC różnicują się w MK, omijając tradycyjne punkty kontrolne zobowiązania rodowodu w odpowiedzi na pewne warunki fizjopatologiczne^{4,5,6,7,8,9,10,11}. Wyniki te podkreślają, że różnicowanie układu krwiotwórczego w kierunku dojrzałego MK jest procesem ciągłym i adaptacyjnym, który odpowiada na potrzeby biologiczne.

Wraz z rosnącą wiedzą na temat biologii komórki i molekularnych aspektów charakteryzujących megakariopoezę¹², większość badań poświęconych badaniu procesu za pomocą cytometrii przepływowej ogranicza się do identyfikacji dojrzałych MK za pomocą specyficznych dla linii markerów powierzchniowych (np. CD42A/B, CD41/CD61), podczas gdy wcześniejsze etapy różnicowania MK pozostają niezbadane. Wcześniej udokumentowaliśmy strategię etapowania megakariopoezy w hodowlach MK szpiku kostnego myszy i szpiku kostnego pochodzących ze szpiku kostnego^13,14, którą dostosowaliśmy i zastosowaliśmy do ludzi¹⁵. W niniejszym artykule przedstawiono strategię immunofenotypowania, która pozwala na scharakteryzowanie megakariopoezy, od HSC do dojrzałych MK, w ludzkich źródłach pierwotnych (szpik kostny -BM- i krew obwodowa -PB-) lub hodowlach in vitro przy użyciu panelu integrującego specyficzne i niespecyficzne markery powierzchniowe MK (m.in. CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT i CD71). Pomimo swoich dużych rozmiarów i kruchości, MK mogą być immunofenotypowane przy użyciu wyżej wymienionych markerów powierzchni komórek i wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w określonych warunkach ciśnienia i średnicy dyszy w celu zminimalizowania pękania komórek i/lub uszkodzenia. Technika ta ułatwia podejście multiomiczne w celu lepszego zrozumienia złożoności megakariopoezy i produkcji płytek krwi w zdrowiu i chorobie ludzkiej. Warto zauważyć, że będzie on stanowił użyteczne narzędzie wspomagające diagnostykę i rokowanie w kontekście klinicznym rosnącego zapotrzebowania.

W tym manuskrypcie dokumentujemy strategię etapowania ludzkiej megakariopoezy za pomocą panelu integrującego specyficzne dla MK i niespecyficzne markery powierzchniowe z pierwotnych źródeł lub wygenerowane in vitro. Dodatkowo udostępniamy protokół sortowania, z aktywowanym fluorescencją sortownikiem komórek, preferowanych frakcji i dojrzałych MK (Rysunek 1). Ten krok nie jest popularny, ponieważ jest trudny technicznie ze względu na duży rozmiar i kruchość MK. Jednak już wcześniej stosowano go zarówno w próbkach szpiku kostnego myszy, jak i ludzkiego, a także ze względu na postęp technologiczny, za każdym razem uzyskując lepszy wynik^16,17,18. Głównymi źródłami ludzkimi, w których można badać MK lub prekursory MK, są między innymi szpik kostny, krew pępowinowa i krew obwodowa. Istotne znaczenie ma właściwe przetwarzanie próbki w celu wyizolowania odpowiedniej frakcji komórkowej do analizy na każdej próbce. Uwzględniono standardowe procedury, z pewnymi względami, które należy wziąć pod uwagę, dążąc do badania megakariopoezy.

Protocol

Próbki krwi pełnej i szpiku kostnego zostały pobrane i przetworzone zgodnie z Deklaracją Helsińską z 1964 roku. Próbki krwi pełnej pobrano od zdrowych dawców po wyrażeniu świadomej zgody (ISPA), w ramach badania zatwierdzonego przez naszą instytucjonalną komisję etyki medycznej (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-). Próbki szpiku kostnego pobrano z materiału odrzutowego aspiratu szpiku kostnego od pacjentów leczonych na Oddziale Hematologii Szpitala Clínico San Carlos (HCSC).

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu udokumentowanego w tym manuskrypcie. Wskazano pierwotne źródła ludzkie lub pierwotne kultury, w których można etapować różnicowanie MK za pomocą immunofenotypowania. Ta strategia immunofenotypowania może być zastosowana do badania procesu w różnych patologiach związanych z linią lub nowotworami złośliwymi w źródłach pierwotnych. Ponadto umożliwia sortowanie komórek MK i prekursorów za pomocą aktywowanego fluorescencją sortera komórek, co pozwala na dalszą analizę wzbogaconych frakcji. Wykorzystane obrazy są częścią Servier Medical Art (SMART) firmy Servier i są objęte licencją CC BY 3.0. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przetwarzanie pełnej krwi i szpiku kostnego przed immunofenotypowaniem

1. W przypadku stosowania krwi pełnej (WB) z donacji jako głównego źródła, opcjonalnie należy wyizolować składnik komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Można to osiągnąć poprzez zastosowanie standardowego wirowania różnicowego w połączeniu z separacją komórek w gradimencie gęstości, jak opisano wcześniej¹⁵.
   1. Krótko mówiąc, odwirować krew w stężeniu 193 x g przez 15 minut (hamulec 3) w temperaturze pokojowej. Odrzuć górną frakcję osocza i zbierz pierścień buforowy. Rozcieńczyć w stosunku 1:1 buforem soli fizjologicznej (PBS)/dwuwodnego cytrynianu trisodowego (38 g/l, pH 7) i ostrożnie odpipetować objętość 25 ml na 15 ml roztworu gradientu gęstości (1,076 g/ml) w probówkach o pojemności 50 ml.
   2. Wirować przez 20 minut przy 1114 x g (akcelerator 3, hamulec 3, temperatura pokojowa). Odrzucić frakcję osocza i zebrać pierścień buforowy zawierający PBMC. Przemyć, dodając taką samą objętość PBS, odwirować przy 435 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w PBS do dalszego wykorzystania.
2. Alternatywnie można użyć próbki WB (około 100 μl) do immunofenotypowania po lizie czerwonych krwinek (RBC) i dokładnym umyciu.
   1. Krótko mówiąc, rozcieńczyć 1:1 w lodowatym buforze lizującym RBC (4,15 g NH₄Cl, 0,5 g KHCO₃ i 18,5 mg EDTA (triplex III) do 500 ml H₂O, pH 7,1-7,4). Poczekaj, aż zawiesina komórek stanie się przezroczysta na czerwoną (3-5 min).
   2. Odwirować przy 435 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić komórki w PBS. Powtórz procedurę tyle razy, ile to konieczne, aby uzyskać osad z krwinek białych.
3. Podobnie, próbki uzyskane ze szpiku kostnego (aspiracja) należy bezpośrednio przetworzyć buforem lizującym RBC (patrz punkt 1.2) i dokładnie przepłukać, tak aby rozpocząć od klarownej zawiesiny jednokomórkowej (Rysunek 1).
   1. Unikaj stosowania wirowania do mieszania próbek podczas przetwarzania, ponieważ może to uszkodzić delikatne MKs. Wymieszaj, przesuwając lub odwracając rurkę.
      UWAGA: Gradient gęstości w celu uzyskania PBMC może skutkować bogatszą i czystszą frakcją komórek w porównaniu z WB zmielonym RBC. Należy jednak pamiętać, że dojrzałe MK o dużej gęstości mogą zostać utracone we frakcji "neutrofilowej". Zostanie to omówione w reprezentatywnych wynikach.

2. Różnicowanie in vitro MK od PBMC

UWAGA: MK można odróżnić in vitro od wcześniejszych prekursorów, takich jak komórki CD34⁺, obecnych w różnych źródłach pierwotnych (np. WB/PBMCs, krew pępowinowa, szpik kostny) oraz od iPSC. W tym celu zastosowano różne protokoły. Tutaj używamy opracowanej przez nas metody hodowli, która pozwala na odróżnienie MK od PBMC, bez konieczności wzbogacania o prekursory CD34^{+15,19,20,21,22}.

1. Protokół ten składa się z trzech faz hodowli, w których stężenie trombopoetyny (TPO) stopniowo wzrasta kosztem czynników wzrostu sprzyjających proliferacji wcześniejszych prekursorów (tj. SCF, EPO), które stopniowo maleją (Rysunek 2) ¹⁵.
   1. Jako podłoże podstawowe należy użyć StemSpan SFEM uzupełnionego 0,4% mieszanki lipidów bogatych w cholesterol i 1% penicyliny/streptomycyny.
      1. W pożywce fazy I należy użyć pożywki podstawowej uzupełnionej SCF (100 ng/ml), erytropoetyną (EPO, 0,5 U/ml) i trombopoetyną (TPO, 30 ng/ml). Pożywka fazy II jest pożywką podstawową uzupełnioną o SCF (50 ng/ml), EPO (0,25 U/ml) i TPO (50 ng/ml). W przypadku pożywki fazy III należy użyć pożywki podstawowej uzupełnionej TPO (100 ng/ml).
   2. Hodowla PBMC w pożywce fazy I. W dniach 6-8 umieść PBMC w pożywce fazy II, a w dniu 9-12 umieść PBMC w pożywce fazy III.
   3. Zastąpić pożywkę przez odwirowanie komórek o stężeniu 435 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej od fazy I do fazy II i przy 95 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej od fazy II do fazy III i ponowne zawieszenie ich w świeżej pożywce.
   4. Hodowla komórek w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . W tych kulturach pierwotnych różnicowanie MK trwa 10-14 dni, a próbki można pobierać w różnych punktach czasowych przez cały okres hodowli, aby śledzić różnicowanie MK.

Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie metody hodowli MK pochodzącej z PBMC. PBMC od zdrowych dawców hodowano zgodnie z opracowanym przez nas protokołem trójfazowym do generowania MK in vitro (schemat zaczerpnięty z Salunkhe i wsp.). ¹⁵ Pokazane są zdjęcia zrobione w 10 i 13 dniu kultury. Zdjęcia są robione obiektywem 20X. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Pobieranie próbek: Umyć komórki, stosując wirowanie na niskiej prędkości przez 5 minut (95 x g) i ponownie zawiesić je w PBS lub PBS zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Do immunofenotypowania idealna gęstość to 10^{5-10 6} komórek/100 μl (patrz punkt 3.1). W zależności od stanu kultur (tj. obecności martwych komórek, szczątków itp.), może być konieczne 1 lub 2 płukania. Zbierz swoje komórki w interesujących punktach czasowych podczas hodowli.

3. Immunofenotypowanie różnicowania MK - inkubacja z panelem oznaczonych przeciwciał

1. Inkubować próbki komórek z panelem znakowanych przeciwciał zgodnie ze standardowymi procedurami, zwracając uwagę na wirowanie z niską prędkością (95 x g) podczas przetwarzania megakariocytów. Zwykle inkubujemy próbki z 1% BSA w PBS w objętościach 100 μL w temperaturze 4 °C, 20 minut, w zakresie 10^{5-10 6} komórek.
2. Skalowanie w górę w razie potrzeby.
3. Po inkubacji dodać 5 ml 1% BSA do PBS, odwirować z niską prędkością (95 x g), zassać supernatant i ponownie zawiesić próbkę w 2% BSA w PBS, aby zachować żywotność MK (2 ml). Dodaj 1-5 mM EDTA, aby rozbić agregaty komórka-komórka (które są naturalnie widoczne w kulturach MK).
4. Przenieść próbki do probówki o okrągłym dnie (probówka FACS) o wymiarach 12 x 75 mm, trzymając je w ciemności do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej lub sortowania komórek.
5. Przygotowanie pojedynczych mieszanin przeciwciał i paneli przeciwciał; ustawienie cytometru przepływowego:
   1. Miareczkować przeciwciała przed ich użyciem w celu określenia optymalnego stężenia w panelach przeciwciał. Optymalne stężenie przeciwciał to najniższe stężenie, które oddziela komórki wyraźnie dodatnie od ujemnych (i pozwala na rozróżnienie pośrednich poziomów ekspresji). Na przykład większość przeciwciał stosuje się w rozcieńczeniu 1:200 (podstawowe 100 μg/ml), chyba że miareczkowano lub wskazano inaczej.
   2. Po ustaleniu miareczkowania przeciwciał należy przygotować 10-krotne rozcieńczenie każdego przeciwciała. Rozcieńczenia te stosuje się do jednokolorowych kontroli i do przygotowania mieszanek panelowych. Rozcieńczenia i mieszanki panelowe nadają się do użycia nawet miesiąc po przygotowaniu (przechowywane w temperaturze 4 °C, chyba że wskazania producenta wykluczają takie warunki przechowywania). Pozwala to na barwienie próbek tym samym panelem przez pewien okres czasu.
   3. Użyj 10 μl na 100 μl 10-krotnego rozcieńczenia zarówno do jednokolorowych kontroli, jak i do mieszanki panelowej.
      1. W przypadku jednokolorowych kontroli użyj kulek powinowactwa przeciwciał, które można bezpośrednio zmierzyć po dodaniu przeciwciała. Jednokolorowe kontrolki powinny być mierzone przy każdym eksperymencie, aby umożliwić odpowiednią regulację kompensacji (i precyzyjne dostrojenie po pomiarze za pomocą oprogramowania analitycznego).
      2. Alternatywnie wykonaj jednokolorowe kontrolki z próbkami komórek. Jednak kulki pozwalają na szybki pomiar danej liczby zdarzeń, które, w zależności od markera przeciwciała/powierzchni, mogą nie być możliwe do uzyskania na złożonych pierwotnych lub hodowanych źródłach komórek. Zalecamy również uruchomienie próbek komórek wybarwionych mieszankami panelowymi "Fluorescence Minus One" (FMO) w celu skonfigurowania odpowiednich ustawień kompensacji (przed rozpoczęciem eksperymentów). Jest to istotne dla dokładnej identyfikacji problemów z kompensacją, a zwłaszcza w przypadku hodowlanych MK, dla identyfikacji interferencji autofluorescencyjnej (która będzie obecna w przypadku użycia pożywki hodowlanej zawierającej czerwień fenolową).
   4. Przygotować wystarczającą objętość mieszanki panelowej, w zależności od liczby próbek, zawierającą przeciwciała zaprojektowanego panelu. Większość naszych paneli zawiera sześć przeciwciał (panele 6-kolorowe, patrz tabele 1-2).
   5. W przypadku tych paneli należy użyć laserów cytometru przepływowego o długości fali 488 nm i 633 nm, jednak panele można dostosować do innych scenariuszy technicznych. Co więcej, kwestie związane z kompensacją można uniknąć w przypadku korzystania z cytometrii przepływowej opartej na spektrometrii mas lub cytometrów z technologią akustycznego ogniskowania.
      1. Barwniki do pomiaru żywotności mogą dawać fałszywe informacje na temat MK, zwłaszcza gdy dojrzeją. MK są bardzo aktywnymi komórkami wychwytującymi, a dodatni wynik w przypadku Hoechst, 7-AAD lub PE nie zawsze musi odzwierciedlać rzeczywistą śmierć komórki. Alternatywą (jeśli wymagany jest pomiar śmierci komórki) może być zastosowanie barwników mitochondrialnych (CMX Ros) lub barwników reagujących aminami (barwniki Zombie lub Ghost).

Tabela 1: Uwagi na temat markerów powierzchni komórek linii megakariocytów Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Panele przeciwciał Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

4. Analiza ploidalna w połączeniu z 6-kolorowymi panelami

1. W przypadku analizy ploidalnej, w połączeniu z 6-kolorowym panelem przeciwciał, należy przystąpić do utrwalania i przepuszczalności komórek po inkubacji z panelem przeciwciał. Strategia ta pozwoli na zachowanie barwienia markerów powierzchniowych, umożliwiając jednocześnie barwienie DNA komórek. Do barwienia DNA używamy Hoechst 33342, ponieważ można go uwidocznić za pomocą dostępnego fioletowego lasera o długości fali 405 nm.
2. Dla 10^{5-10 6} komórek, po inkubacji z panelem przeciwciał, odwirować komórki (95 x g przez 5 min), ponownie zawiesić w 200 μl buforu utrwalającego i inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Odwirować komórki, jak wskazano powyżej, zawiesić po raz drugi w buforze utrwalającym o objętości 200 μl i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Przygotować bufor permeabilizacyjny, zawierający 0,1% Triton X-100, 200 mg/ml RNazy i 20 mg/ml Hoechst 33342 (przepuszczalność Hoechst MIX).
5. Odwirować komórki jak wyżej, zawiesić je ponownie w 300 μl przepuszczalnego Hoechst MIX i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Ten krok jest bardzo ważny, ponieważ, aby uzyskać czysty pomiar ploidalności, RNA musi zostać zdegradowany.
6. Po upływie czasu inkubacji należy zmierzyć próbki bezpośrednio za pomocą cytometru przepływowego. W przeciwnym razie próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, w ciemności. Zmierz je szybko. Ponieważ jednak próbki te są stałe, pomiar może być opóźniony nawet o 24-48 godzin. Upewnij się, że próbka jest dokładnie strzepnięta przed pomiarem lub przepuszczona przez sitko do komórek, aby zapewnić zawieszenie pojedynczej komórki.
   1. Parametry morfometryczne, takie jak rozproszenie do przodu i boczne, nie są zachowywane po utrwaleniu komórek. Wykres punktowy do przodu/z boku pokaże skurczenie się rozkładu komórek po fiksacji. Jednak barwienie markerem powierzchniowym jest w większości zachowane, a strategia bramkowania jest prawie niezmieniona, co pozwala na analizę statusu ploidalności na różnych etapach różnicowania zdefiniowanych przez kombinacje znaczników powierzchniowych.

5. Analiza różnicowania MK

UWAGA: Zauważyliśmy, że kombinacja CD31/CD71 pozwala na ustawienie liczby bramek, które odpowiadają różnym etapom różnicowania MK. Dalsze bramkowanie wsteczne za pomocą markerów specyficznych dla MK pozwala na oddzielenie dojrzałych i niedojrzałych MK. Ponadto, w świeżych próbkach, bramkowanie wsteczne w celu sprawdzenia obecności innych użytych markerów lub umieszczenia populacji w osiach rozproszenia przód/bok, udoskonala ocenę etapów różnicowania MK i pozwala na odrzucenie innych typów komórek, które mogą być obecne w tych samych populacjach.

1. Użyj panelu przeciwciał, który zawiera wczesne markery prekursorowe (KIT, CD34), popularne markery prekursorowe (CD31, CD71) i markery linii, niektóre z nich są specyficzne (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI itp.) (patrz tabele 1-2). Zastosowanie koktajlu Lineage (Lin) (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 i CD56) pozwala również na "odfiltrowanie" dojrzałych komórek krwiotwórczych, które mogą dodać szum do analizy (przy wyborze populacji Lin^-). Jako przykład przejdziemy przez analizę MK w PBMC, szpiku kostnym oraz poprzez hodowle komórkowe pochodzące z PBMC w reprezentatywnych wynikach.

6. Sortowanie komórek MK i MK prekursorowych

UWAGA: Barwione komórki były analizowane i sortowane na aktywowanym fluorescencyjnie sorterze komórek FACS Aria IIu wyposażonym w standardowe lasery na ciele stałym 488 nm i 633 nm przy użyciu oprogramowania FACSDiva; dane były dodatkowo analizowane i prezentowane za pomocą oprogramowania FlowJo i Cytobank (analiza viSNE). Czystość sortowanych frakcji potwierdzono analizą cytometrii przepływowej każdej z sortowanych frakcji (czystość powyżej 85%).

1. Sortowanie komórek należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe lub w ciągu 1 godziny po inkubacji przeciwciał, aby uniknąć degradacji komórek.
2. Przefiltrować próbkę za pomocą sitka do komórek o wielkości 100 μm, aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki i integralność dużych komórek MK.
3. Użyj dyszy ceramicznej 130 μm, ciśnienia w osłonie ustawionego na 11 funtów na cal kwadratowy (PSI) i częstotliwości napędu kroplowego ustawionej na 12 kHz, aby rozbić strumień na krople.
4. Przed sortowaniem wysterylizuj dyszę, osłonę i linie próbek, wykonując 30-minutową akwizycję penicyliną/streptomycyną rozcieńczoną 1:5 w sterylnej wodzie, a następnie 10-minutową akwizycję sterylną wodą w celu usunięcia pozostałego odkażenia.
5. Gdy strumień się ustabilizuje, dostosuj opóźnienie upuszczania za pomocą zalecanych koralików, aby posortować w trybie precyzyjnego dostrojenia ponad 97,5% odbitych kropli przy natężeniu przepływu 400-1200 zdarzeń na sekundę.
6. Przygotować probówki do zbierania FACS zawierające 500 μl 2% BSA w PBS. Procent BSA można zwiększyć do 5-10%.
7. Wygeneruj szablon eksperymentu z odpowiednimi parametrami macierzy wynagrodzeń.
8. Załaduj probówkę FACS do cytometru.
9. Wykonaj pomiar próbki, aby ustawić pożądane bramki i czystość docelowych populacji komórek. Utrzymuj rekord aktywowany, aby wyświetlić do 200 000 zdarzeń w wybranych bramkach populacji podczas sortowania komórek.
10. FACS Aria IIu pozwala na separację do 4 różnych populacji komórek w tym samym czasie. Utwórz nowy układ sortowania i wybierz urządzenie do pobierania (4 probówki) oraz odpowiedni tryb precyzyjny (zalecana jest pośrednia maska czystości i odzysku). Na koniec dodaj interesujące populacje do każdego pola lokalizacji sortowania (Rysunek 3).

Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie zasady sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Cząstki przechodzą przez dyszę 130 μm i są zmuszane do rozpadu na strumień regularnych kropel w wyniku działania wibracji na dyszę. Następnie kropelki są badane przez laser (punkt analizy), a sygnały są przetwarzane w celu podjęcia "decyzji sortowania" poprzez przyłożenie ładunku do tych kropel. Gdy kropla ładunku przechodzi przez pole elektrostatyczne wysokiego napięcia (płytka detekcyjna), jest odchylana i zbierana do odpowiedniej rurki zbiorczej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

11. Załaduj probówki zbiorcze i zacznij sortować populacje docelowe.
12. Odwirować probówki zbiorcze przez 5 minut przy 95 x g i ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości 2% masy ciała w PBS.
13. Ponownie zmierzyć ułamek każdej posortowanej próbki, aby obliczyć czystość.
14. Przechowuj komórki w odpowiedni sposób do dalszego wykorzystania. Posortowane komórki mogą być wykorzystywane do analiz cytologicznych i molekularnych lub mogą być ponownie hodowane w celu zbadania procesu różnicowania wybranej populacji komórek.

7. Przygotowanie próbki po sortowaniu

1. Przygotowanie cytospinów do analizy cytologicznej za pomocą cytowirówki
   1. Doprowadź posortowane komórki do łatwej w obsłudze objętości roboczej 100-200 μl. Należy wziąć pod uwagę, że gęstość komórek będzie zależeć od wydajności posortowanej populacji w każdym przypadku.
   2. Umieść czysty szkiełko na metalowym uchwycie i umieść górną część filtra. Pamiętaj, aby oznaczyć szkiełko i filtr, aby uniknąć mieszania próbek.
   3. Dodaj 100 μl PBS na otwór filtra przylegający do szkiełka, aby filtr został nawilżony na krawędzi otworu.
   4. Umieść lejek, zamknij metalowy uchwyt i umieść go na swoim miejscu w wirówce.
   5. Dodać próbkę (100-200 μl) do lejka.
   6. Wirować przy 36 x g przez 5 minut. Szkiełka cytospinowe można pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej (odpowiednio przykryte, aby zapobiec kurzowi) i można je przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1 tydzień przed barwieniem immunologicznym lub histochemią.
2. Do barwienia immunologicznego
   1. Utrwalić szkiełka w 2% paraformaldehydzie (PFA) rozcieńczonym w PBS i inkubować przez 5 minut.
      1. Można stosować zakres 0,5-4% PFA w PBS. W naszych rękach zużywamy 4%, aby uzyskać prawidłowe utrwalenie tkanek lub niektórych typów komórek, a 0,5% PFA w PBS wystarcza dla płytek krwi. Podczas konfigurowania tej techniki odpowiedni procent PFA wymaga optymalizacji dla każdego typu/źródła ogniwa.
   2. Inkubować 5 minut w PBS.
   3. Inkubować 5 minut w 50% etanolu (EtOH).
   4. Inkubować 5 minut w 70% EtOH.
   5. Przechowywać w 70% EtOH w temperaturze -20ºC.
   6. Podczas wykonywania barwienia immunologicznego należy ponownie nawodnić i postępować zgodnie ze standardowymi procedurami (przepuszczalność, mycie, blokowanie, inkubacja przeciwciał pierwotnych i wtórnych, konserwacja itp.).
3. Do cytochemii:
   UWAGA: Szkiełka można barwić farbą May-Grünwald Giemsa lub wygodnym barwieniem do każdego celu.
4. Do natychmiastowego badania morfologicznego
   1. Dodać jedną kroplę pożywki montażowej na miejsce zawierające komórkę cytospiny i umieścić szkiełko nakrywkowe.
   2. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż tydzień, chyba że są szczelnie zamknięte, co pozwala na długotrwałe przechowywanie nawet w temperaturze pokojowej. Mocowanie podłoża umożliwia długotrwałe przechowywanie w temperaturze pokojowej.

Results

Szpik kostny i ploidy
W Rysunek 4, pokazujemy reprezentatywną analizę immunofenotypową megakariopoezy w próbkach BM (aspiracji) od pacjentów. Wykreślając frakcję komórkową w stosunku do CD71 i CD31, bramkowaliśmy sześć głównych populacji: CD31^- CD71^- (czerwony), CD31^- CD71⁺ (niebieski), CD31⁺ CD71^- (pomarańczowy), CD31⁺ CD71^środkowy (jasnozielony), CD31⁺ CD71^+...

Discussion

Większość badań koncentrujących się na badaniu megakariopoezy za pomocą cytometrii przepływowej ograniczała się do tej pory do identyfikacji podzbiorów MK przy użyciu tylko markerów powierzchniowych specyficznych dla linii (tj. CD42A/CD42B, CD41/CD61), podczas gdy wcześniejsze etapy różnicowania MK były słabo zbadane. W niniejszym artykule przedstawiamy strategię immunofenotypowania w celu kompleksowej charakterystyki ludzkiej megakariopoezy za pomocą cytometrii przepływowej. Ogólnie rzecz biorąc, chcielibyśmy p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dysza 130 mikronów	BD	643943	wymagana do sortowania MK
5810R Wirówka	Eppendorf		Izolacja i mycie
komórek A-4-62 Rotor kubełkowy	Eppendorf		Izolacja i mycie
komórek Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge	ELITech Group		Zautomatyzowane urządzenie cytologiczne, w którym szkiełka są barwione Mat-Gr& UML; nwald Giemsa
CO2 Inkubator Galaxy 170 S	Eppendorf		Inkubacja komórek
Cytospin 4 Cytospin Thermo	Scientific		Do przygotowania cytospinów
Sorter FACSAria IIu	BD		488 nm i 633 nm
Cytometr przepływowy FACSCanto II		Lasery BD 488 nm , 633 nm i 405 nm
	Olympus		Microphotographs
Olympus Microscope BX 61	Olympus
Microphotographs Zoe Fluorescent Cell Imager	BioRad		Microphotographs
Aby uzyskać PBMCs
Lipidy Cholesterol Bogaty w surowicę dorosłego bydła	Sigma-Aldrich	L4646	lub podobny
Lymphoprep	Stem Cell Technologie	#07801	lub podobne
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P4333	lub podobna
Rekombinowana ludzka erytropoetyna (EPO)	R& D Systems	287-TC-500	lub podobny
Rekombinowany czynnik ludzkich komórek macierzystych (SCF)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC2115	lub podobny
Rekombinowana ludzka trombopoetyna (TPO)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™		Agoniści receptora PHC9514 lub TPO
StemSpan SFEM	Stem Cell Technologies	#09650
Analizy
Albumina surowicy bydlęcej	Merck	A7906-100G	lub podobna
BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	Przeciwciała dla komórek ludzkich pochodzą na ogół od myszy.
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714	lub podobne
BD FACS Koraliki Accudrop	BD	345249
CD31 AF-647	BD	561654	Mysz anty-ludzka
CD31 FITC	Immunostep	31F-100T
CD34 FITC	BD	555821	Mysz anty-ludzka
CD41 PE	BD 555467		Mysz anty-ludzka
CD41 PerCP-Cy5.5	BD	333148	Mysz anty-ludzka
CD42A APC	Immunostep	42AA-100T	Zaobserwowaliśmy niespecyficzne wiązanie... które należy ocenić
CD42A PE	BD		Mysz anty-ludzka
CD42B PerCP	Biolegend	303910	Mysz anty-ludzka
CD49B PE	BD		Mysz anty-ludzka
CD61 FITC	BD	555753	Mysz anty-ludzka
CD71 APC-Cy7	Biolegend	334109	Mysz anty-ludzka
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Ludzki blok BD Fc Blok	BD	564219	Fc - zestaw kontrolny
PE-Cy7	Biolegend	313212	Mysz anty-ludzka
Lineage Cocktail 2 FITC	BD	643397	Mysz anty-ludzka
RNAza	Merck	R6513	lub podobny
Triton X-500	Merck	93443-500ML	lub podobne
Sitka do komórek do sortowania
CellTrics Filtry 100 mikrometrów	Sysmex	04-004-2328	Sitka do komórek
Uwaga: nie określamy ogólnych odczynników/chemikaliów (PBS, EDTA itp.) ani jednorazowych (probówki itp.), ani odczynników określonych w poprzednich opublikowanych i standardowych protokołach  - chyba że określono inaczej.