Method Article

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

DOI:

10.3791/62576

⸱

April 25th, 2021

 ,  , 
1Laboratory for Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agregacja białek jest cechą charakterystyczną zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), choroba Huntingtona (HD) i tak dalej. Do wykrywania i analizowania rozpuszczalnych lub dyfuzyjnych oligomerów lub agregatów białkowych zastosowano spektroskopię korelacji fluorescencji (FCS), która może wykryć prędkość dyfuzji i jasność pojedynczej cząstki przy czułości pojedynczej cząsteczki. Jednak właściwa procedura i know-how w zakresie wykrywania agregacji białek nie były szeroko udostępniane. W tym miejscu przedstawiono standardową procedurę pomiaru FCS właściwości dyfuzyjnych białek podatnych na agregację w lizacie komórkowym i żywych komórkach: związany z ALS karboksylowy fragment 25 kDa białka wiążącego TAR DNA/RNA 43 kDa (TDP25) i dysmutaza ponadtlenkowa 1 (SOD1). Reprezentatywne wyniki pokazują, że część agregatów TDP25 znakowanego białkiem zielonej fluorescencji (GFP) była nieznacznie zawarta w rozpuszczalnej frakcji lizatu komórkowego Neuro2a mysiego nerwiaka zarodkowego. Co więcej, SOD1 znakowany GFP z mutacją związaną z ALS wykazuje wolniejszą dyfuzję w żywych komórkach. W związku z tym wprowadzamy tutaj procedurę wykrywania agregacji białka poprzez jego właściwości dyfuzyjne za pomocą FCS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agregacje białek związane z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona i tak dalej1 są znane jako toksyczne i zakłócają homeostazę białek (proteostazę) w komórkach i organach, co może prowadzić do starzenia się2. Oczekuje się, że klirens agregacji białek będzie strategią terapeutyczną; Jednak substancje chemiczne, które zapobiegają tworzeniu się agregacji białek i rozkładają agregaty białkowe (np. małe cząsteczki lub leki), nie zostały jeszcze ustalone. Co więcej, sposób, w jaki agregacja białek wywiera toksyczność, pozosta....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Materiały i odczynniki

  1. Do hodowli komórkowej należy stosować roztwory wolne od pirogenów i pożywkę (Tabela 1).
  2. Przygotuj roztwory do eksperymentu biochemicznego przy użyciu ultraczystej wody i użyj jako wolne od DNaz / RNaz.
  3. Wybierz odpowiedni FBS dla hodowli komórkowej z procesem kontroli partii. Ponieważ wybrana partia FBS zmienia się regularnie, nie można tutaj przedstawić katalogu i numeru partii dla FBS.
  4. Plazmidowe DNA
    1. Przygotowanie pmeGFP-N15 dla wyrażenia monomeru eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 dla wyrażenia GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy pomiar FCS GFP-TDP25 w lizacie komórkowym i SOD1-G85R-GFP w żywych komórkach. W obu przypadkach udało się uzyskać dodatnią amplitudę i gładkie ACF. Wykazaliśmy, że część GFP-TDP25 ulegająca ekspresji w komórkach Neuro2a została odzyskana we frakcji rozpuszczalnej we wskazanym stanie6. We frakcji rozpuszczalnej lizatu komórkowego wykryto niezwykle jasne cząsteczki fluorescencji w zapisie szybkości zliczania fotonów za pomocą FCS (Rysunek 2A, góra, strzałka). Ta.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jeśli chodzi o kalibrację systemu przed pomiarami, należy użyć tych samych naczyń szklanych, które są używane do pomiaru próbki (np. 8-dołkowa szklana komora przykrywająca lizat komórkowy i szklana podstawa o średnicy 35 mm dla żywych komórek). Ze względu na adsorpcję Rh6G na szkle, jego efektywne stężenie może czasami się zmniejszać. Jeśli tak, należy użyć wysoce stężonego roztworu Rh6G, takiego jak 1 μM, tylko do regulacji otworka. W celu ochrony detektora należy unikać ekstremalnie wysokich szybkości zliczania fotonów.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy ci nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.K. był wspierany przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), przez grant od Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, przez grant z Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) oraz grant in-aid od Hoansha Foundation. M. K. był częściowo wspierany przez JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas " Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) oraz grant JSPS na badania naukowe w obszarach innowacyjnych "Fizyka informacyjna materii ożywionej" (#20H05522).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% (w/v) Trypsyna-1 mmol/L EDTA· Roztwór 4Na z czerwienią fenolową (trypsyna-EDTA)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.201-16945
Naczynia plastikowe 100 mmCORNING430167
35-milimetrowa szklana podstawaIWAKI3910-035Do pomiaru żywych komórek
Plastikowe naczynia 35 mmThermo Fisher Scientific150460
Płyta aluminiowaBio-BikAB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27Carl Zeiss
Obiektyw Skrobak do komórekSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-93100
Membrana filtracyjna z octanu celulozy (0,22 mm)Advantech Toyo25CS020AS
Szklana komora pokrywowa 8-dołkowaIWAKI5232-008Do pomiaru roztworu
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM)Sigma-AldrichD5796podłoże podstawowe
Surowica bydlęca płodu (FBS)biosurowiceWymagane sprawdzenie partii
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019
LSM510 META + ConfoCor3System FCSCarl Zeiss
Mysi nerwiak zarodkowy Komórki Neuro2aATCCCCL-131Linia komórkowa
Opti-MEM IThermo Fisher Scientific31985070
pCAGGSRIKENRDB08938Plazmidowe DNA dla nośnika transfekcji
Roztwór penicyliny-streptomycyny (&razy; 100Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.168-23191
pmeGFP-C1-TDP25Plazmidowe DNA dla TDP25 znakowane monomerycznym eGFP
pmeGFP-N1Plazmidowe DNA do ekspresji monomeru eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85RPlazmidowe DNA dla mutanta G85R SOD1 sprzężonego z ALS oznaczonego monomerycznym
koktajlem inhibitorów proteazySigma-AldrichP8304
) eGFP

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein AggregationFluorescence Correlation SpectroscopyNeurodegenerative DisordersDiffusion PropertiesCell LysateLive Cell MeasurementGFP Tagged ProteinsCurve Fitting AnalysisConfocal MicroscopySoluble Oligomers

Related Articles