Method Article

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

DOI:

10.3791/62576

⸱

April 25th, 2021

 ,  , 
1Laboratory for Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agregacja białek jest cechą charakterystyczną zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Alzheimera (AD), choroba Parkinsona (PD), choroba Huntingtona (HD) i tak dalej. Do wykrywania i analizowania rozpuszczalnych lub dyfuzyjnych oligomerów lub agregatów białkowych zastosowano spektroskopię korelacji fluorescencji (FCS), która może wykryć prędkość dyfuzji i jasność pojedynczej cząstki przy czułości pojedynczej cząsteczki. Jednak właściwa procedura i know-how w zakresie wykrywania agregacji białek nie były szeroko udostępniane. W tym miejscu przedstawiono standardową procedurę pomiaru FCS właściwości dyfuzyjnych białek podatnych na agregację w lizacie komórkowym i żywych komórkach: związany z ALS karboksylowy fragment 25 kDa białka wiążącego TAR DNA/RNA 43 kDa (TDP25) i dysmutaza ponadtlenkowa 1 (SOD1). Reprezentatywne wyniki pokazują, że część agregatów TDP25 znakowanego białkiem zielonej fluorescencji (GFP) była nieznacznie zawarta w rozpuszczalnej frakcji lizatu komórkowego Neuro2a mysiego nerwiaka zarodkowego. Co więcej, SOD1 znakowany GFP z mutacją związaną z ALS wykazuje wolniejszą dyfuzję w żywych komórkach. W związku z tym wprowadzamy tutaj procedurę wykrywania agregacji białka poprzez jego właściwości dyfuzyjne za pomocą FCS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agregacje białek związane z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Huntingtona i tak dalej1 są znane jako toksyczne i zakłócają homeostazę białek (proteostazę) w komórkach i organach, co może prowadzić do starzenia się2. Oczekuje się, że klirens agregacji białek będzie strategią terapeutyczną; Jednak substancje chemiczne, które zapobiegają tworzeniu się agregacji białek i rozkładają agregaty białkowe (np. małe cząsteczki lub leki), nie zostały jeszcze ustalone. Co więcej, sposób, w jaki agregacja białek wywiera toksyczność, pozostaje nieuchwytny. Dlatego, aby promować projekty badawcze związane z agregacją białek, ważne jest wprowadzenie procedur o wysokiej przepustowości, aby po prostu wykrywać agregację białek. Wykrywanie agregacji białek za pomocą przeciwciał rozpoznających konformację agregacji białek i barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla agregacji jest szeroko stosowane3. Jednak trudno jest wykryć agregację, zwłaszcza w żywych komórkach przy użyciu tak klasycznych procedur.

Förster resonance energy transfer (FRET) to procedura do wykrywania agregacji białek i zmian strukturalnych. Jednak FRET nie jest w stanie analizować dynamiki białek (np. dyfuzji i oligomeryzacji białka w żywych komórkach)3. Dlatego wprowadzamy tutaj prosty protokół wykrywania agregacji białek w roztworze (np. Lizacie komórkowym) i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS), która mierzy właściwości dyfuzyjne i jasność cząsteczek fluorescencyjnych z czułością pojedynczej cząsteczki4. FCS to metoda zliczania fotonów przy użyciu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego (LSM). Za pomocą bardzo czułego detektora fotonów i obliczenia funkcji autokorelacji (ACF) czasu nadejścia fotonu, mierzy się czas przejścia i jasność cząsteczek fluorescencyjnych w objętości detekcji. Dyfuzja zwalnia wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej; w ten sposób oddziaływanie międzycząsteczkowe można oszacować za pomocą FCS. Jeszcze silniej wzrost jasności cząsteczki fluorescencji wskazuje na homooligomeryzację cząsteczek. Dlatego FCS jest potężnym narzędziem do wykrywania takiej agregacji białek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Materiały i odczynniki

  1. Do hodowli komórkowej należy stosować roztwory wolne od pirogenów i pożywkę (Tabela 1).
  2. Przygotuj roztwory do eksperymentu biochemicznego przy użyciu ultraczystej wody i użyj jako wolne od DNaz / RNaz.
  3. Wybierz odpowiedni FBS dla hodowli komórkowej z procesem kontroli partii. Ponieważ wybrana partia FBS zmienia się regularnie, nie można tutaj przedstawić katalogu i numeru partii dla FBS.
  4. Plazmidowe DNA
    1. Przygotowanie pmeGFP-N15 dla wyrażenia monomeru eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 dla wyrażenia GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 dla wyrażenia SOD1-G85R-GFP; oraz pCAGGS8 jako nośnik.
      UWAGA: meGFP jest wariantem monomerycznym przenoszącym mutację A206K wzmocnionego GFP (eGFP). TDP25 jest powiązanym z ALS C-końcowym fragmentem TDP-43. SOD1-G85R jest mutantem SOD1 związanym z ALS.
  5. Szczep komórek
    1. Użyj mysiego nerwiaka zarodkowego Neuro2a cells.
      UWAGA: Komórki Neuro2a mają wysoką wydajność transfekcji i wysoką ekspresję białek egzogennych. Do ekspresji TDP25 wymagane są szczepy komórkowe o wysokiej wydajności ekspresji, takie jak komórki Neuro2a lub HEK293. W komórkach HeLa TDP25 nie był w stanie ulegać efektywnej ekspresji.

2. Hodowla komórkowa i transfekcja

  1. Przygotuj plastikowe naczynie o średnicy 100 mm, w którym komórki Neuro2a będą częściowo zlewać się w normalnym pożywce.
    UWAGA: Konieczna jest inkubacja w temperaturze 37 °C przez około 48-72 godziny po poprzednim wysiewie, aż do osiągnięcia półzrębowości.
  2. Usuń nośnik.
  3. Dodać 0,5 ml roztworu trypsyny-EDTA do naczynia do hodowli komórkowych i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 1 minutę.
  4. Dodaj 9,5 ml normalnej pożywki wzrostowej do naczynia i zawieś oderwane komórki.
  5. Używając błękitu trypanowego do barwienia martwych komórek, policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek lub ręcznie. Następnie rozcieńczyć komórki w pożywce hodowlanej (1,0 × 105/ml).
  6. Dodaj 2 ml zawiesiny komórek do plastikowego naczynia o średnicy 35 mm do lizy komórek lub naczynia ze szklaną podstawą do pomiaru żywych komórek.
  7. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 1 dzień.
  8. Następujące przygotowania należy rozpocząć 15 minut przed dniem transfekcji.
  9. Przygotuj dwie probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 100 μl Opti-MEM I do każdej probówki.
  10. W pierwszej probówce wymieszaj 1,0 μg plazmidowego DNA (roztwór A). W drugiej probówce wymieszać 2,5 μl Lipofectaminy 2000 (roztwór B).
    UWAGA: Aby utrzymać wydajność transfekcji, utrzymuj całkowitą ilość DNA na tym samym poziomie. Aby zmniejszyć poziom ekspresji do pomiaru FCS w żywych komórkach, frakcja plazmidowego DNA do ekspresji białka powinna się zmniejszyć (np. 0,2 μg pmeGFP-N1-SOD1-G85R i 0,8 μg mieszaniny pCAGGS). Ponadto należy zachować ten sam stosunek między objętością Lipofectamine 2000 a ilością plazmidowego DNA.
  11. Delikatnie wymieszaj roztwór A i B, dodając po jednym do każdej probówki, a następnie inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (roztwór C).
  12. Dodać roztwór C do pożywki hodowlanej i inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.

3. Liza komórek i wymiana pożywki

  1. Sprawdź ekspresję GFP za pomocą rutynowego mikroskopu.
  2. Usuń podłoże z naczynia.
  3. Dodać 2 ml PBS w temperaturze 25 °C, aby wypłukać pożywkę. Usuń PBS.
  4. Umieść naczynie na aluminiowej płycie na wierzchu pokruszonego lodu.
    UWAGA: Jako sprzęt laboratoryjny używamy płyty aluminiowej o grubości 1 mm wyciętej w niedzielnym sklepie z narzędziami lub dostępnej w handlu.
  5. Dodać 200 μl buforu do lizy w temperaturze 4 °C. Delikatnie wstrząsnąć naczyniem, tak aby bufor był równomiernie rozprowadzony na dnie naczynia.
  6. Zeskrob naczynie za pomocą skrobaka do komórek i odzyskaj lizat z nierozpuszczonymi resztkami komórek w nowej probówce o pojemności 1,5 ml.
  7. Odwirować roztwór o stężeniu 20 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Odzyskać supernatant w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
    UWAGA: Nie zamrażaj lizatu.
  9. W przypadku pomiarów na żywo należy wymienić pożywkę przed pomiarem. Sprawdź przyczepienie ogniw za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. Potwierdź ekspresję za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

4. Kalibracja spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS)

  1. Uruchom system i uruchom oprogramowanie operacyjne. Włącz laser Argon+ (458/477/488/514 nm). Ustabilizuj system przez co najmniej 30 minut.
  2. Ustaw tor optyczny: Rozdzielacz świateł głównych: HFT488; Lustro dichroiczne: NFT600; Filtr barierowy fluorescencyjny: filtr pasmowoprzepustowy 505-540 (BP505-540); Detektor: fotodioda lawinowa (APD)).
  3. Ustaw rozmiar otworu, wprowadzając wartość bezpośrednio (66 μm; 1 jednostka przewiewna).
  4. Dodać roztwór rodaminy 6G (Rh6G) do studzienki szklanej komory nakrywkowej na scenie.
  5. Dodaj zanurzeniową ultraczystą wodę na obiektywie. Nie używaj olejku immersyjnego.
  6. Ustaw komorę na stoliku mikroskopu. Przesuń stół montażowy do odpowiedniej pozycji.
  7. Skoncentruj się na górnej powierzchni szkła, mierząc rozproszone światło od powierzchni szkła. Po opuszczeniu soczewki obiektywu do dołu obróć pokrętło ostrości zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby wyregulować.
    UWAGA: Sprawdź kierunek obracania pokrętła ostrości, ponieważ jest ono przeciwne między tymi wyprodukowanymi w Japonii i Niemczech.
  8. Podnieś ogniskową 200 μm ponad górną powierzchnię szkła, aby obserwować wnętrze roztworu.
  9. Kliknij opcję Szybkość zliczania i monitoruj szybkość zliczania fotonów.
  10. Stopniowo zwiększaj wartość przestrajalnych filtrów akustyczno-optycznych (AOTF) (np. transmisja lasera wzbudzenia), tak aby wartość szybkości zliczania była większa niż 10 kHz.
  11. Kliknij opcję Regulacja otworków i otwórz kreatora regulacji otworków. Znajdź pozycję otworkową z najwyższą (szczytową) liczbą fotonów zarówno na osi x, jak i y.
  12. Obróć pierścień korekcyjny soczewki obiektywu tak, aby wartość liczby na cząsteczkę (CPM) była najwyższa.
    UWAGA: Ponieważ podana tutaj grubość szkła nakrywkowego komory wynosi 0,12-0,17 mm, pierścień korekcyjny znajduje się mniej więcej na minimalnym poziomie lub zaledwie kilka obrotów od niego, gdzie CPM jest maksymalny.
  13. Stopniowo zmniejszaj wartość AOTF, tak aby wartość CPM wynosiła 2-3 kHz.
  14. Uzyskaj funkcję autokorelacji (ACF) Rh6G przez 90 s.
  15. Po zakończeniu pomiaru kliknij przycisk Dopasuj, aby przeprowadzić analizę dopasowania krzywej.
  16. Wybierz model jednoskładnikowej dyfuzji trójwymiarowej (3D) ze stanem trypletowym.
    UWAGA: Rh6G jest monodyspersyjny i jednoskładnikowy dyfuzyjny ze stanem trypletowym.
  17. Ustaw czas rozpoczęcia montażu, przesuwając czerwoną linię. Kliknij opcję Dopasuj wszystko i sprawdź odchylenie pasowania. Po wykonaniu dopasowania krzywej upewnij się, że czas dyfuzji (DT) i parametr konstrukcji (SP) mieszczą się w przybliżeniu w zakresie odpowiednio 20-30 μs i 4-8.
  18. Zapamiętaj wartość parametru konstrukcyjnego. Wartość SP należy wykorzystać do analizy dopasowania krzywej wszystkich ACF zmierzonych tego samego dnia, w tych samych warunkach optycznych i przy użyciu tego samego rodzaju szklanej podstawki lub komorowego zestawu szkła nakrywkowego na stoliku mikroskopu.

5. Pomiar FCS w lizacie komórkowym

  1. Przygotować lizaty komórkowe (patrz wyżej).
  2. Umieść lizat w komorze ze szkłem nakrywkowym. Umieść pokrywkę, aby uniknąć wysuszenia, i pokrywę sceny, aby uzyskać lekkie zacienienie.
  3. Ustaw warunek akwizycji, moc lasera, czas pomiaru i powtórzenia.
  4. Kliknij opcję Count rate (Szybkość zliczania) i dostosuj wartość AOTF lasera tak, aby wartość CPM była większa niż 1 kHz.
  5. Wykonaj pomiar próbny przez 1 minutę. Sprawdź, czy obliczony ACF wykazuje dodatnią amplitudę i płynny zanik.
  6. Wykonaj główny pomiar przez 5 min.
    UWAGA: Całkowity czas pomiaru jest stopniowo zwiększany, aż kształt ACF nie zmieni się, nawet jeśli czas pomiaru zostanie zwiększony.
  7. Kliknij przycisk Dopasuj, aby przeprowadzić analizę dopasowania krzywej.
  8. Wybierz model dla dwuskładnikowej dyfuzji 3D ze stanem trypletowym. Pamiętaj, aby wprowadzić wartość SP i zmienić jej ustawienie na "Stałe", a nie "Wolne" przed kliknięciem Dopasuj wszystko.
  9. Wyeksportuj dopasowaną tabelę jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami.
  10. W razie potrzeby wyeksportuj rekord ACF i Count rate jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami.

6. Pomiar FCS w żywych komórkach

  1. Przed pomiarem wymień pożywkę na nową.
  2. Użyj inkubatora z temperaturą. Ustaw naczynie z kulturą komórkową na stoliku mikroskopu.
  3. Potwierdź ostrość i pozycję za pomocą mikropu konfokalnego. Wybierz celę pomiarową. Powiększ i dostosuj położenie komórki. Uzyskaj obrazy fluorescencyjne komórki wykazującej ekspresję GFP w trybie niskiej prędkości skanowania.
  4. Wybierz pozycję pomiaru FCS za pomocą opcji Pozycja w sekcji "FCS".
  5. Wybierz co najmniej jeden punkt pomiarowy FCS za pomocą krzyżyka (Rysunek 1).
  6. Zmierz ACF przez 1 min.
    UWAGA: Ponieważ białka fluorescencyjne mają tendencję do fotowybielania w żywych komórkach z powodu powolnego ruchu w porównaniu z roztworem, czas pomiaru powinien być minimalny. Na ogół trudno jest uzyskać ACF w komórce tak płynnie, jak pomiary roztworu, ponieważ długotrwały pomiar doprowadzi do fotowybielania białek fluorescencyjnych.
  7. Kliknij przycisk Dopasuj, aby przeprowadzić analizę dopasowania krzywej przy użyciu modelu dwuskładnikowej dyfuzji 3D ze stanem trypletowym.
    UWAGA: W przypadku pomiarów żywych komórek model dwuskładnikowej dyfuzji 3D ze stanem trypletowym byłby lepszy, ponieważ empirycznie trudno jest zmniejszyć wartość chi-kwadrat za pomocą jednoskładnikowego modelu dyfuzji 3D ze względu na istnienie różnych ruchomych komponentów w żywej komórce. Ale nawet przy użyciu modelu do trójskładnikowej dyfuzji 3D, składniki dyfuzyjne zwykle nie są rozdzielane w porównaniu z użyciem modelu dla dwuskładnikowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy pomiar FCS GFP-TDP25 w lizacie komórkowym i SOD1-G85R-GFP w żywych komórkach. W obu przypadkach udało się uzyskać dodatnią amplitudę i gładkie ACF. Wykazaliśmy, że część GFP-TDP25 ulegająca ekspresji w komórkach Neuro2a została odzyskana we frakcji rozpuszczalnej we wskazanym stanie6. We frakcji rozpuszczalnej lizatu komórkowego wykryto niezwykle jasne cząsteczki fluorescencji w zapisie szybkości zliczania fotonów za pomocą FCS (Rysunek 2A, góra, strzałka). Ta...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jeśli chodzi o kalibrację systemu przed pomiarami, należy użyć tych samych naczyń szklanych, które są używane do pomiaru próbki (np. 8-dołkowa szklana komora przykrywająca lizat komórkowy i szklana podstawa o średnicy 35 mm dla żywych komórek). Ze względu na adsorpcję Rh6G na szkle, jego efektywne stężenie może czasami się zmniejszać. Jeśli tak, należy użyć wysoce stężonego roztworu Rh6G, takiego jak 1 μM, tylko do regulacji otworka. W celu ochrony detektora należy unikać ekstremalnie wysokich szybkości zliczania fotonów...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy ci nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.K. był wspierany przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), przez grant od Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, przez grant z Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) oraz grant in-aid od Hoansha Foundation. M. K. był częściowo wspierany przez JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas " Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) oraz grant JSPS na badania naukowe w obszarach innowacyjnych "Fizyka informacyjna materii ożywionej" (#20H05522).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% (w/v) Trypsyna-1 mmol/L EDTA· Roztwór 4Na z czerwienią fenolową (trypsyna-EDTA)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.201-16945
Naczynia plastikowe 100 mmCORNING430167
35-milimetrowa szklana podstawaIWAKI3910-035Do pomiaru żywych komórek
Plastikowe naczynia 35 mmThermo Fisher Scientific150460
Płyta aluminiowaBio-BikAB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27Carl Zeiss
Obiektyw Skrobak do komórekSumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-93100
Membrana filtracyjna z octanu celulozy (0,22 mm)Advantech Toyo25CS020AS
Szklana komora pokrywowa 8-dołkowaIWAKI5232-008Do pomiaru roztworu
Zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium firmy Dulbecco (DMEM)Sigma-AldrichD5796podłoże podstawowe
Surowica bydlęca płodu (FBS)biosurowiceWymagane sprawdzenie partii
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019
LSM510 META + ConfoCor3System FCSCarl Zeiss
Mysi nerwiak zarodkowy Komórki Neuro2aATCCCCL-131Linia komórkowa
Opti-MEM IThermo Fisher Scientific31985070
pCAGGSRIKENRDB08938Plazmidowe DNA dla nośnika transfekcji
Roztwór penicyliny-streptomycyny (&razy; 100Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.168-23191
pmeGFP-C1-TDP25Plazmidowe DNA dla TDP25 znakowane monomerycznym eGFP
pmeGFP-N1Plazmidowe DNA do ekspresji monomeru eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85RPlazmidowe DNA dla mutanta G85R SOD1 sprzężonego z ALS oznaczonego monomerycznym
koktajlem inhibitorów proteazySigma-AldrichP8304
) eGFP

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
  3. Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
  4. Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
  5. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  6. Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230(2016).
  7. Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
  8. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  9. Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
  10. Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
  11. Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
  12. Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
  13. Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
  14. Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662(2019).
  15. Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  17. Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
  18. Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
  19. Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein AggregationFluorescence Correlation SpectroscopyNeurodegenerative DisordersDiffusion PropertiesCell LysateLive Cell MeasurementGFP Tagged ProteinsCurve Fitting AnalysisConfocal MicroscopySoluble Oligomers

Related Articles