Artykuł metodologiczny

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

DOI:

10.3791/62577

⸱

23 maja 2021

 , 
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół identyfikuje białka odpornościowe enzymów bakteriobójczych: kolicyny E3 i bakteriocyny, wytwarzanych przez patogenny szczep Escherichia coli za pomocą indukcji antybiotyków i identyfikowanych przez tandemową spektrometrię mas MALDI-TOF-TOF i odgórną analizę proteomiczną za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Białko odpornościowe kolicyny E3 (Im3) i białko odpornościowe bakteriocyny (Im-Bac) zidentyfikowano na podstawie widocznych jonów fragmentacyjnych typu b i / lub y generowanych przez rozszczepienie szkieletu polipeptydowego (PBC) po stronie C-końcowej reszt kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego i asparaginy w mechanizmie fragmentacji efektu kwasu asparaginowego. Oprogramowanie szybko skanuje sekwencje białek in silico pochodzące z sekwencjonowania całego genomu szczepu bakteryjnego. Oprogramowanie iteracyjnie usuwa również reszty aminokwasowe sekwencji białka w przypadku, gdy sekwencja dojrzałego białka zostanie skrócona. Pojedyncza sekwencja białka zawierała jony o masie i fragmentach zgodne z jonami wykrytymi dla każdego białka odpornościowego. Sekwencja kandydująca została następnie ręcznie sprawdzona, aby potwierdzić, że wszystkie wykryte jony fragmentacyjne mogą zostać przypisane. N-końcowa metionina Im3 została usunięta po translacji, podczas gdy Im-Bac miał pełną sekwencję. Ponadto stwierdziliśmy, że tylko dwa lub trzy niekomplementarne jony fragmentacyjne utworzone przez PBC są niezbędne do zidentyfikowania prawidłowej sekwencji białka. Na koniec zidentyfikowano promotor (skrzynkę SOS) przed genami przeciwbakteryjnymi i odpornościowymi w genomie plazmidowym szczepu bakteryjnego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza i identyfikacja niestrawionych białek za pomocą spektrometrii mas jest określana jako analiza proteomiczna z góry na dół1,2,3,4. Jest to obecnie uznana technika, która wykorzystuje jonizację elektronopryskową (ESI)5 i analizatory mas o wysokiej rozdzielczości6, oraz zaawansowane techniki dysocjacji, np. dysocjacja transferu elektronów (ETD), dysocjacja wychwytu elektronów (ECD)7, ultrafioletowa fotodysocjacja (UV-PD)8, itp.

Inną techniką miękkiej jonizacji jest desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI)9,10,11, która była mniej szeroko wykorzystywana do analizy odgórnej, częściowo dlatego, że jest głównie sprzężona z analizatorami mas czasu przelotu (TOF), które mają ograniczoną rozdzielczość w porównaniu do innych analizatorów masy. Pomimo tych ograniczeń, instrumenty MALDI-TOF i MALDI-TOF-TOF zostały wykorzystane do szybkiej analizy odgórnej czystych białek oraz frakcjonowanych i niefrakcjonowanych mieszanin białek. Do identyfikacji czystych białek szczególnie przydatną techniką jest rozpad w źródle (ISD), ponieważ umożliwia analizę jonów fragmentacyjnych ISD za pomocą spektrometrii mas (MS), a także tandemową spektrometrię mas (MS/MS) fragmentów jonów białkowych, dostarczając fragment specyficzny dla sekwencji, często z końców N i C białka docelowego, analogicznie do sekwencjonowania Edmana12,13. Wadą podejścia ISD jest to, że podobnie jak w sekwencjonowaniu Edmana, próbka musi zawierać tylko jedno białko. Jedno zapotrzebowanie na białko wynika z potrzeby jednoznacznego przypisania jonów fragmentacyjnych do jonu prekursorowego. Jeśli w próbce obecne są dwa lub więcej białek, może być trudno przypisać, które jony fragmentacyjne należą do których jonów prekursorowych.

Przypisywanie jonów fragmentacyjnych/prekursorowych można rozwiązać za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Podobnie jak w każdym klasycznym eksperymencie MS/MS, jony prekursorowe są masowo selekcjonowane/izolowane przed fragmentacją, a wykryte jony fragmentacyjne można przypisać określonemu jonowi prekursorowemu. Jednak techniki dysocjacji dostępne dla tego podejścia są ograniczone głównie do dysocjacji wywołanej zderzeniem o wysokiej energii (HE-CID)14 lub rozpadu po źródle (PSD)15,16. HE-CID i PSD są najbardziej skuteczne w fragmentacji peptydów i małych białek, a pokrycie sekwencji może być w niektórych przypadkach ograniczone. Ponadto PSD powoduje rozszczepienie szkieletu polipeptydowego (PBC) głównie po stronie C-końcowej reszt kwasu asparaginowego i glutaminowego w wyniku zjawiska zwanego efektem kwasu asparaginowego17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS znalazł również niszowe zastosowanie w identyfikacji taksonomicznej mikroorganizmów: bacteria21, fungi22, oraz viruses23. Na przykład widma MS są wykorzystywane do identyfikacji nieznanych bakterii przez porównanie z biblioteką referencyjną widm MS znanych bakterii przy użyciu algorytmów rozpoznawania wzorców do porównania. Podejście to okazało się bardzo skuteczne ze względu na swoją szybkość i prostotę, chociaż wymagało całonocnej hodowli izolatu. Jony białkowe wykryte za pomocą tego podejścia (zwykle poniżej 20 kDa) składają się na odcisk palca MS umożliwiający rozdzielczość taksonomiczną na poziomie rodzaju i gatunku, a w niektórych przypadkach na poziomie podgatunku24 i poziom szczepu25,26. Pozostaje jednak potrzeba nie tylko taksonomicznej klasyfikacji potencjalnie patogennych mikroorganizmów, ale także identyfikacji określonych czynników wirulencji, toksyn i czynników oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR). Aby to osiągnąć, masa peptydów, białek lub małych cząsteczek jest mierzona przez MS, a następnie izolowana i fragmentowana przez MS/MS.

Bakterie chorobotwórcze często przenoszą okrągłe fragmenty DNA zwane plazmidami. Plazmidy, wraz z profagami, są głównym wektorem poziomego transferu genów między bakteriami i są odpowiedzialne za szybkie rozprzestrzenianie się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe i innych czynników wirulencji wśród bakterii. Plazmidy mogą również przenosić geny przeciwbakteryjne (AB), np. kolicynę i bakteriocynę. Kiedy te geny ulegają ekspresji, a białka są wydzielane, działają w celu wyłączenia maszynerii translacji białek sąsiednich bakterii zajmujących tę samą niszę środowiskową27. Jednak te enzymy bakteriobójcze mogą również stanowić zagrożenie dla gospodarza, który je wytworzył. W konsekwencji gen ulega koekspresji przez gospodarza, który specyficznie hamuje funkcję enzymu AB i jest określany jako jego białko odpornościowe (Im).

Antybiotyki uszkadzające DNA, takie jak mitomycyna-C i cyprofloksacyna, są często używane do wywołania odpowiedzi SOS u E. coli (STEC) produkującej toksynę Shiga, której gen toksyny Shiga (stx) znajduje się w genomie profaga obecnym w genomie bakteryjnym28. Wcześniej zastosowaliśmy indukcję antybiotyków, MALDI-TOF-TOF-MS/MS i analizę proteomiczną z góry na dół, aby wykryć i zidentyfikować typy i podtypy Stx wytwarzane przez szczepy STEC29,30,31,32. W poprzedniej pracy szczep STEC O113:H21 RM7788 hodowano przez noc na pożywkach agarowych z dodatkiem mitomycyny-C. Jednak zamiast wykryć przewidywaną podjednostkę B Stx2a w m/z ~7816, inny jon białkowy wykryto w m / z ~7839 i zidentyfikowano jako hipotetyczne białko kodowane plazmidem o nieznanej funkcji33. W obecnej pracy zidentyfikowaliśmy dwa kodowane plazmidem białka AB-Im wytwarzane przez ten szczep za pomocą indukcji antybiotyków, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, oraz odgórnej analizy proteomicznej przy użyciu samodzielnego oprogramowania opracowanego do przetwarzania i skanowania sekwencji białek in silico pochodzących z sekwencjonowania całego genomu (WGS). Ponadto w oprogramowaniu uwzględniono możliwość modyfikacji po translacji (PTM) polegającej na obcinaniu sekwencji. Białka odpornościowe zidentyfikowano za pomocą tego oprogramowania na podstawie zmierzonej masy dojrzałego jonu białkowego i specyficznych dla sekwencji jonów fragmentacyjnych z PBC spowodowanych działaniem kwasu asparaginowego i wykrytych przez MS/MS-PSD. Na koniec zidentyfikowano promotor przed genami AB/Im w genomie plazmidowym, który może wyjaśniać ekspresję tych genów, gdy szczep ten jest narażony na działanie antybiotyku uszkadzającego DNA. Fragmenty tej pracy zostały zaprezentowane na National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17-20 sierpnia 2020 r.)34.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki mikrobiologicznej

  1. Zaszczepić 25 ml bulionu Luria (LB) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml szczepem E. coli O113:H21 RM7788 (lub innym szczepem bakteryjnym) z bulionu glicerolowego za pomocą sterylnej pętli o pojemności 1 μl. Zakryć probówkę i przeprowadzić hodowlę wstępną w temperaturze 37 °C, wstrząsając (200 obr./min) przez 4 godziny.
  2. Podwielokrotność 100 μl wstępnie wyhodowanego bulionu i rozprowadzić na płytce agarowej LB uzupełnionej 400 lub 800 ng/ml mitomycyny-C. Płytki agarowe do hodowli sadzić statycznie przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Szczepy STEC są mikroorganizmami chorobotwórczymi. Wszystkie manipulacje mikrobiologiczne, poza hodowlą, należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL-2.
  3. Zebrać komórki bakteryjne z pojedynczych widocznych kolonii za pomocą sterylnej pętli o pojemności 1 μl i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 2,0 ml wyłożonej pierścieniem O-ring, zawierającej 300 μl wody klasy HPLC. Zakryj probówkę, krótko zwiruj i odwiruj przy 11 337 x g przez 2 minuty, aby granulować komórki.

2. Spektrometria mas

  1. Umieścić 0,75 μl podwielokrotności supernatantu próbki na tarczy MALDI ze stali nierdzewnej i pozostawić do wyschnięcia. Pokryć wysuszoną plamkę próbki 0,75 μl podwielokrotnością nasyconego roztworu kwasu synapinowego w 33% acetonitrylu, 67% wodzie i 0,2% kwasie trifluorooctowym. Pozostaw miejsce do wyschnięcia.
  2. Analizować wysuszone plamy próbek za pomocą spektrometru mas MALDI-TOF-TOF.
    1. Po załadowaniu celu MALDI do spektrometru mas należy kliknąć przycisk akwizycji w trybie liniowym MS w oprogramowaniu do akwizycji. Wprowadź zakres m/z do analizy, wprowadzając m/z dolnej i górnej granicy (np. od 2 kDa do 20 kDa) w odpowiednich polach w oprogramowaniu metody akwizycji.
    2. Kliknij miejsce próbki do analizy w szablonie docelowym MALDI w oprogramowaniu. Następnie naciśnij lewy przycisk myszy i przeciągnij kursor myszy nad miejsce próbki, aby określić prostokątny obszar, który ma zostać pobrany do ablacji/jonizacji laserowej. Zwolnij przycisk myszy, a akwizycja zostanie zainicjowana. Zbierz 1 000 śrutów laserowych dla każdego miejsca próbki.
      UWAGA: Akwizycja danych jest wyświetlana w czasie rzeczywistym w oknie akwizycji oprogramowania.
    3. Jeśli nie zostaną wykryte żadne jony, zwiększ intensywność lasera, regulując przesuwaną skalę w obszarze Intensywność lasera w oprogramowaniu, aż zostanie wykryty sygnał jonów białkowych. Jest to określane jako threshold.
      UWAGA: Przed analizą plamki próbki należy zewnętrznie skalibrować przyrząd w trybie liniowym MS z kalibrantami białkowymi, których m/z obejmują analizowany zakres, np. stany naładowania +1 i +2 kalibrów białkowych: cytochromu C, lizozymu i mioglobiny obejmują zakres masowy od 2 kDa do 20 kDa. Masa pośrednia w określonym zakresie mas jest używana jako masa skupiona, np. 9 kDa. Masa ogniskowa to jon, którego m/z jest optymalnie skupiony do wykrycia przez detektor liniowy.
    4. Po zakończeniu akwizycji w trybie liniowym MS kliknij przycisk Akwizycja w trybie odbicia MS/MS w oprogramowaniu do akwizycji. Wprowadź masę prekursora, która ma zostać poddana analizie, w polu Masa prekursora. Następnie wprowadź szerokość izolacji (w Da) do okna masy prekursora dla strony o niskiej i dużej masie masy prekursora, np. ±100 Da.
    5. Kliknij przycisk CID Off. Kliknij przycisk Metastable Suppressor ON. Dostosuj intensywność lasera do co najmniej 90% jego maksymalnej wartości, regulując przesuwaną listwę skali pod intensywnością lasera w oprogramowaniu.
    6. Kliknij miejsce próbki do analizy w szablonie docelowym MALDI w oprogramowaniu. Następnie naciśnij lewy przycisk myszy i przeciągnij kursor myszy nad miejsce próbki, aby określić prostokątny obszar, który ma być próbkowany do ablacji/jonizacji laserowej. Zwolnij przycisk myszy, a akwizycja zostanie zainicjowana. Zbierz 10 000 śrutów laserowych dla każdego miejsca próbki.
      UWAGA: Przed analizą punktową próbki przyrząd powinien być zewnętrznie skalibrowany w trybie reflektronu MS/MS przy użyciu jonów fragmentacyjnych z rozpadu po źródle (PSD) o stanie naładowania +1 alkilowanej tioredoksyny35.
  3. Nie przetwarzaj surowych danych MS. Przetwarzaj surowe dane MS/MS-PSD, wykonując następującą sekwencję kroków w określonej kolejności: zaawansowana korekcja linii bazowej (32, 0,5, 0,0), a następnie usuwanie szumów (dwa odchylenia standardowe), a następnie wygładzanie Gaussa (31 punktów).
  4. Ręcznie sprawdź dane MS/MS-PSD pod kątem obecności widocznych jonów fragmentacyjnych generowanych przez PBC19,20.
  5. Oceń dane MS/MS w odniesieniu do bezwzględnej i względnej obfitości jonów fragmentacyjnych oraz ich stosunku sygnału do szumu (S/N). Do identyfikacji białek należy używać tylko najobficiej występujących jonów fragmentacyjnych, zwłaszcza jeśli dane MS/MS-PSD są zaszumione.

3. Budowa bazy danych białek in silico

  1. Wygeneruj plik tekstowy zawierający sekwencje białek in silico szczepu bakteryjnego, które zostaną zeskanowane przez oprogramowanie Protein Biomarker Seeker w celu identyfikacji białka. Sekwencje białek pochodzą z sekwencjonowania całego genomu (WGS) analizowanego szczepu (lub szczepu blisko spokrewnionego).
  2. Wejdź na stronę NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), aby pobrać około 5 000 sekwencji białkowych określonego szczepu bakterii (np. Escherichia coli O113:H21 szczep RM7788) poddanego analizie. Maksymalny rozmiar pobieranych sekwencji to 200.
    1. W związku z tym skopiuj i wklej 25 pobrań do jednego pliku tekstowego. Wybierz format FASTA (tekstowy) dla każdego pobieranego pliku.

4. Oprogramowanie do obsługi Protein Biomarker Seeker

  1. Kliknij dwukrotnie plik wykonywalny Protein Biomarker Seeker. Pojawi się okno graficznego interfejsu użytkownika (GUI) (Rysunek 1, górny panel).
  2. Wprowadź masę biomarkera białkowego (mierzoną w trybie liniowym MS) do pola masy dojrzałego białka. Następnie wprowadź błąd pomiaru masy w polu Tolerancja masy. Standardowy błąd pomiaru masy wynosi ±10 Da dla białka 10 000 Da.
  3. Opcjonalnie kliknij przycisk Kalkulator masy białka komplementarnego jonu b/y, aby obliczyć masę białka z przypuszczalnej pary jonów komplementarnych fragmentów (CFIP lub b/y). Pojawi się wyskakujące okienko, Kalkulator Masy Białkowej, (Rysunek 1, dolny panel).
    1. Wprowadź m/z domniemanego CFIP i kliknij przycisk Dodaj parę. Pojawi się obliczona masa białka.
    2. Skopiuj i wklej tę liczbę w polu Dojrzała masa białkowa i zamknij okno Kalkulator masy białkowej.
  4. Wybierz długość peptydu sygnałowego N-końca, klikając pole Ustaw ograniczenie pozostałości. Pojawi się wyskakujące okienko z przesuwaną skalą i kursorem. Przesuń kursor na żądaną długość peptydu sygnałowego (maksymalnie 50). Jeśli nie zostanie wybrana żadna długość peptydu sygnału, oprogramowanie wykona nieograniczone obcinanie sekwencji.
  5. W warunku jonów fragmentacyjnych w graficznym interfejsie użytkownika wybierz reszty do rozszczepienia szkieletu polipeptydowego (PBC). Kliknij na pola jednej lub więcej pozostałości: D, E, N i/lub P.
    1. Kliknij przycisk Wprowadź jony fragmentacyjne (+1) do przeszukania. Pojawi się wyskakujące okienko Fragment Page. Następnie kliknij przycisk Dodaj jon fragmentu, który odpowiada liczbie jonów fragmentacyjnych do wprowadzenia, tj. jedno kliknięcie dla każdego jonu fragmentu. Pojawi się pole rozwijane dla każdego jonu fragmentu, który ma zostać wprowadzony.
    2. Wprowadź m/z jonów fragmentacyjnych i związaną z nimi tolerancję m/z. Po zakończeniu kliknij przycisk Zapisz i zamknij.
      UWAGA: Rozsądna tolerancja m/z wynosi ±1,5.
    3. Wybierz minimalną liczbę jonów fragmentacyjnych, które muszą zostać dopasowane do identyfikacji, przewijając do żądanej liczby w polu po prawej stronie opcji Ile jonów fragmentacyjnych musi zostać dopasowanych.
      UWAGA: Trzy dopasowania powinny być wystarczające.
    4. Wybierz reszty cysteiny, które mają być w stanie utlenionym, klikając odpowiednie kółko. Jeśli po przeszukaniu nie zostaną znalezione żadne identyfikacje białek, powtórz wyszukiwanie z cysteinami w stanie zredukowanym. Jeżeli po przeszukaniu nie zostaną znalezione żadne identyfikacje, należy zwiększyć tolerancję jonów odłamkowych do ±3 i powtórzyć poszukiwania.
  6. W ustawieniach pliku kliknij przycisk Wybierz plik FAPSA, aby przeglądać i wybierać plik FASTA (tekstowy) zawierający sekwencje białek in silico szczepu bakteryjnego wcześniej skonstruowane w krokach protokołu od 3.1 do 3.2. Następnie wybierz folder wyjściowy i utwórz nazwę pliku wyjściowego.
  7. Kliknij przycisk Uruchom wyszukiwanie we wpisach plików. Pojawi się wyskakujące okienko zatytułowane Potwierdź parametry wyszukiwania (Rysunek 1, dolny panel), wyświetlające parametry wyszukiwania przed rozpoczęciem wyszukiwania.
  8. Jeśli parametry wyszukiwania są poprawne, kliknij przycisk Rozpocznij wyszukiwanie. Jeśli parametry wyszukiwania nie są poprawne, kliknij przycisk Anuluj i ponownie wprowadź poprawne parametry. Po zainicjowaniu wyszukiwania okno parametrów zamyka się i pojawia się nowe wyskakujące okienko z paskiem postępu (Rysunek 1, dolny panel) pokazujące postęp wyszukiwania i bieżące zestawienie liczby znalezionych identyfikatorów.
  9. Po zakończeniu wyszukiwania (kilka sekund) pasek postępu zamyka się automatycznie, a podsumowanie wyszukiwania jest wyświetlane w polu Dziennik GUI (Rysunek 2, górny panel). Ponadto pojawi się również nowe wyskakujące okienko wyświetlające identyfikację białka, jeśli taka istnieje (Rysunek 2, dolny panel).
    UWAGA: Sekwencje białek in silico z nierozpoznanymi resztami, np. U lub X, są automatycznie pomijane w analizie, a sekwencje te są następnie zgłaszane z oddzielnym wyskakującym okienkiem, aby ostrzec operatora, które (jeśli w ogóle) sekwencje zostały pominięte po zakończeniu wyszukiwania.

5. Potwierdzenie sekwencji białka po wyszukiwaniu

  1. Potwierdź poprawność sekwencji kandydackiej za pomocą analizy ręcznej.
    UWAGA: Celem oprogramowania Protein Biomarker Seeker jest identyfikacja sekwencji białka z dużą dokładnością poprzez wyeliminowanie wielu ewidentnie nieprawidłowych sekwencji białek z rozważań i włączenie skrócenia sekwencji jako możliwego PTM w dojrzałym białku. Ponieważ liczba zwracanych możliwych sekwencji kandydujących jest niewielka, ręczne potwierdzanie jest możliwe do opanowania.
  2. Wygeneruj tabelę średnich m/z jonów fragmentacyjnych typu b i y sekwencji kandydacyjnej przy użyciu dowolnego oprogramowania do spektrometrii mas lub proteomiki posiadającego taką funkcjonalność. Porównaj średnią m/z jonów fragmentacyjnych in silico po stronie C-końcowej reszt D, E i N (oraz po stronie N-końcowej reszt P) z m/z widocznych jonów fragmentacyjnych z danych MS/MS-PSD.
    UWAGA: Najbardziej widoczne jony fragmentacyjne MS/MS-PSD powinny być łatwo dopasowane do jonów fragmentacyjnych in silico związanych z D, E i N. Jednak mechanizm fragmentacji efektu kwasu asparaginowego jest mniej wydajny w pobliżu N- lub C-końców sekwencji białka36.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 3 (górny panel) pokazuje MS STEC O113:H21 szczep RM7788 hodowany przez noc na LBA uzupełniony 400 ng/ml mitomycyny-C. Piki w m/z 7276, 7337 i 7841 zostały wcześniej zidentyfikowane odpowiednio jako białko szoku zimnego C (CspC), białko szoku zimnego E (CspE) i białko plazmidowe o nieznanej funkcji33. Jon białkowy w m/z 9780 [M+H]+ był analizowany przez MS/MS-PSD, jak pokazano na Rysunek 3 (dolny panel). Jon prekursorowy wyizolowano za ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zagadnienia dotyczące protokołu
Głównymi zaletami obecnego protokołu są jego szybkość, prostota przygotowania próbek oraz użycie przyrządu, który jest stosunkowo łatwy w obsłudze, szkoleniu i konserwacji. Chociaż oddolna i odgórna analiza proteomiczna za pomocą chromatografii cieczowej-ESI-HR-MS jest wszechobecna i pod wieloma względami znacznie lepsza od odgórnej metodą MALDI-TOF-TOF, wymaga więcej czasu, pracy i wiedzy. Złożoność instrumentów może często wpływać na to, czy niektóre platformy instr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oprogramowanie Protein Biomarker Seeker jest dostępne za darmo (bez kosztów) po skontaktowaniu się z Cliftonem K. Fagerquistem pod adresem clifton.fagerquist@usda.gov. Pragniemy podziękować za wsparcie tych badań przez ARS, USDA, CRIS grant: 2030-42000-051-00-D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oprogramowanie Explorer serii 4000AB SciexWersja 3.5.3
4800 Plus Analizator MALDI TOF/TOFAB Sciex
Acetonitryl Optima LC / MS klasaFisher ChemicalA996-1
BSL-2 Szafa na zagrożenia biologiczneThe Baker CompanySG403A-HE
Cytochrome-CSigmaC2867-10MG
Oprogramowanie Data ExplorerAB SciexWersja 4.9
Zestaw do redukcji i alkilowania białekFocus G-Biosciences786-231
Oprogramowanie GPMAWLighthouseData Version 10.0
InkubatorVWR9120973
LB AgarInvitrogen22700-025
Luria BrothInvitrogen12795-027
LysozymeSigmaL4919-1G
, 2 mL, nakrętka, O-ringFisher Scientific02-681-343
Wirówka MiniSpin PlusEppendorf22620207
Mitomycyna-C (z paciorkowców)Sigma-AldrichM0440-5MG
MioglobinaSigmaM5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420Thermo ScientificModel 420
Kwas SinapinicThermo Scientific1861580
Sterylne pętle 1 uLFisher Scientific22-363-595
Tioredoksyna (E. coli, rekombinowana)SigmaT0910-1MG
Kwas trifluorooctowySigma-Aldrich299537-100G
Woda Optima LC/MS klasaFisher ChemicalW6-4
Probówki do mikrowirówek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136(2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841(2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001(2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924(2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255(2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460(2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , Palm Springs, CA. (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Proteomika top downspektrometria masodporno na kolicyn E3odporno na bakteriocynyfragmentacja bia ekindukcja antybiotykamiidentyfikacja sekwencji bia kowej

Powiązane artykuły