Artykuł metodologiczny

Wybór nanociał hamujących ukierunkowanych na transporter za pomocą elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM)

DOI:

10.3791/62578

⸱

3 maja 2021

 , 
1Biozentrum, University of Basel

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanociała są ważnymi narzędziami w biologii strukturalnej i stanowią ogromny potencjał dla rozwoju terapii. Jednak wybór nanociał o właściwościach hamujących może być wyzwaniem. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM) do klasyfikacji nanociał hamujących i niehamujących ukierunkowanych na elektrogeniczne transportery błonowe.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciwciała jednodomenowe (nanociała) były szeroko stosowane w badaniach mechanistycznych i strukturalnych białek i mają ogromny potencjał jako narzędzia do rozwoju terapii klinicznych, z których wiele zależy od hamowania białek błonowych, takich jak transportery. Jednak większość metod stosowanych do określania zahamowania aktywności transportowej jest trudna do wykonania w procedurach o wysokiej przepustowości i zależy od dostępności oznakowanych substratów, komplikując w ten sposób badania przesiewowe dużych bibliotek nanotonów. Elektrofizjologia membranowa z solidnym nośnikiem (SSM) jest metodą wysokoprzepustową, stosowaną do charakteryzowania transporterów elektrogenicznych oraz pomiaru ich kinetyki transportu i hamowania. W tym miejscu pokazujemy implementację elektrofizjologii opartej na SSM do selekcji nanociał hamujących i niehamujących ukierunkowanych na elektrogeniczny transporter wtórny oraz do obliczania stałych hamujących nanociał. Technika ta może być szczególnie przydatna do selekcji nanociał hamujących ukierunkowanych na transportery, dla których znakowane substraty nie są dostępne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciwciała składają się z dwóch identycznych ciężkich łańcuchów i dwóch lekkich łańcuchów, które są odpowiedzialne za wiązanie antygenu. Wielbłądowate mają przeciwciała tylko o łańcuchach ciężkich, które wykazują podobne powinowactwo do pokrewnego antygenu w porównaniu z konwencjonalnymi przeciwciałami1,2. Domena pojedynczej zmiennej (VHH) przeciwciał opartych wyłącznie na łańcuchach ciężkich zachowuje pełny potencjał wiązania antygenu i wykazano, że jest bardzo stabilna1,2. Te wyizolowane cząsteczki VHH lub "nanociała" zostały wdrożone w badaniach związanych z biochemią białek błonowych jako narzędzia do stabilizacji konformacji3,4, jako inhibitory5,6, jako środki stabilizujące7, oraz jako gadżety do określania struktury8,9,10. Nanociała mogą być generowane przez immunizację wielbłądowatych w celu wstępnego wzbogacenia komórek B, które kodują nanociała specyficzne dla celu, a następnie izolację komórek B, a następnie klonowanie biblioteki nanokomórek i selekcję przez fagi display11,12,13. Alternatywny sposób generowania nanociał opiera się na metodach selekcji in vitro, które opierają się na budowie bibliotek i selekcji poprzez wyświetlanie fagów, rybosomów lub drożdży14,15,16,17,18,19,20. Te metody in vitro wymagają dużych rozmiarów bibliotek, ale korzystają z unikania immunizacji zwierząt i faworyzują wybór nanociał ukierunkowanych na białka o stosunkowo niskiej stabilności.

Mały rozmiar nanociał, ich wysoka stabilność i rozpuszczalność, silne powinowactwo antygenowe, niska immunogenność i stosunkowo łatwa produkcja, czynią je dobrymi kandydatami do rozwoju terapii21,22,23. W szczególności nanociała hamujące aktywność wielu białek błonowych są potencjalnymi zasobami do zastosowań klinicznych5,24,25,26. W przypadku transporterów błonowych, aby ocenić, czy nanonik ma aktywność hamującą, konieczne jest opracowanie testu, który pozwala na wykrycie transportowanych substratów i/lub kosubstratów. Takie testy zwykle obejmują znakowane cząsteczki lub projektowanie metod wykrywania specyficznych dla substratu, które mogą nie mieć uniwersalnego zastosowania. Ponadto identyfikacja nanociał hamujących na ogół wymaga badań przesiewowych dużej liczby substancji wiążących. W związku z tym metoda, która może być stosowana w trybie wysokiej przepustowości i która nie opiera się na oznakowanych podłożach, jest niezbędna do tego wyboru.

Elektrofizjologia oparta na SSM jest niezwykle czułą, wysoce rozdzielczą w czasie techniką, która pozwala na wykrywanie ruchu ładunków przez błony (np. wiązanie/transport jonów)27,28. Technika ta została zastosowana do scharakteryzowania transporterów elektrogenicznych, które są trudne do zbadania przy użyciu innych technik elektrofizjologicznych ze względu na stosunkowo niski obrót tych białek29,30,31,32,33,34,35. Elektrofizjologia SSM nie wymaga stosowania znakowanych substratów, nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i można stosować proteoliposomy lub pęcherzyki błonowe zawierające transporter będący przedmiotem zainteresowania. Tutaj pokazujemy, że elektrofizjologia oparta na SSM może być wykorzystana do klasyfikowania nanociał ukierunkowanych na transporter o właściwościach hamujących i niehamujących. Jako dowód słuszności zasady opisujemy rekonstytucję bakteryjnego transportera choliny w liposomach, a następnie szczegółowe kroki w celu unieruchomienia proteoliposomów na czujnikach SSM. Następnie opisujemy, jak wykonywać pomiary elektrofizjologiczne transportu choliny w oparciu o SSM oraz jak wyznaczyć połówkowe maksymalne stężenie efektywne (EC50). Następnie pokazujemy, jak wykorzystać elektrofizjologię opartą na SSM do badań przesiewowych wielu nanociał i identyfikacji inhibitorów transportu choliny. Na koniec opisano, w jaki sposób wyznaczyć połowiczne maksymalne stężenia hamujące (IC50) wybranych nanociał hamujących.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rekonstytucja białka błonowego

  1. Zmieszać 3 ml polarnych lipidów E. coli z 1 ml fosfatydylocholiny w kolbie okrągłodennej pod wentylowanym kapturem.
  2. Suszyć mieszaninę lipidów przez 20 minut w próżni za pomocą wyparki obrotowej i łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu usunięcia chloroformu. W razie potrzeby wysuszyć w atmosferze azotu lub argonu.
  3. Używając buforu TS (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) zawierającego 2 mM β-merkaptoenol, ponownie zawiesić lipidy do 25 mg/ml.
  4. Podwielokrotności lipidów w 500 μl podwielokrotności, błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
  5. Rozmrozić jedną 500 μl podwielokrotności lipidów i rozcieńczyć w stosunku 1:1 przy użyciu buforu TS zawierającego 2 mM β-merkaptoetanolu.
  6. Wytłacz zawiesinę lipidową 15 razy za pomocą membrany o długości 400 nm.
  7. Rozcieńczyć zawiesinę lipidów, aby uzyskać końcowe stężenie lipidów 4,4 mg/ml.
  8. Dodaj n-dodecyl-β-D-maltozyd (DDM), aby uzyskać końcowe stężenie 0,2% i pozostaw na 1 godzinę z prędkością 200 obr./min w temperaturze pokojowej (RT).
  9. Dodaj oczyszczone białko do lipidów, stosując stosunek lipidów do białka między 1:10 a 1:100 (w:w).
    UWAGA: Stosunek należy dostosować w zależności od siły sygnału wykrytego w pomiarach SSM-elektrofizjologii transportu substratu (patrz poniżej). Aby uzyskać większe sygnały, użyj mniejszych proporcji lipidów do białek.
  10. Inkubować mieszaninę, obracając się z prędkością 200 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  11. Dodać 30 mg/ml kulek adsorpcyjnych polistyrenu, wstępnie umytych w buforze TS.
    UWAGA: Dodawaj kulki styropianowe stopniowo.
  12. Inkubować mieszaninę kulek i lipidów przez 30 minut w temperaturze pokojowej, powoli mieszając.
  13. Aby usunąć koraliki, pozostaw mieszaninę kulek i lipidów tak, aby kulki się uspokoiły. Przenieś roztwór do nowej probówki i pozostaw kulki. Dodać 30 mg/ml świeżych kulek adsorbentu polistyrenowego do oddzielonej mieszaniny lipidów.
  14. Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, powoli mieszając.
  15. Oddzielić kulki od mieszaniny zgodnie z opisem w kroku 1.13 i dodać 30 mg/ml świeżych kulek adsorpcyjnych z polistyrenu.
  16. Inkubować mieszaninę przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
  17. Oddzielić kulki od mieszaniny zgodnie z opisem w kroku 13 i dodać 30 mg/ml świeżych kulek adsorpcyjnych z polistyrenu.
  18. Inkubować mieszaninę przez 2 godziny w temperaturze 4 °C do czwartego i ostatniego przemycia.
  19. Wirować przy 110 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  20. Przepłukać osad 500 μl buforu TS zawierającego 2 mM β-merkaptoetanolu.
  21. Ponownie odwirować przy 110 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  22. Zawiesić osad do końcowego stężenia lipidów 25 mg/ml w buforze TS z 2 mM β-merkaptoetanolu.
  23. Oszacuj stężenie białka za pomocą testu w postaci czarnego w żelu lub amido36.
  24. Podwielokrotnić proteoliposomy, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie żetonów

  1. Napełnij pojedynczy chip czujnika 50-100 μl 0,5 mM roztworu 1-oktadekanetiolu (zawieszonego w izopropanolu).
  2. Inkubować chip z roztworem przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usuń roztwór tiolu, stukając chipem w chusteczkę.
  4. Przepłucz czujnik 3 razy 5 ml czystego izopropanolu.
  5. Przepłucz czujnik 3 razy 5 ml podwójnie destylowanej wody.
  6. Osusz czujnik, stukając w bibułkę.
  7. Zastosować 1,5 μl z 7,5 μg/μL 1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (lipidy wysuszone w parowniku rotacyjnym i ponownie zawieszone w n-dekanach).
  8. Natychmiast po tym należy napełnić czujnik 50 μl nieaktywującego się buforu SSM, który nie zawiera substratu. Doprowadzi to do spontanicznego powstania warstwy SSM.
    UWAGA: Bufor SSM powinien zostać wcześniej zoptymalizowany w celu określenia optymalnych warunków, w których szumy tła są niskie. Jako punkt wyjścia można użyć ogólnego buforu zawierającego 30 mM HEPES pH 7,4, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl. Bufor SSM bez podłoża służy do mycia przed i po pomiarze (bufor nieaktywujący). Aby uniknąć niedopasowania, należy użyć buforu nieaktywującego do przygotowania buforu zawierającego substrat (bufor aktywujący). Podłoże można dodawać bezpośrednio w postaci proszku lub w małej objętości z materiału o wysokim stężeniu, aby uniknąć rozcieńczeń.
  9. Rozmrozić proteoliposomy z kroku 1.24 w RT.
  10. Rozcieńczyć proteoliposomy w proporcjach od 1:5 do 1:100 (proteoliposomy:bufor, (v:v)) w nieaktywującym buforze SSM (tutaj 1:20).
  11. Sonikuj proteoliposomy przez 20-30 s lub 3 razy przez 10 s, umieszczając je na lodzie między sonikacjami, jeśli to konieczne. W tym przypadku zastosowano sonograf w kąpieli wodnej o częstotliwości 45 kHz.
  12. Nanieść 5-10 μl rozcieńczonej próbki proteoliposomów z sonikacją na powierzchnię czujnika, nie dotykając jej.
  13. Odwirować wióry z roztworem w temperaturze pokojowej przez 30 minut z prędkością od 2 000 do 3 000 x g.
    UWAGA: Używaj probówek o pojemności 50 ml z płaskim dnem. Ostrożnie umieść chipy czujnika pionowo za pomocą pęsety. Można również użyć płytek 6-dołkowych i wirówki z uchwytem na płytki.
  14. Użyj chipów czujnika tego samego dnia.

3. Pomiar transportu substancji rozpuszczonej: określenie warunków nasycenia

UWAGA: Jako dowód zasady, te eksperymenty zostały przeprowadzone przy użyciu bakteryjnego transportera choliny odtworzonego w liposomach zgodnie z protokołem opisanym powyżej. Przedstawiono tutaj krok po kroku proces określania warunków nasycenia substratu choliny przed pomiarem inhibicji przez nanociała.

  1. Przygotować 1-2 l nieaktywującego bufora SSM.
    UWAGA: Należy przygotować i stosować ten sam zapas buforowy SSM dla wszystkich aktywujących i nieaktywujących we wszystkich pomiarach.
  2. Weź 10 czystych probówek i przenieś 10 ml nieaktywującego buforu SSM do każdej z nich.
  3. Dodać substrat do probówek z kroku 3.2, stosując serię stężeń wokół oczekiwanego połowy maksymalnego stężenia (tutaj 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 mM choliny) w celu przygotowania aktywujących SSM. Użyj bulionu o wysokim stężeniu, aby uniknąć rozcieńczeń.
  4. Włącz komputer SSM.
  5. Uruchom oprogramowanie SSM i poczekaj, aż komputer zostanie zainicjowany automatycznie. Ustaw ścieżkę zapisu danych i potwierdź, naciskając przycisk OK. Wybierz standardowy protokół wstępnego czyszczenia w opcjach przepływu pracy i kliknij przycisk Uruchom.
  6. Zamontuj chip pokryty proteoliposomem na gnieździe, przesuń ramię, aby zablokować chip i zamknij zamontowany chip za pomocą nasadki.
  7. Wybierz program CapCom w przepływie pracy i pozwól mu działać, aby określić przewodność i pojemność. Upewnij się, że przewodność jest poniżej 5 nS, a pojemność wynosi od 15 do 35 nF przed użyciem jej do pomiaru.
    UWAGA: W przypadku stosowania chipa 3 mm producent zaleca wartość pojemności 15-35 nF i przewodność poniżej 5 nS.
  8. Przenieść roztwory aktywujące do fiolek i umieścić w próbniku sondy.
  9. Przenieś nieaktywujący się bufor do zbiornika i umieść go obok uchwytu na wióry w miejscu zbiornika po prawej stronie.
  10. Utwórz protokół dla przepływu pracy, używając sekwencji roztworów nieaktywujących (B), aktywujących (A) i nieaktywujących (B) (sekwencja B-A-B) oraz pętli, która wykonuje trzy pomiary i przechodzi do następnego bufora aktywującego dla wszystkich 10 przygotowanych w kroku 3.3. Użyj domyślnego natężenia przepływu na poziomie 200 μl/s, używając czasów przepływu 1 s - 1 s - 1 s dla sekwencji B-A-B. Kliknij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć pomiar.
    UWAGA: Typowy eksperyment składa się z sekwencyjnego przepływu roztworów nieaktywujących (B), aktywujących (A) i nieaktywujących (B) (zapisanych jako B-A-B; patrz Rysunek 1A). Unieruchomione proteoliposomy na czujniku zostaną przemyte roztworami. W związku z tym wymiana roztworu B-A generuje gradient stężenia substratu, który napędza reakcję transportu elektrogenicznego.
  11. Zapisz protokół i pozwól na uruchomienie przepływu pracy, klikając przycisk Odtwórz. Wykonaj ten sam rodzaj eksperymentu, ale przy użyciu liposomów bezbiałkowych. Jest to bardzo ważne, ponieważ pokazałoby intensywność prądów tła. Należy to wziąć pod uwagę przy analizie danych transportu elektrogenicznego mierzonego za pomocą proteoliposomów (Rysunek 1C).
  12. Użyj dowolnego preferowanego oprogramowania do analizy danych, aby wykreślić zmierzony prąd w funkcji czasu. Odczytać prąd szczytowy ręcznie, lub w przypadku korzystania z oprogramowania, skorzystać z funkcji szacowania wysokości piku w zakresie dodania bufora aktywującego.
  13. Wykreśl prąd szczytowy w stosunku do stężenia substratu, aby określić EC50 podłoża za pomocą regresji nieliniowej (Rysunek 1B, C). Odczytać najniższe stężenie, przy którym prąd szczytowy osiąga wartość maksymalną, stężenie to odpowiada warunkom nasycenia.
    UWAGA: Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że liczba proteoliposomów, które pozostają unieruchomione, różni się w zależności od chipa. Ta różnica jest oczywista, ponieważ prądy szczytowe w identycznych warunkach pomiaru będą wykazywać różne amplitudy. W związku z tym konieczne jest znormalizowanie prądowych amplitud pomiarów wykonywanych na każdym chipie z osobna przed porównaniem pomiarów między różnymi preparatami chipów.

4. Seryjna klasyfikacja nanociał hamujących i niehamujących

UWAGA: Ta sekcja pokazuje, jak mierzyć transport choliny w obecności nanociał, które wiążą się specyficznie z bakteryjnym transporterem choliny. Mniejsze prądy szczytowe w obecności nanociał wskazują na zahamowanie transportu. Nanociała niehamujące nie będą miały wpływu na transport substratu, tj. nie będą miały wpływu na spadek sygnału prądu szczytowego.

  1. Przygotować 1-2 litry nieaktywującego buforu SSM.
  2. Przenieść 50 ml nieaktywującego buforu SSM do czystej probówki. Dodać substrat cholinę do końcowego stężenia 5 mM (warunki nasycenia). Użyj tego do pomiaru kontroli dodatniej.
  3. Przenieść 10 ml nieaktywującego buforu SSM do czystej probówki. Dodać substrat cholinę do końcowego stężenia 5 mM (warunki nasycenia) i dodać nanonik do końcowego stężenia 500 nM.
  4. Powtórz krok 4.3 dla każdego nanoorganizmu, aby przygotować roztwory aktywujące.
    UWAGA: Jeżeli oczyszczone nanociała zostaną ponownie zawieszone w innym buforze niż bufor SSM, ich dodanie do aktywujących i nieaktywujących doprowadzi do niezgodności. Należy unikać niedopasowania bufora, ponieważ może to prowadzić do wysokiego poziomu hałasu. Zamiana buforu oczyszczonych nanociał na bufor SSM może pomóc w uniknięciu tego problemu. Ponadto zaleca się stosowanie stężeń nanocząsteczkowych, które pozwalają na osiągnięcie warunków nasycenia. Biorąc pod uwagę, że stałe wiązania nanociał są na ogół poniżej 100 nM, w tym eksperymencie zaleca się stężenie nanocząsteczki wynoszące 500 nM. Jednak ważne jest, aby wstępnie przesiać w celu uzyskania optymalnych stężeń.
  5. Uruchom maszynę SSM i zmierz pojemność i przewodność chipa pokrytego proteoliposomem zgodnie z opisem w krokach 3.4-3.7.
  6. Przenieść roztwór aktywujący bez nanocząsteczki do fiolki i umieścić bufor w próbniku sondy. Przenieść nieaktywujący się bufor bez nanocząsteczki do zbiornika i umieścić go w próbniku sondy.
  7. Przenieść roztwory aktywujące zawierające nanociała do fiolek i umieścić w próbniku sondy. Przenieść nieaktywujące zawierające nanociała do fiolek i umieścić w próbniku sondy.
  8. Utwórz protokół dla przepływu pracy przy użyciu sekwencji rozwiązań nieaktywujących (B), aktywujących (A) i nieaktywujących (B) (sekwencja B-A-B).
  9. Utwórz pętlę, która wykonuje następujące czynności: trzy pomiary sekwencji B-A-B przy użyciu bez nanociała, dwa pomiary sekwencji B-A-B z zawierającymi nanociało, 120-sekundowy czas opóźnienia inkubacji z nanociałem, a następnie 3 pomiary sekwencji B-A-B z zawierającymi nanociało.
  10. Zapisz przepływ pracy i pozwól mu działać, klikając przycisk Odtwórz.
    UWAGA: Ten przepływ pracy zmierzy początkowe warunki transportu bez hamowania, uruchamiając protokół B-A-B 3 razy przy użyciu nieaktywujących (B) i aktywujących (A) bez nanonika (Rysunek 1B,C), a następnie zmierzy wpływ nanocząsteczki na transport, uruchamiając protokół B-A-B 5 razy z nieaktywującymi i aktywującymi zawierającymi nanociała (Rysunek 2A). Kinetyka wiązania drugiego rzędu dyktuje interakcję nanociał i ich docelowych białek. Dlatego ważne jest, aby wykorzystać opóźnienie czasowe w kroku B-A, aby dać nanociałom wystarczająco dużo czasu na związanie się z transporterami w proteoliposomach na chipie. Optymalne czasy zależą od stężenia nanocząsteczki, tj. przy niższych stężeniach wymagane są dłuższe czasy. Pierwsze dwa pomiary są wymagane w celu dostosowania systemu do nowych warunków, a drugi przebieg powinien być wykonany po czasie opóźnienia wynoszącym 120 s. Do analizy danych należy używać tylko następujących trzech pomiarów.
  11. Utwórz nowy protokół przepływu pracy, używając sekwencji roztworów nieaktywujących (B), aktywujących (A) i nieaktywujących (B) (sekwencja B-A-B) oraz pętli 5 pomiarów w celu wypłukania odwracalnie związanego nanociała.
    UWAGA: Opcjonalnie należy uwzględnić etap inkubacji, aby umożliwić dysocjację nanociał o niskiej kinetyce.
  12. Zapisz przepływ pracy i pozwól mu działać, klikając przycisk Odtwórz.
  13. Porównaj ostatni prąd szczytowy pomiarów z początkowym pomiarem samego podłoża w kroku 4.10. Nanobody został pomyślnie wypłukany, a warunki początkowe zostały przywrócone, jeśli prąd szczytowy osiągnie wartość początkową, w przeciwnym razie powtórz kroki 4.12-4.13 lub zmień na nowy chip.
  14. Powtórz kroki 4.6-4.13 i użyj indywidualnych chipów dla każdego ekranu nanoskóry ( Rysunek 2C) lub powtórz z wieloma nanociałami przy użyciu tego samego chipa ( Rysunek 2D).
  15. Użyj dowolnego preferowanego oprogramowania do analizy danych, aby wykreślić zmierzony prąd w funkcji czasu. Odczytać prąd szczytowy ręcznie, lub jeśli jest dostępny, w używanym oprogramowaniu automatycznie wybrać funkcję szacowania wysokości piku w zakresie dodawania bufora aktywacyjnego.
  16. Znormalizuj prąd szczytowy w obecności nanociała, na podstawie poprzedniego pomiaru tylko substratu. Wykreśl prądy szczytowe na histogramie i porównaj pomiary prądów szczytowych podłoża z prądami szczytowymi zmierzonymi w obecności nanociał (Rysunek 2C,D), aby zidentyfikować nanociała hamujące.
    UWAGA: Normalizacja wyznaczonych prądów szczytowych dla każdego pojedynczego przebiegu z nanotonem powinna być przeprowadzona z uwzględnieniem prądu szczytowego w przypadku braku nanobody z poprzedniego pomiaru. Ponadto, ponieważ liczba proteoliposomów, które pozostają unieruchomione, różni się w zależności od chipa, ważne jest, aby znormalizować aktualne amplitudy pomiarów wykonywanych na każdym chipie osobno przed porównaniem pomiarów między różnymi preparatami chipów.

5. Pomiar IC50 z nanociałami hamującymi

UWAGA: Po zidentyfikowaniu nanociał hamujących, możliwe jest określenie ich połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC50). Odbywa się to poprzez pomiar transportu choliny w stałym stężeniu, przy jednoczesnym zmiennym stężeniu hamującego nanociała.

  1. Przygotować 1-2 l nieaktywującego się buforu SSM.
  2. Przenieść 50 ml nieaktywującego buforu SSM do czystej probówki. Dodać substrat cholinę do końcowego stężenia 5 mM (warunki nasycenia). Należy go stosować jako roztwór aktywujący do kontroli dodatniej.
  3. Weź 8 czystych probówek i dodaj do każdej po 5 ml roztworu nieaktywującego. Dodać substrat cholinę do końcowego stężenia 5 mM (warunki nasycenia). Dodać do probówek nanobody hamujący w stężeniach w oczekiwanym zakresie IC50 (tutaj 500 nM - 1 nM).
  4. Weź 8 czystych probówek i dodaj do każdej 10 ml roztworu nieaktywującego. Dodać nanobody hamujący do każdej probówki indywidualnie w tym samym stężeniu, co w kroku 5.3. Odpowiada to buforowi, który nie jest aktywowany.
    UWAGA: Spowoduje to wygenerowanie serii aktywujących i nieaktywujących par o różnych stężeniach tego samego hamującego nanociała.
  5. Uruchom konfigurację SSM i zmierz pojemność i przewodność chipa pokrytego proteoliposomem zgodnie z opisem w krokach 3.4-3.7.
  6. Przenieść roztwór aktywujący bez nanocząsteczki do fiolki i umieścić go w próbniku z sondą. Przenieś nieaktywujący się bufor bez nanobody do zbiornika i umieść go w miejscu zbiornika obok uchwytu na chipy po prawej stronie.
  7. Przenieść roztwory aktywujące zawierające nanociała do fiolek i umieścić w próbniku sondy. Przenieść nieaktywujące zawierające nanociała do fiolek i umieścić w próbniku sondy.
  8. Utwórz protokół dla przepływu pracy przy użyciu sekwencji rozwiązań nieaktywujących (B), aktywujących (A) i nieaktywujących (B) (sekwencja B-A-B). Dołącz pętlę, aby zmierzyć każde stężenie 2 razy, inkubować przez 120 s i zmierzyć jeszcze 3 razy. Proces pracy rozpocznie się od pozytywnej kontroli samego substratu, po której nastąpi najniższe stężenie nanociała. Po każdym pomiarze nanonu następuje kolejny pomiar kontroli pozytywnej z samym substratem w celu przywrócenia początkowej amplitudy piku, przed przejściem do następnego wyższego stężenia nanonu.
    UWAGA: Kinetyka drugiego rzędu dyktuje wiązanie nanociał. Dlatego ważne jest, aby użyć opóźnienia czasowego w kroku B-A. Optymalne czasy zależą od stężenia nanonu, tj. przy niższych stężeniach wymagane są dłuższe czasy; Tutaj zastosowano 120 s z zadowalającymi wynikami.
  9. Użyj dowolnego preferowanego oprogramowania do analizy danych, aby wykreślić zmierzony prąd w funkcji czasu. Odczytaj prąd szczytowy ręcznie lub, jeśli korzystasz z oprogramowania, wybierz funkcję szacowania wysokości piku w zakresie dodawania bufora aktywacji (Rysunek 3A). Wykreśl prądy szczytowe w stosunku do stężenia nanonu, aby wyznaczyć IC50 za pomocą regresji nieliniowej ( Rysunek 3B).
    UWAGA: Znormalizuj aktualne amplitudy pomiarów wykonywanych dla każdego pojedynczego chipa przed porównaniem pomiarów między różnymi preparatami chipów.

6. Czyszczenie czujników

  1. Po użyciu opłucz chipy pojedynczego czujnika 10 ml wody destylowanej.
  2. Wysusz chip, stukając nim w bibułkę.
  3. Napełnij wnękę czujnika chipa 100 μl czystego izopropanolu i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Umieść bawełniany wacik w czystym izopropanolu i inkubuj przez 1-3 minuty.
  5. Użyj wstępnie nasączonych bawełnianych wacików i delikatnie obróć na powierzchni czujnika bez nacisku, aby usunąć pozostałości.
  6. Przepłukać czujnik 5 ml czystego izopropanolu.
  7. Przepłucz czujnik 10 ml wody destylowanej.
  8. Osusz czujnik, stukając chipem w chusteczkę.
  9. Pozostaw czujnik do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej i przechowuj w temperaturze pokojowej w suchych warunkach.
    UWAGA: Czujniki mogą być ponownie użyte do 4-5 razy, jeśli są odpowiednio czyszczone i przechowywane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrofizjologia oparta na SSM była szeroko wykorzystywana do charakterystyki transporterów elektrogenicznych. W przedstawionym tutaj protokole pokazujemy, jak wykorzystać elektrofizjologię opartą na SSM do klasyfikacji nanociał ukierunkowanych na wtórny transporter (w tym przypadku bakteryjny symporter choliny) na podstawie ich właściwości hamujących i niehamujących. Jedną z najbardziej użytecznych cech tej techniki jest to, że pozwala ona na wysokoprzepustowe badanie przesiewowe wielu warunków buforowych. Ta szczególn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona technika klasyfikuje nanociała o właściwościach hamujących i niehamujących, ukierunkowane na transportery elektrogeniczne. Ocena transportu substratu jest możliwa dzięki wykryciu ruchu ładunków przez transporter osadzony w błonie proteoliposomów. Niektóre z krytycznych etapów podczas przygotowania eksperymentu to odtworzenie aktywnego białka w liposomach, przygotowanie stabilnych monowarstw na chipach SSM oraz przywrócenie warunków początkowych po zastosowaniu protokołu płukania w celu usunięcia związanych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Cedricowi A. J. Hutterowi i Markusowi A. Seegerowi z Instytutu Mikrobiologii Medycznej Uniwersytetu w Zurychu oraz Gonzalo Cebrero z Biozentrum Uniwersytetu w Bazylei za współpracę przy tworzeniu syntetycznych nanociał (sybody). Dziękujemy Marii Barthmes i Andre Bazzone'owi z NANION Technologies za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF) (PP00P3_170607 oraz NANION Research Grant Initiative to C.P.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór 1-oktadekanetioluSigma AldrichO1858-25ML
1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholinaAvanti Polar Lipids850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 Adsorbent (kulki adsorbentu polistyrenu)BioRad#152-3920
PD 10 Kolumny odsalająceGE HealthcareGE17-0851-01
Filtr membranowy 200 nmWhatman NucleoporeWHA800282
2-propanolMerck33539-1L-R
n-DecaneSigma Aldrich8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltozyd (DDM)Avanti Polar Lipids850520P-25g
Chlorek soduAppliChem131659.1211
(konfiguracja SSM) SURFE2R N1Nanion-----
SURFE2R Chipy z pojedynczym czujnikiem N1Nanion# 161001
Trizma BaseSigma AldrichT1503
E. coli Polarny ekstrakt lipidowyAvanti Polar Lipids100600C
Egg PC L-&alfa;-fosfatydylocholina Avanti Polar Lipids840051C

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
  2. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  3. Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641(2017).
  4. Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216(2020).
  5. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
  6. Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296(2017).
  7. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  8. Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
  9. Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
  10. Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
  11. Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
  12. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
  13. Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
  14. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317(2018).
  15. McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
  16. Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
  17. Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228(2016).
  18. Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).
  19. Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
  20. Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
  21. vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
  22. Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
  23. Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273(2018).
  24. Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
  25. Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
  26. Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187(2015).
  27. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  28. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  29. Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
  30. Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
  31. Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
  32. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
  33. Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392(2016).
  34. Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183(2020).
  35. Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
  36. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
  37. Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064(2020).
  38. Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Inhibicja transporter welektrofizjologia SSMtransportery elektrogenneprzesiewanie nanociatest proteoliposomalnyinhibicja bia ek b onowychkinetyka transportuwyznaczanie IC50

Powiązane artykuły