Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pęseta optyczna do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62589

⸱

12 lutego 2022

 ,  , 
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia kompletny eksperymentalny przepływ pracy do badania interakcji RNA-białko za pomocą pęsety optycznej. Przedstawiono kilka możliwych konfiguracji eksperymentalnych, w tym połączenie pęsety optycznej z mikroskopią konfokalną.

Streszczenie

RNA przyjmuje różnorodne fałdy strukturalne, które są niezbędne dla jego funkcji, a tym samym mogą wpływać na różne procesy w komórce. Ponadto struktura i funkcja RNA może być modulowana przez różne czynniki transakcyjne, takie jak białka, metabolity lub inne RNA. Na przykład cząsteczki RNA z przesunięciem ramki są regulatorowymi RNA zlokalizowanymi w regionach kodujących, które kierują translację rybosomów do alternatywnej otwartej ramki odczytu, a tym samym działają jako przełączniki genów. Mogą również przyjmować różne fałdy po związaniu się z białkami lub innymi faktorami trans. Aby przeanalizować rolę białek wiążących RNA w translacji oraz sposób, w jaki modulują one strukturę i stabilność RNA, kluczowe jest jednoczesne badanie wzajemnych oddziaływań i cech mechanicznych tych kompleksów RNA-białko. Praca ta ilustruje, w jaki sposób można wykorzystać pęsetę optyczną sprzężoną z pojedynczą cząsteczką i fluorescencją do zbadania konformacyjnego i termodynamicznego krajobrazu kompleksów RNA-białko w wysokiej rozdzielczości. Jako przykład opracowano interakcję zaprogramowanego przez SARS-CoV-2 rybosomalnego elementu przesuwnego ramki z krótkim izoformem czynnika transdziałającego białka przeciwwirusowego palca cynkowego. Ponadto rybosomy znakowane fluorescencyjnie monitorowano za pomocą jednostki konfokalnej, co ostatecznie umożliwiło badanie wydłużenia translacji. Test OT sprzężony z fluorescencją może być szeroko stosowany do badania różnych kompleksów RNA-białko lub czynników transaktywnych regulujących translację i może ułatwić badania nad regulacją genów opartą na RNA.

Wprowadzenie

Transfer informacji genetycznej z DNA do białek za pośrednictwem mRNA to złożony proces biochemiczny, który jest precyzyjnie regulowany na wszystkich poziomach poprzez makromolekularne interakcje wewnątrz komórek. Dla regulacji translacji interakcje RNA-białko odgrywają kluczową rolę w szybkim reagowaniu na różne bodźce i sygnały1,2. Niektóre interakcje RNA-białko wpływają na stabilność mRNA, a tym samym zmieniają czas, w którym RNA jest aktywne translacyjnie. Inne interakcje RNA-białko są związane z mechanizmami kodowania, takimi jak odczyt kodonu stop, omijanie lub programowane rybosomalne przesunięcie ramki (PRF)3,4,5,6,7. Ostatnio wykazano, że wiele białek wiążących RNA (RBP) oddziałuje ze stymulującymi elementami mRNA i maszynerią translacyjną, aby dyktować, kiedy i ile przekodowania nastąpi w komórce7,8,9,10,11. W związku z tym, aby przeanalizować rolę białek wiążących RNA w translacji oraz sposób, w jaki modulują one strukturę i stabilność RNA, kluczowe jest szczegółowe zbadanie zasad interakcji i właściwości mechanicznych tych kompleksów RNA-białko.

Dziesięciolecia pracy położyły podwaliny pod badanie wieloetapowego i wieloskładnikowego procesu translacji, który opiera się na skomplikowanej komunikacji między RNA a składnikami białkowymi maszynerii translacyjnej, aby osiągnąć szybkość i dokładność12,13,14. Kolejnym kluczowym krokiem w zrozumieniu złożonych zdarzeń regulacyjnych jest określenie sił, skal czasowych i determinantów strukturalnych podczas translacji z dużą precyzją12,15,16,17. Badania dynamiki konformacyjnej RNA, a zwłaszcza tego, jak czynniki pomocnicze działające transakcyjnie wpływają na strukturę RNA podczas translacji, zostały dodatkowo naświetlone przez pojawienie się narzędzi jednocząsteczkowych, w tym pęsety optycznej lub falowodów w trybie zerowym16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26.

Pęseta optyczna (OT) reprezentuje wysoce precyzyjną technikę pojedynczej cząsteczki, która została zastosowana do badania wielu rodzajów procesów dynamicznych zależnych od RNA, w tym transkrypcji i translacji26,27,28,29,30,31,32. Zastosowanie pęsety optycznej pozwoliło na szczegółowe zbadanie oddziaływań molekularnych, struktur kwasów nukleinowych i właściwości termodynamicznych, kinetyki i energetyki tych procesów16,17,22,33,34,35,36,37,38,39. Test pęsety optycznej opiera się na uwięzieniu mikroskopijnych obiektów za pomocą skupionej wiązki laserowej. W typowym eksperymencie OT cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest uwiązana między dwoma przezroczystymi (zwykle polistyrenowymi) koralikami (Rysunek 1A)27. Koraliki te są następnie chwytane przez pułapki optyczne, które zachowują się jak sprężyny. W ten sposób siłę przyłożoną do cząsteczki można obliczyć na podstawie przemieszczenia kulki od środka skupionej wiązki laserowej (środek pułapki). Ostatnio pęsety optyczne zostały połączone z mikroskopią konfokalną (Rysunek 1B), umożliwiając pomiary fluorescencji lub rezonansu Förstera (FRET)40,41,42. Otwiera to zupełnie nowe pole możliwych eksperymentów pozwalających na jednoczesny pomiar, a tym samym precyzyjną korelację danych spektroskopii sił i fluorescencji.

Tutaj demonstrujemy eksperymenty z użyciem pęsety optycznej połączonej z mikroskopią konfokalną do badania interakcji białko-RNA regulujących translacyjne przesunięcie ramki. Pomiędzy obiektywem a skraplaczem znajduje się komora przepływowa z pięcioma kanałami, która umożliwia ciągłe nanoszenie próbki z przepływem laminarnym. Za pośrednictwem kanałów mikroprzepływowych różne składniki mogą być wstrzykiwane bezpośrednio, co skraca czas pracy ręcznej, a także pozwala na bardzo małe zużycie próbki podczas całego eksperymentu.

Po pierwsze, zaproponowano podstawowe wytyczne pomocne w projektowaniu eksperymentów OT oraz omówiono zalety i pułapki różnych konfiguracji. Następnie opisano przygotowanie próbek i eksperymentalne przepływy pracy, a także przedstawiono protokół analizy danych. Aby przedstawić przykład, przedstawiamy wyniki uzyskane z eksperymentów rozciągania RNA w celu zbadania elementu RNA SARS-CoV-2 zmieniającego ramkę ramki (Rysunek 2A) z czynnikiem transdziałającym krótką izoformą białka przeciwwirusowego palca cynkowego (ZAP), która zmienia translację wirusowego RNA z alternatywnej ramki odczytu43. Ponadto wykazano, że rybosomy znakowane fluorescencją można zastosować w tym teście konfokalnym OT, co byłoby przydatne do monitorowania procesyjności i szybkości maszynerii translacyjnej. Przedstawiona tutaj metoda może być wykorzystana do szybkiego przetestowania wpływu różnych, ligandów lub innych składników komórkowych w celu zbadania różnych aspektów translacji. Na koniec omówiono typowe pułapki eksperymentalne i sposoby ich rozwiązywania. Poniżej przedstawiono kilka kluczowych punktów w projektowaniu eksperymentalnym.

Zbuduj projekt
Zasadniczo istnieją dwa powszechne podejścia do tworzenia konstruktu RNA zgodnego z OT. Pierwsze podejście wykorzystuje długą cząsteczkę RNA, która jest hybrydyzowana z komplementarnymi uchwytami DNA, uzyskując w ten sposób konstrukt składający się z dwóch hybrydowych regionów RNA / DNA flankujących jednoniciową sekwencję RNA w środku (Figura 2B). To podejście jest stosowane w większości eksperymentów OT RNA33,44,45.

Drugie podejście wykorzystuje uchwyty dsDNA z krótkimi (około 20 nt) zwisami15,17. Te zwisy są następnie hybrydyzowane z cząsteczką RNA. Chociaż jest to bardziej skomplikowane w konstrukcji, zastosowanie uchwytów dsDNA przezwycięża niektóre ograniczenia systemu hybrydowego DNA/RNA. W zasadzie można zastosować nawet bardzo długie uchwyty (>10kb), co jest wygodniejsze w przypadku pomiarów konfokalnych. Ponadto cząsteczka RNA może być ligowana do uchwytów DNA w celu zwiększenia stabilności uwięzi.

Strategia etykietowania końcowego
Konstrukt musi być przywiązany do koralików poprzez silne oddziaływanie molekularne. Chociaż dostępne są metody kowalencyjnego wiązania uchwytów z koralikami46, silne, ale niekowalencyjne interakcje, takie jak streptawidyna-biotyna i digoksygenina-przeciwciało, są powszechnie stosowane w eksperymentach OT15,33,35,45. W opisanym protokole konstrukt jest znakowany biotyną lub digoksygeniną, a kulki są pokryte odpowiednio streptawidyną lub przeciwciałami przeciwko digoksygeninie (Rysunek 1A). Takie podejście byłoby odpowiednie do przykładania sił do około 60 pN (na uwięzi)47. Co więcej, zastosowanie różnych strategii etykietowania 5' i 3' pozwala określić orientację linki utworzonej między koralikami17.

Znakowanie białek do pomiarów fluorescencji
W przypadku obrazowania konfokalnego istnieje kilka powszechnie stosowanych podejść do znakowania fluorescencyjnego. Na przykład fluorofory mogą być kowalencyjnie przyłączone do reszt aminokwasowych, które znajdują się natywnie w białkach lub są wprowadzane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce przez reaktywną grupę organiczną. Barwniki tiolowe lub aminowo-reaktywne mogą być stosowane odpowiednio do znakowania reszt cysteiny i lizyny. Istnieje kilka odwracalnych metod ochrony w celu zwiększenia specyficzności etykietowania48,49, jednak natywne białka są zazwyczaj znakowane wieloma resztami. Chociaż mały rozmiar fluoroforu może dawać przewagę, niespecyficzne znakowanie może zakłócać aktywność białka, a zatem intensywność sygnału może się różnić49. Ponadto, w zależności od skuteczności etykietowania, intensywność sygnału może się różnić w zależności od eksperymentu. Dlatego przed eksperymentem należy przeprowadzić kontrolę aktywności.

W przypadku, gdy interesujące białko zawiera znacznik N- lub C-końcowy, taki jak znacznik Hisa lub znacznik paciorkowca, specyficzne etykietowanie tych znaczników stanowi inne popularne podejście. Co więcej, etykietowanie ukierunkowane na znaczniki zmniejsza ryzyko zakłóceń aktywności białka przez fluorofor i może zwiększyć rozpuszczalność49. Jednak znakowanie specyficzne dla znacznika zwykle daje białka znakowane monofluoroforem, które mogą być trudne do wykrycia. Inny sposób specyficznego znakowania można osiągnąć poprzez zastosowanie przeciwciał.

Konfiguracja mikrofluidyki
Połączenie OT z systemem mikrofluidycznym pozwala na szybkie przejście między różnymi warunkami eksperymentalnymi. Co więcej, obecne systemy wykorzystują utrzymywanie przepływu laminarnego wewnątrz komory przepływowej, co wyklucza mieszanie cieczy z innych kanałów w kierunku prostopadłym względem kierunku przepływu. Dlatego przepływ laminarny jest szczególnie korzystny dla projektu eksperymentalnego. Obecnie powszechnie stosuje się komory przepływowe z maksymalnie 5 kanałami (Rysunek 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

  1. Klonuj sekwencję docelową do wektora zawierającego fragmenty DNA lambda, które pełnią funkcję sekwencji uchwytowych (Rysunek 2)43,50.
  2. Najpierw przygotuj matrycę DNA do dalszych in vitro transkrypcja za pomocą PCR (Rysunek 2B; reakcja 1). Na tym etapie PCR do końca 5' cząsteczki DNA sensownego dodawany jest promotor T732,33,43,50Przygotuj reakcję PCR zgodnie z Tabela 1Przeprowadź reakcję PCR w 50 µL alikwoty z odpowiednią liczbą cykli w termocyklerze.
  3. Przygotuj fragmenty łączące (handles) za pomocą dwóch oddzielnych reakcji PCR (Tabela 1, Rycina 2B; reakcja 2 i 3). Najpierw należy wygenerować fragment uchwytu 5' za pomocą PCR. Następnie należy wygenerować fragment uchwytu 3', jednocześnie znakując go digoksigeniną przy użyciu primera znakowanego digoksigeniną na końcu 5'.32,33,43,50.
  4. Po reakcji PCR oczyść DNA, wykorzystując kolumny wirówki z krzemionką.
  5. Przeprowadź in vitro reakcja transkrypcji z użyciem polimerazy RNA T7 (Tabela 2)32,33,43,50Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 2-4 h, w zależności od długości RNA. Następnie do reakcji należy dodać DNazę I i inkubować w 37 °C przez 30 min w celu strawienia matrycy DNA. RNA należy oczyścić, wykorzystując kolumny wirówkowe z krzemionką.
  6. Podczas reakcji znakowania uchwytu 5' (Tabela 3), a następnie do końca 3' uchwytu należy dodać biotin-16-dUTP przy użyciu polimerazy DNA T438,50Przeprowadzić reakcję w temperaturze pokojowej przez 1–2 h. Następnie oczyścić DNA za pomocą kolumienek spinowych z krzemionką.
    UWAGA: Ponieważ uchwyt 5' musi zostać oznakowany na końcu 3' (Rysunek 2B), znakowania nie można przeprowadzić podczas reakcji PCR.
  7. Wymieszać wymienione powyżej komponenty – końcówkę 5' (znakowaną biotyną na końcu 3'), końcówkę 3' (znakowaną digoksigeniną na końcu 5') oraz RNA – w stosunku molowym 1:1:1 w buforze do hybrydyzacji (80% formamid, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, pH 8), aby otrzymać pożądany hybryd RNA/DNA (Tabela 4). Podgrzać mieszaninę wyżarzającą do 85 °C przez 10 min, a następnie powoli schłodzić do 4 °C.
  8. Wymieszać wyżelowaną próbkę z 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH 5) oraz 3 objętości lodowatego etanolu i inkubować w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 h lub w temperaturze -20 °C przez noc.
  9. Wiruj próbki przy 15 000 × g przez 30 min w temperaturze 4 °COdrzucić supernatant i wysuszyć osad (zazwyczaj niewidoczny) pod próżnią.
  10. Na koniec resuspender osad w 50 µL wody wolnej od RNaz i przygotować alikwoty. Alikwoty przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia. W przypadku krótkotrwałego przechowywania próbki można również przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Konfiguracja urządzenia

UWAGA: Poniższy protokół został zoptymalizowany dla komercyjnego instrumentu do pęset optycznych C-Trap firmy LUMICKS. W związku z tym, podczas korzystania z innych pęset optycznych, konieczne mogą być korekty przedstawionych kroków. Jeśli system mikroprzepływowy urządzenia nie jest używany, jest on przechowywany w wybielaczu (roztworze podchlorynu sodu) i musi zostać wypłukany przed użyciem.

  1. Wylać wybielacz i napełnić strzykawki 1 mL wody wolnej od RNaz.
  2. Dodać 50 µL 0,5 M tiosiarczanu sodu do co najmniej 1 mL wody wolnej od RNaz i dokładnie przemyć układ (1 bar, co najmniej 0,5 mL), aby usunąć pozostałości wybielacza z układu.
  3. Wylać roztwór tiosiarczanu sodu ze strzykawek. Wymienić strzykawki na nowe i przemyć układ co najmniej 0,5 mL wody wolnej od RNaz.
    UWAGA: Należy dopilnować, aby układ mikroprzepływowy nigdy nie pracował na sucho, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza w układzie.
  4. Nanieść 2 krople oleju imersyjnego (współczynnik załamania światła 1,33) lub około 70 µL wody na górną część obiektywu.
  5. Umieścić komorę przepływową w ramce mocującej w odpowiedniej pozycji.
  6. Nanieść 2 krople oleju imersyjnego (współczynnik załamania światła 1,51) na górną część komory przepływowej.
  7. Włączyć urządzenie laserowe w aparaturze do pęsety optycznej. Po uruchomieniu włączyć laser pułapkujący w interfejsie oprogramowania na 100%.
  8. Używając kamer diagnostycznych (Z-finder), dostosować oś Z do środka komory pomiędzy drugą a trzecią refleksją (międzypowierzchniową), gdzie pierścienie refrakcji są największe, obracając mikrosrubą.
    UWAGA: Za każdym razem, gdy obiektyw jest przesuwany bliżej komory pomiarowej i płaszczyzna ogniskowa obiektywu przecina granicę między dwiema fazami, w trybie Z-finder można zauważyć refleksję. Możliwe są 4 interfejsy: (i) woda/olej imersyjny i szkło dolne (ii) szkło dolne i bufor wewnątrz komory (iii) bufor wewnątrz komory i szkło górne (iv) szkło górne i olej imersyjny dla kondensora.
  9. Dostosować pozycję kondensora (ustawiając laser pułapkujący na około 50%), tak aby kondensor stykał się z olejem imersyjnym na górnej części komory pomiarowej.
  10. Ustawić ostrość, powoli przesuwając kondensorem w dół/górę, aż w trybie moon (kamery diagnostyczne) pojawi się około 10 pasm światła.

3. Pomiar próbek

  1. Inkubować kulek powlekanych anty-digoksigeniną (AD) z konstruktami próbek (3 µL 0,1% (w/v) zawiesiny kulek AD + 4 µL próbki) oraz z 1 µL inhibitorów RNazy i 8 µL buforu do analizy (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0,05% Tween 20, 5 mM DTT) w temperaturze pokojowej (RT) przez 10-20 min. Po inkubacji rozcieńczyć próbkę w 500 µL buforu do analizy.
    UWAGA: Zaleca się dodanie do buforu pochłaniaczy tlenu, szczególnie podczas pomiarów fluorescencji, aby zapobiec uszkodzeniom oksydacyjnym. W tym przypadku zastosowano system pochłaniania tlenu zawierający glukozę (8,3 mg/mL), oksydazę glukozową (40 U/mL) i katalazę (185 U/mL).
  2. Wymieszać 0,8 µL 1% (w/v) kulek powlekanych streptawidyną (SA) z 1 mL buforu do analizy.
  3. Usunąć wodę ze strzykawek i napełnić je odpowiednimi zawiesinami/roztworami. Płukać przez co najmniej 2 min przy ciśnieniu około 1 bar, a następnie rozpocząć wychwytywanie kulek.
    UWAGA: W zależności od konfiguracji eksperymentalnej można zastosować różne układy kanałów (Rysunek 3). Typowo jeden kanał przepływowy jest wypełniony kulkami anty-digoksigeninowymi niosącymi cząsteczkę RNA. Drugi kanał jest wypełniony kulkami powlekanymi streptawidyną. Kanał buforowy służy do tworzenia wiązań (tethering). Czwarty kanał może zostać wykorzystany do wprowadzenia białka wiążącego RNA (Rysunek 3C), lub alternatywnie białko RBP można dodać bezpośrednio do kanału buforowego (Rysunek 3B).
  4. Aby przechwycić kulki, należy oddalić od siebie pułapki optyczne. Najpierw przejść do kanału AD i przechwycić kulkę AD w pułapce 1. Następnie przesunąć stoлик do kanału SA i przechwycić pojedynczą kulkę SA za pomocą pułapki 2.
    UWAGA: Należy starać się pozostawać na granicy kanału buforowego i kanału z kulkami, aby uniknąć utraty już przechwyconej kulki lub zapobiec przechwyceniu wielu kulek przez jedną pułapkę.
  5. Po przechwyceniu kulek o odpowiednim rozmiarze, przejść do kanału buforowego i zatrzymać przepływ laminarny. Następnie przeprowadzić kalibrację siły, aby sprawdzić sztywność pułapki. Odpowiednie wartości sztywności nie powinny różnić się w osi x/y o więcej niż 10-15%.
    UWAGA: Dostosować moc lasera lub podział wiązki lasera między pułapkami w zależności od rozmiaru kulek. Kalibracji siły nie trzeba przeprowadzać dla każdej pary kulek, o ile wzorce kulek są zgodne (wynik podobieństwa > 0,9). Należy ją jednak wykonywać regularnie lub przynajmniej za każdym razem, gdy zmieniają się warunki analizy.
  6. Rozpocząć próbę utworzenia wiązania poprzez zbliżenie do siebie kulek, odczekanie kilku sekund, a następnie ponowne ich oddalenie; powtarzać czynność aż do utworzenia wiązania. Utworzenie wiązania objawia się wzrostem mierzonej siły podczas oddalania dwóch kulek od siebie.
    UWAGA: Aby uniknąć utworzenia wielu wiązań, kulki nie powinny być zbliżane zbyt mocno. Po przechwyceniu wiązania między dwiema kulkami, jego jakość można sprawdzić, znajdując plateau nadrozciągania. Plateau dla pojedynczego wiązania powinno znajdować się w zakresie od 50 do 60 pN.
  7. Po uzyskaniu wiązania rozpocząć pomiar. W zależności od badanego zjawiska należy wybrać odpowiednią konfigurację pomiarową (Rysunek 1B-D).
    UWAGA: Zazwyczaj na początku eksperymentu przeprowadza się eksperyment z rampą siłową, aby sprawdzić jakość wiązania i zbadać jego zachowanie. Następnie można rozpocząć eksperymenty z siłą stałą lub pozycją stałą, aby dalej badać przejścia stanów. Gdy wykonano wystarczającą liczbę pomiarów na próbce RNA, aby określić jej zachowanie, do układu można dodać znakowane czynniki w celu wykonania pomiarów konfokalnych.
  8. Aby przeprowadzić pomiary fluorescencji, włączyć lasery konfokalne i jednostkę licznika fotonów w urządzeniu do pęsety optycznej.
  9. Włączyć laser wzbudzenia o pożądanej długości fali w interfejsie oprogramowania i ustawić moc lasera na 5% lub wyższą, w zależności od fluoroforu.
    UWAGA: W czasie, gdy pomiary nie są prowadzone, należy obniżyć ustawienie mocy lasera wzbudzenia do 0%, aby uniknąć nadmiernych uszkodzeń fotochemicznych próbki.
  10. Rozpocząć obrazowanie próbki, korzystając z funkcji obrazowania w oprogramowaniu.
    UWAGA: Aby uzyskać dobrze ostrość obrazu, płaszczyzna ogniskowa mikroskopu konfokalnego i pułapek optycznych muszą być wyrównane. W tym celu można wykorzystać autofluorescencję kulek polistyrenowych w kanale niebieskiego lasera. Płaszczyznę ogniskową pułapek optycznych przesuwa się w górę lub w dół w osi z, aż obraz kulek osiągnie maksymalną średnicę. W tej pozycji można mierzyć sygnał fluorescencji cząsteczki powiązanej między kulkami.
  11. Aby korzystać z funkcji kymografu, określić pozycję x-y osi kymografu w taki sposób, aby umożliwić detekcję wiązania między kulkami.
  12. W trakcie pomiaru skład buforu można łatwo zmieniać, przenosząc kulki do różnych kanałów lub zmieniając bufor dostarczany w systemie mikroprzepływowym.

4. Analiza danych

  1. Przetwarzanie wstępne surowych danych
    1. Za pomocą prostego skryptu wykonaj downsampling surowych danych w stopniu wystarczającym, aby (i) przyspieszyć późniejsze przetwarzanie danych, ale (ii) nadal zachować wszystkie krytyczne informacje (Rysunek 4A). Zazwyczaj do tego celu odpowiedni jest zakres 100-5000 Hz.
      UWAGA: Częstotliwość zbierania danych w eksperymentach z pęsetą optyczną jest często wyższa niż jest to konieczne do analizy – w przedstawionych eksperymentach domyślna częstotliwość zbierania danych wynosi 78 125 Hz. Ze względu na ograniczoną przestrzeń dyskową, zmniejszenie częstotliwości próbkowania danych jest wygodne i pozwala zaoszczędzić czas. W tym przypadku surowe dane poddano downsamplingowi z współczynnikiem 30.
    2. Następnie zastosuj filtr sygnału, aby zredukować wysokoczęstotliwościowy szum pomiarowy z sygnału (Rysunek 4A). Dostosuj stopień filtra oraz parametry częstotliwości odcięcia, aby zoptymalizować wyniki danych dla różnych eksperymentów (Rysunek 5).
      UWAGA: Wśród filtrów sygnałów jeden z najszerzej stosowanych jest filtr Butterwortha51. W danych uzupełniających udostępniono napisany na zamówienie skrypt w języku python, umożliwiający przetwarzanie wstępne surowych danych. Parametry downsamplingu i filtrowania sygnału (częstotliwość odcięcia, stopień filtra) muszą zostać zoptymalizowane dla różnych eksperymentów.
  2. Do analizy danych z rampy siły zastosuj następujące kroki.
    1. Oznacz stopnie unfoldingu albo ręcznie, znajdując odpowiednie punkty na wykresie trajektorii siły, albo za pomocą napisanych na zamówienie skryptów. Stopnie unfoldingu charakteryzują się nagłym spadkiem siły połączonym ze wzrostem odległości na krzywej siła-odległość (FD).
    2. Po oznaczeniu zdarzeń unfoldingu dopasuj różne regiony krzywej FD, korzystając z odpowiednich modeli (Rysunek 4D).
      UWAGA: Dla regionu przed pierwszym stopniem unfoldingu tether można uznać za „dwuniciowy” i powszechnie dopasowuje się go przy użyciu rozciągliwego modelu łańcucha podobnego do robaka (WLC)47,52,53. Fragmenty po pierwszym zdarzeniu unfoldingu są traktowane jako kombinacja nukleotydów dwuniciowych (uchwytów) i nukleotydów jednoniciowych (unfoldingowanej cząsteczki RNA). Dlatego dopasowanie danych jest bardziej złożone – zazwyczaj stosuje się kombinację dwóch modeli WLC lub modeli WLC i łańcucha swobodnie przegubowego (FJC)36,39,52. Rozciągliwy model WLC posiada dwa główne parametry dopasowania: długość konturową (LC) oraz długość persistencji (LP). Długość konturowa odpowiada długości całkowicie rozciągniętej cząsteczki, a długość persistencji definiuje właściwości zginania badanej cząsteczki. Model ten można opisać następującym równaniem (1). WLC może być używany do modelowania zachowania zarówno regionów sfałdowanych, jak i unfoldingowanych, choć dla każdego z nich należy zastosować osobny model z różnymi parametrami.
      (1) Równanie modelu łańcucha podobnego do robaka, \(X_{WLC}=L_C[1-\frac{1}{2}(\frac{k_BT}{F\cdot L_p})^{1/2}+\frac{F}{S}]\).
      gdzie x to rozciągnięcie, LC to długość konturowa, F to siła, LP to długość persistencji, kB to stała Boltzmanna, T to temperatura termodynamiczna, a S to moduł rozciągliwości.
      Drugi model, nazywany łańcuchem swobodnie przegubowym (FJC), jest powszechnie używany do opisu zachowania unfoldingowanych regionów jednoniciowych. Wykorzystuje on podobne parametry polimerów, ale traktuje każdą jednostkę „łańcucha” jako sztywny pręt, co tutaj odpowiada nukleotydom unfoldingowanego regionu jednoniciowego. Poniższe równanie (2) opisuje ten model:
      (2) Wzór na rozciągnięcie elastycznego łańcucha polimerowego; równanie równowagi statycznej; do użytku badawczego.
      UWAGA: Nasze laboratorium opracowało niedawno algorytm umożliwiający przetwarzanie wsadowe surowych danych z rampy siły o nazwie „Practical Optical Tweezers Analysis TOol (POTATO)54”. Algorytm wykonuje downsampling i filtrowanie danych, następnie identyfikuje możliwe stopnie unfoldingu, a na koniec przeprowadza dopasowanie danych. POTATO posiada przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).
  3. Dane o stałej sile przetwarzaj w następujący sposób:
    UWAGA: Poniższe instrukcje można analogicznie zastosować do danych o stałej pozycji.
    1. W przypadku danych o stałej sile wykreśl odległość w funkcji czasu (Rysunek 5). Histogram pokazujący częstotliwość (liczbę wystąpień) różnych konformacji w funkcji względnej zmiany pozycji jest użytecznym sposobem charakteryzowania różnych stanów dominujących i mniejszościowych (Rysunek 7).
    2. Dopasuj histogram za pomocą (wielokrotnych) funkcji Gaussa, aby oszacować całkowity procent poszczególnych konformerów przy danej sile (Rysunek 7C). Dopasowania Gaussa, średnia pozycja i odchylenie standardowe zarysowują zależność od siły między różnymi populacjami.
      UWAGA: W danych uzupełniających udostępniono napisany na zamówienie skrypt w języku python, umożliwiający przetwarzanie wstępne i podstawowe bimodalne dopasowanie Gaussa dla danych o stałej sile. Parametry (częstotliwość odcięcia, stopień filtra, oczekiwane średnie, wartości odchylenia standardowego i amplitudy) muszą zostać zoptymalizowane dla różnych eksperymentów.
    3. Następnie zastosuj ukryty model Markowa (Hidden Markov model), aby dalej analizować stany, co może ujawnić dodatkowe produkty pośrednie fałdowania (konformery)55. Dalsze informacje na temat stałej siły i ukrytego modelu Markowa można znaleźć w55,56,57,58.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji skupiono się głównie na pomiarach oddziaływań RNA-białko/ligand za pomocą fluorescencyjnej pęsety optycznej. Opis ogólnych eksperymentów z wykorzystaniem pęsety optycznej dla RNA oraz odpowiadające im reprezentatywne wyniki przedstawiono w 32. Bardziej szczegółowe omówienie oddziaływań RNA/DNA-białko znajduje się również w 1,2,26,59,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj demonstrujemy zastosowanie pęsety optycznej sprzężonej z fluorescencją do badania interakcji i dynamicznego zachowania cząsteczek RNA z różnymi ligandami. Poniżej omówiono krytyczne kroki i ograniczenia obecnej techniki.

Krytyczne kroki w protokole
Podobnie jak w przypadku wielu innych metod, jakość próbki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych danych. Dlatego, aby uzyskać próbki o jak najwyższej jakości, warto poświęcić czas na optymalizację procedury prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Anuji Kibe i Jun. Prof. Redmondowi Smythowi za krytyczną recenzję manuskryptu. Dziękujemy Tatianie Koch za fachową pomoc techniczną. Dziękujemy Kristynie Pekarkovej za pomoc w nagrywaniu eksperymentalnych filmów. Prace w naszym laboratorium są wspierane przez Stowarzyszenie Helmholtza oraz finansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC) Grant nr 948636 (dla NC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
szczepy bakteryjne
E. coli HB101kolekcja laboratoryjnaNie dotyczyklonowania wektorów
< silnych> chemikaliów i enzymów< / silny>
chlorek soduSigma-Aldrich31424
Biotyna-16-dUTPRoche11093070910Biotynylacja
BSASigma-AldrichA4737
KatalazyLumicksN/ASystem skanowania tlenu
Ditiotreitol (DTT)Melford LabsD11000
DNAzy I z trzustki bydlęcejSigma-AldrichD4527Transkrypcja in vitro
dNTPsTh.Geyer11786181PCR
EDTASigma-AldrichE9884
FormamidSigma-Aldrich11814320001
GlukozaSigma-AldrichG8270-1KGSystem scavanger tlenu
Oksydaza glukozowaLumicksN/ASystem scavanger
tlenu HEPESCarl RothHN78.3
Chlorek magnezuCarl Roth2189.1
Phusion Polimeraza DNANEBM0530LMontaż Gibsona, klonowanie
Chlorek potasuMerck529552-1KG
PrimeSTAR GXL DNA PolimerazaTakara Bio ClontechR050APCR
Pirofosfotaza, termostabilna, nieorganicznaNEBM0296LInhibitor RNazy transkrypcji in vitro
Molox1000379515
rNTPSlife technologiesR0481transkrypcja in vitro
Tiosulofat soduSigma-AldrichS6672-500GDezaktywacja wybielacza
Sytox GreenLumicksN/Apomiary konfokalne
T4 DNA PolimerazaNEBM0203SBiotynylacja
T5 egzonukleazaNEBM0363SMontaż Gibsona, klonowanie
polimerazy RNA T7Wyprodukowany we własnymtranskrypcja in vitro/A
polimeraza DNA TaqNEBM0267SPCR
Ligaza TaqBiozymL6060LMontaż Gibsona, klonowanie
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP7949
Kits
Zestaw do znakowania białek monolitycznych RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)NanotemperMO-L011Używany do znakowania rybosomów
Purefrex 2.0GeneFrontierPF201-0.25-EXRybosomy używane do znakowania
oligonukleotydy
5' uchwyt T7 forwardMicrosynthna zamówienieniestandardowe5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3', służy do generowania szablonu transkrypcji OT in vitro w PCR 1
3' obsługa odwrotnaMikrosyntezatorna zamówienieniestandardowe 5' -  GTCAAAGTGCCCCCGTTATCC - 3', służy do generowania szablonu transkrypcji OT in vitro w PCR 1
5' uchwyt naprzódMikrosyntezatorna zamówienie niestandardowe5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , służy do generowania uchwytu 5' w PCR 2
5' uchwyt odwrotnyMikrosyntezatorzamówienieniestandardowe 5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', służy do generowania uchwytu 5' w PCR 2
3' uchwyt do przoduMicrosynthna zamówienie niestandardowe5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', służy do generowania uchwytu 3' w PCR 3
uchwytu 3' wstecznego 5' znakowany digoksygeninąMikrosyntezatorna zamówienieniestandardowe 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCCCCCGTTATCC - 3', używany do generowania uchwytu 3' w wektorach PCR 3
DNApMZ_OT
produkowanych we własnym zakresieN/Adalszy opis w "Badania strukturalne białka Cardiovirus 2A ujawniają molekularne podstawy rozpoznawania RNA i kontroli translacyjnej"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and algorithms
Atomhttps://atom.io/packages/ide-pythonN/A
BluelakeLumicksN/A
Graphpadhttps://www.graphpad.com/N/A
InkScape 0.92.3https://inkscape.org/N/A
Matlabhttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlN/A
POTATON/A
RNAstructurehttps://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.htmlN/A
Spyderhttps://www.spyder-ide.org/N/A
Inny
Cząstki polistyrenu pokryte streptawidyną, 1,5-1,9 i mikro; m, 5 ml, 1.0% w/vSpherotechSVP-15-5
Cząstki polistyrenu powlekane anty-digoksygeniną, 2,0-2,4 i mikro; m, 2 ml, 0,1% w/vSpherotechDIGP-20-2
StrzykawkiVWRTERUMO SS+03L1
Devices
C-trapLumicksN/A  Pęseta optyczna sprzężona z mikroskopią konfokalną
zakresie N na ' https://github.com/lpekarek/POTATO.git

Bibliografia

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096(2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118(2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, Pt 7 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172(2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582(2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler's murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406(2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O'Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714(2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799(2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O'Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23(2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542(2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500(2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549(2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484(2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, Clifton, N.J. 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193(2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137(2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795(1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166(2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110(2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246(2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272(2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749(2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Techniki pojedynczych cz steczekmikroskopia konfokalnaeksperymenty z ramp si ybia ka wi ce RNAprzesuni cie ramki odczytu rybosomalnegostabilno struktury RNAznakowanie fluorescencyjne
Pęseta optyczna do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.