Artykuł metodologiczny

Techniki obchodzenia się w celu zmniejszenia stresu u myszy

DOI:

10.3791/62593

⸱

25 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje technikę obsługi u myszy, technikę obsługi 3D, która ułatwia rutynowe obchodzenie się poprzez redukcję zachowań podobnych do lęku i przedstawia szczegóły dotyczące dwóch istniejących powiązanych technik (obsługa tunelu i ogona).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta laboratoryjne są poddawane wielokrotnym manipulacjom przez naukowców lub opiekunów zwierząt. Wywoływany przez to stres może mieć głęboki wpływ na dobrostan zwierząt, a także może być czynnikiem zakłócającym zmienne eksperymentalne, takie jak miary lęku. Z biegiem lat opracowano techniki obchodzenia się ze zwierzętami, które minimalizują stres związany z obchodzeniem się z nimi, ze szczególnym naciskiem na szczury, a niewielką uwagą na myszy. Wykazano jednak, że myszy mogą być przyzwyczajone do manipulacji za pomocą technik obchodzenia się. Przyzwyczajenie myszy do obchodzenia się z nimi zmniejsza stres, ułatwia rutynowe obchodzenie się z nimi, poprawia dobrostan zwierząt, zmniejsza zmienność danych i poprawia wiarygodność eksperymentów. Pomimo korzystnych efektów obsługi, podejście polegające na podnoszeniu ogona, które jest szczególnie stresujące, jest nadal szeroko stosowane. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy opis i demonstrację nowo opracowanej techniki posługiwania się myszą, mającej na celu zminimalizowanie stresu doświadczanego przez zwierzę podczas interakcji z człowiekiem. Ta ręczna technika jest wykonywana przez 3 dni (technika obsługi 3D) i koncentruje się na zdolności zwierzęcia do przyzwyczajenia się do eksperymentatora. Badanie to pokazuje również wpływ wcześniej ustalonych technik obsługi tunelowej (przy użyciu tunelu poliwęglanowego) oraz techniki podnoszenia ogona. W szczególności badany jest ich wpływ na zachowania podobne do lęku, za pomocą testów behawioralnych (Elevated-Plus Maze i Novelty Suppressed Feeding), dobrowolnej interakcji z eksperymentatorami i pomiarów fizjologicznych (poziom kortykosteronu). Technika obsługi 3D i technika obsługi tunelowej zmniejszyły fenotypy podobne do lęku. W pierwszym eksperymencie, w którym wykorzystano 6-miesięczne samce myszy, technika obsługi 3D znacznie poprawiła interakcję z eksperymentatorem. W drugim eksperymencie, z udziałem 2,5-miesięcznej samiczki, obniżono poziom kortykosteronu. W związku z tym obsługa 3D jest użytecznym podejściem w scenariuszach, w których wymagana lub preferowana jest interakcja z eksperymentatorem, lub w których obsługa tunelowa może nie być możliwa podczas eksperymentu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy i szczury są niezbędnymi zasobami do badań przedklinicznych1,2 do wielu celów, w tym badań endokrynologicznych, fizjologicznych, farmakologicznych lub behawioralnych2. Z rosnącej liczby badań na zwierzętach wynika, że niekontrolowane zmienne środowiskowe, w tym interakcja z człowiekiem, wpływają na różne wyniki badań biomedycznych3,4,5. Jest to odpowiedzialne za znaczną zmienność obserwowaną w eksperymentach i laboratoriach badawczych4,5, co stanowi poważne zastrzeżenie w badaniach na zwierzętach.

Różne podejścia zostały wdrożone w celu ograniczenia wpływu stresorów środowiskowych i zmniejszenia reaktywności na interakcje międzyludzkie. Na przykład, aby ograniczyć wpływ stresorów środowiskowych, we wszystkich laboratoriach wdrożono standaryzację warunków mieszkaniowych i zautomatyzowane systemy utrzymania6,7. Jeśli chodzi o interakcje z ludźmi, powszechnie stosowane podejścia do obchodzenia się ze zwierzętami i transportu nie uwzględniały dyskomfortu i stresu zwierząt. Na przykład, podnoszenie zwierząt za ogon lub używanie kleszczy8 zwiększa lęk w linii bazowej9,10,11, zmniejsza eksplorację9,12 i znacznie przyczynia się do zmienności międzyosobniczej w obrębie i między badaniami13,14. W rezultacie opracowano inne podejścia, takie jak technika obchodzenia się z kubkiem, która ma zastosowanie do myszy i szczurów. W tym podejściu zwierzęta są "wyjmowane" z klatki i trzymane przez eksperymentatorów rękami tworzącymi cup9,10,11. Inną przydatną alternatywą dla obsługi ogona jest użycie tunelu poliwęglanowego do przenoszenia myszy9,10,15. Takie podejście eliminuje bezpośrednią interakcję między myszą a eksperymentatorem. Zarówno podejście kubkowe, jak i tunelowe wykazało skuteczność w zmniejszaniu zachowań podobnych do lęku i strachu przed eksperymentatorem, które mogą być wyolbrzymione przez awersyjne techniki obsługi, takie jak podnoszenie ogona/obsługa ogona9,10.

Dlatego też, coraz więcej dowodów wskazuje na przydatność właściwej obsługi myszy do zmniejszania zmienności między osobami9,11, oraz poprawy dobrostanu zwierząt10. Jednak wymienione powyżej techniki nadal napotykają na ograniczenia. Technika obchodzenia się z kubkiem została wdrożona z harmonogramami od 10 dni (10 sesji w ciągu 2 tygodni16) do 15 tygodni17, co jest znaczną ilością czasu dla personelu placówki i eksperymentatorów. Dodatkowo, skuteczność obsługi kubka różni się w zależności od strain9, a konwencjonalne obchodzenie się z kubkiem w otwartych dłoniach może prowadzić do tego, że naiwne myszy lub szczególnie nerwowe szczepy będą skakać z ręka9,18. Obsługa tunelu skutkuje bardziej spójnymi i ogólnie szybszymi wynikami w gentling19. Tunele są również wykorzystywane jako wzbogacenie klatek domowych. Pomagają zwierzętom szybko przyzwyczaić się do obchodzenia się z nimi i zapewniają dodatkowe korzyści płynące z wzbogacenia. Obsługa tunelowa ma jednak ograniczenia w przenoszeniu zwierząt między urządzeniami. Co ciekawe, Hurst i West9, oraz Henderson et al.20 wykazali, że stosowanie delikatnego i krótkiego ręcznego obchodzenia się z zwierzętami z tunelu do aparatury nie wpływa na ich fenotyp.

Aby zapewnić alternatywę dla istniejących metod, z osiągalnym przyzwyczajeniem w krótkim czasie, ten artykuł opisuje nową technikę, która rozszerza technikę obsługi kubków, nie wymagając więc specjalnego sprzętu. Podejście to wykorzystuje kamienie milowe do oceny poziomu komfortu, jaki myszy mają w procesie obsługi. Wykazuje skuteczność w zmniejszaniu reaktywności myszy i stresu (na poziomie behawioralnym i hormonalnym), ułatwia rutynowe obchodzenie się z nią i przyczynia się do zmniejszenia zmienności między zwierzętami. Szczegóły tej techniki znajdują się tutaj, a jej skuteczność w zmniejszaniu zachowań podobnych do lęku, poprawie interakcji z eksperymentatorami i ograniczaniu uwalniania obwodowego hormonu stresu (kortykosteronu) wykazano w dwóch oddzielnych badaniach (samce i samice myszy), w porównaniu z technikami obsługi tunelowej (kontrola pozytywna) i technikami obsługi ogona (kontrola negatywna).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez komitet opieki nad zwierzętami CAMH i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

UWAGA: Opisana tutaj metoda postępowania może być stosowana w różnych szczepach myszy, w tym nietransgenicznych (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, itp.) i transgenicznych. Może być również stosowany u młodych lub starych myszy, zauważając, że młode dorosłe myszy (4-6 tygodniowe) są zwykle nieco bardziej aktywne niż myszy dorosłe lub stare, szczególnie w dniu 1.

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Przed rozpoczęciem badania, zgodnie z wytycznymi ARRIVE21, losowo przypisz myszy do każdej grupy (3D-Handling, Tunnel Handling lub Tail Handling).
  2. Zidentyfikuj pomieszczenie, w którym ma zostać wykonana obsługa. Można go wykonać w pomieszczeniu mieszkalnym lub w oddzielnym pomieszczeniu. Jeżeli obchodzenie się z zwierzętami odbywa się w oddzielnym pomieszczeniu, co wymaga przemieszczenia zwierząt na ruchomym wózku, należy pozwolić zwierzętom przyzwyczaić się do nowego pomieszczenia przez 20–30 minut przed rozpoczęciem protokołu obchodzenia się z nimi.
  3. W przypadku zwierząt trzymanych w grupie, użyj tymczasowej klatki do trzymania myszy po kontakcie, zanim zgrupujesz je wszystkie w początkowej klatce domowej. Zmniejsza to potencjalne walki między zwierzętami przed kontaktem (szczególnie u samców).
  4. Pracuj na blacie (najlepiej oczyszczonym blacie) lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego, z klatką trzymaną z dala od dotykanego zwierzęcia. Bliska odległość od klatki w ośrodku zwiększa ryzyko skakania. Jeśli zwierzęta są trzymane w grupie, wskakiwanie myszy do klatki domowej może powodować stres u współlokatorów.
    UWAGA: Praca w szafie bezpieczeństwa biologicznego ogranicza ryzyko skakania myszy po podłodze i może być wymagana w niektórych obiektach. Technika ta może być stosowana w komorze bezpieczeństwa biologicznego, upewniając się, że zawsze wykonujesz wszystkie kroki wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego i unikając myszy chodzących po przedramionach przewodnika.

2. DZIEŃ 1: 5 minut na mysz

  1. Delikatnie otwórz klatkę i umieść pokrywę z boku, usuń materiały gniazdowe i inne urozmaicenie, takie jak koła jezdne lub schronienia.
  2. Wprowadź otwartą dłoń w rękawiczce do klatki domowej, powoli kładąc dłoń po jednej stronie ściany klatki (ściana najbliżej przewodnika, Rysunek 1A).
    1. Nie próbuj od razu podnosić myszy.
  3. Pozostań w bezruchu i pozwól zwierzęciu przyzwyczaić się do obecności ręki w klatce przez około 30 sekund.
  4. Spróbuj podnieść mysz w dłoni (tj. unikaj podnoszenia zwierzęcia za ogon).
    1. Jeśli mysz nie jest łatwa do podniesienia po 3 próbach, poprowadź mysz do rogu i chwyć ją obiema rękami.
    2. Delikatnie przesuń złożone dłonie w kierunku myszy, aby spróbować ją podnieść.
    3. Jeśli nie powiedzie się po maksymalnie 3 próbach obiema rękami, delikatnie podnieś mysz za podstawę ogona i przenieś ją na przedramię lub płaską dłoń.
  5. Trzymając mysz w dłoni, trzymaj dłoń tak płasko i otwartą, jak to możliwe.
    UWAGA: Zapewnia to płaską platformę, na którą może nadepnąć mysz, i ogranicza ryzyko ugryzienia.
  6. Trzymając dłoń otwartą i płaską dłonią do góry, umieść drugą rękę obok ręki trzymającej mysz i pozwól myszy swobodnie poruszać się z ręki do ręki bez żadnych ograniczeń (Rysunek 1B).
  7. Pozwól myszy eksplorować i poruszać się między rękami przez 1 minutę.
    1. W tym momencie myszy mogą próbować odskoczyć. Ustaw wskazówki tak, aby jeśli mysz podskoczy, wyląduje na blacie, a nie na podłodze.
    2. Jeśli mysz wygląda, jakby przygotowywała się do skoku (zbliżając się do krawędzi dłoni i stapiając na tylnych łapach), powoli połóż drugą rękę przed nią i spróbuj nakłonić ją do wejścia na tę rękę. Unikaj gwałtownych ruchów, ponieważ zwiększa to ryzyko skakania.
    3. Jeśli mysz skacze, spróbuj ją podnieść, unikając obsługi ogona i wznów sesję obsługi. Jeśli mysz pozostaje na podłodze lub poza rękami przez więcej niż 10 sekund, dodaj dodatkowy czas do sesji obsługi, aby nadrobić czas, w którym mysz była poza rękami.
    4. Rób notatki ze skoku. Całkowita liczba skoków może być wykorzystana do oceny potencjalnej zmienności między zwierzętami.
  8. Po 1 minucie posługiwania się płaskimi rękami rozluźnij dłoń i lekko zanurz mysz w dłoni, a następnie delikatnie przetoczyj mysz między rękami (Rysunek 1C).
    1. Aby "toczyć się", umieść mysz w dłoni, na płaskiej dłoni, prostopadle do palców.
    2. Powoli zamknij dłoń, kładąc palce na grzbiecie myszy.
    3. Umieść wolną rękę bezpośrednio pod ręką trzymającą mysz.
    4. Powoli obróć/obróć dłoń za pomocą myszy, aby delikatnie przenieść mysz do drugiej ręki (obrót o 180°).
    5. Powtarzaj to w tę i z powrotem między rękami.
  9. Na przemian z delikatnego przetaczania się między rękami i swobodnej eksploracji na otwartych dłoniach przez 60 s, naprzemiennie co około 20 sekund.
  10. Wykonaj "test schronienia" (Rysunek 1D).
    1. Pozwól myszy przesunąć się do krawędzi dłoni, a następnie zbliż do siebie 2 wskazówki.
    2. Bardzo powoli przyłóż je tak, aby mysz zmieściła się w "schronieniu" utworzonym przez dłonie. Pozostaw otwór, aby mysz mogła uciec w razie potrzeby.
    3. Staraj się trzymać mysz w schronieniu przez 5-10 s, bez żadnych ograniczeń.
    4. Na przemian z testu schronienia, przetaczania się między rękami i swobodnej eksploracji otwartych dłoni przez kolejne 60 sekund, upewniając się, że wykonasz krok schronienia 3 lub więcej razy.
  11. We wszystkich procedurach opisanych w punkcie 2.10 nie należy się spieszyć. Jeśli mysz wydaje się zestresowana (tj. nieśmiało ucieka, skacze z rąk, unika kontaktu z rękami itp.), będąc uwięzioną w dłoniach, kontynuuj przetaczanie się między rękami i swobodną eksplorację przez 20 sekund, a następnie spróbuj ponownie.
  12. Kamień milowy: Wykonaj co najmniej 1 udany test schronienia trwający 10 sekund, aby ukończyć Dzień 1.
    1. Uznaj, że test schronienia jest udany, gdy mysz pozostaje w dłoniach. Jeśli mysz wystawi głowę i wróci do schronu, to i tak jest to udany test. Jeśli zwierzę całkowicie wyjdzie ze schroniska, jest to porażka.
  13. Pozwól na swobodną eksplorację w rękach przez 30 s.
  14. Delikatnie umieść mysz w klatce. Jeśli mysz jest trzymana w grupie, umieść ją w tymczasowej klatce, dopóki wszyscy koledzy z klatki nie zostaną obsłużeni. Przywróć myszy do ich pierwotnej klatki, podnosząc je w dłoni. Nie używaj podnośnika ogonowego.
  15. Oczyść blat stołu z potencjalnego kału i moczu za pomocą 70% etanolu.
  16. Dokładnie wypłucz rękawice 70% etanolem (lub odpowiednim roztworem czyszczącym) lub zmień rękawice przed kontaktem z następną myszą (możliwe jest zachowanie tych samych rękawic dla kolegów z klatki).
    UWAGA: Zaleca się obchodzenie się z rozsądną liczbą zwierząt, aby uniknąć zmęczenia przewodnika. Obchodzenie się z 24 myszami trwa około 2 godzin i zaleca się, aby nie przekraczać 24 myszy na przewodnika. Jeżeli konieczne jest zajęcie się większą liczbą zwierząt, zaleca się albo posiadanie wielu opiekunów, albo podzielenie procedur obchodzenia się z nimi na podgrupy na kilka dni.

3. DZIEŃ 2: 3 do 5 minut na mysz

  1. Spróbuj podnieść mysz w dłoni. Na tym etapie powinno to być już wykonalne, a myszy nie powinny wyskakiwać z ręki.
  2. Zacznij z otwartą dłonią, tak jak w dniu 1, pozwalając myszy na swobodną eksplorację przez 20 sekund.
  3. Następnie kilkakrotnie przerzuć mysz między rękami (4-5 razy).
  4. Wykonaj "test schronienia" przez 5 sekund.
  5. Powtórz test schronienia kilka razy (~5-6) w ciągu 2 do 3 minut.
  6. W tym samym okresie od 2 do 3 minut naprzemiennie z przewracaniem się między rękami i swobodną eksploracją otwartych dłoni od 1 dnia, aby poprawić przyzwyczajenie.
    1. Dotknij myszką po głowie i plecach (Rysunek 1E), 5-6 razy. Oznaką przyzwyczajenia jest to, że mysz pozwala jej dotknąć bez próby ucieczki.
    2. Wykonaj "Szturchanie nosa": Spróbuj dotknąć pyska myszy 2 do 3 razy (Rysunek 1F).
      1. Jeśli mysz próbuje ugryźć lub wykazuje wyraźne oznaki stresu po dotknięciu, nie próbuj natychmiast ponownie szturchnąć nosa. Zamiast tego naprzemiennie z eksploracją płaskiej ręki i rolką. "Przyzwyczajenie" przejawia się w tym, że zwierzę nie ucieka ani nie odwraca głowy w przypadku kontaktu z człowiekiem.
  7. We wszystkich procedurach opisanych w 3.4-3.6 nie spiesz się z procesem. Jeśli mysz wydaje się zestresowana tym, że jest uwięziona w dłoniach lub nie chce być dotykana, kontynuuj przewracanie się między rękami przez 20-30 sekund, a następnie spróbuj ponownie.
  8. Kamienie milowe: Wykonaj co najmniej 1 udane szturchnięcie nosem przez 2-3 sekundy, aby zakończyć Dzień 2.
  9. Przerwij tę sesję po około 3 minutach obsługi, jeśli zwierzę dobrze reaguje na "schronienie", "głaskanie głowy", "szturchanie nosa" i jeśli mysz wydaje się być chętna do eksploracji dłoni bez oznak stresu.
  10. Jeśli mysz nadal wykazuje oznaki stresu lub nie reaguje dobrze na "test schronienia" lub test "szturchnięcia nosa", kontynuuj sesję do osiągnięcia 5 minut, jak w dniu 1.
  11. Włóż mysz do klatki, wyczyść blat stołu i rękawiczki jak w dniu 1.

4. DZIEŃ 3: Około 3 minuty na mysz

  1. Trzeciego dnia wykonuj te same czynności, co w dniu 2, przez 2 do 3 minut.
    1. Podnieś mysz w dłoni.
    2. Przenoś i obracaj mysz między rękami
    3. Wykonaj test schronienia.
    4. Spróbuj pogłaskać mysz po plecach i głowie.
  2. Wykonuj naprzemiennie te kroki przez około 1 do 2 minut.
  3. Kontynuuj procedurę, aż mysz będzie wystarczająco zrelaksowana, aby usiąść w dłoni bez próby ucieczki.
  4. Przed końcem dnia 3 powtórz test schronienia i test szturchnięcia nosa jako test przyzwyczajenia.
    1. Jeśli oba testy można wykonać za pierwszym razem, proces habituacji jest zakończony. Kontynuuj delikatne obchodzenie się z myszą przez 30 s do minuty.
    2. Jeśli mysz jest początkowo odporna na którykolwiek z testów, powtórz kroki 4.1-4.3 przez 20-30 s przed ponowną próbą testu szturchnięcia nosa i schronienia.
    3. Jeśli mysz pozostanie odporna na te testy po 3 minutach, trzeci dzień można powtórzyć.
  5. Kamienie milowe: Wykonaj co najmniej 2 udane testy schronienia po 10 s każdy i 2 udane testy szturchnięcia nosem, aby zakończyć Dzień 3 i zakończyć całą procedurę obsługi 3D.
  6. Umieść mysz z powrotem w klatce, wyczyść blat stołu i rękawice.

5. Opcjonalne podejście dla zwierząt, które mają być poddane krępowaniu w celu wstrzyknięcia lub zgłębnika

UWAGA: W dniu 3, jeśli zwierzę będzie skrępowane do celów eksperymentalnych (doustne zgłębniki, wstrzyknięcie dootrzewnowe, itp.), myszy mogą zostać poddane testowi szczypania szyi.

  1. Chwyć kark między kciukiem a palcem wskazującym (Rysunek 1G).
  2. Podnieś mysz 3-5 cm nad dłoń przez 2-3 s.
    UWAGA: Jest to zwykle nienaturalna pozycja dla dorosłych myszy, a jeśli myszy pozostają prawie nieruchome, są dobrze przyzwyczajone do obsługi i będą łatwe do powstrzymania w celach eksperymentalnych.
  3. Umieść mysz z powrotem w płaskiej dłoni lub jeśli mysz reaguje na szczypanie szyi, rozważ umieszczenie jej na rękawie eksperymentatora, pokrywie klatki lub blacie
    UWAGA: Jeśli pracujesz w szafie bezpieczeństwa biologicznego, nie umieszczaj myszy na rękawie, ponieważ może ona podejść i wyjść z szafy bezpieczeństwa biologicznego. Preferuj umieszczanie myszy na blacie wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego.
  4. Pozostaw mysz na 1 minutę, aby swobodnie eksplorować rękę eksperymentatora.

6. Opcjonalne podejście dla dodatkowych dni obsługi

  1. W przypadku silnie zestresowanej linii myszy, dodaj dodatkowe dni, aby zmniejszyć reaktywność i poziom stresu zwierząt, stosując metody opisane w Dzień 2/3.
    UWAGA: Na wyjściowy stres zwierząt może wpływać wiele czynników, w tym napięcie, obecność modyfikacji transgenicznej, wiek, płeć i warunki utrzymania. Jeżeli czynniki te nie są spójne między grupami, takimi jak zwierzęta w podeszłym wieku badane w porównaniu z młodymi zwierzętami kontrolnymi lub zwierzęta transgeniczne badane w porównaniu z kontrolami typu dzikiego, zaleca się, aby dla każdej grupy stosować taką samą liczbę dni habituacji.

7. Obsługa tunelu

UWAGA: Ta technika ma zastosowanie tylko do myszy z obsługą tunelową. Tunele to rury poliwęglanowe o długości około 13 cm i średnicy 5 cm.

  1. Umieść tunel w klatce myszy.
  2. Pozostaw tunel w klatce na 7 dni przed obróbką.
  3. Otwórz klatkę i umieść pokrywę z boku.
  4. Delikatnie wprowadź mysz do tunelu z poliwęglanu (już w klatce).
  5. Podnieś tunel z klatki poziomo. W razie potrzeby luźno przykryj końce tunelu, aby zwierzę nie wyskoczyło/nie wypadło z tunelu, potencjalnie wpadając z powrotem do klatki lub na podłogę.
  6. Przenieś zwierzę w tunelu z dala od klatki domowej i trzymaj je z dala od wszelkich powierzchni przez 30 sekund.
  7. Umieść tunel z powrotem w klatce domowej, pozwalając myszy wyjść z tuby.
  8. Odczekaj 60 sekund, a następnie powtórz kroki 7.4-7.7 raz.
  9. Dokładnie spłucz rękawiczki 70% etanolem lub zmień rękawiczki przed przyzwyczajeniem następnej myszy.
  10. Powtarzaj tę procedurę przez 10 kolejnych dni.

8. Obsługa ogona

UWAGA: Ta technika ma zastosowanie tylko do myszy z uchwytem ogonowym. Służy do przenoszenia myszy z klatki do aparatu i odwrotnie.

  1. Otwórz klatkę i umieść pokrywę z boku.
  2. Chwyć myszy za podstawę ogona między kciukiem a palcem wskazującym.
  3. Podnieś mysz z klatki.
  4. W ciągu 2-3 sekund przenieś mysz na przeciwległe przedramię eksperymentatora, trzymając ogon, aby uniknąć zwisania myszy.
  5. Gdy podczas realizacji tego doświadczenia wymagane jest obchodzenie się z ogonem (np. przed pobraniem krwi do badania kortyzolu), zwierzęta są przenoszone na przedramię eksperymentatora za pomocą ogona i trzymane przez 15 sekund przed powrotem do klatki.

9. Labirynt Elevated Plus

  1. Konfiguracja pokoju
    1. Umieść labirynt na środku pokoju, pod aparatem cyfrowym wyposażonym w kartę pamięci.
    2. Ustaw światło w pomieszczeniu na ~60 luksów za pomocą 2 lamp stojących umieszczonych za labiryntem.
    3. Wyłącz oświetlenie górne, aby uniknąć bezpośredniego światła w labiryncie, które tworzy odbicia i zakłóca wykrywanie zwierząt w labiryncie.
    4. Po ustawieniu całego sprzętu przenieś zwierzęta do pokoju i pozwól im zaaklimatyzować się do ustawień światła i nowego środowiska przez 30 minut.
  2. testowanie
    1. Oczyść labirynt 70% etanolem, aby zapobiec zapachom z kurzu lub zwierzęcia, które było wcześniej testowane.
    2. Uruchom aparat.
    3. Użyj kartki papieru z identyfikatorem zwierzęcia, aby nagrać identyfikator na filmie, przed umieszczeniem zwierzęcia w labiryncie (ułatwi to prawidłową identyfikację, która mysz jest filmowana na każdym filmie).
    4. Użyj odpowiedniej techniki obchodzenia się z każdym zwierzęciem, aby przenieść je do labiryntu.
    5. Umieść mysz na centralnej platformie, skierowaną w stronę otwartego ramienia.
    6. Pozwól myszy eksplorować urządzenie przez 10 minut, bez zakłóceń.
    7. Po 10 minutach zatrzymaj kamerę.
    8. Wyciągnij mysz z labiryntu i umieść ją z powrotem w klatce.
    9. Oczyść kał i mocz z labiryntu za pomocą 70% etanolu.
    10. Po zakończeniu testów na wszystkich myszach przenieś filmy z karty pamięci do komputera w celu śledzenia wideo.
    11. Korzystając z automatycznego oprogramowania do śledzenia zwierząt, śledź liczbę wejść do otwartych i zamkniętych ramion oraz czas spędzony w otwartych lub zamkniętych ramionach (tutaj Ethovision XT 14).

10. Interakcja z eksperymentatorem (wywodząca się z Hurst and West9)

  1. Konfiguracja pokoju
    1. Umieść stół na środku sali testowej pod aparatem cyfrowym wyposażonym w kartę pamięci.
    2. Ustaw światło na 50-70 luksów za pomocą 4 żarówek umieszczonych w rogu pomieszczenia skierowanym do sufitu. Wyłącz oświetlenie górne, aby uniknąć bezpośredniego światła w labiryncie, które tworzy odbicia i zakłóca wykrywanie zwierząt na arenie.
    3. Przyprowadź zwierzęta do pokoju.
    4. Pozwól im zaaklimatyzować się w pomieszczeniu przez 30 minut.
  2. eksperyment
    1. Umieść klatkę domową pod aparatem cyfrowym.
    2. Zdejmij pokrywę.
    3. Usuń materiał gniazdowy i inne urozmaicenie, które może przeszkadzać w śledzeniu zwierząt.
    4. Uruchom aparat.
    5. Użyj karty klatki z identyfikatorem zwierzęcia, aby zidentyfikować zwierzę na filmie.
    6. Umieść rękę w klatce domowej wzdłuż ściany klatki z przodu po prawej stronie.
      1. Upewnij się, że głowa przewodnika nie blokuje kamery, aby sfilmować mysz.
    7. Uruchom minutnik.
    8. Trzymaj rękę nieruchomo przez 2 minuty i pozwól myszy badać dłoń.
    9. Wyjmij rękę z klatki na 15 sekund.
    10. Spróbuj podnieść mysz za pomocą złożonych dłoni i zapisz, czy mysz ucieka.
    11. Powtórz ostatni krok do pięciu razy, co 5 sekund lub do momentu, gdy mysz pozwoli się podnieść.
    12. Zapisz liczbę prób wymaganych do podniesienia myszy.
    13. Wróć materiał do zagnieżdżania i wzbogacenie do klatki.
    14. Wyczyść rękawiczki 70% etanolem lub zmień rękawiczki przed przystąpieniem do następnego zwierzęcia.
    15. Po przetestowaniu przenieś filmy z karty pamięci do komputera.
    16. Korzystając z automatycznego oprogramowania do śledzenia wideo, podziel klatkę na cztery równe ćwiartki i zarejestruj czas spędzony przez mysz w każdym kwadrancie (tutaj Ethovision XT 14).

11. Karmienie stłumione nowościami

  1. Deprywacja żywnościowa
    1. Na 3 dni przed badaniem należy przeprowadzić pełną wymianę klatki i trzymać zwierzęta w jednym pomieszczeniu (preferowane jest pojedyncze trzymanie w celu przeprowadzenia badania w klatce domowej).
      UWAGA: Zapewnienie świeżej ściółki usuwa potencjalny kurz lub małe kawałki jedzenia, które nagromadziły się w pościeli od ostatniej zmiany klatki.
    2. Dzień przed badaniem zważ wszystkie zwierzęta około godziny 18.
    3. Wyjmij całą żywność z pojemnika na żywność i upewnij się, że w klatce lub w pościeli nie ma kawałków jedzenia.
  2. Konfiguracja pokoju
    1. Umieść komorę NSF na stole.
    2. Wypełnij komorę cienką warstwą ściółki kukurydzianej (lub innej ściółki, która różni się od ściółki używanej w domowej klatce dla zwierząt).
    3. Ustaw światło o natężeniu 70 luksów za pomocą 4 żarówek umieszczonych w rogu stołu, na którym stoi komnata, skierowaną do sufitu. Wyłącz światła górne, aby utrzymać słabe oświetlenie pomieszczenia.
    4. Umieść jedną kulkę standardowej karmy używanej w placówce, po stronie komory skierowanej w stronę eksperymentatora (≈10 cm od ściany).
  3. testowanie
    1. Rano po pozbawieniu jedzenia przyprowadź zwierzęta do pokoju 30 minut przed badaniem, aby umożliwić im aklimatyzację do ustawień światła i nowego środowiska.
    2. Zważ wszystkie zwierzęta, aby zmierzyć ich utratę masy ciała na podstawie masy zmierzonej poprzedniego dnia. Zwierzęta powinny stracić 8-12% w ciągu nocy, aby móc prawidłowo wykonać zadanie.
    3. Posortuj zwierzęta według utraty wagi i przesiewaj je, zaczynając od myszy, która straciła najwięcej, do myszy, która straciła najmniej na wadze.
    4. Upewnij się, że komora jest wypełniona ściółką i pojedynczym granulem.
    5. Umieść zwierzę po przeciwnej stronie komory, z dala od granulatu pokarmowego.
    6. Natychmiast uruchom minutnik.
    7. Pozwól myszy eksplorować komorę do 12 minut.
    8. Zmierz opóźnienie podejścia i karmienia (zwierzę musi gryźć i jeść) na granulkach żywności.
      1. Potraktuj to jako podejście, gdy zwierzę zbliża się do wypluwki, wącha ją i nie gryzie.
      2. Zdefiniuj ugryzienie jako moment, w którym zwierzę zaczyna spożywać granulkę.
    9. Zapisz opóźnienie, aby zbliżyć się i nakarmić się granulką w ciągu kilku sekund.
    10. Gdy mysz zżywi się granulką pokarmu, wyjmij ją z komory.
    11. Wyrzuć ściółkę, ale zachowaj granulkę, która zostanie użyta do testowania popędu apetytu w domowej klatce myszy.
    12. Zresetuj komorę dla następnego zwierzęcia i kontynuuj z następnym zwierzęciem.
    13. 15 minut po zakończeniu testu w komorze upuść śrut użyty podczas testu, do wnętrza klatki domowej myszy, na ścianę z przodu klatki.
    14. Zmierz opóźnienie, aby pożywić się granulatem, gdy pellet znajduje się w klatce domowej. Jest to środek na napęd apetytu.
      1. Lepiej jest usunąć materiał gniazdowy, aby upewnić się, że mysz widzi granulkę wrzucaną do klatki.

12. Pobieranie surowicy i pomiar kortykosteronu

  1. Ze zwierzętami należy obchodzić się przez 1 minutę zgodnie z przypisaną techniką, 15 minut przed pobraniem krwi (można to zrobić w przypadku zwierząt trzymanych w grupach lub w pomieszczeniach indywidualnych, mając na uwadze ryzyko bójek podczas przegrupowywania myszy).
    1. W przypadku myszy z uchwytem tunelowym poprowadź je do tunelu, podnieś tunel z klatki na 1 minutę i umieść mysz w klatce.
    2. W przypadku myszy z uchwytem ogonowym chwyć tylną podstawę myszy i wyjmij mysz z klatki. Przenieś mysz do rękawa eksperymentatora na 1 minutę i włóż mysz z powrotem do klatki, dotykając ogona.
    3. W przypadku myszy z uchwytem 3D użyj złożonych dłoni, aby wyjąć mysz z klatki. Trzymaj mysz w złożonych dłoniach przez 1 minutę i włóż ją z powrotem do klatki.
  2. Po 15 minutach od użycia należy przystąpić do pobierania krwi z żyły podżuchwowej22.
  3. Mocno pochyl mysz tak, aby głowa myszy była bezpiecznie unieruchomiona.
  4. Zlokalizuj miejsce nakłucia.
    1. Wzdłuż żuchwy twarzy znajduje się mały, bezwłosy wgłębienie, które można wykorzystać jako punkt orientacyjny do zlokalizowania miejsca nakłucia. Rysując linię między podstawą szczęki a tym wgłębieniem, miejsce nakłucia leży za tym wgłębieniem w kierunku ucha na około 5 mm, tuż za zawiasem szczęki.
  5. Trzymać czystą igłę 23 G prostopadle do miejsca wkłucia i wykonywać szybkie, zdecydowane ruchy nakłuwające. Końcówka igły powinna wniknąć na głębokość między 1-2 mm, krew popłynie natychmiast po nakłuciu żyły.
  6. Zbierz ~150 μL krwi w probówkach pobranych pokrytych EDTA i przechowuj na lodzie.
  7. Lekko dociśnij sterylnym gazikiem do miejsca nakłucia przez 5 s lub dłużej, aby krew mogła się skrzepnąć.
  8. Gdy krew zakrzepnie, wróć mysz do jej domowej klatki.
  9. Odwirować krew w temperaturze 4 °C 3 500 x g przez 10 min.
  10. Zdekantować supernatant.
  11. Przechowywać supernatant w temperaturze -20 °C do dalszych analiz.
  12. Zmierz poziom kortykosteronu za pomocą zestawu ELISA kortykosteronu zgodnie z protokołem producenta.
  13. Użyj spektrofotometru, aby odczytać wyniki ELISA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadzono dwa oddzielne badania na myszach C57BL/6. Badanie #1 obejmowało 6-miesięcznych chłopców, a badanie #2 obejmowało 2,5-miesięczne samice (N=36/badanie) z Jackson Laboratories (Cat #000664). Myszy trafiły do placówki w wieku 2 miesięcy. Podczas gdy samice z Badania #2 były obsługiwane i testowane dwa tygodnie po przybyciu, mężczyźni z Badania #1 byli obsługiwani i testowani dopiero w wieku 6 miesięcy (opóźnienie spowodowane globalnym zamknięciem pandemii). W tym czasie jedna mysz z Badania #2 zmarła, zanim za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie i opracowanie metody opierają się na obserwacji, że techniki obchodzenia się z myszami są nadal pomijane przez społeczność naukową, a niektóre laboratoria nadal niechętnie wdrażają techniki habituacji lub obchodzenia się z nimi w celu zmniejszenia stresu i reaktywności zwierząt przed eksperymentami. Obchodzenie się ze zwierzętami wiąże się z pewnym nakładem czasu, ale zapewnia im korzystne skutki, które mogą przyczynić się do powodzenia przeprowadzanych doświadczeń, i zapobiega konieczności wielokrotnego przep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Komitetowi ds. Opieki nad Zwierzętami CAMH za wsparcie tej pracy, a także opiekunom zwierząt CAMH, którzy dostarczyli obszernych informacji zwrotnych na temat użyteczności procedury, motywując do przeprowadzenia opisanych eksperymentów i przedłożenia szczegółowego protokołu innym użytkownikom. Praca ta została częściowo sfinansowana ze środków CAMH BreakThrough Challenge, przyznanego TP, oraz ze środków wewnętrznych CAMH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
23 G x 1 cal BD PrecisionGlide sterylna igła podskórna ogólnego zastosowania. Regularny typ ściany i regularna faza.BD2546-CABD305145Igły do pobierania krwi
BD Vacutainer® Probówki EDTA do pobierania krwi żylnej z lawendą BD Hemogard&handel; zamknięcie, 2.0ml (13x75mm), 100/pkBD367841EDTA Powlekane probówki do pobierania krwi
Łóżko" o kolby i frac14; ” Ściółka laboratoryjna dla zwierząt z kolb kukurydzyBed-O-CobsBEDO1/4Nowatorska ściółka do karmienia z tłumieniem nowości
WirówkaEppendorfWirówka 5424 RDo wirowania krwi.
Zestaw ELISA kortykosteronuTesty trzpienioweK003-H1W
Aparat cyfrowyPanasonicHC-V770Kamera do nagrywania interakcji EPM / Eksperymentator
Elevated Plus MazeHome Maden/aNiestandardowy labirynt wykonany z czterech czarnych ramion z pleksiglasu (dwa otwarte ramiona (29 cm długości i 7 cm szerokości) i dwa zamknięte ramiona (29 cm długości x 7 cm szerokości ze ściankami o wysokości 16 cm)) które tworzą kształt krzyża z dwoma otwartymi ramionami naprzeciwko siebie trzymany 55 cm nad podłogą
EtanolMedstore House Marka39753-P016-EA95Rozcieńczyć do 70% wodą destylowaną, do czyszczenia
Ethovision XT 15Noldusn/aOprogramowanie do automatycznego śledzenia zwierząt
Laboratorium Dieta dla gryzoniLabDietRodent Diet 5001Standardowa dieta dla gryzoni
Karta pamięciKingstone TechnologySDA3/64GBDo nagrywania wideo i transfer plików
Nowość Tłumiona komora karmieniaHome Madenie dotyczyNiestandardowa komora testowa z pleksi z przezroczystymi podłogami i ścianami o długości 62 cm, szerokości 31 cm i wysokości 40 cm.
Rurki Parlycarbonate HomeMaden/adługości 13 cm i średnicy 5 cm
Purina Yesterday' s aktualności Pościel z gazet z recyklinguPurina n/aStandardowa pościel
SpektrofotometrBiotekEpoch Microplate Reader
o

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936(2006).
  2. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26(2012).
  4. Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
  5. Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
  6. Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
  7. Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751(2019).
  8. Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  9. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  10. Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305(2019).
  11. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999(2017).
  12. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  13. Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
  14. Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075(2009).
  15. Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281(2020).
  16. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  17. Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718(2015).
  18. Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
  19. Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401(2013).
  20. Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454(2020).
  21. Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410(2020).
  22. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  23. Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
  24. LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
  25. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  26. Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
  27. Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures - a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
  28. Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649(2020).
  29. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  30. Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
  31. Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obs uga myszyredukcja stresu u zwierz tmyszy laboratoryjnechwytanie za pomoc tuneluchwytanie za ogonchwytanie 3Dzachowania l kowepoziomy kortykosteronutesty behawioralne

Powiązane artykuły