Przekrój optyczny i wizualizacja krążka międzykręgowego od rozwoju embrionalnego do zwyrodnienia

Summary

Prezentujemy metodę badania przestrzennej organizacji chondrocytów w pierścieniu włóknistym krążka międzykręgowego za pomocą metody optycznego przekroju.

Abstract

Zwyrodnienie krążka międzykręgowego (IVD) jest główną przyczyną bólu krzyża i pociąga za sobą wysoki stopień upośledzenia u osób dotkniętych chorobą. Aby zdekodować zwyrodnienie dysku i móc opracować podejścia regeneracyjne, niezbędne jest dokładne zrozumienie biologii komórkowej IVD. Jednym z aspektów tej biologii, który wciąż pozostaje bez odpowiedzi, jest pytanie, w jaki sposób komórki są rozmieszczone przestrzennie w stanie fizjologicznym i podczas degeneracji. Właściwości biologiczne IVD i jego dostępność sprawiają, że tkanka ta jest trudna do analizy. W niniejszym badaniu badano przestrzenną organizację chondrocytów w pierścieniu włóknistym od wczesnego rozwoju embrionalnego do końcowego stadium zwyrodnienia. Metoda przekroju optycznego (Apotome) jest stosowana do wykonywania analiz barwienia o wysokiej rozdzielczości przy użyciu bydlęcej tkanki embrionalnej jako modelu zwierzęcego i ludzkiej tkanki dysku uzyskanej od pacjentów poddawanych operacji kręgosłupa. Z powodu bardzo dużej gęstości chondrocytów we wczesnym embrionalnym krążku bydła, liczba komórek zmniejsza się podczas ciąży, wzrostu i dojrzewania. W ludzkich dyskach wzrost gęstości komórkowej towarzyszył postępowi degeneracji tkanek. Jak już wykazano w przypadku chrząstki stawowej, tworzenie się skupisk stanowi charakterystyczną cechę zaawansowanego zwyrodnienia dysku.

Introduction

Krążek międzykręgowy (IVD) to struktura oparta na chrząstce, która biochemicznie i pod względem architektury komórkowej, na pierwszy rzut oka, pod wieloma względami przypomina chrząstkę stawową¹. Rzeczywiście, zarówno zwyrodnienie IVD, jak i choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) chrząstki stawowej charakteryzują się zwężeniem przestrzeni stawowej z powodu zużycia chrząstki, tworzeniem się torbieli podchrzęstnej i osteofitów oraz stwardnieniem podchrzęstnym^2,3. Pomimo tych pozornych podobieństw, architektura i rola funkcjonalna obu tkanek różnią się. Podczas gdy macierz chrząstki stawowej składa się głównie z tworzącej arkadę sieci kolagenu typu II, IVD składa się z trzech różnych typów tkanek: bogate w kolagen jądro miażdżyste typu II w środku przejmuje obciążenia osiowe i przekazuje je do otaczającego pierścienia gęsto upakowanych okrągłych włókien kolagenu typu I, który nazywa się pierścieniem włóknistym. Ich funkcją jest pochłanianie translowanych ciśnień osiowych otrzymywanych przez jądro bogate w proteoglikany i wodę dzięki wytrzymałości włókien wzdłużnych na rozciąganie. Na górze i na dole każdego jądra i pierścienia szklista, chrzęstna płytka końcowa tworzy połączenie z sąsiednimi kręgami⁴ (Rysunek 1).

W chrząstce stawowej można znaleźć cztery różne przestrzenne wzorce chondrocytów: pary, struny, podwójne struny, małe lub duże skupiska5^,6,7 (Rysunek 2). Zmiany w tym wzorcu są związane z początkiem i progresją choroby zwyrodnieniowej stawów^8,9. Przestrzenna organizacja chondrocytów wskazuje również na bezpośrednią właściwość funkcjonalną chrząstki, a mianowicie jej sztywność, co podkreśla funkcjonalne znaczenie tego podejścia do oceniania opartego na obrazie^10,11. Wzorce te można dodatkowo zidentyfikować za pomocą już istniejącej klinicznie dostępnej technologii¹². Ze względu na podobieństwa między IVD a chrząstką stawową można postawić hipotezę, że charakterystyczne wzorce chondrocytów są również obecne w IVD. Tworzenie się klastrów jest zjawiskiem obserwowanym również w zdegenerowanym IVD^13,14.

Podczas próby analizy przestrzennej organizacji komórkowej w IVD, konieczne jest pokonanie kilku technicznych trudności, które nie występują podczas badania chrząstki stawowej:

Po pierwsze, przetwarzanie samej tkanki jest znacznie trudniejsze niż w przypadku jednorodnej chrząstki szklistej, która w dużej mierze składa się z kolagenu typu II. Głównym składnikiem błonnika w IVD jest kolagen typu I, który znacznie utrudnia generowanie cienkich skrawków histologicznych. Podczas gdy w szklistej chrząstce stawowej nawet grube odcinki mogą być łatwo analizowane ze względu na "szklisty" charakter tkanki, sieć kolagenu typu I IVD jest optycznie wysoce nieprzepuszczalna. Z tego powodu silny szum tła jest częstym problemem w histologii IVD. Szybkim i tanim sposobem na penetrację tej optycznie gęstej tkanki jest zastosowanie optycznego urządzenia do cięcia, np. za pomocą Apotome. W takim Apotomie siatka jest umieszczana w ścieżce oświetlenia konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Przed siatką umieszcza się płasko-równoległą szklaną płytę. Przechyla się w przód i w tył, rzutując w ten sposób siatkę na obrazie w trzech różnych pozycjach. Dla każdej pozycji Z tworzone są i nakładane na siebie trzy obrazy RAW z rzutowaną siatką. Za pomocą specjalnego oprogramowania można obliczyć nieostre światło. Podstawową zasadą jest to, że jeśli siatka jest widoczna, ta informacja jest ostra, jeśli nie, jest uważana za nieostrą. Dzięki tej technice można uzyskać dobrze ostre obrazy o wysokiej rozdzielczości w rozsądnym czasie.

Po drugie, tkanka jest trudna do zdobycia od ludzkich dawców. Podczas wykonywania całkowitej wymiany stawu kolanowego można uzyskać całą powierzchnię stawu do dalszej analizy podczas operacji. Chociaż choroba zwyrodnieniowa stawów biegunkowych jest również chorobą całego stawu, istnieją jednak silne różnice ogniskowe w jakości chrząstki, przy czym zwykle niektóre obszary stawu są nadal nienaruszone, na przykład z powodu zmniejszonego obciążenia w tym obszarze. Sytuacja ta jest inna w IVD, gdzie operacja jest zwykle wykonywana tylko wtedy, gdy dysk jest globalnie zniszczony. W przypadku pobierania tkanki od dawców ludzkich z sali operacyjnej, tkanka jest również wysoce rozdrobniona i konieczne jest prawidłowe przypisanie tkanki do jednego z trzech typów chrząstki w IVD przed wykonaniem dalszych analiz. Aby umożliwić bardziej szczegółową analizę również większych odcinków tkanek i przyjrzeć się rozwojowi embrionalnemu IVD, konieczny jest wybór zwierzęcego organizmu modelowego.

Przy wyborze takiego organizmu modelowego ważne jest, aby mieć system, który jest porównywalny z ludzkim dyskiem pod względem anatomii i wymiarów, obciążenia mechanicznego, obecnej populacji komórek, jak również składu tkankowego. Na potrzeby przedstawionej techniki proponujemy wykorzystanie bydlęcej tkanki krążka międzykręgowego: Krytyczną właściwością ludzkiego krążka międzykręgowego, skutkującą jego niskim potencjałem regeneracyjnym, jest utrata komórek struny grzbietowej podczas dojrzewania w jądrze. Jednak w wielu organizmach modelowych komórki struny grzbietowej można wykryć przez całe ich życie. Większość z niewielu zwierząt, które tracą komórki struny grzbietowej, takich jak owce, kozy lub psy chondrodystrofigowe, ma IVD, które jest znacznie mniejsze niż ludzkie krążki. Występują tylko lędźwiowe krążki bydlęce o średnicy tarczy strzałkowej porównywalnej do tych u ludzi IVD¹⁵.

Kluczowym czynnikiem prowadzącym do wczesnej degeneracji dysku jest nadmierne obciążenie mechaniczne. Ciśnienie wewnątrzdyskowe stojącej krowy w odcinku lędźwiowym kręgosłupa wynosi około 0,8 MPa przy kręgosłupie ustawionym poziomo. Co zaskakujące, ciśnienia te są porównywalne z naciskami śróddyskowymi w odcinku lędźwiowym podawanym dla wyprostowanego ludzkiego kręgosłupa (0,5 MPa)^15,16. Również ilość wody i proteoglikanów w krążkach bydlęcych jest porównywalna do tej w IVD od młodych ludzi¹⁷. W związku z tym, chociaż rzeczywisty wzorzec ruchu segmentów ruchu może różnić się u zwierząt czworonożnych od dwunożnych u ludzi, pod względem całkowitego obciążenia i charakterystyki dysku, krowa jest znacznie bliższa biologii człowieka niż inne uznane modele zwierzęce do IVD, takie jak owce i psy.

W tym protokole prezentujemy technikę analizy zmian w IVD z punktu widzenia przestrzennej organizacji chondrocytów od wczesnego rozwoju embrionalnego do końcowego stadium zwyrodnienia.

Protocol

Do analizy rozwoju i dojrzewania embrionalnego użyto krążków bydlęcych. Aby ocenić zwyrodnienie IVD, przeanalizowano próbki ludzkie.

Ludzka tkanka IVD została pobrana od pacjentów poddawanych operacji zwyrodnienia dysku lędźwiowego, wypadnięcia dysku lub urazu kręgosłupa na Wydziale Chirurgii Ortopedycznej Szpitala Uniwersyteckiego w Tybindze i Centrum Urazowym BG w Tybindze. Pełna zgoda komisji bioetycznej została uzyskana przed rozpoczęciem badania (numer projektu 244/2013BO2). Przed udziałem w badaniu uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich pacjentów. Metody przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.

Tkanka bydlęca została uzyskana z Bawarskiego Krajowego Urzędu ds. Zdrowia i Bezpieczeństwa Żywności/Oberschleißheim oraz z zakładu utylizacyjnego w Warthausen (Niemcy). Uzyskano zgodę władz lokalnych i weterynaryjnych na tkanki pochodzące z martwych zwierząt.

1. Pobieranie próbek

1. Ludzka tkanka IVD: Śródoperacyjnie uzyskane próbki do diagnostyki in vitro należy natychmiast umieścić w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 2% (v/v) penicyliny-streptomycyny i 1,2% (v/v) amfoterycyny B. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania. Przetwarzaj tkankę w ciągu 48 godzin. Alternatywnie chusteczki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
2. Bydlęca tkanka IVD: Należy upewnić się, że tkanka została pobrana od zwierząt w ciągu 24 godzin po śmierci.
   Wyciąć krążki bydlęce wraz z otaczającymi je kręgami od martwych zwierząt en bloc. Zamrożoną tkankę transportować na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetwarzania.
   UWAGA: Jeśli planowane są tylko analizy fluorescencyjne i nie są planowane dalsze metody biochemicznej oceny ilościowej, takie jak ELISA lub PCR, należy przeprowadzić utrwalanie tkanki, jak wyjaśniono poniżej. Pozwala to na dłuższe przechowywanie tkanki, zanim będzie musiała zostać przetworzona. Aby zapobiec pogorszeniu stanu macierzy tkankowej, należy przeprowadzić utrwalanie w ciągu 48 godzin po pobraniu, chyba że tkanka jest bezpośrednio zamrożona.

2. Przygotowanie próbki

1. Rozmrozić zamrożoną tkankę w temperaturze pokojowej. Przetwarzaj tkankę, gdy tylko nie będzie już wyczuwalne żadne kryształki lodu po cyfrowym delikatnym ściśnięciu tkanki.
   UWAGA: Przygotować tkankę w DMEM na szalce Petriego.
2. Zidentyfikuj pochodzenie ludzkiej tkanki IVD (pierścień włóknisty, strefa pośrednia, jądro miażdżyste lub chrzęstna płytka końcowa) na podstawie właściwości makroskopowych, takich jak gęstość i orientacja kolagenu.
3. Weź segment ruchowy składający się z krążka kostnego bydła IVD z dwoma sąsiednimi kręgami i wypreparuj dysk jako całość z kości podchrzęstnej za pomocą ostrza chirurgicznego (ostrze nr 15).
   1. Użyj dwóch anatomicznych kleszczy, aby obrócić dysk, aby dotrzeć do obszarów bardziej wyśrodkowanych. Wykonaj sekcję. Upewnij się, że wycięcie jądra miażdżystego jest ostatnie, ponieważ jest ono znacznie cieńsze niż pierścień, podatne na rozerwanie i nie odpada łatwo w określony sposób.
   2. Zidentyfikuj różne obszary chrząstki.
   3. Wytnij obszar zainteresowania z całego dysku za pomocą ostrza chirurgicznego (ostrze numer 20 lub 22). Alternatywnie użyj ostrza do kriotomów.
      UWAGA: Ponieważ krążki bydlęce są dostarczane en bloc jako część kręgosłupa, krążki mogą być przygotowane in toto. Ułatwia to prawidłową identyfikację różnych rodzajów chrząstek. Podczas preparowania dysku w sposób opisany powyżej, chrzęstna płytka końcowa pozostaje na kręgach. Jeżeli obszar ten ma być zbadany, najlepiej jest zdjąć go z leżącej pod nim kości za pomocą dłuta pracującego w lekko zgiętym kierunku stycznym.
4. W przypadku gdy zarodki mają długość korony i zadu mniejszą niż 20 cm, należy upewnić się, że zarodki są przetwarzane w całości, aby zachować architekturę tkankową IVD. W takich przypadkach nie należy wykonywać żadnych preparacji kręgów.
5. Po wycięciu dysku w całości zidentyfikuj różne obszary chrząstki.
   1. Odwapnienie przeprowadzić w kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (20% (m/v); pH = 7,4) w temperaturze pokojowej. Objętość należy dobrać w zależności od wielkości próbki - cała tkanka musi być dobrze pokryta EDTA.
   2. Codziennie zmieniaj roztwór odwapniający, który może trwać do 5 dni, w zależności od wielkości tkanki.
   3. Sprawdź, czy odwapnienie powiodło się za pomocą igły o rozmiarze 20, która penetruje kręgi bez zauważalnego oporu.
      UWAGA: Codzienna zmiana roztworu odwapniającego jest ważna, aby zapobiec nasyceniu spoiwa chelatowego EDTA w celu utrzymania skuteczności reakcji. Zapobiega również kolonizacji bakteryjnej.

3. Klasyfikacja wieku, integralności i zwyrodnienia próbki

1. Sklasyfikuj ludzką tkankę dysku do jednej z pięciu poniższych kategorii za pomocą informacji klinicznych, a także obrazowania rentgenowskiego i rezonansu magnetycznego¹⁸ (Rysunek 3).
   UWAGA: Kategoria I: Aby służyć jako próbka prawie zdrowa, należy użyć pierścienia bez żadnych radiologicznych objawów zwyrodnienia IVD wynikającego z ostrego urazu kręgosłupa.
   Kategoria II: Aby zilustrować sytuację ostrego stanu zapalnego z początkiem zwyrodnienia, należy użyć tkanki ze strefy pośredniej od pacjentów z objawami klinicznymi trwającymi krócej niż 4 tygodnie.
   Kategoria III: Opis sytuacji, w której reakcja zapalna zdążyła już wpłynąć na tkankę i komórki pobiera tkanki od pacjentów, którzy byli operowani z powodu wypadania jądra atomowego, ale z objawami trwającymi dłużej niż 4 tygodnie.
   Kategoria IV: W przypadku umiarkowanego zwyrodnienia dysku wybierz pierścienie uzyskane z operacji z fuzją międzytrzonową w chorobie zwyrodnieniowej dysku z wynikiem Pfirrmanna 3 lub 4 w obrazowaniu rezonansu magnetycznego¹⁹.
   Kategoria V: Dla końcowego stadium procesu zwyrodnienia uzyskanego z zabiegu chirurgicznego z fuzją międzytrzonową w chorobie zwyrodnieniowej dysku z wynikiem Pfirrmanna 5.
2. Na podstawie etapu rozwojowego/wieku zwierzęcia należy zaklasyfikować tkankę bydlęcą do jednej z ośmiu kategorii, jak przedstawiono w tabeli 1.
   1. Oblicz wiek ciążowy na podstawie długości korony i zadu zarodków na podstawie wzoru sugerowanego przez Kellera:
      Wiek ciążowy w miesiącach =
      UWAGA: Zwierzęta w pierwszych 4 tygodniach ciąży mają długość korony i zadu 0,8-2,2 cm²⁰.

4. Utrwalenie tkanek

1. Utrwalić próbki w 10-krotnie większej objętości niż próbka 4% (w/v) roztworu formaldehydu w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) przez noc w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Roztwór formaldehydu wnika w tkankę z prędkością około 1 mm/godzinę z każdego kierunku. W przypadku bardzo małych lub bardzo dużych próbek może być konieczne dostosowanie czasu naświetlania.
2. Przechowywać tkankę w PBS w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.

5. Przekrój histologiczny

1. Opaść próbki w rozpuszczalnym w wodzie podłożu do zatapiania na pokrętle kriotomowym.
   1. Umieść tkankę na gałce w taki sposób, aby powstała albo płaszczyzna osiowa, albo płaszczyzna, która prostopadle przecina blaszki kolagenu typu I (np. środkowa strzałkowa płaszczyzna przekroju).
      UWAGA: Tkanka musi być całkowicie pokryta podłożem do zatapiania.
2. Osadzoną tkankę należy przeciąć na sekcje o grubości 70 μm w próbkach ludzkich i 40 μm w próbkach bydlęcych przy użyciu standardowego kriotomu.
   UWAGA: Różnica w grubości przekroju wynika z różnicy w integralności tkanek między nienaruszonym krążkiem bydlęcym a wysoce zdegenerowaną tkanką ludzką.
3. Zbierz skrawki na szklanym szkiełku.
   1. Owiń skrawki tkanki hydrofobowym pisakiem.
   2. Przepłukać skrawki 3 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia rozpuszczalnego w wodzie podłoża do zatapiania.

6. Barwienie fluorescencyjne

1. Dodać 60 μl 1% (v/v) DAPI (Exmax 358 nm, Emmax 461 nm) oraz 1% (v/v) barwienia Actin Tracking (Exmax 540 nm, Emmax 565 nm) do PBS i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Opisany tutaj protokół barwienia polega na wizualizacji jądra za pomocą barwienia jądrowego DAPI (niebieski) i cytoplazmy za pomocą barwienia śledzącego aktynę (czerwony). IVD ma silną autofluorescencję dzięki włóknom kolagenowym w kanale zielonym. Ilość płynu dodawanego do sekcji w tym protokole jest przeznaczona dla przekrojów o wymiarach około 5 mm x 5 mm. W przypadku większych odcinków ilość tę należy odpowiednio zwiększyć. Wszystkie prace wykonuj w pomieszczeniach bez bezpośredniego nasłonecznienia i przy przyciemnionym świetle, aby zapobiec wybielaniu barwnika.
2. Usunąć płyn barwiący za pomocą pipety i przemyć trzykrotnie 60 μl PBS za każdym razem.
3. Dodać odpowiednie podłoże montażowe i przykryć sekcje szkiełkiem nakrywkowym.
   UWAGA: Upewnij się, że podczas dodawania szkiełka nakrywkowego nie ma pęcherzyków powietrza. Najlepiej zrobić to, rozpoczynając kontakt ślizgu z suwakiem na jednej obręczy, a następnie pozwól, aby poślizg powoli opadał.

7. Obrazowanie i przetwarzanie mikroskopowe

1. Umieść szkiełko z zabarwionym fragmentem na uchwycie próbki mikroskopu.
   UWAGA: Ze względu na gęstą sieć kolagenu typu I w IVD, rozproszone światło utrudnia wizualizację tkanki przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jest wykonanie przekroju optycznego przy użyciu oświetlenia strukturalnego. Pozwala to również na renderowanie trójwymiarowej projekcji całego preparatu w obu kanałach (niebieskim i czerwonym). Najlepiej zrobić to za pomocą ustawienia oświetlenia strukturalnego i trybu Mosaic z soczewką obiektywową o 10-krotnym powiększeniu, aby uzyskać przegląd próbki, a także rekonstrukcje 3D poszczególnych wzorów.
2. Uruchom urządzenie do oświetlenia strukturalnego.
   1. Obrazowanie w pojedynczym polu widzenia należy wykonać za pomocą odpowiedniego mikroskopu fluorescencyjnego, filtrów fluorescencyjnych i odpowiedniego oświetlenia.
      UWAGA: Dostosuj czas naświetlania dla wszystkich używanych filtrów, aby ustandaryzować akwizycję obrazu. Aby uzyskać dokładne odwzorowanie próbki na obrazie o wyższej rozdzielczości, należy wybrać sekcje o większym powiększeniu (np. obiektyw 20x).
   2. Przetwarzanie końcowe obrazów poprzez optymalizację intensywności i jasności za pomocą oprogramowania do optymalizacji obrazu kompatybilnego z mikroskopem fluorescencyjnym.
3. Aby zobrazować przekrój jako całość, użyj techniki obrazowania mozaikowego
   1. Otwórz ustawienia akwizycji (naciśnij 6D- Akwizycja) z panelu paska narzędzi.
   2. Dostosuj ustawienia mozaiki (w MosaiX Register) i zdefiniuj liczbę kolumn i rzędów obrazów pola widzenia, które później mają zostać scalone w jeden obraz ogólny
   .
   3. Naciśnij przycisk Setup i dostosuj korekcję ostrości poszczególnych kafelków.
      UWAGA: Jest prawie niemożliwe, aby duży wycinek tkanki miał całą powierzchnię tkanki w jednej płaszczyźnie ostrości. Obrazy kafelków na różnych poziomach ogniskowych można wykonać za pomocą "MosaiX Acquisition".
   4. Aby rozpocząć pobieranie kafelków obrazu, naciśnij przycisk Start.
   5. Zszyj obrazowane płytki za pomocą funkcji zszywania (przycisk zszywania) z 20% zakładką wbudowaną w oprogramowanie.
   6. Przetwarzanie końcowe obrazów poprzez optymalizację intensywności i jasności za pomocą oprogramowania do optymalizacji obrazu kompatybilnego z mikroskopem fluorescencyjnym.
4. Aby przeanalizować przestrzenną organizację chondrocytów, użyj funkcji 3D wbudowanej w oprogramowanie.
   1. Dostosuj ustawienia stosu z. Zdefiniuj parametry skanowania: zdefiniuj pozycje początkowe i końcowe w osi z oraz odległość przekroju, aktywując przycisk Start/Stop.
      UWAGA: Oprogramowanie automatycznie oblicza liczbę plasterków.
   2. Aby rozpocząć pobieranie stosów z obrazów, naciśnij przycisk Start.
   3. Przetwarzanie końcowe obrazów poprzez optymalizację intensywności i jasności za pomocą oprogramowania do optymalizacji obrazu kompatybilnego z mikroskopem fluorescencyjnym.
5. Wyeksportuj zdjęcia w formacie pliku zgodnym z oprogramowaniem do przetwarzania obrazu.
   UWAGA: Eksportuj rekonstrukcje 3D jako pojedyncze obrazy i/lub jako interaktywny model 3D lub w formacie wideo.

8. Identyfikacja wzorca komórkowego i ocena gęstości

1. Otwórz wyeksportowane obrazy mozaiki całego przekroju tkanki w odpowiednim programie do przetwarzania obrazu.
2. Zdefiniuj obszary poddawane ocenie gęstości komórek, definiując obszary zainteresowania o wymiarach 500 μm x 500 μm na rysunkach.
   UWAGA: Wszystkie kafelki, które nie mają odpowiedniej jakości obrazu, są wyłączone z analizy.
3. Zidentyfikuj indywidualne wzorce komórkowe.
   UWAGA: Pojedyncze komórki są definiowane jako pojedyncze komórki - w pełni zamknięte w sąsiedniej macierzy. Pary definiuje się jako dwie sąsiadujące ze sobą komórki znajdujące się blisko siebie (<25 μm), przy czym komórki są ze sobą połączone za pomocą swoich macierzy (patrz Rysunek 2). Formacje strunowe to co najmniej trzy chondrocyty ustawione w linii (od środka jąder <25 μm). Komórki te są otoczone nienaruszoną macierzą, a między każdą komórką można zobaczyć wzajemne połączenia macierzy. Klastry reprezentują wiele komórek, które znajdują się w bezpośredniej odległości od siebie (<25 μm) i są zamknięte w dużej luce pozbawionej macierzy.
4. Użyj wtyczki zliczania komórek do ilościowej analizy wzorców komórkowych.
   UWAGA: Barwienie cytoplazmą stanowi metodę weryfikacji w celu identyfikacji różnych wzorców przestrzennych.
5. Oblicz gęstość komórek, dzieląc zliczone komórki przez rozmiar wybranego obszaru zainteresowania.

Results

Korzystając z obrazów mozaikowych, można wyraźnie rozpoznać architekturę IVD z gęstą siecią włókien kolagenowych w pierścieniu i bardziej miękkim jądrem (Rysunek 4). Podczas rozwoju embrionalnego można zaobserwować ciągły spadek gęstości komórkowej (Ryc. 5). Podczas gdy we wczesnych stadiach rozwoju IVD można stwierdzić gęstość komórek wynoszącą 11 435 komórek/mm² w bydlęcym pierścieniu włóknistym i 17 426 komórek/mm² w jądrze miażdżystym bydła, liczby te szybko spadają do 1 011 ko...

Discussion

Korzystając z mikroskopii fluorescencyjnej wzbogaconej obrazowaniem mozaikowym i przekrojem optycznym, oceniliśmy przestrzenne rozmieszczenie chondrocytów w pierścieniu lędźwiowego IVD podczas rozwoju, dojrzewania i zwyrodnienia. Podczas gdy tkanka zwyrodnieniowa mogła być pobierana od pacjentów poddawanych operacji kręgosłupa z powodu zwyrodnienia dysku, analiza okresu embrionalnego i fazy dojrzewania wymagała użycia organizmu modelowego (bydlęcego). Wysokie zagęszczenie komórek obserwowano w pierścieniu we wczesnym roz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amfoterycyna B	Merck KGaA,  Niemcy	A2942
Szkiełka mikroskopowe adhezyjne SuperFrost Plus	R. Langenbrinck, Niemcy	03-0060
ApoTome	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Niemcy	462000115
AxioVision Rel. 4.8 z Modul MosaiX	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Niemcy
CellMask Actin Tracking Stain	Thermo Fischer Scientific, US	A57249
Cryostat	Leica Biosystems, Stany	CM3050S
DAPI	Thermo Fischer Scientific, US	D1306
Zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco	, Gibco, Life Technologies, Niemcy	41966052
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma-Aldrich, US	60004
Miskop fluorescencyjny - Axio Observer Z1 z kamerą Axio Cam MR3 i Colibri	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Niemcy	3834000604
Formaldehyd	Merck KGaA,  Niemcy	104002
Obraz J 1.53a, z wtyczką licznika komórek	National Insittute of Health (NIH), US
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin	Thermo Fischer Scientific, US	A12380
Mikroskopijne okulary ochronne	R. Langenbrinck, Niemcy	01-1818/1
PAP Pen Liquid Blocker	Usługi naukowe  GmbH, Niemcy	N71310
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich, US	P4333
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich, US	P5119
Skalpel	pf medical AG, Niemcy	2023-01
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Holandia	SA6255012