Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przekrój optyczny i wizualizacja krążka międzykręgowego od rozwoju embrionalnego do zwyrodnienia

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62594

⸱

8 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopedic Surgery, University Hospital of Tübingen, 2Department of Orthopedic Surgery, University Hospital of Tübingen, 3Institute for Bioinformatics and Medical Informatics, Faculty of science of the University of Tübingen, 4Medical faculty of the University of Tübingen, 5Bavarian Health and Food Safety Authority

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę badania przestrzennej organizacji chondrocytów w pierścieniu włóknistym krążka międzykręgowego za pomocą metody optycznego przekroju.

Streszczenie

Zwyrodnienie krążka międzykręgowego (IVD) jest główną przyczyną bólu krzyża i pociąga za sobą wysoki stopień upośledzenia u osób dotkniętych chorobą. Aby zdekodować zwyrodnienie dysku i móc opracować podejścia regeneracyjne, niezbędne jest dokładne zrozumienie biologii komórkowej IVD. Jednym z aspektów tej biologii, który wciąż pozostaje bez odpowiedzi, jest pytanie, w jaki sposób komórki są rozmieszczone przestrzennie w stanie fizjologicznym i podczas degeneracji. Właściwości biologiczne IVD i jego dostępność sprawiają, że tkanka ta jest trudna do analizy. W niniejszym badaniu badano przestrzenną organizację chondrocytów w pierścieniu włóknistym od wczesnego rozwoju embrionalnego do końcowego stadium zwyrodnienia. Metoda przekroju optycznego (Apotome) jest stosowana do wykonywania analiz barwienia o wysokiej rozdzielczości przy użyciu bydlęcej tkanki embrionalnej jako modelu zwierzęcego i ludzkiej tkanki dysku uzyskanej od pacjentów poddawanych operacji kręgosłupa. Z powodu bardzo dużej gęstości chondrocytów we wczesnym embrionalnym krążku bydła, liczba komórek zmniejsza się podczas ciąży, wzrostu i dojrzewania. W ludzkich dyskach wzrost gęstości komórkowej towarzyszył postępowi degeneracji tkanek. Jak już wykazano w przypadku chrząstki stawowej, tworzenie się skupisk stanowi charakterystyczną cechę zaawansowanego zwyrodnienia dysku.

Wprowadzenie

Krążek międzykręgowy (IVD) to struktura oparta na chrząstce, która biochemicznie i pod względem architektury komórkowej, na pierwszy rzut oka, pod wieloma względami przypomina chrząstkę stawową1. Rzeczywiście, zarówno zwyrodnienie IVD, jak i choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) chrząstki stawowej charakteryzują się zwężeniem przestrzeni stawowej z powodu zużycia chrząstki, tworzeniem się torbieli podchrzęstnej i osteofitów oraz stwardnieniem podchrzęstnym2,3. Pomimo tych pozornych podobieństw, architektura i rola funkcjonalna obu tkanek różnią się. Podczas gdy macierz chrząstki stawowej składa się głównie z tworzącej arkadę sieci kolagenu typu II, IVD składa się z trzech różnych typów tkanek: bogate w kolagen jądro miażdżyste typu II w środku przejmuje obciążenia osiowe i przekazuje je do otaczającego pierścienia gęsto upakowanych okrągłych włókien kolagenu typu I, który nazywa się pierścieniem włóknistym. Ich funkcją jest pochłanianie translowanych ciśnień osiowych otrzymywanych przez jądro bogate w proteoglikany i wodę dzięki wytrzymałości włókien wzdłużnych na rozciąganie. Na górze i na dole każdego jądra i pierścienia szklista, chrzęstna płytka końcowa tworzy połączenie z sąsiednimi kręgami4 (Rysunek 1).

W chrząstce stawowej można znaleźć cztery różne przestrzenne wzorce chondrocytów: pary, struny, podwójne struny, małe lub duże skupiska5,6,7 (Rysunek 2). Zmiany w tym wzorcu są związane z początkiem i progresją choroby zwyrodnieniowej stawów8,9. Przestrzenna organizacja chondrocytów wskazuje również na bezpośrednią właściwość funkcjonalną chrząstki, a mianowicie jej sztywność, co podkreśla funkcjonalne znaczenie tego podejścia do oceniania opartego na obrazie10,11. Wzorce te można dodatkowo zidentyfikować za pomocą już istniejącej klinicznie dostępnej technologii12. Ze względu na podobieństwa między IVD a chrząstką stawową można postawić hipotezę, że charakterystyczne wzorce chondrocytów są również obecne w IVD. Tworzenie się klastrów jest zjawiskiem obserwowanym również w zdegenerowanym IVD13,14.

Podczas próby analizy przestrzennej organizacji komórkowej w IVD, konieczne jest pokonanie kilku technicznych trudności, które nie występują podczas badania chrząstki stawowej:

Po pierwsze, przetwarzanie samej tkanki jest znacznie trudniejsze niż w przypadku jednorodnej chrząstki szklistej, która w dużej mierze składa się z kolagenu typu II. Głównym składnikiem błonnika w IVD jest kolagen typu I, który znacznie utrudnia generowanie cienkich skrawków histologicznych. Podczas gdy w szklistej chrząstce stawowej nawet grube odcinki mogą być łatwo analizowane ze względu na "szklisty" charakter tkanki, sieć kolagenu typu I IVD jest optycznie wysoce nieprzepuszczalna. Z tego powodu silny szum tła jest częstym problemem w histologii IVD. Szybkim i tanim sposobem na penetrację tej optycznie gęstej tkanki jest zastosowanie optycznego urządzenia do cięcia, np. za pomocą Apotome. W takim Apotomie siatka jest umieszczana w ścieżce oświetlenia konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego. Przed siatką umieszcza się płasko-równoległą szklaną płytę. Przechyla się w przód i w tył, rzutując w ten sposób siatkę na obrazie w trzech różnych pozycjach. Dla każdej pozycji Z tworzone są i nakładane na siebie trzy obrazy RAW z rzutowaną siatką. Za pomocą specjalnego oprogramowania można obliczyć nieostre światło. Podstawową zasadą jest to, że jeśli siatka jest widoczna, ta informacja jest ostra, jeśli nie, jest uważana za nieostrą. Dzięki tej technice można uzyskać dobrze ostre obrazy o wysokiej rozdzielczości w rozsądnym czasie.

Po drugie, tkanka jest trudna do zdobycia od ludzkich dawców. Podczas wykonywania całkowitej wymiany stawu kolanowego można uzyskać całą powierzchnię stawu do dalszej analizy podczas operacji. Chociaż choroba zwyrodnieniowa stawów biegunkowych jest również chorobą całego stawu, istnieją jednak silne różnice ogniskowe w jakości chrząstki, przy czym zwykle niektóre obszary stawu są nadal nienaruszone, na przykład z powodu zmniejszonego obciążenia w tym obszarze. Sytuacja ta jest inna w IVD, gdzie operacja jest zwykle wykonywana tylko wtedy, gdy dysk jest globalnie zniszczony. W przypadku pobierania tkanki od dawców ludzkich z sali operacyjnej, tkanka jest również wysoce rozdrobniona i konieczne jest prawidłowe przypisanie tkanki do jednego z trzech typów chrząstki w IVD przed wykonaniem dalszych analiz. Aby umożliwić bardziej szczegółową analizę również większych odcinków tkanek i przyjrzeć się rozwojowi embrionalnemu IVD, konieczny jest wybór zwierzęcego organizmu modelowego.

Przy wyborze takiego organizmu modelowego ważne jest, aby mieć system, który jest porównywalny z ludzkim dyskiem pod względem anatomii i wymiarów, obciążenia mechanicznego, obecnej populacji komórek, jak również składu tkankowego. Na potrzeby przedstawionej techniki proponujemy wykorzystanie bydlęcej tkanki krążka międzykręgowego: Krytyczną właściwością ludzkiego krążka międzykręgowego, skutkującą jego niskim potencjałem regeneracyjnym, jest utrata komórek struny grzbietowej podczas dojrzewania w jądrze. Jednak w wielu organizmach modelowych komórki struny grzbietowej można wykryć przez całe ich życie. Większość z niewielu zwierząt, które tracą komórki struny grzbietowej, takich jak owce, kozy lub psy chondrodystrofigowe, ma IVD, które jest znacznie mniejsze niż ludzkie krążki. Występują tylko lędźwiowe krążki bydlęce o średnicy tarczy strzałkowej porównywalnej do tych u ludzi IVD15.

Kluczowym czynnikiem prowadzącym do wczesnej degeneracji dysku jest nadmierne obciążenie mechaniczne. Ciśnienie wewnątrzdyskowe stojącej krowy w odcinku lędźwiowym kręgosłupa wynosi około 0,8 MPa przy kręgosłupie ustawionym poziomo. Co zaskakujące, ciśnienia te są porównywalne z naciskami śróddyskowymi w odcinku lędźwiowym podawanym dla wyprostowanego ludzkiego kręgosłupa (0,5 MPa)15,16. Również ilość wody i proteoglikanów w krążkach bydlęcych jest porównywalna do tej w IVD od młodych ludzi17. W związku z tym, chociaż rzeczywisty wzorzec ruchu segmentów ruchu może różnić się u zwierząt czworonożnych od dwunożnych u ludzi, pod względem całkowitego obciążenia i charakterystyki dysku, krowa jest znacznie bliższa biologii człowieka niż inne uznane modele zwierzęce do IVD, takie jak owce i psy.

W tym protokole prezentujemy technikę analizy zmian w IVD z punktu widzenia przestrzennej organizacji chondrocytów od wczesnego rozwoju embrionalnego do końcowego stadium zwyrodnienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Do analizy rozwoju i dojrzewania embrionalnego wykorzystano krążki bydlęce. W celu oceny degeneracji krążka międzykręgowego przeanalizowano próbki ludzkie.

Ludzkie tkanki krążka międzykręgowego (IVD) pozyskano od pacjentów poddawanych operacjom z powodu degeneracji krążka międzykręgowego odcinka lędźwiowego, wypadnięcia krążka międzykręgowego lub urazów kręgosłupa w Klinice Chirurgii Ortopedycznej Uniwersyteckiego Szpitala w Tübingen oraz w Centrum Traumatycznym BG w Tübingen. Przed rozpoczęciem badania uzyskano pełną zgodę komisji etycznej (numer projektu 244/2013BO2). Od wszystkich pacjentów przed przystąpieniem do badania uzyskano pisemną świadomą zgodę. Metody były realizowane zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.

Tkankę bydlęcą pobrano z Bawarskiego Państwowego Urzędu ds. Zdrowia i Bezpieczeństwa Żywności w Oberschleißheim oraz z zakładu utylizacji zwierząt w Warthausen (Niemcy). Uzyskano zgodę lokalnych i weterynaryjnych organów nadzorczych na pobranie tkanek od zwierząt martwych.

1. Pozyskiwanie próbek

  1. Ludzka tkanka IVD: Próbki IVD pobrane podczas operacji należy niezwłocznie umieścić w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z dodatkiem 2% (v/v) penicyliny-streptomycyny i 1,2% (v/v) amfoterycyny B. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki. Tkankę należy przetworzyć w ciągu 48 h. Alternatywnie tkanki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
  2. Bydża tkanka IVD: Należy upewnić się, że tkanka została pobrana od zwierząt w ciągu 24 h po śmierci.
    Krążki bydlęce wraz z otaczającymi kręgami należy wyciąć z martwych zwierząt en-bloc. Zamrożoną tkankę transportować na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszej obróbki.
    UWAGA: Jeśli planowane są wyłącznie analizy fluorescencyjne, a nie przewidziano dalszych metod ilościowych, takich jak ELISA lub PCR, należy przeprowadzić fiksację tkanki zgodnie z opisem poniżej. Pozwala to na dłuższe przechowywanie tkanki przed koniecznością jej przetworzenia. Aby zapobiec degradacji macierzy tkankowej, fiksację należy przeprowadzić w ciągu 48 h od pobrania, chyba że tkanka została zamrożona bezpośrednio.

2. Przygotowanie próbek

  1. Odprzymrozić zamrożoną tkankę w temperaturze pokojowej. Przystąpić do obróbki tkanki, gdy tylko po delikatnym ucisku palcami nie będą już wyczuwalne kryształki lodu.
    UWAGA: Przygotowanie tkanki należy przeprowadzić w DMEM w szalce Petriego.
  2. Zidentyfikować pochodzenie ludzkiej tkanki IVD (pierścień włóknisty, strefa przejściowa, jądro miażdżyste lub płytka graniczna) na podstawie właściwości makroskopowych, takich jak gęstość i orientacja kolagenu.
  3. Pobrać segment ruchowy składający się z bydlęcego krążka IVD wraz z dwoma sąsiadującymi kręgami i wyciąć cały krążek z kości podchrząstkowej za pomocą skalpela (ostrze numer 15).
    1. Użyć dwóch pęset anatomicznych do odwrócenia krążka, aby dotrzeć do obszarów bardziej centralnych. Przeprowadzić sekcję. Należy pamiętać, aby jądro miażdżyste wycinać na samym końcu, ponieważ jest ono znacznie cieńsze niż pierścień włóknisty, podatne na rozdarcia i nie oddziela się łatwo w sposób określony.
    2. Zidentyfikować poszczególne obszary chrząstki.
    3. Wyciąć obszar zainteresowania z całego krążka za pomocą skalpela (ostrze numer 20 lub 22). Alternatywnie można użyć ostrza do kriotomu.
      UWAGA: Ponieważ krążki bydlęce występują w bloku jako część kręgosłupa, można je przygotowywać w całości (in-toto). Znacznie ułatwia to prawidłową identyfikację różnych typów chrząstki. Podczas sekcji krążka w opisany powyżej sposób, płytka graniczna pozostaje na kręgach. Jeśli obszar ten ma zostać zbadany, najlepiej oddzielić go od leżącej poniżej kości za pomocą dłuta, pracując w lekko zgiętym kierunku stycznym.
  4. W przypadku embrionów o długości od czubka głowy do pośladka mniejszej niż 20 cm, należy przetwarzać embriony w całości, aby zachować architekturę tkankową IVD. W takich przypadkach nie przeprowadzać żadnej sekcji kręgów.
  5. Po wycięciu krążka w całości zidentyfikować poszczególne obszary chrząstki.
    1. Przeprowadzić dekalcyfikację w kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (20% (w/v); pH = 7.4) w temperaturze pokojowej. Dobrać objętość w zależności od wielkości próbki – cała tkanka musi być dobrze przykryta EDTA.
    2. Wymieniać roztwór do dekalcyfikacji codziennie; proces ten może trwać do 5 dni, w zależności od wielkości tkanki.
    3. Zweryfikować sukces dekalcyfikacji za pomocą igły 20 Gauge, która powinna przeniknąć przez kręgi bez zauważalnego oporu.
      UWAGA: Codzienna wymiana roztworu do dekalcyfikacji jest istotna, aby zapobiec nasyceniu chelatującego wiązania EDTA i utrzymać efektywność reakcji. Zapobiega to również kolonizacji bakteryjnej.

3. Ocena wieku, integralności i degeneracji próbek

  1. Zaklasyfikuj tkankę krążka międzykręgowego człowieka do jednej z pięciu następujących kategorii, korzystając z informacji klinicznych oraz zdjęć rentgenowskich i obrazowania rezonansem magnetycznym18 (Rysunek 3).
    UWAGA: Kategoria I: Jako próbkę niemal zdrową należy wykorzystać pierścień włóknisty bez radiologicznych oznak degeneracji IVD pochodzącej z ostrej urazy kręgosłupa.
    Kategoria II: Aby zilustrować stan ostrego zapalenia z początkową degeneracją, należy wykorzystać tkankę ze strefy pośredniej od pacjentów z objawami klinicznymi trwającymi krócej niż 4 tygodnie.
    Kategoria III: Aby opisać sytuację, w której reakcja zapalna miała już czas wpłynąć na tkankę i komórki, należy pobrać tkankę od pacjentów operowanych z powodu wypadnięcia jądra miażdżystego, u których objawy trwały powyżej 4 tygodni.
    Kategoria IV: W przypadku umiarkowanej degeneracji krążka należy wybrać pierścień włóknisty uzyskany podczas operacji zrostu międzytrzonowego w chorobie zwyrodnieniowej krążka międzykręgowego z wynikiem Pfirrmanna 3 lub 4 w obrazowaniu rezonansem magnetycznym19.
    Kategoria V: Dla procesu degeneracji w stadium końcowym należy pobrać pierścień włóknisty uzyskany podczas operacji zrostu międzytrzonowego w chorobie zwyrodnieniowej krążka międzykręgowego z wynikiem Pfirrmanna 5.
  2. Zaklasyfikuj tkankę bydlęcą na podstawie stadium rozwoju/wieku zwierzęcia do jednej z ośmiu kategorii, zgodnie z Tabelą 1.
    1. Oblicz wiek ciążowy na podstawie długości ciało-czubek (CRL) embrionów, korzystając ze wzoru sugerowanego przez Kellera:
      Wiek ciążowy w miesiącach = Równanie matematyczne: pierwiastek kwadratowy z (długość ciało-czubek (cm) plus 1 minus 1).
      UWAGA: Zwierzęta w pierwszych 4 tygodniach ciąży charakteryzują się długością ciało-czubek wynoszącą 0.8-2.2 cm20.

4. Fixacja tkanek

  1. Utrwal próbki w 10-krotnej objętości próbki 4% (w/v) roztworze formaldehydu w buforze fosforanowym (PBS) przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Roztwór formaldehydu przenika przez tkankę z prędkością około 1 mm/godzinę z każdej strony. W przypadku próbek bardzo małych lub bardzo dużych może być konieczna korekta czasu ekspozycji.
  2. Przechowuj tkankę w PBS w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki.

5. Przygotowanie skrawków histologicznych

  1. Osadź próbki w rozpuszczalnym w wodzie medium do zatapiania na pokrętle kriotomu.
    1. Umieść tkankę na pokrętle w taki sposób, aby uzyskać płaszczyznę osiową lub płaszczyznę przecinającą lamelki kolagenu typu I prostopadle (np. płaszczyznę cięcia pośrodkowego strzałkowego).
      UWAGA: Tkanka musi być całkowicie pokryta medium do zatapiania.
  2. Wykonaj skrawki z zatopionej tkanki o grubości 70 µm w przypadku próbek ludzkich i 40 µm w przypadku próbek bydlęcych, używając standardowego kriotomu.
    UWAGA: Różnica w grubości skrawka wynika z różnic w integralności tkanki pomiędzy nienaruszonym dyskiem bydlęcym a silnie zdegenerowaną tkanką ludzką.
  3. Zabierz skrawki na szkiełko przedmiotowe.
    1. Obrysuj skrawki tkanki za pomocą pisaka hydrofobowego.
    2. Przepłucz skrawki 3 razy solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS), aby usunąć rozpuszczalne w wodzie medium do zatapiania.

6. Barwienie fluorescencyjne

  1. Dodać 60 µL 1% (v/v) DAPI (Exmax 358 nm, Emmax 461 nm) oraz 1% (v/v) barwnika Actin Tracking (Exmax 540 nm, Emmax 565 nm) w PBS i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Opisany tutaj protokół barwienia służy do wizualizacji jądra komórkowego za pomocą barwnika jądrowego DAPI (kolor niebieski) oraz cytoplazmy za pomocą barwnika Actin Tracking (kolor czerwony). IVD wykazuje silną autofluorescencję w kanale zielonym ze względu na włókna kolagenowe. Ilość płynu dodawanego do przekrojów w tym protokole jest przeznaczona dla fragmentów o rozmiarze około 5 mm x 5 mm. W przypadku większych przekrojów ilość tę należy odpowiednio zwiększyć. Wszystkie prace należy prowadzić w pomieszczeniach bez bezpośredniej ekspozycji na światło słoneczne i przy przyciemnionym oświetleniu, aby zapobiec blaknięciu barwnika.
  2. Usunąć płyn barwiący za pomocą pipety i przemyć trzykrotnie, używając za każdym razem 60 µL PBS.
  3. Dodać odpowiednie medium montażowe i przykryć przekroje szkiełkiem cover slip.
    ​UWAGA: Podczas nakładania szkiełka należy upewnić się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Najlepiej zrobić to, przykładając krawędź szkiełka do preparatu i powoli opuszczając go na powierzchnię.

7. Obrazowanie mikroskopowe i przetwarzanie danych

  1. Umieść preparat z barwionym skrawkiem na uchwycie próbek mikroskopu.
    UWAGA: Ze względu na gęstą sieć kolagenu typu I w IVD, światło rozproszone utrudnia wizualizację tkanki przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Jednym ze sposobów rozwiązania tego problemu jest wykonanie sekcjonowania optycznego przy użyciu oświetlenia ustrukturyzowanego. Pozwala to również na stworzenie trójwymiarowej projekcji całego preparatu w obu kanałach (niebieskim i czerwonym). Najlepiej zrobić to, korzystając z ustawień oświetlenia ustrukturyzowanego i trybu Mosaic z obiektywem o powiększeniu 10x, aby uzyskać przegląd próbki, a także rekonstrukcje 3D poszczególnych wzorców.
  2. Uruchom urządzenie do oświetlenia ustrukturyzowanego.
    1. Wykonaj obrazowanie pojedynczego pola widzenia przy użyciu odpowiedniego mikroskopu fluorescencyjnego, filtrów fluorescencyjnych i właściwego oświetlenia.
      UWAGA: Dostosuj czas ekspozycji dla wszystkich użytych filtrów, aby ustandaryzować akwizycję obrazu. Aby uzyskać dokładną reprezentację preparatu w wyższej rozdzielczości, obrazuj skrawki przy większym powiększeniu (np. obiektyw 20x).
    2. Poddaj zdjęcia postprocesowi, optymalizując intensywność i jasność za pomocą oprogramowania do optymalizacji obrazu kompatybilnego z mikroskopem fluorescencyjnym.
  3. Aby z wizualizować skrawka jako całość, zastosuj technikę obrazowania mozaikowego
    1. Otwórz ustawienia akwizycji (naciśnij 6D- Acquisition) z panelu paska narzędzi.
    2. Dostosuj ustawienia mozaiki (w MosaiX Register) i określ liczbę kolumn oraz wierszy obrazów pola widzenia, które zostaną później scalone w jeden obraz poglądowy.
    3. Naciśnij Setup i dostosuj korekcję ostrości poszczególnych kafelków.
      UWAGA: W przypadku dużego skrawka tkanki prawie niemożliwe jest ustawienie całej powierzchni tkanki w jednej płaszczyźnie ostrości. Kafelki obrazu na różnych poziomach ogniskowania mogą być pobierane przez funkcję „MosaiX Acquisition”.
    4. Aby rozpocząć akwizycję kafelków obrazu, naciśnij Start.
    5. Scal obrazowane kafelki, korzystając z funkcji zszywania (przycisk Stitching ) z 20% zakładką (overlap) zaimplementowaną w oprogramowaniu.
    6. Poddaj zdjęcia postprocesowi, optymalizując intensywność i jasność za pomocą oprogramowania do optymalizacji obrazu kompatybilnego z mikroskopem fluorescencyjnym.
  4. Aby przeanalizować przestrzenną organizację chondrocytów, użyj funkcji 3D zaimplementowanej w oprogramowaniu.
    1. Dostosuj ustawienia stosu z (z-stack). Określ parametry skanowania: zdefiniuj pozycje startową i stopową w osi z oraz odległość między warstwami (slice distance), aktywując przycisk Start/Stop.
      UWAGA: Oprogramowanie automatycznie oblicza liczbę warstw.
    2. Aby rozpocząć akwizycję stosów z obrazu, naciśnij Start.
    3. Poddaj zdjęcia postprocesowi, optymalizując intensywność i jasność za pomocą oprogramowania do optymalizacji obrazu kompatybilnego z mikroskopem fluorescencyjnym.
  5. Wyeksportuj zdjęcia w formacie pliku kompatybilnym z oprogramowaniem do przetwarzania obrazów.
    ​UWAGA: Eksportuj rekonstrukcje 3D jako pojedyncze obrazy i/lub jako interaktywny model 3D lub w formacie wideo.

8. Identyfikacja wzorców komórkowych i ocena gęstości

  1. Otwórz wyeksportowane obrazy mozaikowe całego przekroju tkanki w odpowiednim programie do przetwarzania obrazów.
  2. Wyznacz obszary poddawane ocenie gęstości komórek poprzez zdefiniowanie w obrazach obszarów zainteresowania (ROI) o wymiarach 500 µm x 500 µm.
    UWAGA: Wszystkie kafelki, które nie posiadają odpowiedniej jakości obrazu, są wykluczane z analizy.
  3. Zidentyfikuj poszczególne wzorce komórkowe.
    UWAGA: Pojedyncze komórki definiuje się jako komórki indywidualne – w pełni otoczone przez przyległą macierz. Pary definiuje się jako dwie sąsiednie komórki w bliskim sąsiedztwie (<25 µm), w których komórki są połączone za pomocą swoich macierzy (patrz Rysunek 2). Formacje sznurkowe to co najmniej trzy chondrocyty ustawione w linii (odległość między środkami jąder <25 µm). Komórki te są otoczone nienaruszoną macierzą, a między poszczególnymi komórkami widoczne są połączenia macierzy. Klastry reprezentują wiele komórek znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie (<25 µm) i zamkniętych w dużej lakunie pozbawionej macierzy.
  4. Użyj wtyczki do liczenia komórek w celu ilościowej analizy wzorców komórkowych.
    UWAGA: Barwienie cytoplazmy stanowi metodę weryfikacji służącą do identyfikacji różnych wzorców przestrzennych.
  5. Oblicz gęstość komórek, dzieląc liczbę policzonych komórek przez wielkość wybranego obszaru zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dzięki zastosowaniu obrazów mozaikowych można wyraźnie rozpoznać architekturę IVD z gęstą siecią włókien kolagenowych w pierścieniu włóknistym oraz bardziej miękkim jądrem (Rycina 4). W trakcie rozwoju embrionalnego można zaobserwować ciągły spadek gęstości komórkowej (Rycina 5). O ile we wczesnych etapach rozwoju IVD stwierdza się gęstość komórek na poziomie 11 435 cells/mm² w bydlęcym anulus fibrosus oraz 17 426 cells/mm² w bydlęcym nucleus pulposus, o tyle wa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Korzystając z mikroskopii fluorescencyjnej wzbogaconej obrazowaniem mozaikowym i przekrojem optycznym, oceniliśmy przestrzenne rozmieszczenie chondrocytów w pierścieniu lędźwiowego IVD podczas rozwoju, dojrzewania i zwyrodnienia. Podczas gdy tkanka zwyrodnieniowa mogła być pobierana od pacjentów poddawanych operacji kręgosłupa z powodu zwyrodnienia dysku, analiza okresu embrionalnego i fazy dojrzewania wymagała użycia organizmu modelowego (bydlęcego). Wysokie zagęszczenie komórek obserwowano w pierścieniu we wczesnym roz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy naszym współautorom z oryginalnych publikacji za pomoc i wsparcie. Dziękujemy Charlotte Emmie Bamberger za pomoc w zdobyciu obrazów apotomów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amfoterycyna BMerck KGaA,  NiemcyA2942
Szkiełka mikroskopowe adhezyjne SuperFrost PlusR. Langenbrinck, Niemcy03-0060
ApoTomeCarl Zeiss MicroImaging GmbH, Niemcy462000115
AxioVision Rel. 4.8 z Modul MosaiXCarl Zeiss MicroImaging GmbH, Niemcy
CellMask Actin Tracking StainThermo Fischer Scientific, USA57249
CryostatLeica Biosystems, StanyCM3050S
DAPIThermo Fischer Scientific, USD1306
Zmodyfikowane podłoże Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, Gibco, Life Technologies, Niemcy41966052
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma-Aldrich, US60004
Miskop fluorescencyjny - Axio Observer Z1 z kamerą Axio Cam MR3 i ColibriCarl Zeiss MicroImaging GmbH, Niemcy3834000604
FormaldehydMerck KGaA,  Niemcy104002
Obraz J 1.53a, z wtyczką licznika komórekNational Insittute of Health (NIH), US
Invitrogen Alexa Fluor 568 PhalloidinThermo Fischer Scientific, USA12380
Mikroskopijne okulary ochronneR. Langenbrinck, Niemcy01-1818/1
PAP Pen Liquid BlockerUsługi naukowe  GmbH, NiemcyN71310
Penicylina-StreptomycynaSigma-Aldrich, USP4333
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma-Aldrich, USP5119
Skalpelpf medical AG, Niemcy2023-01
Tissue-tek O.C.T. CompoundSakura Finetek, HolandiaSA6255012

Bibliografia

  1. Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
  2. Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004).
  3. Pye, S. R., et al. Lumbar disc degeneration: association between osteophytes, end-plate sclerosis and disc space narrowing. Annals of the Rheumatic Diseases. 66 (3), 330-333 (2007).
  4. Humzah, M. D., Soames, R. W. Human intervertebral disc: structure and function. The Anatomical Record. 220 (4), 337-356 (1988).
  5. Schumacher, B. L., Su, J. L., Lindley, K. M., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Horizontally oriented clusters of multiple chondrons in the superficial zone of ankle, but not knee articular cartilage. The Anatomical Record. 266 (4), 241-248 (2002).
  6. Rolauffs, B., Williams, J. M., Grodzinsky, A. J., Kuettner, K. E., Cole, A. A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  7. Felka, T., et al. Loss of spatial organization and destruction of the pericellular matrix in early osteoarthritis in vivo and in a novel in vitro methodology. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1200-1209 (2016).
  8. Rolauffs, B., et al. Onset of preclinical osteoarthritis: the angular spatial organization permits early diagnosis. Arthritis and Rheumatism. 63 (6), 1637-1647 (2011).
  9. Aicher, W. K., Rolauffs, B. The spatial organization of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (4), 645-653 (2014).
  10. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 97, 109409(2019).
  11. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organization in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  12. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  13. Ciapetti, G., et al. Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 21, Suppl 1 10(2012).
  14. Johnson, W. E., Eisenstein, S. M., Roberts, S. Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation. Connective Tissue Research. 42 (3), 197-207 (2001).
  15. Buttermann, G. R., Beaubien, B. P., Saeger, L. C. Mature runt cow lumbar intradiscal pressures and motion segment biomechanics. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. 9 (2), 105-114 (2009).
  16. Wilke, H. J., Neef, P., Caimi, M., Hoogland, T., Claes, L. E. New in vivo measurements of pressures in the intervertebral disc in daily life. Spine. 24 (8), Phila Pa. 755-762 (1999).
  17. Demers, C. N., Antoniou, J., Mwale, F. Value and limitations of using the bovine tail as a model for the human lumbar spine. Spine. 29 (24), Phila Pa. 2793-2799 (2004).
  18. Hofmann, U. K., et al. Chondrocyte death after mechanically overloading degenerated human intervertebral disk explants is associated with a structurally impaired pericellular matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 2000-2010 (2018).
  19. Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine. 26 (17), Phila Pa. 1873-1878 (2001).
  20. Habermehl, K. H. Die Altersbestimmung bei Haus- und Labortieren. , Paul Parey. Berlin, Hamburg. (1975).
  21. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  22. Bonnaire, F. C., et al. The intervertebral disc from embryonic development to disc degeneration: insights into spatial cellular organization. The Spine Journal: Official Journal of the North American Spine Society. (21), 00198(2021).
  23. Vieira-Neto, A., Galvao, K. N., Thatcher, W. W., Santos, J. E. P. Association among gestation length and health, production, and reproduction in Holstein cows and implications for their offspring. Journal of Dairy Science. 100 (4), 3166-3181 (2017).
  24. Ott, A. Die Entwicklung des schwarzbunten Niederungsrindes von der Geburt bis zum 5. Lebensjahr mit variationsstatistischen Untersuchungen einer Population solcher Rinder von der Geburt bis zum 3. Lebensjahr. Zeitschrift für Tierzüchtung und Züchtungsbiologie. 45 (3), 259-308 (1940).
  25. Urban, J. P. G., Roberts, S., Ralphs, J. R. The Nucleus of the Intervertebral Disc from Development to Degeneration1. American Zoologist. 40 (1), 53-61 (2000).
  26. Risbud, M. V., Shapiro, I. M. Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content. Nature Reviews. Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).
  27. Iatridis, J. C., Michalek, A. J., Purmessur, D., Korecki, C. L. Localized intervertebral disc injury leads to organ level changes in structure, cellularity, and biosynthesis. Cell and Molecular Bioengineering. 2 (3), 437-447 (2009).
  28. Torre, O. M., Mroz, V., Bartelstein, M. K., Huang, A. H., Iatridis, J. C. Annulus fibrosus cell phenotypes in homeostasis and injury: implications for regenerative strategies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1442 (1), 61-78 (2019).
  29. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  30. Johnson, W. E., Roberts, S. Rumours of my death may have been greatly exaggerated': a brief review of cell death in human intervertebral disc disease and implications for cell transplantation therapy. Biochemical Society Transactions. 35, Pt 4 680-682 (2007).
  31. Roberts, S. Disc morphology in health and disease. Biochemical Society Transactions. 30, Pt 6 864-869 (2002).
  32. Lama, P., Kulkarni, J., Tamang, B. The role of cell clusters in intervertebral disc degeneration and its relevance behind repair. Spine Research. 03, 15(2017).
  33. Sharp, C. A., Roberts, S., Evans, H., Brown, S. J. Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining. European Spine Journal: Official Publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society and the European Section of the Cervical Spine Research Society. 18 (11), 1587-1594 (2009).
  34. Freemont, A. J. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain. Rheumatology. 48 (1), Oxford. 5-10 (2009).
  35. Müllers, Y., et al. Quantitative analysis of F-actin alterations in adherent human mesenchymal stem cells: Influence of slow-freezing and vitrification-based cryopreservation. PLoS One. 14 (1), 0211382(2019).
  36. McCann, M. R., Séguin, C. A. Notochord cells in intervertebral disc development and degeneration. Journal of Developmental Biology. 4 (1), 3(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Degeneracja kr ka mi dzykr gowegoorganizacja chondrocyt wobrazowanie mozaikowemikroskopia fluorescencyjnaanaliza g sto ci kom rekpier cie w knistyj dro mia d yste
Przekrój optyczny i wizualizacja krążka międzykręgowego od rozwoju embrionalnego do zwyrodnienia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.