Aktywacja i koniugacja rozpuszczalnych polisacharydów za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny (CDAP)

Podsumowanie

Białka i ligandy zawierające aminy mogą być kowalencyjnie połączone z polisacharydami aktywowanymi przez odczynnik cyjanelacyjny, tetrafluoroboran 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP), tworząc kowalencyjne koniugaty białkowe (ligand)-polisacharydy. W artykule opisano ulepszony protokół przeprowadzania kontrolowanej aktywacji CDAP w temperaturze 0 °C i zmiennym pH oraz przeprowadzania późniejszej koniugacji aktywowanych polisacharydów.

Streszczenie

Szczepionki skoniugowane są niezwykłym postępem w wakcynologii. W celu przygotowania skoniugowanych szczepionek polisacharydowych polisacharydy mogą być wygodnie funkcjonalizowane i łączone z białkami nośnikowymi szczepionki za pomocą tetrafluoroboranu 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP), łatwego w obsłudze odczynnika cyjanulowego. CDAP aktywuje polisacharydy w reakcji z grupami hydroksylowymi węglowodanów o pH 7-9. Stabilność i reaktywność CDAP są w dużym stopniu zależne od pH. pH reakcji zmniejsza się również podczas aktywacji z powodu hydrolizy CDAP, co sprawia, że dobra kontrola pH jest kluczem do powtarzalnej aktywacji. Oryginalny protokół aktywacji CDAP przeprowadzono w temperaturze pokojowej w niebuforowanych roztworach o pH 9.

Ze względu na szybką reakcję w tym stanie (<3 min) i towarzyszący jej szybki spadek pH spowodowany szybką hydrolizą CDAP, wyzwaniem było szybkie dostosowanie i utrzymanie docelowego pH reakcji w krótkim czasie. Opisany tutaj ulepszony protokół jest wykonywany w temperaturze 0 °C, co spowalnia hydrolizę CDAP i wydłuża czas aktywacji z 3 min do ~15 min. Dimetyloaminopirydyna (DMAP) była również używana jako bufor do wstępnego dostosowania roztworu polisacharydów do docelowego pH aktywacji przed dodaniem odczynnika CDAP. Dłuższy czas reakcji, w połączeniu z wolniejszą hydrolizą CDAP i zastosowaniem buforu DMAP, ułatwia utrzymanie pH aktywacji przez cały czas trwania procesu aktywacji. Ulepszony protokół sprawia, że proces aktywacji jest mniej szalony, bardziej powtarzalny i bardziej podatny na skalowanie.

Wprowadzenie

Szczepionki skoniugowane, takie jak te składające się z polisacharydów kowalencyjnie połączonych z białkiem nośnikowym, należą do niezwykłych osiągnięć w wakcynologii^1,2. Polisacharydy, jako antygeny niezależne od limfocytów T, są słabo immunogenne u niemowląt i nie wywołują pamięci, zmiany klas ani dojrzewania powinowactwa przeciwciał³. Niedociągnięcia te zostały przezwyciężone w skoniugowanych szczepionkach polisacharydowych⁴. Ponieważ większość polisacharydów nie ma wygodnego uchwytu chemicznego do koniugacji, muszą one najpierw stać się reaktywne lub "aktywowane". Aktywowany polisacharyd jest następnie łączony bezpośrednio z białkiem (lub białkiem zmodyfikowanym) lub jest funkcjonalizowany w celu dodatkowej derywatyzacji przed koniugacją⁴. Większość licencjonowanych skoniugowanych szczepionek polisacharydowych wykorzystuje aminację redukcyjną lub cyjanilację do aktywacji hydroksylów polisacharydowych. Bromek cyjanu (CNBr), odczynnik, który wcześniej był używany do aktywacji żywic chromatograficznych, był początkowo używany do derywatyzacji polisacharydów. Jednak CNBr wymaga wysokiego pH, zwykle ~ pH 10,5 lub wyższego, aby częściowo zdeprotonować hydroksyli polisacharydów, tak aby były wystarczająco nukleofilowe, aby zaatakować grupę cyjano. Wysokie pH może być szkodliwe dla labilnych polisacharydów, a ani CNBr, ani początkowo utworzony aktywny ester cyjanowy nie są wystarczająco stabilne przy tak wysokim pH.

CDAP (tetrafluoroboran 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny; Rysunek 1) został wprowadzony przez Lees et al. do stosowania jako środek cyjanylujący do aktywacji polisacharydów^5,6. Stwierdzono, że CDAP, który jest krystaliczny i łatwy w obsłudze, aktywuje polisacharydy przy niższym pH niż CNBr i przy mniejszej liczbie reakcji ubocznych. W przeciwieństwie do CNBr, polisacharydy aktywowane CDAP mogą być bezpośrednio sprzężone z białkami, co upraszcza proces syntezy. Polisacharydy aktywowane CDAP mogą być funkcjonalizowane diaminą (np. Heksanodiaminą) lub dihydrazydem (np. dihydrazydem adypinowym, ADH) w celu wytworzenia polisacharydów pochodnych amino- lub hydrazydów. Wysokie stężenie odczynnika homobifunkcyjnego służy do tłumienia sieciowania polisacharydów. Polisacharydy aminowe mogą być następnie sprzężone przy użyciu dowolnej z niezliczonych technik stosowanych do koniugacji białek. Polisacharydy derywatyzowane hydrazydem są często sprzężone z białkami za pomocą odczynnika karbodimidowego (np. 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDAC))⁷. Dalsza optymalizacja aktywacji polisacharydów CDAP została opisana przez Lees et al.⁸ i jest włączona do opisanego tutaj protokołu.

Przegląd koniugacji CDAP
Protokół CDAP można skonceptualizować jako dwie fazy: (1) aktywacja polisacharydu i (2) koniugacja aktywowanego polisacharydu z białkiem lub ligandem (Rysunek 2). Celem pierwszego kroku jest skuteczna aktywacja polisacharydu, podczas gdy celem drugiego jest efektywna koniugacja z aktywowanym polisacharydem. Aktywowany polisacharyd łączy ze sobą te dwa etapy. Ta konceptualizacja pomaga skupić się na krytycznych elementach każdego kroku. Rysunek 2 rozwija tę konceptualizację, pokazując pożądane reakcje aktywacji i sprzężenia, wraz z reakcjami hydrolizy i reakcjami ubocznymi.

Podczas fazy aktywacji, trzy główne problemy to stabilność CDAP, reakcja CDAP z hydroksylami polisacharydowymi oraz stabilność aktywowanego polisacharydu (Rysunek 3). Hydroliza CDAP wzrasta wraz z pH, podobnie jak hydroliza aktywowanego polisacharydu i reakcje uboczne. Jednak reakcja CDAP z polisacharydem jest ułatwiona przez zwiększenie pH. Skuteczna aktywacja polisacharydów za pomocą CDAP wymaga równowagi między 1) reaktywnością polisacharydu i CDAP oraz 2) hydrolizą i reakcjami ubocznymi zarówno odczynnika, jak i aktywowanego polisacharydu.

W oryginalnym protokole aktywacji CDAP opisanym przez Lees et al.⁵, aktywacja polisacharydów CDAP została przeprowadzona w temperaturze pokojowej w niebuforowanym roztworze pH 9. Stwierdzono, że szybkość aktywacji była szybka w tych warunkach, a aktywacja byłaby zakończona w ciągu 3 minut. Reakcjom towarzyszyła również szybka hydroliza CDAP, powodująca gwałtowny spadek pH niebuforowanego roztworu reakcyjnego. Wyzwaniem było szybkie podniesienie i utrzymanie pH reakcji na docelowym poziomie w tak krótkim czasie. W opisanym protokole aktywację przeprowadzono poprzez dodanie CDAP z roztworu podstawowego o stężeniu 100 mg/ml do niebuforowanego roztworu polisacharydowego. pH zostało podniesione 30 s później przy "równej objętości 0,2 M trietyloaminy". Białko, które miało być sprzężone, dodawano następnie po 2,5 minuty do reakcji aktywacji. Warto zauważyć, że pH etapu aktywacji nie było dobrze kontrolowane i najprawdopodobniej początkowo przekroczyło docelowe pH. Szybka reakcja, wymagająca natychmiastowej regulacji pH, sprawiła, że proces aktywacji był trudny do kontrolowania i trudny do skalowania.

W przeciwieństwie do oryginalnego protokołu, opisany tutaj zmodyfikowany protokół ma dwie główne ulepszenia. Po pierwsze, pH roztworu polisacharydowego jest wstępnie dostosowywane do docelowego pH aktywacji, przy użyciu DMAP jako bufora, przed dodaniem CDAP. DMAP ma pKa 9,5, a zatem ma dobrą moc buforową wokół pH 9, a w przeciwieństwie do wielu innych, nie stwierdzono, aby DMAP promował hydrolizę CDAP⁸. Co więcej, DMAP jest już produktem pośrednim procesu i dlatego nie dodaje nowego składnika do mieszaniny reakcyjnej. Wstępna regulacja pH przed dodaniem CDAP eliminuje duże wahania pH na początku reakcji i pozwala na bardziej efektywne utrzymanie docelowego pH podczas reakcji. Drugą poprawą jest przeprowadzenie reakcji aktywacji w temperaturze 0 °C, gdzie szybkość hydrolizy CDAP jest znacznie wolniejsza niż w temperaturze pokojowej. Dzięki dłuższemu okresowi półtrwania odczynnika w temperaturze 0 °C, czas aktywacji wydłuża się z 3 minut do 15 minut, aby zrekompensować wolniejszą szybkość aktywacji w niższej temperaturze. Dłuższy czas reakcji z kolei ułatwia utrzymanie pH reakcji. Zastosowanie temperatury 0 °C spowalnia również degradację polisacharydów wrażliwych na pH, umożliwiając przygotowanie koniugatów tego typu polisacharydów. Ulepszenia w protokole sprawiają, że proces aktywacji jest mniej szalony, łatwiejszy do kontrolowania, bardziej powtarzalny i bardziej podatny na skalowanie.

Ten artykuł opisuje ulepszony protokół przeprowadzania kontrolowanej aktywacji polisacharydów CDAP w temperaturze 0 °C i przy określonym docelowym pH oraz przeprowadzania późniejszej derywatyzacji aktywowanych polisacharydów za pomocą ADH. Opisano również test kwasu trinitrobenzenosulfonowego (TNBS), oparty na metodzie Qi et al.⁹, do oznaczania poziomu hydrazydu na zmodyfikowanym polisacharydzie. Opisano również zmodyfikowany test dla heksoz na bazie rezorcyny i kwasu siarkowego¹⁰, który może być stosowany do oznaczania szerszego zakresu polisacharydów. Więcej informacji na temat aktywacji i koniugacji CDAP można znaleźć we wcześniejszych publikacjach^5,6,8 autorstwa Lees et al.

Protokół

UWAGA: Przygotuj wcześniej roztwór polisacharydu, roztwór ADH, roztwór DMAP i roztwór podstawowy CDAP przed wykonaniem procedur aktywacji i funkcjonalizacji polisacharydów. Umieść rozwiązania i sprzęt w uporządkowanym, wygodnym i logicznym miejscu. Opisana reakcja dotyczy 10 mg polisacharydu i może być skalowana w górę lub w dół. Zaleca się ocenę protokołu na małą skalę przed skalowaniem w górę.

1. Przygotuj 5 mg/ml roztworu polisacharydowego, 2 mL.

1. Do liofilizowanych polisacharydów
   1. Przed otwarciem odczekać, aż pojemnik z polisacharydem osiągnie temperaturę pokojową. Odważyć 10 mg polisacharydu w probówce z nakrętką za pomocą wagi analitycznej. Użyj eliminatora ładunków elektrostatycznych, aby ułatwić pobieranie próbek i dokładniejsze ważenie proszku.
   2. Dodać 2 ml 0,15 M chlorku sodu (NaCl) do probówki, aby rozpuścić polisacharyd. Zakryj i wywiruj rurkę.
      UWAGA: Chlorek sodu nie wpływa na reakcję CDAP, ale może wpływać na strukturę drugorzędową polisacharydów. Niektóre polisacharydy są lepiej rozpuszczalne przy różnych stężeniach soli.
   3. Mieszaj probówkę obracając się od końca do końca przez 12-24 godziny, w zależności od masy cząsteczkowej polisacharydu, aby polisacharyd mógł się w pełni uwodnić. W razie potrzeby delikatnie ogrzej rurkę, aby ułatwić rozpuszczanie.
2. Do rozpuszczonych polisacharydów w roztworze buforowym
   UWAGA: Aby zapewnić skuteczną aktywację CDAP, roztwór polisacharydów nie powinien zawierać żadnego buforu, zwłaszcza jonów fosforanowych. Postępuj zgodnie z poniższą procedurą, aby zastąpić bufor wodą lub roztworem soli i dostosować stężenie polisacharydów do 5 mg/ml.
   1. Otrzymać urządzenie z filtrem odśrodkowym o pojemności 4 ml lub 15 ml o odpowiedniej wartości odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO).
      UWAGA: MWCO jest idealnie 5-10 razy mniejsze niż masa cząsteczkowa polisacharydu.
   2. Dodać objętość buforowanego roztworu polisacharydów zawierającego ~20 mg polisacharydu do wkładu filtrującego. Napełnij do pełna kreskę wodą lub roztworem soli fizjologicznej. Szczelnie zakryj filtr. Wymieszaj kilka razy od końca do końca.
   3. Odwirować urządzenie filtrujące z siłą odśrodkową sugerowaną przez producenta. Upewnij się, że czas wirowania jest wystarczająco długi, aby osiągnąć co najmniej 5-krotne zmniejszenie objętości po każdym wirowaniu. Odrzuć przepływ. Ponownie zmontuj urządzenie filtrujące.
   4. Napełnij wkład filtra do pełna kreski świeżą wodą lub roztworem soli fizjologicznej. Szczelnie zakryj filtr. Wymieszaj zawartość w filtrze, obracając się od końca do końca ~10 razy lub delikatnie wirując; Powtórz wirowanie.
      UWAGA: Polisacharyd może gromadzić się na dnie wkładu filtracyjnego urządzenia odśrodkowego, tworząc żel. Zaleca się ponowne wymieszanie retendenta znajdującego się we wkładzie filtracyjnym ze świeżym wkładem przed następnym wirowaniem.
   5. Powtórz cykl napełniania i wirowania co najmniej 3 razy.
   6. Wykonaj poniższe ćwiczenie, aby odzyskać retenant polisacharydowy z wkładu filtrującego.
      1. Dodaj świeżą wodę lub sól fizjologiczną do wkładu filtrującego tak, aby objętość wynosiła ~1 ml. Mieszać pipetując w górę i w dół lub delikatnie wirując.
      2. Przenieść cały zmieszany retenent do probówki o pojemności 5 ml. Dodaj 1 ml świeżej wody lub soli fizjologicznej do wkładu filtra. Przepłukać filtr, pipetując w górę i w dół lub delikatnie wirując. Przenieś i połącz wszystkie płukanki z odzyskanym polisacharydem.
   7. Oznaczyć stężenie polisacharydów (patrz oznaczenie polisacharydowe w sekcji 7.3). Rozcieńczyć polisacharyd dodatkową wodą lub solą fizjologiczną do 5 mg/ml.
3. Po przygotowaniu roztworu polisacharydów schłodzić probówkę zawierającą roztwór polisacharydu w wiadrze na lód.

2. Przygotuj 0,5 M roztwór dihydrazydu kwasu adypinowego (ADH), 10 ml.

1. Odważyć 0,87 g ADH na wadze analitycznej i rozpuścić w 8 ml 0,1 M kwasu HEPES (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego), pH 8.
2. Dostosować do docelowego pH za pomocą 1 M wodorotlenku sodu (NaOH), monitorowanego za pomocą pH-metru. Doprowadzić do 10 ml z dodatkowym buforem i ponownie potwierdzić pH.

3. Przygotuj 2,5 M roztwór DMAP, 10 ml.

UWAGA: DMAP jest toksyczny i przenika przez skórę. Podczas wykonywania zabiegu należy nosić rękawice nitrylowe.

1. Ostrożnie odważyć 3 g DMAP do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 5 ml wody do DMAP i mieszać przez wirowanie przez 5 minut, aby uzyskać mętny roztwór (~ 7 ml).
2. Podczas mieszania dodawać przyrosty 50 μl 10 N kwasu solnego (HCl) do roztworu DMAP. Mieszaj między każdym dodatkiem. Przestań dodawać, gdy rozwiązanie stanie się klarowne.
3. Dodawać 10 N NaOH w odstępach co 25 μl, aby doprowadzić roztwór DMAP do ~pH 8.
4. Doprowadzić roztwór DMAP do 10 ml z wodą, aby uzyskać 2,5 M roztwór.
5. Dostosuj pH roztworu 2,5 M DMAP.
   UWAGA: pH roztworu DMAP zmienia się wraz ze stężeniem i siłą jonową. To ćwiczenie ma na celu precyzyjne dostrojenie 2,5 M materiału DMAP do określonego pH, tak aby po zmieszaniu z 10 objętościami polisacharydu otrzymany roztwór był zbliżony do pH docelowego do aktywacji.
   1. Przygotować serię probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 1 ml wody lub roztworu NaCl, w zależności od tego, który z nich został użyty do przygotowania roztworu polisacharydów. Schłodzić rurki na lodzie.
   2. Dodać 100 μl DMAP do schłodzonej probówki. Wiruj i zmierz pH za pomocą pH-metru. Następnie wyrzuć zmierzoną rurkę.
   3. Jeżeli zmierzone pH nie jest bliskie wartości docelowej, należy skorygować pH podstawki DMAP za pomocą odpowiednio 1 M NaOH lub HCl. Powtarzać kroki 3.5.2 i 3.5.3 do momentu, gdy zmierzone pH zbliży się do docelowego pH.

4. Przygotować 100 mg/ml roztworu podstawowego CDAP

UWAGA: Proszek CDAP powinien być szczelnie zamknięty i przechowywany w temperaturze -20 °C i pozostawiony do osiągnięcia temperatury pokojowej przed otwarciem. Podczas wykonywania zabiegu należy nosić rękawice nitrylowe.

1. Wytaruj probówkę wirówkową z zatrzaskową nasadką o pojemności 1,5 ml na wadze analitycznej. Za pomocą małej szpatułki odważyć 10-140 mg CDAP do probówki. Zwróć uwagę na rzeczywistą wagę CDAP.
2. Oznaczyć objętość acetonitrylu potrzebną do przygotowania 100 mg/ml CDAP. Otwarty acetonitryl w dygestorium.
3. Używając pipety o odpowiedniej objętości, nabierz i uwolnij acetonitryl, aby zrównoważyć jego parę w końcówce pipety. Poczekaj, aż rozpuszczalnik wypłynie z końcówki pipety po kilku sekundach i przygotuj się do przeniesienia go bezpośrednio do probówki CDAP. Pobrać obliczoną objętość acetonitrylu i bezpośrednio przenieść ją do probówki CDAP. Zamknij nakrętkę.
   UWAGA: Acetonitryl można również przenieść do probówki CDAP za pomocą strzykawki Hamilton lub jej odpowiednika o odpowiednim rozmiarze.
4. Vortex, aby w pełni rozpuścić CDAP. Umieść probówkę CDAP w pojemniku na lód.
   UWAGA: CDAP jest stabilny w acetonitrylu na zimno. Zapasy rozpuszczalne mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez >1 tydzień. Zaleca się jednak przygotowanie świeżych roztworów CDAP.

5. Aktywacja polisacharydów i funkcjonalizacja hydrazydu

1. Przed rozpoczęciem aktywacji upewnić się, że wszystkie następujące elementy są gotowe, a roztwory schłodzone na lodzie: 2 ml roztworu polisacharydowego o stężeniu 5 mg/ml w płaskodennym pojemniku o szerokim otworze, zawierającym mieszadło, umieszczonym na mieszadle magnetycznym; 100 mg/ml roztwór podstawowy CDAP; 2,5 M roztwór podstawowy DAMAP; pH-metr z półmikrosondą pH, takie jak sonda o średnicy 6 mm, skalibrowana dla temperatury 0 °C zgodnie z instrukcjami producenta; pipetę o pojemności 100 μl gotową do użycia; timer wyczyszczony i gotowy do użycia; głowica dozująca autotitratora umieszczona w pozycji lub pipeta o pojemności 10 μl gotowa do użycia; 0,5 M roztwór ADH.
2. Wstępnie dostosuj pH polisacharydu do docelowego pH za pomocą DMAP.
   1. Umieścić sondę pH w roztworze polisacharydu i pozostawić ją w roztworze podczas całej procedury aktywacji.
   2. Przenieść 200 μl roztworu podstawowego DMAP do roztworu polisacharydów przez krople dodawane pod mieszaniem. Dostosuj pH roztworu do docelowego pH aktywacji. Dodaj 0,1 M HCl, aby obniżyć pH i 0,1 M NaOH, aby zwiększyć pH. Należy unikać przekroczenia docelowego pH o więcej niż 0,1 jednostki pH i utrzymywać reakcję schłodzoną w łaźni lodowo-wodnej przez cały czas aktywacji.
3. Aktywacja CDAP
   1. Odpipetować 100 μl CDAP w górę i w dół, aby zrównoważyć parę w końcówce pipety. Przenieść 100 μl CDAP do roztworu polisacharydów, mieszając.
      UWAGA: Ta aktywacja wykorzystuje 1 mg CDAP na 1 mg polisacharydu jako stosunek wyjściowy. Współczynnik ten można zwiększyć lub zmniejszyć podczas optymalizacji aktywacji.
   2. Uruchom timer i monitoruj zmianę pH podczas całej aktywacji. Utrzymać reakcję na docelowym pH, niezwłocznie dodając do reakcji 10 μl przyrostu 0,1 M NaOH za pomocą dozownika (lub pipety) do autotitratora.
      UWAGA: Może pomóc skrócić czas reakcji pH, aby delikatnie wymieszać za pomocą sondy pH. Na początku pH spada szybciej i może być konieczne częstsze dodawanie 0,1 M NaOH. W miarę postępu reakcji spadek pH staje się wolniejszy, a dodawanie staje się rzadsze. pH powinno pozostać zasadniczo niezmienione, gdy zbliża się optymalny czas aktywacji, który wynosi 10-15 minut dla aktywacji pH 9.
4. Funkcjonalizacja ADH
   1. Po osiągnięciu optymalnego czasu aktywacji dodać 2 ml 0,5 M ADH jednorazowo do aktywowanego polisacharydu podczas mieszania. Sprawdź, czy pH mieści się w zakresie docelowym (pH 8-9 dla ADH).
      UWAGA: Jedno dodanie z szybkim mieszaniem minimalizuje prawdopodobieństwo reakcji obu końców dihydrazydu z aktywowanym polisacharydem, zapobiegając sieciowaniu polisacharydów.
   2. Kontynuować mieszanie mieszaniny reakcyjnej przez co najmniej 1 godzinę. Przenieść mieszaninę reakcyjną do temperatury 4 °C, ale dopuszczalna jest temperatura 0-20 °C.
      UWAGA: Reakcja funkcjonalizacji ADH nie jest silnie zależna od temperatury. Ponieważ duży nadmiar dihydrazydu działa jak odczynnik hartujący, nie jest konieczne dalsze gaszenie aktywowanego polisacharydu. Jednak w przypadku bezpośredniego sprzężenia białek reakcja powinna być wygaszona, zwykle za pomocą 1 M glicyny o pH 8-9.

6. Oczyszczanie polisacharydu funkcjonalizowanego ADH przez dializę

UWAGA: Surowy produkt z reakcji funkcjonalizacji ADH zawiera wysokie stężenie ADH (0,5 M), które może być najefektywniej usunięte przez intensywną dializę. Filtracja żelowa, zarówno za pomocą kolumny, jak i urządzenia do odsalania wirowego, nie jest tak wydajna, zwłaszcza gdy wymagane jest usunięcie resztkowego zanieczyszczenia ADH.

1. Określić MWCO membrany dializycznej. Użyj odcięcia 3 kDa dla mniejszych polisacharydów.
   UWAGA: MWCO membrany dializacyjnej jest idealnie 5-10 razy mniejsze niż MW polisacharydu.
2. Wybierz żądany format dializy (kasety lub przewody) i odpowiednią pojemność urządzenia. Upewnij się, że pojemność urządzenia jest 2 razy większa niż objętość próbki. Zapoznaj się z instrukcją obsługi urządzenia
dostarczoną przez producenta.
3. Przed użyciem należy nawodnić membranę dializacyjną w wodzie. Przenieść surowy derywatyzowany roztwór polisacharydu do urządzenia do dializy zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Nosić rękawice nitrylowe, aby uniknąć kontaktu z DMAP.
4. Dializować w pojemniku wypełnionym 2-4 litrami 1 M NaCl i mieszadłem. Umieść pojemnik na talerzu mieszającym w chłodni lub w lodówce. Podczas dializy należy delikatnie i w sposób ciągły mieszać dializat.
5. Po dializacji przez co najmniej 4 godziny zmienić na świeży 1 M NaCl i dializować przez co najmniej 12 godzin. Dializować z 2 zmianami 0,15 M soli fizjologicznej, każda przez co najmniej 12 godzin. W razie potrzeby dializuj przeciwko 2 podmianom wody.
6. Sprawdź, czy cały ADH został usunięty, testując dializ przez noc za pomocą szybkiego testu TNBS.
   1. Uzyskaj 3 probówki borokrzemianowe, oznacz je odpowiednio jako kontrolę ujemną (ctrl), dodatnią kontrolę i próbkę.
   2. Do ujemnej probówki ctrl dodać 975 μl 0,1 M boranu o pH 9.
   3. Do dodatniej probówki ctrl dodać 100 μl 0,05 mM ADH (0,1 mM hydrazydu) i 875 μl 0,1 M boranu, pH 9.
   4. Do probówki z próbką dodać 500 μl dializatu na noc i 475 μl 0,1 M boranu o pH 9.
   5. Dodaj 25 μl 1% TNBS do wszystkich trzech probówek. Dobrze wymieszaj. Umieść w ciemności na 1 godzinę.
   6. Porównaj intensywność koloru 3 probówek w ciągu 1 godziny. Upewnij się, że intensywność koloru probówki próbki znajduje się pomiędzy intensywnością dodatniego ctrlu a ujemnego ctrlu, co oznacza, że zanieczyszczenie ADH spadło do 0,01 mM lub mniej. Dializuj jeszcze raz.
      UWAGA: Rozsądne jest maksymalne obniżenie poziomu zanieczyszczenia ADH, tak aby hydrazyd ADH stanowił mniej niż 1% całkowitego hydrazydu w oczyszczonym polisacharydzie hydrazydowym.
   7. Odzyskaj derywatyzowany polisacharyd z dializy. Określić stężenie polisacharydów i hydrazydu. Obliczyć stosunek hydrazydu do polisacharydów (patrz punkt 7). Jeżeli dializowany polisacharyd musi być skoncentrowany do 5-10 mg/ml, należy zapoznać się z punktem 1.2.

7. Analiza polisacharydów derywatyzowanych hydrazydem

UWAGA: Celem opisanej tutaj analizy jest określenie stężenia polisacharydów, stężenia hydrazydu oraz poziomu derywatyzacji hydrazydu pod względem stosunku hydrazydu do polisacharydu.

1. Przygotowanie próbki
   UWAGA: Polisacharydy, które mają być testowane, muszą być wolne od zanieczyszczeń węglowodanami, aminami lub hydrazydami o niskiej masie cząsteczkowej. Próbki liofilizowane powinny być suche i wolne od soli, aby zapewnić dokładny pomiar masy. Zwykle ~1 ml roztworu 1-2 mg/ml jest wystarczający do testów.
   1. Zważyć co najmniej 10 mg liofilizowanej próbki polisacharydowej na wadze analitycznej za pomocą niestatycznej szpatułki lub eliminatora ładunków elektrostatycznych. Rozpuścić polisacharyd w wodzie lub soli fizjologicznej do stężenia (np. 2 mg/ml) tak, aby sygnały testu mieściły się w liniowym zakresie krzywej wzorcowej.
   2. Wymieszaj od końca do końca i odczekaj wystarczająco dużo czasu, aby próbka całkowicie się rozpuściła. Wykonaj nawodnienie przez noc w zależności od masy cząsteczkowej polisacharydów.
2. Test polisacharydowy: metoda rezorcyny/kwasu siarkowego
   UWAGA: Odpowiedni test dla polisacharydów będzie zależał od składu węglowodanowego polimerów. Oryginalny test rezorcyny/kwasu siarkowego był przeznaczony dla cukrów heksozy¹⁰. Test został tutaj zmodyfikowany poprzez podniesienie temperatury etapu ogrzewania z 90 °C do 140 °C. W tej wyższej temperaturze test traci pewną specyficzność, ale może być używany do oznaczania wielu cukrów. Jednak nadal konieczne jest określenie przydatności testu dla konkretnego polisacharydu. Dla każdego punktu zalecane są trzy części, ale ze względu na pojemność bloku grzewczego może być konieczne pewne zakwaterowanie.
   1. Przygotować 75% kwas siarkowy
      UWAGA: Stężony kwas siarkowy jest wyjątkowo i może powodować poważne oparzenia. Wykonaj tę procedurę w dygestorium chemicznym. Zawsze wlewaj stężony kwas do wody, a nie odwrotnie!
      1. Dodaj 50 ml wody do szklanej butelki o pojemności 200 ml. Umieść butelkę w zimnej kąpieli wodnej. Powoli dodawaj 150 ml kwasu siarkowego. Zakręć butelkę tak, aby była odpowietrzona.
      2. Pozwól, aby roztwór zrównoważył się do temperatury pokojowej. Roztwór należy zużyć w ciągu 3 miesięcy.
   2. Przygotuj normy węglowodanowe
      1. Przygotować niemodyfikowany roztwór polisacharydów o stężeniu 1 mg/ml do użycia jako wzorzec. Alternatywnie, jako norm><ę należy użyć mieszanki poszczególnych cukrów w proporcji znajdującej się w powtórzonej jednostce polisacharydu, w ilości 1 mg/ml całkowitego stężenia cukru. UWAGA: Chociaż mieszanka cukrowa zwykle daje taki sam wynik jak polimer węglowodanowy o identycznym składzie cukrowym, należy to potwierdzić doświadczalnie.
   3. Upewnij się, że blok grzewczy z uchwytami na probówki borokrzemianowe 13 x 100 działa. Użyj podkładki ochronnej pod spodem i wokół bloku grzewczego na wypadek rozlania kwasu. Podgrzej blok grzewczy do 140 °C przez co najmniej 1 godzinę, aby osiągnąć stabilną, jednolitą temperaturę we wszystkich zastosowanych blokach.
   4. Oznaczyć 13 x 100 probówek borokrzemianowych, trzykrotnie dla każdego wzorca i każdej próbki. Dodać 0, 2,5, 5, 7,5, 10 μg (lub μL) wzorca węglowodanowego 1 mg/ml do odpowiednio oznakowanych probówek wzorcowych. Dodaj wodę do każdej probówki, aby zwiększyć objętość do 100 μL.
      UWAGA: Generowany kolor zależy od konkretnych cukrów. Ponieważ niektóre cukry wymagają większej masy, aby wytworzyć pełny zakres absorbancji, rzeczywiste ilości użyte do krzywej wzorcowej mogą się różnić.
   5. Ustawić testy próbki, dodając objętość zawierającą ~ 5 μg derywatyzowanego polisacharydu do trzech probówek z próbkami i doprowadzić całkowitą objętość do 100 μl wodą. Alternatywnie, jeśli stężenie polisacharydów w próbce jest nieznane, należy wykonać serię 4-krotnych rozcieńczeń. Zbadać 100 μl każdego rozcieńczenia w trzech powtórzeniach.
   6. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować świeży rezorcynol w stężeniu 6 mg/ml w wodzie dejonizowanej (dI). Wirować, aż rezorcyna znajdzie się w roztworze. Do każdej probówki dodać 100 μl rezorcyny o stężeniu 6 mg/mL.
   7. Ostrożnie wlej szacowaną ilość 75% kwasu siarkowego do małej zlewki.
      UWAGA: Noś fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe i okulary ochronne. Uważaj na krople, rozlane płyny i zachlapania. Trzymaj pod ręką mokre ręczniki papierowe, aby wytrzeć wszelkie krople. Ponieważ aktywność kwasu siarkowego zmienia się przy długotrwałym wystawieniu na działanie powietrza, należy użyć jednolitej mieszaniny kwasu siarkowego do całego testu.
   8. Używając wielokrotnego pipetora, równomiernie dodać 300 μl 75% kwasu siarkowego do każdej probówki. Energicznie obracaj probówki, aby dobrze wymieszać, kierując rurkę na bok podczas wirowania. Umieść rurki w bloku grzejnym w stałym tempie w kolejności sekwencyjnej. Gdy wszystkie rurki znajdą się w środku, natychmiast ustaw timer na 3 minuty.
   9. Po 3 minutach wyjmij rurki w stałym tempie w tej samej kolejności i umieść je bezpośrednio w stojaku w lodowatej kąpieli wodnej. Pozostaw probówki, aż będą lodowato zimne. Wyjmij rurki i pozwól im zrównoważyć się do temperatury pokojowej przez ~ 5 minut, aby zapobiec kondensacji pary wodnej na kuwecie podczas odczytu.
   10. Ustawić spektrofotometr UV/VIS tak, aby odczytywał absorbancję przy długości fali 430 nm przy użyciu kuwety o długości drogi 10 mm. Blank z zerową rurką standardową. Odczytaj absorbancję wszystkich probówek przy 430 nm.
       UWAGA: Jednorazowe plastikowe kuwety są wygodne w użyciu.
   11. Skonstruuj krzywą standardową, wykreślając μg wzorca węglowodanów w funkcji A₄₃₀. Zobacz Rysunek 4 przedstawia typową krzywą wzorcową wykorzystującą glukozę jako wzorzec odniesienia.
   12. Użyć probówek do oznaczania próbek o wartościach A₄₃₀ mieszczących się w zakresie liniowym krzywej wzorcowej, obliczyć ilość μg nieznanego polisacharydu w probówkach do próbek z równania krzywej standardowej. Określić stężenie nieznanego polisacharydu na podstawie objętości dodanego nieznanego polisacharydu, uwzględniając rozcieńczenia. Przelicz stężenie na powtórzone jednostki mg/ml lub μM zgodnie z wymaganiami.
3. Test hydrazydowy z użyciem kwasu trinitrobenzenosulfonowego (TNBS)
   1. Przygotować 0,9% NaCl zawierający 0,02% azydku sodu (bufor próbki) przez rozpuszczenie 9 g NaCl i 200 mg azydku sodu w dI_H2O do końcowej objętości 1 l.
   2. Przygotować 0,1 M boranu sodu o pH 9 (bufor do oznaczania), mieszając 100 ml 0,5 M boranu sodu o pH 9 z 400 ml dI_H2O. Potwierdzić, że pH roztworu wynosi 9 ± 0,1; w razie potrzeby dostosować.
   3. Przygotować 1% TNBS, rozcieńczając 200 μl 5% roztworu kwasu 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowego do 1 ml z dI_H2O. Oznaczyć probówkę jako 1% TNBS i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez tydzień.
   4. Przygotować 50 mM ADH (odpowiednik 100 mM hydrazydu).
      1. Odważyć 871 mg adipinydhirazdu (ADH) w proszku za pomocą wagi analitycznej. Rozpuść proszek w butelce z odczynnikiem, dodając bufor próbki do 100 ml za pomocą wagi ładowanej od góry.
      2. Oznacz butelkę jako 100 mM hydrazydu/50 mM ADH. Butelkę szczelnie zamknąć i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 rok.
   5. Przygotuj wzorce hydrazydów (hydrazyd 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 i 0,6 mM).
      1. Przygotować 6 wzorców hydrazydów, rozcieńczając 100 mM zapas hydrazydu buforem próbki za pomocą wagi ładowanej od góry. Przygotuj 100 ml każdego wzorca, aby zminimalizować błąd stężenia. Szczelnie zamknąć butelki i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 rok.
   6. Ustawianie reakcji testowych
      UWAGA: Test TNBS przeprowadza się przy objętości reakcji 1 ml. Każda probówka testowa składa się ze 100 μl próbki (lub wzorca), 875 μl buforu testowego i 25 μl 1% roztworu TNBS. Wszystkie reakcje testowe (zarówno dla próbek, jak i wzorców) są sporządzane w trzech egzemplarzach.
      1. Oznacz 3 probówki ze szkła borokrzemianowego (12 x 75 mm) dla każdej normy, w tym normy zerowej. Posortuj i ułóż standardowe probówki w stojaku na probówki w kolejności zwiększania stężenia. Użyj skalibrowanej mikropipety o pojemności 100 μl lub 200 μl, aby dokładnie dodać 100 μl wzorców do każdej odpowiedniej probówki. Jako wzorzec zerowy użyj 100 μl buforu próbki.
      2. Oznaczyć 3 probówki ze szkła borokrzemianowego (12 x 75 mm) dla każdej rozcieńczonej próbki, która ma być oznaczona. Odpowiednio posortuj i ułóż probówki z próbkami w stojaku na probówki. Użyj skalibrowanej mikropipety o pojemności 100 μl lub 200 μl, aby dokładnie dodać 100 μl próbki do każdej odpowiedniej probówki z próbką.
      3. Użyj skalibrowanej mikropipety o pojemności 1000 μl, aby dokładnie dodać 875 μl buforu testowego do wszystkich probówek: wzorców i próbek.
   7. Aby rozpocząć reakcję testową, użyj skalibrowanej mikropipety o pojemności 100 μl, aby dokładnie dodać 25 μl 1% TNBS do każdej probówki testowej. Zacznij od zerowych probówek wzorcowych, przejdź do probówek wzorcowych w kolejności rosnącego stężenia, a następnie do probówek z próbkami zgodnie z wcześniej ustaloną kolejnością. Zmieniaj końcówki podczas rozpoczynania nowego wzorca lub nowej próbki i utrzymuj czas spędzony na dodawaniu TNBS do wszystkich probówek z dokładnością do 5 minut.
      1. Wiruj wszystkie probówki testowe przez 2 sekundy z dużą prędkością lub przy ustawieniu prędkości, pozwalając cieczy wewnątrz probówki testowej zawirować w górę, aby osiągnąć wysokość 1/2 cala od otworu probówki.
      2. Zapisz czas rozpoczęcia testu i ustaw timer na 2 godziny. Umieść stojak na probówki testowe w ciemności w temperaturze pokojowej na 2 godziny. Kiedy czas się skończy, ponownie przekręć wszystkie probówki i przystąp do zbierania danych.
   8. Gromadzenie danych
      1. Pozwól, aby spektrofotometr UV/VIS rozgrzał się, a linia podstawowa się ustabilizowała. Ustawić długość fali detekcji na 500 nm dla testu hydrazydowego. Użyj kuwety kwarcowej o pojemności 1 ml i długości ścieżki 1 cm do wszystkich pomiarów absorbancji dla całego testu.
      2. Rozpocznij zbieranie danych od przeniesienia testu wzorca zerowego do kuwety; wyzeruj przyrząd (ustaw absorbancję na zero).
      3. Wykonaj pojedynczy odczyt na każdej probówce i zapisz wartości absorbancji w tabeli danych. Usuń resztki płynu z kuwety przed odczytaniem nowej próbki. Zacznij od norm zerowych, przejdź do norm rosnącego stężenia, a następnie do próbek. Po uruchomieniu wykonuj wszystkie kroki sprawnie bez zatrzymywania się i odczytaj wszystkie probówki w ciągu 10 minut.
   9. Analizowanie przykładowych danych
      1. Utwórz krzywą standardową, wykreślając standard hydrazydu mM w porównaniu z A₅₀₀. Znajdź równanie krzywej standardowej w postaci y = ax + b, gdzie y oznacza hydrazyd mM, a x oznacza A₅₀₀. Zobacz Rysunek 4 dla typowej krzywej standardowej.
      2. Obliczyć mM hydrazydu w próbkach, stosując równanie krzywej standardowej, dostosowując do współczynników rozcieńczenia. Do obliczeń należy wybrać tylko probówki do oznaczania próbek, w których wartości A₅₀₀ mieszczą się w zakresie liniowym krzywej wzorcowej.
      3. Obliczyć stosunek molowy hydrazydu/polisacharydu za pomocą równania (1).
         Hydrazyd/polisacharyd = h / c × MW (1)
         Gdzie h jest mM hydrazydem, c jest stężeniem mg/ml polisacharydu, a MW jest masą cząsteczkową polisacharydu w kDa.
      4. Obliczyć gęstość znakowania hydrazydów na 100 kDa polisacharydu, stosując równanie (2).
         Gęstość znakowania na polisacharyd 100 kDa = h / c × 100 (2)
         Gdzie h jest mM hydrazydem, a c jest stężeniem mg/ml polisacharydu.
         UWAGA: Dla wygody można uznać, że polisacharydy mają masę cząsteczkową 100 000 daltonów. Pozwala to na rozważenie "gęstości znakowania" w porównaniu poziomu derywatyzacji różnych polisacharydów.
      5. Obliczyć gęstość znakowania hydrazydu jako procent wagowy ADH.
         1. Określić efektywne stężenie ADH w mg/ml za pomocą równania (3).
            mg/ml ADH = (mM hydrazyd / 1000) × 174 (3)
            gdzie 174 jest MW ADH.
         2. Obliczyć % masy ADH, korzystając z równania (4).
            % masy ADH = (mg/ml ADH) / (mg/ml polisacharydu) × 100 (4)

Wyniki

Aby zilustrować aktywację i derywatyzację polisacharydu za pomocą chemii CDAP, dekstran był aktywowany przy 0,25 i 0,5 mg CDAP/mg dekstranu. Dla każdej reakcji roztwór dekstranu o stężeniu 10 mg/ml w wodzie schładzano na lodzie i dodawano 1/^{10 objętości} 2,5 M zapasu DMAP (przygotowanego zgodnie z opisem w sekcji 3). Roztwór końcowy doprowadzono do pH 9 przez dodanie 0,1 M NaOH w 10 μl podwielokrotności. Roztwór schładzono i mieszano, dodano CDAP, a pH utrzymywano na poziomie pH 9 poprzez dodanie 10 μl podwielokrotności 0,1 M NaOH przez 15 minut. Dodano tylko 0,25 ml 0,5 M ADH przy pH 9 (mniej niż zwykle) i pozostawiono reakcję do przebiegu przez noc w temperaturze 4 °C.

Oznaczony dekstran był następnie sekwencyjnie dializowany z 1 M NaCl, 0,15 M NaCl i wodą, jak opisano w sekcji 6. ADH-dekstran oznaczono następnie na obecność dekstranu za pomocą testu rezorcyny/kwasu siarkowego (sekcja 7.2). Typowa krzywa wzorcowa wykorzystująca glukozę jako wzorzec cukru jest pokazana w Rysunek 4A. Zawartość hydrazydu oznaczono za pomocą testu TNBS opisanego w punkcie 7.3. Typowa krzywa wzorcowa hydrazydu wykorzystująca ADH jako wzorzec jest podana w Rysunek 4B.

Reprezentatywne obliczenia z aktywacji dekstranu na dwóch poziomach aktywacji są pokazane w Rysunek 4A,B. Dane przedstawiono zarówno jako hydrazydy na 100 kDa polimeru dekstranu, jak i jako procent wagowy ADH w stosunku do dekstranu, jak opisano odpowiednio w sekcjach 7.9.3.4 i 7.9.3.5, w Rysunek 4C. Stopień derywatyzacji w przybliżeniu podwoił się, gdy stosunek CDAP został podwojony.

Rysunek 1: Struktura chemiczna CDAP. CDAP = tetrafluoroboran 1-cyjano-4-dimetyloamirydyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Proces aktywacji i koniugacji CDAP. Proces jest koncepcyjnie podzielony na dwie fazy, przy czym aktywowany polisacharyd jest wspólny dla obu. W podstawowych warunkach CDAP aktywuje hydroksyle polisacharydowe, uwalniając DMAP (reakcja 1). Hydroliza CDAP uwalnia również DMAP (reakcja 3). Chociaż pokazany jest ester cyjano-estr, może to nie być rzeczywisty półprodukt. Produkt pośredni jest zatem określany jako "aktywowany" polisacharyd (CDAP). Podczas pierwszej fazy aktywacji aktywowany polisacharyd może ulegać hydrolizie (reakcja 4) lub ulegać reakcjom ubocznym (reakcja 5). W drugiej fazie koniugacji (reakcja 2) aktywowany polisacharyd reaguje z aminą, tworząc stabilne wiązanie izomocznikowe oprócz reakcji 4 i 5. Skróty: CDAP = tetrafluoroboran 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny; DMAP = 4-dimetyloaminopirydyna; R-NH₂ = amina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Aktywacja i koniugacja CDAP. Proces ten wymaga zrównoważenia reaktywności CDAP z polisacharydem, stabilności CDAP i aktywowanego polisacharydu, a także reaktywności aktywowanego polisacharydu z reaktywnością aminy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki dla aktywacji dekstranu przez CDAP. Typowe krzywe wzorcowe dla testów (A) rezorcyny/kwasu siarkowego i (B) TNBS. Przedstawiono wyniki testów dla dekstranu aktywowanego za pomocą dekstranu w dawkach 0,25 i 0,5 mg CDAP/mg. Glukoza została użyta jako wzorzec do testu rezorcyny. Dekstran w mg/ml dzieli się przez 100 kDa, aby uzyskać stężenie molowe. Stężenie hydrazydu określa się przy użyciu ADH jako wzorca, a wyniki wyraża się jako μM Hz. (C) Obliczanie stosunku hydrazydu do dekstranu. Poziom derywatyzacji obliczono w postaci hydrazydów na 100 kDa dekstranu, aby ułatwić porównanie polimerów o różnych średnich masach cząsteczkowych. Procentowy stosunek wagowy g ADH/g dekstranu obliczono przy użyciu MW wynoszącej 174 g/mol dla ADH. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

CDAP jest wygodnym odczynnikiem do derywatyzacji i koniugacji polisacharydów. W tym artykule opisano ogólną metodę wykorzystania CDAP do wyprowadzania polisacharydów z hydrazydami (PS-ADH) i uwzględniono ostatnio opublikowane ulepszenia⁸. Po pierwsze, technika ta podkreśla znaczenie utrzymania docelowego pH w celu kontrolowania procesu aktywacji. Odkryliśmy, że podczas gdy wiele popularnych zakłóca reakcję aktywacji CDAP, DMAP może być z powodzeniem stosowany jako bufor do zarządzania pH⁸. Co więcej, DMAP jest już produktem ubocznym reakcji aktywacji CDAP. Wreszcie, buforowanie roztworu polisacharydowego za pomocą DMAP przed dodaniem CDAP ułatwia precyzyjne ukierunkowanie i utrzymanie pH reakcji. Jak opisujemy, przydatne jest dostosowanie pH stężonego roztworu podstawowego DMAP w taki sposób, aby po rozcieńczeniu osiągnął docelowe pH. Po drugie, przeprowadzenie procesu na zimno spowolniło czas reakcji, dzięki czemu proces aktywacji był mniej szalony i bardziej wyrozumiały. Niższa temperatura zmniejszyła szybkość hydrolizy CDAP, a optymalny czas aktywacji przy pH 9 wzrasta z ~3 min do ~15 min. Ponadto do osiągnięcia tego samego poziomu aktywacji potrzeba mniej CDAP niż w przypadku wykonywania w temperaturze pokojowej.

Polisacharydy derywatyzowane ADH mogą być sprzężone z białkami za pomocą karbodimidów (np. EDAC)⁷. Na przykład kilka licencjonowanych szczepionek przeciwko Haemophilus influenzae b (Hib) wykorzystuje polirybozylorybicytolfosforan (PRP) derywatyzowany z ADH do koniugacji z toksoidem tężcowym za pomocą EDAC. Początkowo stosowano CNBr, ale CDAP jest znacznie łatwiejszym odczynnikiem do wykorzystania w tym celu. Z naszego doświadczenia wynika, że dobry zakres docelowy dla derywatyzacji ADH to 10-30 hydrazydów na 100 kDa polisacharydu lub ~1-3% ADH wagowo.

Ten sam proces można zastosować do pochodnej polisacharydów aminami pierwszorzędowymi poprzez zastąpienie ADH diaminą. Zaleca się stosowanie heksanodiaminy do pochodnej polisacharydów z aminami⁸. Aminowany polisacharyd (PS-NH₂) może być sprzężony przy użyciu odczynników opracowanych do koniugacji białek¹¹. Zazwyczaj PS-NH₂ jest derywatyzowany maleimidem (np. 4-[N-maleimidometylo]cykloheksano-1-karboksylan sukcynimidylu (SMCC) lub ester N-γ-maleimidobutyryl-oksysukcynimidu (GMBS)), a białko jest tiolowane (np. 3-(2-pirydyloditionio)propionianem sukcynimidylu (SPDP)). Chemia tiolowo-maleimidowa jest bardzo wydajna.

Białka mogą być również bezpośrednio sprzężone z polisacharydami aktywowanymi przez CDAP za pośrednictwem ɛ-aminy na lizynach. Chociaż zastosowany protokół aktywacji jest ogólnie podobny do opisanego tutaj, konieczne jest zoptymalizowanie poziomu aktywacji, stężenia polisacharydów i białka, a także stosunku białka do polisacharydu ^5,6,8.

Dekstran jest jednym z najłatwiejszych do aktywacji polisacharydów za pomocą CDAP ze względu na stosunkowo dużą gęstość grup hydroksylowych, ale niektóre polisacharydy, takie jak antygen Vi, mogą stanowić wyzwanie. W związku z tym nie ma jednego "najlepszego" protokołu dla koniugacji CDAP bezpośrednio z białkami. Sugerujemy najpierw opracowanie protokołu w celu osiągnięcia odpowiednich poziomów aktywacji, określonych na podstawie zakresu derywatyzacji hydrazydu, a następnie przystąpienie do bezpośredniego sprzężenia białek z polisacharydem aktywowanym CDAP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Acetonitryl	Sigma	34851
Dihydrazyd kwasu adypinowego	Sigma	A0638	MW 174
Amicon Ultra 15 10 kDa	Milipore	UFC901008	MW granica może wynosić 30 kDa dla 200 kDa PS
Waga
Autotitrator lub elektroniczna zlewka
2-4 L
CDAP	SAFC	RES1458C	Sigma
DMAP	Sigma	107700	MW 122.2
Lód
HCl 1 M	VWR	BDH7202-1
Mikromieszadło	VWR	76001-878
Rurka do mikrofuge (do CDAP)	VWR	87003-294
NaCl	VWR
NaOH 1 M	Sigma	1099130001
NaOH 10 M	Miernik pH Sigma	SX0607N-6
Sonda pH	Cole Parmer	55510-22	6 mm x 110 mm Epoksydowa
sonda
Pipety i końcówki
Sól fizjologiczna lub PBS
Mała zlewka 5-20 ml	VWR	10754-696	Zlewka 10 ml zapewnia miejsce na sondę pH i pipetę
Małe wiaderko
Mała szpatułka Płytka
			mieszająca
Test rezorcyny
Końcówka Combitip	Eppendorf	10 ml
DI rurka
	Repligen	132650T	Spectra/Por 6-8kDa
Klipsy do przewodów dializacyjnych	Repligen	142150
Blok
Rękawice nitrylowe	VWR
Repeat pipettor	Eppendorf	M4
Rezorcynol	Sigma	398047
Cukier standard		W stosownych przypadkach
Kwas siarkowy 75%	VWR	BT126355-1L
Test czasowy
TNBS
Adipinowy dihydrazyd	Sigma	A0638	MW 174
Probówki borokrzemianowe 12 x 75	VWR	47729-570
Boran sodu, 0,5 M pH 9	Boston Biologicals	BB-160
TNBS 5% z V/V	Sigma	P2297	MW 293.17