Artykuł metodologiczny

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

3.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62599

⸱

3 sierpnia 2021

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Center for Biomedical Engineering, School of Engineering, Brown University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Streszczenie

Modelowe błony komórkowe są użytecznym narzędziem przesiewowym o różnych zastosowaniach, od wczesnego odkrywania leków po badania toksyczności. Błona komórkowa jest kluczową barierą ochronną dla wszystkich typów komórek, oddzielającą wewnętrzne składniki komórkowe od środowiska zewnątrzkomórkowego. Błony te składają się w dużej mierze z dwuwarstwy lipidowej, która zawiera zewnętrzne hydrofilowe grupy głowy i wewnętrzne hydrofobowe grupy ogonowe, a także różne białka i cholesterol. Skład i struktura samych lipidów odgrywają kluczową rolę w regulacji funkcji biologicznych, w tym interakcji między komórkami a mikrośrodowiskiem komórkowym, które może zawierać farmaceutyki, toksyny biologiczne i toksyny środowiskowe. W pracy opisano metody formułowania jedno- i wielolipidowych oraz zawieszonych dwuwarstw lipidowych naśladujących komórki naśladujące dwuwarstwy. Wcześniej opracowano jednolipidowe dwuwarstwy lipidowe fosfatydylocholiny (PC), a także wielolipidowe dwuwarstwy lipidowe inspirowane trofoblastami łożyska do wykorzystania w zrozumieniu interakcji molekularnych. W tym miejscu zostaną przedstawione metody uzyskiwania obu typów modeli dwuwarstwowych. W przypadku dwuwarstw wielowarstwowych naśladujących komórki, pożądany skład lipidowy jest najpierw określany poprzez ekstrakcję lipidów z komórek pierwotnych lub linii komórkowych, a następnie chromatografię cieczową ze spektrometrią mas (LC-MS). Korzystając z tej kompozycji, pęcherzyki lipidowe są wytwarzane metodą cienkowarstwowej hydratacji i ekstruzji, a ich średnica hydrodynamiczna i potencjał zeta są charakteryzowane. Dwuwarstwy lipidowe podparte i zawieszone mogą być następnie formowane za pomocą mikrowagi kryształów kwarcu z monitorowaniem rozpraszania (QCM-D) oraz na porowatej membranie do zastosowania odpowiednio w równoległym teście przepuszczalności sztucznej błony (PAMPA). Reprezentatywne wyniki podkreślają powtarzalność i wszechstronność dwuwarstwowych modeli lipidowych błon komórkowych in vitro. Przedstawione metody mogą pomóc w szybkiej, łatwej ocenie mechanizmów interakcji, takich jak przenikanie, adsorpcja i osadzanie różnych cząsteczek i makrocząsteczek w błonie komórkowej, pomagając w badaniach przesiewowych kandydatów na leki i przewidywaniu potencjalnej toksyczności komórkowej.

Wprowadzenie

Błona komórkowa, składająca się głównie z fosfolipidów, cholesterolu i białek, jest kluczowym składnikiem wszystkich żywych komórek1. Dzięki organizacji opartej na amfifilowości lipidów, błona komórkowa działa jako bariera ochronna i reguluje sposób, w jaki komórka wchodzi w interakcje z otaczającym ją środowiskiem2. Kilka procesów komórkowych jest zależnych od składu lipidów i białek błony1,2. Na przykład interakcje błony komórkowej są ważne dla skutecznego dostarczania leków3. Farmaceutyki, produkty biologiczne, nanomateriały, toksyny biologiczne i toksyny środowiskowe mogą wpływać na integralność błony komórkowej, wpływając w ten sposób na funkcję komórki4. Budowa in vitro modeli błon naśladujących komórki w oparciu o skład lipidowy błon komórkowych może dostarczyć łatwych narzędzi, które znacznie usprawnią badania potencjalnego wpływu tych materiałów na komórki.

Model dwuwarstw lipidowych obejmuje pęcherzyki lipidowe, wspierane dwuwarstwy lipidowe i zawieszone dwuwarstwy lipidowe. Dwuwarstwy lipidowe są modelem fosfolipidowej błony komórkowej powszechnie stosowanym w zastosowaniach biotechnologicznych, w których pęcherzyki lipidowe są pękane na podpartym materiale podłoża5,6,7,8,9. Jedną z powszechnych technik stosowanych do monitorowania tworzenia dwuwarstw jest mikrowaga kryształów kwarcu z monitorowaniem dyssypacji (QCM-D), która bada adsorpcję pęcherzyków w porównaniu z właściwościami cieczy masowej in situ8,10,11,12,13,14. Wcześniej QCM-D był używany do wykazania, że w warunkach przepływu, po osiągnięciu krytycznego pokrycia pęcherzykami lipidowymi fosfatydylocholiny (PC) na powierzchni, spontanicznie pękają one na sztywne dwuwarstwy lipidowe15. Wcześniejsze prace dotyczyły również wspieranego tworzenia dwuwarstw lipidowych o różnym składzie lipidowym16, włączenie białek lipidowych17,18,19, oraz wykorzystując poduszki polimerowe20, uzyskując wspierane dwuwarstwy lipidowe zdolne do naśladowania różnych aspektów funkcji błony komórkowej.

Dwuwarstwy lipidowe zostały użyte do naśladowania różnych barier biologicznych od poziomu subkomórkowego do narządowego, w tym mitochondriów, czerwonych krwinek i błon komórkowych wątroby, poprzez zmianę składników fosfolipidów, cholesterolu i glikolipidów21. Te bardziej złożone pęcherzyki wielolipidowe mogą wymagać dodatkowych metod w celu uzyskania pęknięcia pęcherzyków, w zależności od składu lipidowego. Na przykład w poprzednich badaniach wykorzystano peptyd α-helisowy (AH) pochodzący z niestrukturalnego białka 5A wirusa zapalenia wątroby typu C w celu wywołania tworzenia dwuwarstw poprzez destabilizację zaadsorbowanych pęcherzyków lipidowych22,23. Korzystając z tego peptydu AH, wcześniej utworzono dwuwarstwy lipidowe naśladujące komórki łożyska24. Ogromny potencjał dwuwarstw lipidowych do zastosowań biomedycznych został zademonstrowany w badaniach obejmujących transport molekularny i nanocząsteczkowy25, 26, environmental toxicant interactions27, Składanie i funkcja białek17,18,19, układ peptydów i insercja28, 29, badanie przesiewowe leków30 oraz platformy mikroprzepływowe31.

Zawieszone dwuwarstwy lipidowe zostały wykorzystane do badań przesiewowych w farmacji za pomocą równoległego testu przepuszczalności sztucznej błony (PAMPA), gdzie dwuwarstwa lipidowa jest zawieszona na porowatej wkładzie hydrofobowym32,33,34,35. Modele lipidowe PAMPA zostały opracowane dla różnych interfejsów biologicznych, w tym interfejsów krew-mózg, policzkowych, jelitowych i przezskórnych36. Łącząc zarówno podpartą dwuwarstwę lipidową, jak i techniki PAMPA, można dokładnie zbadać adsorpcję, przepuszczalność i osadzanie związków w składnikach lipidowych pożądanej tkanki lub typu komórki.

Ten protokół opisuje wytwarzanie i zastosowanie modeli dwuwarstwowych lipidów błony komórkowej in vitro do badania kilku interakcji molekularnych. Szczegółowo opisano przygotowanie zarówno jednolipidowych, jak i wielolipidowych oraz zawieszonych dwuwarstw lipidowych. Aby utworzyć podpartą dwuwarstwę lipidową, pęcherzyki lipidowe są najpierw opracowywane przy użyciu metod cienkowarstwowego nawilżania i wytłaczania, a następnie charakterystyki fizykochemicznej. Omówiono tworzenie podpartej dwuwarstwy lipidowej przy użyciu monitorowania QCM-D i wytwarzania zawieszonych błon lipidowych do stosowania w PAMPA. Na koniec badane są pęcherzyki wielolipidowe do rozwoju bardziej złożonych błon naśladujących komórki. Wykorzystując oba typy wytwarzanych błon lipidowych, protokół ten pokazuje, w jaki sposób można wykorzystać to narzędzie do badania interakcji molekularnych. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta konstruuje dwuwarstwy lipidowe naśladujące komórki o wysokiej powtarzalności i wszechstronności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych

  1. Metoda hydratacji cienkiej warstwy
    1. Przygotowanie i przechowywanie roztworów zapasowych lipidów
      UWAGA: Wszystkie etapy z wykorzystaniem chloroformu muszą być przeprowadzane w dygestorium. Do pipetowania chloroformu należy zawsze używać końcówek do pipet z włókna węglowego, odpornych na rozpuszczalniki. Roztwory zawierające chloroform należy zawsze przechowywać w fiolkach szklanych.
      1. Przygotuj roztwór zapasowy lipidów o stężeniu 10 mg/ml, dodając odpowiednią objętość chloroformu do fiolki zawierającej proszek lipidowy, a następnie dokładnie wymieszaj. Na przykład dodaj 20 ml chloroformu do 200 mg L-α-fosfatydylocholiny (jajo, kurzy) (eggPC). W razie potrzeby roztwór zapasowy można przygotować w innym stężeniu.
        UWAGA: Jeśli lipid w proszku był przechowywany w ampułce, po dodaniu chloroformu należy przenieść go do szklanej fiolki z nakrętką z wkładką z politetrafluoroetylenu (PTFE).
      2. Uszczel zakrętkę fiolki Parafilmem i przechowuj w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy.
    2. Tworzenie suchej warstwy lipidowej
      1. Do czystej fiolki szklanej należy dodać odpowiednią objętość roztworu zapasowego lipidów, aby uzyskać końcowe stężenie pęcherzyków wynoszące 2,5 mg/mL. Na przykład, aby otrzymać 1 mL pęcherzyków egg PC o stężeniu 2,5 mg/mL, należy odpipetować 250 µL roztworu stokowego PC z jaja do fiolki.
        UWAGA: Przygotowana objętość może zależeć od stosowanego procesu ekstruzji (patrz krok 1.3). Maksymalna zalecana objętość dla mini ekstrudera wynosi 1 ml, natomiast zakres objętości dla dużego ekstrudera wynosi 5–50 ml.
      2. Usunąć chloroform z roztworu zapasowego lipidów za pomocą strumienia N22 gaz (czystość 5.0).
      3. Aby zapewnić całkowite usunięcie chloroformu, należy podłączyć wysuszony film lipidowy do pompy próżniowej i pozostawić na co najmniej 4 h.
        UWAGA: Na tym etapie proces można przerwać. Jeśli film lipidowy nie zostanie wykorzystany bezpośrednio po suszeniu próżniowym, należy go przechowywać w eksykatore do momentu użycia. Zaobserwowano, że filmy lipidowe przechowywane w tych warunkach przez 1 tydzień pozwalają na otrzymanie pęcherzyków o podobnej jakości; w razie potrzeby należy przeprowadzić dalsze badania nad jakością pęcherzyków po dłuższym czasie przechowywania.
    3. Wykonywanie cykli zamrażania, odmrażania i wirowania w vorteksie
      1. Przygotować roztwór buforu Tris-chlorek sodu (NaCl) zawierający 10 mM zasady Tris i 100 mM NaCl. Nawilżyć wysuszony film lipidowy wymaganą objętością buforu Tris-NaCl, aby uzyskać końcowe stężenie pęcherzyków 2,5 mg/mL, a następnie mieszać w wstrząsarze wortex przez około 15–30 s.
      2. Przenieść zawiesinę pęcherzyków do pojemnika z suchym lodem i pozostawić do zamrożenia, przez około 30 min. Po całkowitym zamrożeniu próbki rozmrozić zawiesinę w 30-40 °C łaźnia wodna. Zawiesinę rozmrożonych pęcherzyków wymieszać w wirówce typu vortex.
        UWAGA: ciekły azot2 można stosować zamiast suchego lodu. Zawiesinę pęcherzyków przenieść do ciekłego azotu na 30 s, a następnie natychmiast rozmrozić w 80°C łaźnia wodna
      3. Powtórzyć krok 1.1.3.2 jeszcze 4 razy, aby przeprowadzić łącznie 5 cykli zamrażania, rozmrażania i mieszania w wortexie.
  2. Wytłaczanie
    UWAGA: Po zakończeniu cykli zamrażania, rozmrażania i mieszania w wirówce (vortexowaniu) powstają pęcherzyki wielowarstwowe. Ekstruzja pomaga w zmniejszeniu ich rozmiaru i tworzeniu dużych pęcherzyków jednowarstwowych.
    1. Proces w mini-wytłaczarce (1 ml)
      1. Dokładnie oczyścić wszystkie elementy ekstrudera, używając łagodnego detergentu w wodzie ultrapure, a następnie przepłukać co najmniej trzy razy wodą ultrapure, upewniając się, że cały detergent został usunięty. Osuszyć za pomocą N2 gaz
      2. Zmontować dwa wewnętrzne wsporniki membrany oraz pierścienie O-ring (średnica wewnętrzna 12,7 mm; średnica zewnętrzna 15,2 mm). Ułożyć każdy wspornik membrany tak, aby pierścień O-ring był skierowany do góry.
      3. Nawilż uprzednio podkładkę filtra wodą ultrapure. Umieść ją na powierzchni podkładki membrany wewnątrz pierścienia O. Powtórz czynność dla drugiej wewnętrznej podkładki membrany.
      4. Umieść jeden wewnętrzny wspornik membrany w zewnętrznej obudowie ekstrudera. Na wewnętrznym wsporniku membrany, bezpośrednio nad wspornikiem filtra, umieść jedną membranę poliwęglanową o rozmiarze porów 100 nm.
        UWAGA: Membrany poliwęglanowe są przechowywane oddzielnie, pomiędzy arkuszami niebieskiego papieru. Przed umieszczeniem membrany na podłożce należy usunąć papier rozdzielający.
      5. Umieść drugi wewnętrzny wspornik membrany w obudowie zewnętrznej ekstrudera, tak aby strona z pierścieniem O-ring i wspornikiem filtra była skierowana w stronę membrany poliwęglanowej. Włóż łożysko PTFE do nakrętki mocującej i dokręć je do obudowy zewnętrznej ekstrudera. Wepnij ekstruder w blok grzejny.
      6. Napełnij jedną z strzykawek zawiesiną pęcherzyków lipidowych, a następnie umieść strzykawkę w bloku grzewczym ekstrudera, w pełni wkładając igłę do jednego z jego końców. Włóż drugą, pustą strzykawkę z przeciwległej strony i zablokuj obie strzykawki za pomocą zacisków ramion bloku grzewczego.
        UWAGA: W razie potrzeby należy umieścić blok grzejny ekstrudera na płycie grzejnej i ustawić temperaturę powyżej temperatury przejścia fazowego lipidu. W celu dokładnego pomiaru temperatury należy włożyć termometr do uchwytu wbudowanego w blok grzejny i odczekać do osiągnięcia wymaganej temperatury (~15 min). W przypadku pęcherzyków lipidowych z PC jaja kurzego podgrzewanie podczas ekstruzji nie jest wymagane.
      7. Powoli wtłocz zawiesinę pęcherzyków do pustej strzykawki, a następnie z powrotem do strzykawki pierwotnej. Przez cały proces ekstruzji monitoruj zmiany ciśnienia, które mogą wskazywać na nieszczelność. Powtórz czynność jeszcze 20 razy, aby uzyskać łącznie 21 przejść przez membranę poliwęglanową. Przenieś pęcherzyki lipidowe do czystej szklanej fiolki w celu przechowywania.
        UWAGA: Liczba cykli ekstruzji może zostać zoptymalizowana w zależności od składu lipidów.
      8. Jeśli zastosowano ogrzewanie, należy odczekać, aż zawiesina ekstrudowanych pęcherzyków osiągnie temperaturę pokojową. Ekstrudowane pęcherzyki lipidowe należy przechowywać w 4 °C do czasu dalszego użycia.
        UWAGA: Zalecany czas przechowywania pęcherzyków jest w znacznym stopniu zależny od składu lipidowego, a ich właściwości fizykochemiczne (np. średnica hydrodynamiczna, potencjał zeta) powinny być monitorowane w czasie. Na przykład pęcherzyki PC z żółtka jaja kurzego były przechowywane przez co najmniej dwa tygodnie bez zmian wielkości pęcherzyków lub zdolności do tworzenia dwuwarstwy.
    2. Proces ekstruzji w skali dużej (5–50 ml)
      UWAGA: Należy wykonać kroki 1.2.2.1–1.2.2.5, jeśli wybrany lipid wymaga podgrzania. Jeśli podgrzewanie nie jest konieczne, należy przejść bezpośrednio do kroku 1.2.2.5. Kroki 1.2.2.1–1.2.2.4 nie są wymagane w przypadku PC z żółtka jaja.
      1. Napełnić kolbę o pojemności 1 l wodą z odwróconej osmozy (RO).
        UWAGA: Nie należy używać wody ultrapure do cyrkulacji w systemie 50 ml, ponieważ może to spowodować wymywanie jonów metali z cylindra ekstrudera.
      2. Umieść kolbę o pojemności 1 l w łaźni wodnej na płycie grzejnej i ustaw temperaturę płyty powyżej temperatury przejścia lipidów.
      3. Podłączyć cylinder z próbką do kolby za pomocą elastycznego przewodu, korzystając z wlotu w cylindrze. Drugi koniec przewodu, znajdujący się przy wylocie cylindra, podłączyć do górnej części kolby o pojemności 1 l. W razie potrzeby zabezpieczyć przewody zarówno przy wlocie, jak i wylocie. Pozwoli to na stworzenie jednokierunkowego przepływu wody przez cylinder z próbką.
      4. Włącz pompę, aby rozpocząć cyrkulację wody. Jeśli wymagane jest ogrzewanie, odczekaj około 30–45 minut, aż cylinder z próbką osiągnie pożądaną temperaturę.
      5. Podłącz korek cylindra z próbką do butli z azotem za pomocą elastycznego łącznika przymocowanego do jednostki zaworu bezpieczeństwa.
      6. Oczyścić wszystkie części ekstrudera o pojemności 50 ml za pomocą 70% (v/v) etanolu.
      7. Zmontuj ekstruder, umieszczając wspornik sita z dużym otworem, spiekany dysk, dyski odpływowe oraz membranę poliwęglanową w przestrzeni w dolnym wsporniku ekstrudera. Połącz górny i dolny wspornik ekstrudera za pomocą czterech śrub i dokręć je.
      8. Przymocuj moduł ekstrudera do cylindra z próbką, przykręcając go od dołu i dokręcając kluczem w celu stabilizacji.
        UWAGA: W przypadku zastosowania ogrzewania należy umieścić termometr w cylindrze i odczekać, aż woda osiągnie pożądaną temperaturę przed kontynuowaniem procedury. Pozwoli to zapewnić utrzymanie temperatury próbki przez cały proces ekstruzji.
      9. Napełnić cylinder z próbką wodą ultrapure. Przed wprowadzeniem próbki do cylindra należy przepuścić wodę przez jednostkę ekstrudera. Zabieg ten ma na celu wstępne zwilżenie membran, analogicznie do procedury w mini-ekstruderze.
        UWAGA: Przed włączeniem azotu należy upewnić się, że zakrętka jest całkowicie dokręcona, a zawór spustowy ciśnienia jest w pełni zamknięty. Na tym etapie wymagane jest minimalne ciśnienie (~5–10 psi).
      10. Przenieść zawiesinę pęcherzyków lipidowych do cylindra z próbką i zakręcić górną pokrywą. Powoli zwiększać ciśnienie, aż próbka zacznie kapać z ekstrudera do czystej fiolki szklanej z prędkością około 2-3 kropli/s.
        UWAGA: Na tym etapie nie należy gwałtownie zwiększać ciśnienia, ponieważ zbyt wysokie ciśnienie może negatywnie wpłynąć na membrany i doprowadzić do niepowodzenia procesu ekstruzji.
      11. Po wyciśnięciu całej próbki wyłączyć N2 doprowadzić ciśnienie do cylindra z próbką, a następnie je zwolnić, powoli otwierając zawór bezpieczeństwa. Przelać pęcherzyki lipidowe z powrotem do cylindra z próbką i powtórzyć krok 1.2.2.11 jeszcze 9 razy, aby uzyskać łącznie 10 ekstruzji.
        UWAGA: Wymagane ciśnienie do ekstruzji może maleć wraz ze wzrostem liczby cykli ekstruzji, ponieważ próbka staje się bardziej jednorodna, a jej rozmiary bardziej zbliżone do wielkości porów membrany poliwęglanowej.
      12. Przechowywać zawiesinę ekstrudowanych pęcherzyków lipidowych w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

2. Charakterystyka pęcherzyków lipidowych

  1. Pomiar średnicy hydrodynamicznej za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
    1. Wymieszaj porywami (vortex) pęcherzyki lipidowe i pipetuj 50 µL zawiesiny pęcherzyków lipidowych do jednorazowej kuwety o małej objętości. Przykryj kuwetę, aby zapobiec zanieczyszczeniu kurzem i zanieczyszczeniami.
    2. Wprowadź zawiesinę pęcherzyków do urządzenia DLS, wprowadź dane dotyczące próbki i wykonaj pomiar przy użyciu odpowiedniego oprogramowania.
  2. Potencjał zeta
    1. Przygotuj zgiętą kapilarę do pomiaru potencjału zeta, przemywając ją wodą ultrapure, 70% etanolem i ponownie wodą ultrapure, używając strzykawek podłączonych do wlotów celi. Delikatnie przepchnij ciecz przez celę 3-4 razy i całkowicie opróżnij celę przed przejściem do kolejnego roztworu.
    2. Wymieszaj porywami (vortex) pęcherzyki lipidowe i przygotuj rozcieńczenie pęcherzyków lipidowych w wodzie ultrapure w stosunku 1:10 (v/v).
    3. Wprowadź rozcieńczoną zawiesinę pęcherzyków lipidowych. Usuń pęcherzyki powietrza, przesuwając zawiesinę tam i z powrotem między strzykawkami. Załóż zatyczki na każdy wlot.
      UWAGA: Kluczowe jest usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza, ponieważ wpłyną one na pomiar.
    4. Umieść celę zeta w komorze pomiarowej, upewniając się, że elektrody są w kontakcie. Zamknij górną pokrywę komory pomiarowej. W odpowiednim oprogramowaniu wprowadź dane próbki i wykonaj pomiar.

3. Tworzenie jednowarstwowej lipidowej dwuwarstwy wspieranej przy użyciu QCM-D

  1. Przygotowanie roztworów
    1. Przygotować 2% (w/v) roztwór dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie ultrapure. Mieszać na mieszadle magnetycznym do całkowitego rozpuszczenia. Odmierzyć alikwoty roztworów roboczych o objętości co najmniej 10 ml wody ultrapure, 2% SDS oraz Tris NaCl.
    2. Przygotować rozcieńczenie pęcherzyków lipidowych w buforze Tris-NaCl. Stężenie pęcherzyków zależy od zastosowania. W przypadku PC z żółtka jaja wykazano, że stężenia w zakresie 0,01–0,5 mg/ml umożliwiają pomyślne utworzenie wspieranej lipidowej dwuwarstwy.
  2. Czyszczenie czujników kwarcowych pokrytych krzemionką
    UWAGA: Czyszczenie kryształów QCM-D zależy od materiału powierzchniowego użytego czujnika. W celu utworzenia wspieranych dwuwarstw lipidowych w niniejszym protokole zastosowano kryształy kwarcowe powlekane krzemionką, których opis szczegółowo przedstawiono poniżej, w wersji dostosowanej do standardowej procedury operacyjnej producenta.
    1. Włóż czujnik z kryształu kwarcowego powleczonego krzemionką do modułu przepływowego, upewniając się, że oznaczenie „t” na krysztale pokrywa się z oznaczeniem „t” na module. Zakręć moduł przepływowy.
      UWAGA: Jeśli wykorzystywany system QCM-D umożliwia podłączenie i jednoczesną pracę wielu modułów przepływowych, należy powtórzyć poniższe procedury dla dodatkowych modułów w zależności od potrzeb.
    2. Wsuń moduł przepływowy do podstawy urządzenia w taki sposób, aby elektrody modułu przepływowego połączyły się z systemem analizatora. Zablokuj moduł na miejscu.
    3. Podłącz przewody wlotowe i wylotowe do modułu przepływowego oraz pompy. Umieść przewody w prowadnicach i zamknij pokrywę systemu analizatora. Pod wylotem pompy ustaw pojemnik na odpady w celu zbierania zużytych roztworów.
    4. Aby przeprowadzić czyszczenie, najpierw włącz pompę. Ustaw prędkość przepływu na 400 μL/minWłożyć rurkę doprowadzającą do wody ultrapure i przepuścić przez moduł 5–10 ml.
    5. Przełóż rurkę doprowadzającą do 2% roztworu SDS i przepuść przez moduł 5–10 ml. Przełóż rurkę doprowadzającą z powrotem do wody ultrapure i przepuść przez moduł 10–20 ml. Wyjmij rurkę doprowadzającą z roztworu i przepuść przez nią powietrze, aż do całkowitego usunięcia cieczy.
      UWAGA: Powyższy protokół czyszczenia jest stosowany codziennie przed i po każdym pomiarze. W razie potrzeby można przeprowadzić czyszczenie dokładne. W skrócie, aby wykonać czyszczenie dokładne, należy zdemontować moduły przepływowe. Wszystkie elementy, z wyjątkiem strony elektrody modułu przepływowego, należy zanurzyć w 2% (w/v) roztworze SDS i poddać sonikacji w kąpieli, a następnie dokładnie wypłukać wodą ultrazczystą i wysuszyć strumieniem N22 gaz. Element modułu przepływowego zawierający piny elektrod nie może nigdy mieć kontaktu z cieczą.
    6. Wyjmij czujnik z modułu przepływowego i wypłucz go wodą ultrapurystyczną. Osusz czujnik za pomocą N2 strumień gazu. Osuszyć moduł przepływowy za pomocą N22 strumień gazu. Należy upewnić się, że elektroda pozostaje stale wolna od jakiejkolwiek cieczy.
    7. W dygestorium chemicznym umieść czujnik z kryształu kwarcowego powleczonego krzemionką w urządzeniu do czyszczenia promieniami ultrafioletowymi (UV) i ozonem. Włącz urządzenie i prowadź proces przez co najmniej 2 min. Ostrożnie wyjmij czujniki i umieść je z powrotem w module przepływowym.
  3. Przygotowanie linii bazowej Tris-NaCl
    1. Włącz analizator, aby połączyć go z powiązanym oprogramowaniem, a następnie ustaw temperaturę na wartość wymaganą dla badanej lipidowej dwuwarstwy wspieranej. Odczekaj, aż temperatura ustabilizuje się na wprowadzonej wartości.
      UWAGA: Jeśli temperatura nastawy jest wyższa od temperatury pokojowej, wszystkie roztwory należy podgrzać do tej samej temperatury za pomocą bloku grzejnego.
    2. Skonfiguruj pomiar i wyznacz wszystkie częstotliwości rezonansowe oraz dyssypacje czujnika dla alikwotów 3, 5, 7, 9, 11 i 13 przed rozpoczęciem pomiaru.
      UWAGA: 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. ton alikwotowy można pominąć, ponieważ harmoniczna ta jest nadmiernie wrażliwa i generuje szum w danych.
    3. Włącz pompę i ustaw prędkość przepływu na 175 μL/min lub pożądany przepływ eksperymentalny.
    4. Przed włożeniem rurki wlotowej do roztworu Tris NaCl należy przetrzeć ją etanolem. Uruchom pomiar i rozpocznij przepływ Tris NaCl.
      UWAGA: Dane są zbierane i monitorowane w czasie rzeczywistym. Przejście z powietrza na ciecz w module przepływowym będzie widoczne w oprogramowaniu do zbierania danych jako gwałtowna zmiana dyssypacji (ΔD) wzrost i zmiana częstotliwości (ΔF) spadek.
    5. Pozwól, aby bufor Tris-NaCl przepływał przez moduł przez 5–10 min, upewniając się, że linia bazowa ΔF i ΔD wartości w cieczy pozostają stabilne.
  4. Formowanie jednorodnej lipidowej błony wspieranej
    1. Zatrzymaj pompę, wyjmij rurkę doprowadzającą z roztworu Tris NaCl i ostrożnie zanurz ją w roztworze pęcherzyków lipidowych. Wykonaj przepływ wsteczny przez 5 s, aby usunąć pęcherzyki powietrza z rurki doprowadzającej, a następnie przywróć przepływ przedni. Ponownie uruchom pomiar w oprogramowaniu, aby wyzerować linię bazową.
      UWAGA: Należy uważać, aby w przewodach nie pojawiły się pęcherzyki powietrza, które mogą przedostać się do modułu i zakłócić tworzenie dwuwarstwy oraz rejestrację danych.
    2. Przeprowadzać przepływ pęcherzyków lipidowych do momentu zaobserwowania formowania się dwuwarstwy w czasie rzeczywistym w oprogramowaniu do akwizycji danych (co najmniej 8 min w przypadku pęcherzyków PC z żółtka jaja).
    3. Powtórz krok 3.4.1, aby zmienić zawartość rurki wlotowej z pęcherzyków lipidowych z powrotem na bufor Tris NaCl.
      UWAGA: Jeśli zamierzonym zastosowaniem jest badanie oddziaływań molekularnych, należy przejść bezpośrednio do kroku 6.1 bez zatrzymywania przepływu roztworu lub akwizycji danych. Jeśli końcowym etapem jest formowanie dwuwarstwy, należy przejść do kroku 3.4.4.
    4. W oprogramowaniu zatrzymaj pomiar i zapisz plik. Wyłącz pompę.
    5. Oczyścić moduł przepływowy oraz sensor w postaci kryształu kwarcu pokrytego krzemionką zgodnie z krokami 3.2.4 i 3.2.5 protokołu.

4. Tworzenie zawieszonej dwuwarstwy lipidowej

UWAGA: Protokół tworzenia zawieszonej dwuwarstwy lipidowej został zaadaptowany z protokołu testu przepuszczalności równoległych błon sztucznych (PAMPA) dostarczonego przez producenta płytek filtracyjnych37.

  1. Rozpuścić wybrany lipid w dodekanie do stężenia 20 mg/mL (np. 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholinę (DOPC)).
  2. Dodać 5 μL roztworu lipidu do komory donora, którą jest porowata 96-dołkowa wielowarstwowa płyta filtracyjna z difluorowodoru poliwinyldenu (PVDF) (rozmiar porów 0,45 μm).
  3. Bezzwłocznie zanurzyć płytę filtracyjną w komorze akceptora, którą jest płyta odbiorcza do transportu zawierająca 300 μL 1× fosforanu soli buforowanej (PBS). Dodać 200 μL 1× PBS do komory donora.
    UWAGA: Można uwzględnić kontrole w postaci filtrów zawierających tylko lipid oraz filtrów niepoddanych obróbce, wystawionych na działanie 1× PBS.
  4. Przejść bezpośrednio do sekcji 6.2, aby zbadać oddziaływania molekularne z zawieszoną dwuwarstwą lipidową. Zaleca się ukończenie badania w ciągu 16 h od utworzenia zawieszonej dwuwarstwy.

5. Opracowanie wielolipidowych pęcherzyków i dwuwarstw naśladujących komórki

  1. Ekstrakcja lipidów z komórek ssaków
    UWAGA: Ekstrakcja lipidów odbywa się zgodnie z metodą Bligha-Dyera38.
    1. Hodować odpowiednią linię komórkową w zależności od potrzeb. Po osiągnięciu 70-80% konfluencji (kolba T75), odkleić komórki, stosując trypsynę i kwas etylenodiaminotetraoctowy w temperaturze 37 °C przez 5 min.
    2. Wirować komórki z prędkością 200 × g przez 5 min. Odpiąć nadsącz i resuspender osad komórkowy w 1 mL wody ultrapure.
    3. Do zawiesiny komórkowej dodać 3,75 mL mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku 1:2 (v/v) i mieszać w wortexie przez 15 min. Następnie dodać 1,25 mL chloroformu i mieszać w wortexie przez 1 min. Na koniec dodać 1,25 mL wody i mieszać w wortexie przez 1 min.
    4. Wirować mieszaninę komórkową z prędkością 1000 x g przez 10 min. Zebrać dolną warstwę cieczy, która zawiera lipidy w fazie organicznej. Osuszyć w strumieniu gazu N2.
    5. Oznaczyć zawartość lipidów za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią mas (LC-MS), stosując kolumnę odwróconej fazy C18 o wymiarach 3,5 μm × 50 mm.
    6. Przygotować dwa roztwory do fazy ruchomej: pierwszy składający się z acetonitrylu i wody w stosunku 60:40 (v/v), a drugi z izopropanolu i acetonitrylu w stosunku 90:10 (v/v). Do obu roztworów należy dodać mrówczan amonu do końcowego stężenia 10 mM. W ciągu 60 min zwiększyć gradient fazy ruchomej od 35% (v/v) drugiego roztworu do 95% (v/v).
    7. Detekcję eluentu przeprowadzić w trybie ujemnej jonizacji, stosując kolejno pełne skanowanie MS oraz tandemową spektrometrię mas MS/MS. Zidentyfikować poszczególne gatunki fosfolipidów na podstawie ich stosunków masy do ładunku (m/z). Analizować widma masowe z fragmentacji indukowanej zderzeniowo, korzystając z narzędzi analizy spektrometrii mas LIPID MAPS. Uzyskać chromatogramy jonów ekstrahowanych w celu zintegrowania pola pod krzywą, co pozwoli określić obfitość każdego gatunku lipidów.
    8. Wykonać kroki 5.1.5-5.1.7 dla wzorca lipidowego zawierającego główne klasy lipidów, aby określić względną czułość detekcji dla każdej z różnych klas fosfolipidów.
  2. Przygotowanie wieloskładnikowych pęcherzyków lipidowych
    1. Postępować zgodnie z krokami w 1.1.1, aby przygotować roztwory stokowe lipidów reprezentujących każdy pożądany składnik dwuwarstwy, zidentyfikowany w kroku 5.1.
    2. W oparciu o składy lipidowe uzyskane w kroku 5.1, dodać odpowiednią objętość stoku lipid/chloroform do czystej szklanej fiolki, niezbędną do uzyskania końcowego stężenia pęcherzyków 2,5 mg/mL. Usunąć główną część roztworu suszącego chloroformem w strumieniu gazu N2.
    3. Postępować zgodnie z krokami 1.1.2, 1.1.3 oraz 1.2 w celu utworzenia wieloskładnikowych pęcherzyków lipidowych. Postępować zgodnie z krokiem 2 w celu charakterystyki pęcherzyków.
  3. Tworzenie wieloskładnikowej wspieranej dwuwarstwy lipidowej przy użyciu QCM-D
    UWAGA: Niektóre wieloskładnikowe pęcherzyki lipidowe mogą ulegać spontanicznemu pękaniu i tworzyć dwuwarstwę, podobnie jak jednoskładnikowe pęcherzyki PC przedstawione w kroku 3. Jednak bardziej złożone pęcherzyki wieloskładnikowe mogą wymagać zewnętrznego bodźca, aby wspomóc ich pękanie. W tym przypadku używa się peptydu AH do destabilizacji zewnętrznej warstwy pęcherzyka, co prowadzi do powstania dwuwarstwy. Jeśli jest to pożądane, można rozważyć inne metody destabilizacji i pękania pęcherzyków.
    1. Postępować zgodnie z krokiem 3 w celu utworzenia wieloskładnikowej wspieranej dwuwarstwy lipidowej, wykorzystując wieloskładnikowe pęcherzyki lipidowe utworzone w kroku 5.2.
    2. Jeśli nie zaobserwowano spontanicznego pękania pęcherzyków i tworzenia dwuwarstwy, podjąć próbę destabilizacji pęcherzyków za pomocą peptydu AH. Przygotować roztwór peptydu AH (sekwencja peptydu: H-Ser−Gly−Ser−Trp−Leu−Arg−Asp−Val−Trp−Asp−Trp−Ile−Cys−Thr−Val−Thr−Asp−Phe−Lys−Thr−Trp−Leu−Gln−Ser−Lys−Leu−Asp−Tyr−Lys−Asp-NH2) o stężeniu 13 μM w buforze Tris NaCl z 1% (v/v) dimetylosulfotlenkiem, DMSO.
    3. Postępować zgodnie z krokami 3.4.1-3.4.3. Po kroku 3.4.3 zmienić rurkę wlotową na roztwór peptydu AH. Wprowadzać roztwór do modułu przepływowego, aż zaobserwowane zostaną zmiany ΔF i ΔD wynikające z dodania nowego roztworu. Zatrzymać pompę i pozwolić peptydowi AH inkubować z pęcherzykami przez 10 min.
    4. Przełączyć rurkę wlotową na bufor Tris NaCl i uruchomić przepływ, aby usunąć peptyd AH z pękniętych pęcherzyków, co doprowadzi do pomyślnego utworzenia dwuwarstwy lipidowej.
      UWAGA: Jeśli pożądanym zastosowaniem jest badanie oddziaływań molekularnych, przejść bezpośrednio do kroku 6.1 bez przerywania przepływu roztworu lub akwizycji danych.
    5. W oprogramowaniu zatrzymać pomiar i zapisać plik. Zatrzymać pompę.
    6. Oczyścić moduł przepływowy i czujnik kwarcowy powlekany krzemionką zgodnie z krokami protokołu 3.2.4-3.2.6.
  4. Zawieszone wieloskładnikowe dwuwarstwy lipidowe
    1. Rozpuścić mieszaninę pożądanych lipidów w dodekanie w stężeniu 20 mg/mL.
    2. Przygotować 5 μL roztworu mieszaniny lipidowej o składzie naśladującym pożądane komórki.
    3. Postępować zgodnie z krokami 4.2 i 4.3.
      ​UWAGA: Przejść bezpośrednio do kroku 6.2, aby zbadać oddziaływania molekularne z zawieszoną dwuwarstwą lipidową.

6. Badania oddziaływań cząsteczek z jednoskładnikowymi i wieloskładnikowymi dwuwarstwami lipidowymi

  1. Badanie oddziaływań molekularnych z podpartą dwuwarstwą lipidową przy użyciu QCM-D
    1. Przygotować roztwór badanej cząsteczki w celu analizy adsorpcji do podpartej dwuwarstwy lipidowej. Na przykład przygotować roztwór 200 μM ftalanu di(2-etyloheksylu) (DEHP) w buforze Tris NaCl z dodatkiem 1% (v/v) DMSO.
    2. Jeśli roztwór cząsteczki przygotowano w buforze Tris NaCl, można go wprowadzić bezpośrednio zgodnie z krokiem 3.4.3 dla jednorodnej dwuwarstwy lipidowej lub 5.3.4 dla wieloskładnikowej dwuwarstwy lipidowej. Jeśli cząsteczka musi zostać przygotowana w innym rozpuszczalniku, należy zamiast tego zanurzyć rurkę wlotową w samym rozpuszczalniku przez co najmniej 5 min (np. Tris NaCl z 1% (v/v) DMSO dla DEHP).
      UWAGA: Zmiany lepkości wynikające z zastosowania rozpuszczalnika można monitorować i uwzględnić, przepływając go przed i po wprowadzeniu badanej cząsteczki.
    3. Przełączyć rurkę wlotową do roztworu zawierającego badaną cząsteczkę i utrzymywać przepływ przez co najmniej 5 min. Jeśli jest to pożądane, przepływ można zatrzymać i pozostawić ciecz zawierającą badaną cząsteczkę do inkubacji z dwuwarstwą.
    4. Jeśli użyto innego rozpuszczalnika niż Tris NaCl, należy przełączyć rurkę wlotową z powrotem na sam rozpuszczalnik cząsteczki. Utrzymywać przepływ przez co najmniej 5 min. Następnie przełączyć rurkę wlotową na bufor Tris NaCl i utrzymywać przepływ przez co najmniej 5 min.
    5. W oprogramowaniu zatrzymać pomiar i zapisać plik. Wyłączyć pompę.
    6. Oczyścić moduł przepływowy oraz czujnik z kryształu kwarcu powlekanego krzemionką zgodnie z krokami protokołu 3.2.4-3.2.6.
  2. Badanie oddziaływań molekularnych z zawieszonymi dwuwarstwami lipidowymi przy użyciu PAMPA
    1. Przygotować roztwór badanej cząsteczki. Na przykład przygotować 200 μM DEHP w 1× PBS z dodatkiem 1% (v/v) DMSO.
    2. Przygotować nową płytkę odbiorczą do transportu z 300 μL świeżego 1x PBS na dołek.
    3. Bezpośrednio po kroku 3.3 dla zawieszonej jednorodnej dwuwarstwy lipidowej lub 4.4.3 dla zawieszonej wieloskładnikowej dwuwarstwy lipidowej, usunąć 1× PBS z komory donora w wielośrodowiskowej płytce filtrującej i zastąpić go 200 μL roztworu testowego. Natychmiast zanurzyć płytkę w przygotowanej w kroku 6.2.2 płytce odbiorczej do transportu.
    4. Inkubować przy łagodnym kołysaniu przez pożądany czas (np. 2 h) w temperaturze 25 °C.
    5. Po inkubacji pobrać 150 μL roztworu z komór donora i akceptora. Zmierzyć stężenie cząsteczki w obu próbkach, stosując odpowiednią metodę dostosowaną do właściwości danej cząsteczki.
      1. Na przykład użyć spektrofotometru do mikropłytek z odpowiednią długością fali absorbancji, np. 280 nm dla DEHP, i porównać wynik z krzywą wzorcową badanej cząsteczki.
    6. Obliczyć pozorną przepuszczalność (Papp) badanej cząsteczki, korzystając z następujących równań:
      Wzór na obliczenie LogP, przedstawiający analizę stężenia związku i współczynnik podziału. (1)
      Gdzie Równanie transportu, \(C = \frac{V_D \cdot V_A}{(V_D + V_A)A \cdot t}\), wzór matematyczny. (2)
      UWAGA: [test compound]acceptor to stężenie badanej cząsteczki (np. DEHP) w czasie t w komorze akceptora, a [test compound]initial to początkowe stężenie cząsteczki. A to powierzchnia membrany, t to czas, VD to objętość komory donora, a VA to objętość komory akceptora.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metody tworzenia wspieranych i zawieszonych dwuwarstw lipidowych (Rycina 1). Pierwszym krokiem w tworzeniu wspieranej dwuwarstwy lipidowej jest opracowanie pęcherzyków lipidowych. Mini ekstruder umożliwia przygotowanie małych objętości pęcherzyków lipidowych (1 mL lub mniej), natomiast duży ekstruder pozwala na przygotowanie od 5-50 mL pęcherzyków lipidowych w jednej partii. Rozkłady rozmiarów pęcherzyków jednopowłokowych utworzonych za pomocą mini lub ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten pozwala na tworzenie pęcherzyków lipidowych, podpartych dwuwarstw lipidowych i zawieszonych dwuwarstw lipidowych. Tutaj przedstawiono krytyczne kroki tworzące każdą z tych struktur. Podczas tworzenia pęcherzyków lipidowych ważne jest, aby wytłaczać lipid powyżej temperatury przejścia39. Gdy lipid jest poniżej temperatury przejścia, jest fizycznie obecny w uporządkowanej fazieżelu 39. W tej uporządkowanej fazie ogony lipidowe węglowodorów są w pełni rozciągnięte...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów ani konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ten materiał jest oparty na pracy wspieranej przez National Science Foundation w ramach grantu nr 1942418 przyznanego A.S., oraz National Science Foundation Graduate Research Fellowship przyznanego C.M.B.H., w ramach grantu nr 1644760. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation. Autorzy dziękują dr Noelowi Vera-Gonzálezowi za zebranie danych charakterystyki pęcherzyków lipidowych. Autorzy dziękują profesorowi Robertowi Painowi (Brown University) za użycie jego Zetasizera. Autorzy dziękują Ośrodkowi Spektrometrii Mas Uniwersytetu Browna, a w szczególności dr Tun-Li Shenowi za pomoc w ilościowym określeniu składu lipidów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina  (POPC, 16:0-18:1 PC)Avanti Polar Lipids850457
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-phospho-L-seryna (sól sodowa) (POPS, 16:0-18:1 PS)Avanti Polar Lipids840034
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfoetanoloamina (16:0-18:1 PE)Avanti Polar Lipids850757
1,2-dioleoilo-sn-glycero-2-phospho-L-seryna (DOPS, 18:1 PS)Avanti Polar Lipids840035
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC, 18:1 (Δ 9-Cis) PC)Avanti Polar Lipids850375
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DOPE, 18:1 (Δ 9-Cis) PE)Avanti Polar Lipids850725
1,2-distearoilo-sn-glycero-3-etylofosfocholina (sól chlorkowa) (18:0 EPC (sól Cl)))Avanti Polar Lipids890703
3 mL strzykawki Luer-LocBD309657
40 ml fiolka na próbkę, bursztynowa z politetrafluoroetylenem (PTFE)/gumową wkładkąDuran Wheaton KimbleW224605
AcetonitrylSigma-Aldrich271004
AlconoxFisher Scientific50-821-781
Mrówczan amonuMillipore SigmaLSAC70221
C18, kolumna 3,5 um x 50 mm, SunFireWaters 
ChloroformMillipore SigmaLSAC288306
Kuweta UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPKSarstedt67.758.001
Ftalan di(2-etyloheksylu) (DEHP)Millipore Sigma36735
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Milipore SigmaLSAC472301
EtanolPharmco111000200
Wsporniki filtrów, 10 mmAvanti Polar Lipids610014Rozmiar do mini ekstrudera
Składana kapilarna komórka zetaMalvern PanalyticalDTS1070
IsopropanolSigma-Aldrich190764-4L
KimwipesKimberly Clark34256
L-&alfa;-fosfatydyloinozytol (soja) (soja PI)Avanti Polar Lipids
L-&alfa;-fosfitydylocholina (jaja, kurczak)Avanti Polar Lipids840051
LiposoFast ® LF-50Avestin, Inc.
MetanolSigma-Aldrich179337 -
z uchwytem/blokiem grzewczymAvanti Polar Lipids610000
MultiScreen-IP Płyta filtracyjna, 0,45  &mikro; m, przezroczysty, sterylnyMillipore SigmaMAIPS4510do badań PAMPA
Gazowy azot, ultraczystyTechAirNI T5.0
Hydrofilowe membrany nuklepowe, poliwęglan, 19 mm, 0,1 umWhatman800309Rozmiar do mini wytłaczarki
Hydrofilowe membrany nukleporowe, poliwęglan, 25 mm, 0,1 umWhatman110605Rozmiar do dużego wytłaczarki
ParafilmBemisPM999
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS), 10xGenesee Scienfitic25-507XRozcieńczony do 1x
oprogramowanie Qsoft 401Biolin Scientific
Mikrowaga kwarcowa z dysprosacją Analizator Q-SenseBiolin Scientific
, fiolki ze szkła borokrzemianowego, 20 mlDuran Wheaton Kimble986561
Dwutlenek krzemu, cienki QSensorsBiolin ScientificQSX 303
Chlorek sodu (NaCl)Millipore SigmaLSACS5886
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Fisher ScientificBP166-100
Bezpieczny rozpuszczalnik Końcówki do pipetSigma-AldrichS8064
Sfingomielina (jaja, kurczak)Avanti Polar Lipids
Baza TrizmaMillipore SigmaLSACT1503
Kwas trypsynowo-etylenodiaminooctowyKesons LabsTRL01-6X100ML
Tarcza spustowa Whatman, 25 mmWhatman230600Rozmiar do dużej wytłaczarki
Zetasizer ZS90Malvern Panalytical
Oprogramowanie Zetasizer 7.01Malvern Panalytical
186002551840044 Zestaw mini-ekstrudera 4L Fiolki scyntylacyjne 860061

Bibliografia

  1. Lucio, M., Lima, J. L. F. C., Reis, S. Drug-Membrane Interactions: Significance for Medicinal Chemistry. Current Medicinal Chemistry. 17 (17), 1795-1809 (2010).
  2. Mayne, C. G., et al. The cellular membrane as a mediator for small molecule interaction with membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1858 (10), 2290-2304 (2016).
  3. Bunea, A. I., Harloff-Helleberg, S., Taboryski, R., Nielsen, H. M. Membrane interactions in drug delivery: Model cell membranes and orthogonal techniques. Advances in Colloid and Interface Science. 281, 102177(2020).
  4. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: Applications in drug discovery and drug delivery. Molecular Pharmaceutics. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  5. Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of Lipid Vesicle Deposition on Solid Surfaces: A Combined QCM-D and AFM Study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
  6. Lind, T. K., Cárdenas, M., Wacklin, H. P. Formation of supported lipid bilayers by vesicle fusion: Effect of deposition temperature. Langmuir. 30 (25), 7259-7263 (2014).
  7. Mingeot-Leclercq, M. -P., Deleu, M., Brasseur, R., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy of supported lipid bilayers. Nature protocols. 3 (10), 1654-1659 (2008).
  8. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  9. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  10. Edvardsson, M., Svedhem, S., Wang, G., Richter, R., Rodahl, M., Kasemo, B. QCM-D and reflectometry instrument: applications to supported lipid structures and their biomolecular interactions. Analytical chemistry. 81 (1), 349-361 (2009).
  11. Rodahl, M., et al. Simultaneous frequency and dissipation factor QCM measurements of biomolecular adsorption and cell adhesion. Faraday Discussions. 107, 229-246 (1997).
  12. Keller, C. A., Glasmästar, K., Zhdanov, V. P., Kasemo, B. Formation of Supported Membranes from Vesicles. Physical Review Letters. 84 (23), 5443-5446 (2000).
  13. Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical journal. 75 (3), 1397-1402 (1998).
  14. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature protocols. 5 (6), 1096-1106 (2010).
  15. Bailey, C. M., Tripathi, A., Shukla, A. Effects of Flow and Bulk Vesicle Concentration on Supported Lipid Bilayer Formation. Langmuir. 33 (43), 11986-11997 (2017).
  16. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature reviews. Molecular cell biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  17. Rossi, C., Chopineau, J. Biomimetic tethered lipid membranes designed for membrane-protein interaction studies. European Biophysics Journal. 36 (8), 955-965 (2007).
  18. Hatty, C. R., et al. Investigating the interactions of the 18 kDa translocator protein and its ligand PK11195 in planar lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (3), 1019-1030 (2014).
  19. Min, Y., Kristiansen, K., Boggs, J. M., Husted, C., Zasadzinski, J. a, Israelachvili, J. Interaction forces and adhesion of supported myelin lipid bilayers modulated by myelin basic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3154-3159 (2009).
  20. Heath, G. R., et al. Layer-by-layer assembly of supported lipid bilayer poly-l-lysine multilayers. Biomacromolecules. 17 (1), 324-335 (2016).
  21. Alberts, B., Lewis, J. The Lipid Bilayer. Molecular Biology of the Cell. , 6-11 (2013).
  22. Cho, N. J., Wang, G., Edvardsson, M., Glenn, J. S., Hook, F., Frank, C. W. Alpha-helical peptide-induced vesicle rupture revealing new insight into the vesicle fusion process as monitored in situ by quartz crystal microbalance-dissipation and reflectometry. Analytical Chemistry. 81 (12), 4752-4761 (2009).
  23. Hardy, G. J., Nayak, R., Munir Alam, S., Shapter, J. G., Heinrich, F., Zauscher, S. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by α-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22 (37), 19506-19513 (2012).
  24. Bailey-Hytholt, C. M., Shen, T. L., Nie, B., Tripathi, A., Shukla, A. Placental Trophoblast-Inspired Lipid Bilayers for Cell-Free Investigation of Molecular Interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (28), 31099-31111 (2020).
  25. Domenech, O., Francius, G., Tulkens, P. M., Van Bambeke, F., Dufrêne, Y., Mingeot-Leclercq, M. -P. Interactions of oritavancin, a new lipoglycopeptide derived from vancomycin, with phospholipid bilayers: Effect on membrane permeability and nanoscale lipid membrane organization. Biochimica et biophysica acta. 1788 (9), 1832-1840 (2009).
  26. Bailey, C. M., Kamaloo, E., Waterman, K. L., Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. a Size dependence of gold nanoparticle interactions with a supported lipid bilayer: A QCM-D study. Biophysical Chemistry. 203-204, 51-61 (2015).
  27. Bailey-Hytholt, C. M., Puranik, T., Tripathi, A., Shukla, A. Investigating interactions of phthalate environmental toxicants with lipid structures. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 190, 110923(2020).
  28. Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Antimicrobial peptide alamethicin insertion into lipid bilayer: a QCM-D exploration. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 116, 472-481 (2014).
  29. Lozeau, L. D., Rolle, M. W., Camesano, T. A. A QCM-D study of the concentration- and time-dependent interactions of human LL37 with model mammalian lipid bilayers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167 (1), 229-238 (2018).
  30. Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
  31. Ren, X., et al. Design, fabrication, and characterization of archaeal tetraether free-standing planar membranes in a PDMS-and PCB-based fluidic platform. ACS Applied Materials & Interfaces. 6 (15), 12618-12628 (2014).
  32. Seo, P. R., Teksin, Z. S., Kao, J. P. Y., Polli, J. E. Lipid composition effect on permeability across PAMPA. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 29 (3-4), 259-268 (2006).
  33. Avdeef, A. The rise of PAMPA. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 1 (2), 325-342 (2005).
  34. Avdeef, A., Artursson, P., Neuhoff, S., Lazorova, L., Gråsjö, J., Tavelin, S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA method. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 24 (4), 333-349 (2005).
  35. Campbell, S. D., Regina, K. J., Kharasch, E. D. Significance of Lipid Composition in a Blood-Brain Barrier-Mimetic PAMPA Assay. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 437-444 (2014).
  36. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  37. Schmidt, D., Lynch, J. Evaluation of the reproducibility of Parallel Artificial Membrane Permation Assays (PAMPA). EMD Millipore Corporation. , (2020).
  38. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  39. Nayar, R., Hope, M. J., Cullis, P. R. Generation of large unilamellar vesicles from long-chain saturated phosphatidylcholines by extrusion technique. BBA - Biomembranes. 986 (2), 200-206 (1989).
  40. Lind, T. K., Skida, M. W. A., Cárdenas, M. Formation and Characterization of Supported Lipid Bilayers Composed of Phosphatidylethanolamine and Phosphatidylglycerol by Vesicle Fusion, a Simple but Relevant Model for Bacterial Membranes. ACS Omega. 4 (6), 10687-10694 (2019).
  41. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  42. Bermejo, M., et al. PAMPA-a drug absorption in vitro model: 7. Comparing rat in situ, Caco-2, and PAMPA permeability of fluoroquinolones. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (4), 429-441 (2004).
  43. Kerns, E. H., Di, L., Petusky, S., Farris, M., Ley, R., Jupp, P. Application of parallel artificial membrane permeability assay and Caco-2 permeability. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (6), 1440-1453 (2004).
  44. Masungi, C., et al. Parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) combined with a 10-day multiscreen Caco-2 cell culture as a tool for assessing new drug candidates. Pharmazie. 63 (3), 194-199 (2008).
  45. Vera-González, N., et al. Anidulafungin liposome nanoparticles exhibit antifungal activity against planktonic and biofilm Candida albicans. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (11), 2263-2276 (2020).
  46. Barenholz, Y., Gibbes, D., Litman, B. J., Goll, J., Thompson, T. E., Carlson, F. D. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (1), 2806-2810 (1977).
  47. El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1798 (4), 750-765 (2010).
  48. Tawa, K., Morigaki, K. Substrate-supported phospholipid membranes studied by surface plasmon resonance and surface plasmon fluorescence spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (4), 2750-2758 (2005).
  49. Koenig, B. W., et al. Neutron Reflectivity and Atomic Force Microscopy Studies of a Lipid Bilayer in Water Adsorbed to the Surface of a Silicon Single Crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  50. Lind, T. K., Cárdenas, M. Understanding the formation of supported lipid bilayers via vesicle fusion-A case that exemplifies the need for the complementary method approach (Review). Biointerphases. 11 (2), 020801(2016).
  51. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  52. Isaksson, S., et al. Protein-Containing Lipid Bilayers Intercalated with Size-Matched Mesoporous Silica Thin Films. Nano Letters. 17 (1), 476-485 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wsparta dwuwarstwa lipidowamodele b on kom rkowychwytwarzanie p cherzyk w lipidowychhydratacja cienkiej warstwydynamiczne rozpraszanie wiat amikrowaga kwarcowar wnoleg a b ona sztuczna

Powiązane artykuły