Model apoptozy neuronalnej indukowany kompresją rdzenia kręgowego u szczura

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół generowania modelu ucisku rdzenia kręgowego szczura, oceny jego wyniku behawioralnego i obserwacji uciskanego obszaru rdzenia kręgowego. Oceny behawioralne wykazały zmniejszoną niepełnosprawność ruchową monitora. Barwienie hematoksyliną i eozyną oraz barwienie immunologiczne ujawniły znaczną apoptozę neuronów w ściśniętym obszarze rdzenia kręgowego.

Streszczenie

Jako ciężka postępująca choroba zwyrodnieniowa, mielopatia kręgowa szyjki macicy (CSM) ma złe rokowanie i wiąże się z bólem fizycznym, sztywnością, dysfunkcją motoryczną lub czuciową oraz wysokim ryzykiem uszkodzenia rdzenia kręgowego i akroparaliżu. Dlatego pilnie potrzebne są strategie terapeutyczne, które sprzyjają skutecznej regeneracji rdzenia kręgowego w tej przewlekłej i postępującej chorobie. Skuteczne i powtarzalne modele ucisku rdzenia kręgowego u zwierząt są niezbędne do zrozumienia złożonego mechanizmu biologicznego leżącego u podstaw CSM. Większość modeli urazów rdzenia kręgowego odzwierciedla ostre i strukturalne stany destrukcyjne, podczas gdy modele zwierzęce CSM prezentują przewlekły ucisk w rdzeniu kręgowym. W artykule przedstawiono protokół generowania modelu kompresji rdzenia kręgowego u szczura, który został następnie oceniony poprzez ocenę wyniku behawioralnego i obserwację ściśniętego obszaru rdzenia kręgowego. Oceny behawioralne wykazały zmniejszoną niepełnosprawność motoryczną, w tym ruchy stawów, zdolność do chodzenia, koordynację, stabilność tułowia i siłę mięśni kończyn. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz barwienie immunologiczne ujawniły znaczną apoptozę neuronów w ściśniętym obszarze rdzenia kręgowego.

Wprowadzenie

Jako powszechna postępująca choroba zwyrodnieniowa, CSM stanowi 5-10% wszystkich spondyloz szyjnych¹. Jeśli pacjenci cierpiący na CSM ignorują objawy i nie leczą ich w odpowiednim czasie i skutecznie, może to prowadzić do poważnych powikłań, takich jak uraz rdzenia kręgowego i paraliż kończyn, które pogarszają się wraz z wiekiem, stanowiąc znaczne obciążenie ekonomiczne i psychiczne dla pacjentów i ich rodzin^2,3. Patogeneza CSM jest złożona, obejmuje czynniki statyczne i dynamiczne, teorię niedotlenienia i niedokrwienia, uszkodzenie komórek śródbłonka, teorię niszczenia bariery rdzenia kręgowego krwi oraz teorię zapalenia i apoptozy^4,5,6,7.

Statyczne i dynamiczne mechanizmy ucisku na rdzeń kręgowy powodują objawy kliniczne. Wystające krążki kręgowe, zdeformowane trzony kręgów i zwapniałe więzadła mogą powodować przedłużony ucisk rdzenia kręgowego, co stopniowo wpłynie na barierę krew-rdzeń kręgowy i miejscowe mikrokrążenie w rdzeniu kręgowym^4,8. Z kolei niedokrwienie, stan zapalny i apoptoza wpływają na neurony, aksony i komórki glejowe^6,9.

Eksperymentalne modele zwierzęce uszkodzenia rdzenia kręgowego obejmują uraz stłuczny, uraz kompresyjny, uraz trakcyjny, uraz wywołany fotochemicznie oraz uraz niedokrwienno-reperfuzyjny. Większość z tych modeli odzwierciedla również niektóre ostre i strukturalne stany destrukcyjne (przekrój lub toksyczność chemiczna). Jednak te zwierzęce modele CSM nie mogą przedstawiać postępującej apoptozy neuronalnej w rdzeniu kręgowym.

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół generowania modelu ucisku rdzenia kręgowego u szczura, który został następnie oceniony poprzez ocenę wyniku behawioralnego i obserwację ściśniętego obszaru rdzenia kręgowego. Ten model ucisku rdzenia kręgowego u szczura jest wiarygodnym modelem zwierzęcym do dalszych badań nad mechanizmami zaangażowanymi w CSM.

Protokół

Poniższa procedura została wykonana za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC), Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju. Wszystkie operacje przeżycia zostały przeprowadzone w sterylnych warunkach, zgodnie z wytycznymi NIH. Ból i ryzyko infekcji były kontrolowane za pomocą odpowiednich leków przeciwbólowych i antybiotyków, aby zapewnić pomyślny wynik. Ta procedura chirurgiczna jest zoptymalizowana dla niekrewniaczych samców szczurów rasy Sprague-Dawley (SD) w wieku 12 tygodni i wadze 400 g.

1. Preparat hydrożelu PVA-poliakryloamidowego

UWAGA: Jak pokazano w Rysunek 1G, 1H, hydrożel poliakrylamidowy PVA jest arkuszem polimeru absorbującym wodę. W stanie naturalnym żel jest niezwykle trudny do pokrojenia na małe kawałki. Preparat jest opisany w następujący sposób.

1. Umieść hydrożel poliakryloamidowy PVA w wodzie na 24 godziny, aby ułatwić cięcie po uwodnieniu.
2. Użyj samodzielnie wykonanego narzędzia tnącego (Rysunek 1H), aby podzielić cały hydrożel na kawałki o wymiarach 2 mm x 2 mm x 2 mm.
3. Przenieść te kawałki hydrożelu do pieca w temperaturze 60 °C na 12 godzin w celu odwodnienia na małe kawałki o wymiarach 1 mm x 1 mm x 1 mm jako materiały do implantacji.

2. Znieczulenie i przygotowanie

UWAGA: Upewnij się, że nosisz czepek chirurgiczny, jednorazowe maski medyczne i sterylne rękawiczki chirurgiczne podczas całego sterylnego procesu chirurgicznego.

1. Umieść szczura na poduszce grzewczej i upewnij się, że temperatura w odbycie jest utrzymywana na poziomie 37±1 °C podczas znieczulenia.
2. Umieść szczura w komorze anestezjologicznej wypełnionej 3% izofluranem na 3 minuty.
3. Delikatnie uszczypnij kończyny i palce u nóg szczura pęsetą, aby sprawdzić, czy nie ma utraty reakcji na odstawienie, co wskazuje na udane znieczulenie.
4. Zamocuj szczura na stole operacyjnym w pozycji leżącej, upewniając się, że kończyny i głowa szczura są mocno zamocowane.
5. Przymocuj maskę anestezjologiczną do twarzy szczura. Podawaj 2% izofluranu w mieszaninie tlenu i powietrza za pomocą standardowej maski na nos dla szczurów, aby znieczulić szczura podczas operacji ucisku kręgosłupa.
6. Umieść cylindryczną gazikę (o wymiarach około 30 mm x 20 mm x 60 mm) między szczurem a stołem operacyjnym (Rysunek 1A), aby zapewnić drożność dróg oddechowych i całkowicie odsłonięte pole operacyjne podczas całej operacji.
7. Ogol włosy wokół chirurgicznego obszaru szyi szczura za pomocą golarki elektrycznej.
8. Nałóż krem do depilacji, aby usunąć pozostałe włoski i odsłonić skórę.
9. Zdezynfekuj obszar operacyjny jodoforem.
10. Przykryj zdezynfekowany obszar sterylnym ręcznikiem z otworem odsłaniającym tylko obszar chirurgiczny po grzbietowej stronie szyi szczura.

3. Podejście chirurgiczne

1. Wykonaj podłużne nacięcie w grzbietowej linii środkowej za pomocą skalpela od drugiego wyrostka kolczystego szyjki macicy do drugiego wyrostka kolczystego piersiowego, po przezskórnym ustawieniu drugiego wyrostka kolczystego szyjki macicy i drugiego wyrostka kolczystego piersiowego.
2. Tępo oddziel mięśnie po obu stronach za pomocą kleszczy hemostatycznych, aby odsłonić blaszkę C2-T2 po przecięciu tkanki podskórnej i powięzi warstwa po warstwie.
3. Wywierć otwór (1 mm x 1 mm) w laminarnym odcinku szyjnym (ryc. 1B).
   UWAGA: Aby uniknąć nadmiernego uszkodzenia rdzenia kręgowego, upewnij się, że szyja szczura jest utrzymywana w stanie łuku grzbietowego, pozostawiając wystarczającą przestrzeń między blaszkami szyjnymi.
4. Za pomocą kleszczy mikrochirurgicznych chwycić kawałek hydrożelu poliakryloamidowego PVA o wymiarach 1 mm x 1 mm x 1 mm i włożyć go do wcześniej wywierconego otworu (Rysunek 1C, 1D).
   UWAGA: Przejściowe drganie wskazuje, że model kompresji rdzenia kręgowego został pomyślnie ustalony
.
5. Zszyj tkanki mięśniowe, powięziowe, podskórne i skórne, warstwa po warstwie, za pomocą trójkątnych igieł i szwu 5-0.
6. Po dezynfekcji przenieś zwierzęta z powrotem do klatki i utrzymuj je w cieple.
7. Podskórnie wstrzykiwać analgezję chlorowodorku buprenorfiny (0,03 mg/kg) co 6 godzin przez 3 dni po zabiegu i w razie potrzeby po zabiegu.

4. Postępowanie pooperacyjne

1. Wstrzyknij szczurom równowartość 100 000 jednostek penicyliny dootrzewnowo raz dziennie, aby zapobiec infekcji pooperacyjnej i złagodzić ból.
2. Przenieś szczury do nowych klatek, które były stale ogrzewane lampą na podczerwień, aby zapewnić odpowiednie zachowanie ciepła po operacji.
   UWAGA: Wyjmij lampę grzewczą po przywróceniu przytomności szczura
3. Utrzymuj higienę i wentylację klatki do karmienia szczura.
4. Pomagaj szczurom w jedzeniu i piciu dwa razy dziennie. W razie potrzeby wykonaj masaż pęcherza, aby pomóc w oddawaniu moczu, aż do przywrócenia funkcji oddawania moczu.

5. Ocena zachowania

1. Użyj skali oceny Basso, Beattie i Bresnahan (BBB), aby ocenić zachowanie pooperacyjne.
   UWAGA: Skala oceny BBB jest złotym standardem (Tabela 1) używanym do oceny funkcji związanych z rdzeniem kręgowym u szczurów. Ocenia ruchy szczurów według wyników od 0 (nie zaobserwowano ruchu kończyn tylnych) do 21 (koordynacja chodu, spójność przestrzeni między palcami, równoległe położenie głównych pazurów w całej postawie, stała stabilność tułowia i konsekwentne uniesienie ogona).

6. Test siły chwytu

1. Użyj elektronicznego miernika siły chwytu, aby zmierzyć siłę chwytu.
2. Chwyć dolną połowę szczura, aby zawiesić szczura i pozwól mu chwycić metalowy pręt miernika z przednim uchwytem.
3. Kiedy szczur chwyci metalowy pręt, odciągnij go i zapisz siłę chwytu.
4. Zmierz siłę chwytu trzy razy dla każdego szczura i zapisz najwyższy wynik.

7. Test pochylonej płyty

1. Umieść szczura na gumowej płycie o regulowanym kącie.
2. Stopniowo zwiększaj kąt nachylonej płytki o 5° za każdym razem, aż szczur zdoła utrzymać równowagę i stać stabilnie przez 5 sekund.
3. Zapisz maksymalny kąt, pod jakim szczur może utrzymać równowagę na pochyłej płycie.
4. Zmierz maksymalny kąt trzy razy dla każdego szczura i zapisz najwyższy wynik.

8. Eutanazja, separacja rdzenia kręgowego i zamrożone osadzanie

UWAGA: Upewnij się, że noszone są odpowiednie okulary ochronne i osłona twarzy/maska, aby chronić oczy, twarz i drogi oddechowe przed paraformaldehydem i gazem formaldehydowym.

1. Wstrzyknąć dootrzewnowo ekwiwalent 10% hydratu chloralu w celu znieczulenia szczurów przed otwarciem mostka w celu odsłonięcia serca.
2. Włóż igłę perfuzyjną do wierzchołka serca, przymocuj ją kleszczami hemostatycznymi i powoli wlewaj zwykłą sól fizjologiczną.
3. Wywierć otwór w prawym uszku przedsionka, aż czysta, normalna sól fizjologiczna wypłynie z prawego przedsionka, wskazując na udaną infuzję.
4. Zatrzymaj normalną perfuzję soli fizjologicznej po tym, jak wątroba zmieni kolor na biały.
5. Nasycaj ekwiwalentem 10% paraformaldehydu, aż ciało szczura stanie się sztywne.
6. Po perfuzji paraformaldehydu usuń skórę, mięśnie i tkanki miękkie wokół kręgosłupa; oddziel segment C2-C7 kręgosłupa szyjnego i zanurz go w 10% paraformaldehydzie w celu utrwalenia przez noc.
7. Oddziel rdzeń kręgowy szyjny od kręgosłupa i umieść go w gradiencie stężeń 10%, 20% i 30% roztworów sacharozy w celu stopniowego odwodnienia.
8. Przenieść ściśnięty rdzeń kręgowy o wysokości 2 mm wraz ze środkiem do zatapiania OCT do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
9. Po podziale na plastry o grubości 7 μm i barwieniu (barwienie H&E i znakowanie końcówek naciętych dUTP (TUNEL)/jądra neuronalne (NeuN), patrz punkt 9), należy obserwować odpowiednio histopatologię rdzenia kręgowego i apoptozę neuronów.

9. Barwienie immunologiczne TUNEL/NeuN

1. Zanurzyć odcinki rdzenia kręgowego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zablokować roztworem PBS zawierającym 0,3% Triton X-100 i 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na 1 godzinę.
2. Inkubować odcinki rdzenia kręgowego z króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-NeuN (rozcieńczonym w stosunku 1:200;) przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Przepłukać odcinki rdzenia kręgowego trzy razy w PBS. Następnie inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z Alexa Fluor 594 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Wykonaj jednoetapowy zestaw do oznaczania apoptozy TUNEL (zielona fluorescencja), aby zabarwić jądra apoptotyczne odcinków rdzenia kręgowego.

Wyniki

Uciskowy uraz rdzenia kręgowego może prowadzić do dysfunkcji nerwowo-mięśniowej kończyn
W miarę stopniowego pęcznienia fragmentu hydrożelu, rdzeń kręgowy jest poddawany stałemu uciskowi przez dłuższy czas, co symuluje dysfunkcje kończyn przednich wywołane chorobami szyjnego odcinka rdzenia kręgowego^8,10. W obecnym modelu u większości szczurów (9/10) z grupy modelowej zaobserwowano znaczne przykurcze przedniej łapy po stronie ipsilateralnej (<...

Dyskusja

Celem tego zabiegu chirurgicznego było wygenerowanie powtarzalnej, przedłużonej apoptozy neuronalnej w rdzeniu kręgowym szczura. Kluczową zaletą tego modelu jest to, że rozszerzalne implanty hydrożelowe zapewniają przedłużony ucisk na rdzeń kręgowy, prowadząc w ten sposób do postępującej neuronalnej odpowiedzi apoptotycznej (ryc. 2C), co jest zgodne z patologicznym procesem CSM. W obecnym badaniu śmiertelność z powodu urazu rdzenia kręgowego była niezwykle niska (~2 na 50), podczas gdy powta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Maść z antybiotykiem			Zapobiegaj zakażeniu rany
Buprenorfina-SR			Środek przeciwbólowy
Izofluran	Veteasy		Znieczulenie
		do znieczulenia wziewnego	Znieczulenie
Mikro kleszczyki okulistyczne	Sprzęt medyczny Mingren	Długość: 11 cm, Średnica głowy: 0,3 mm	Przytnij mięsień
Kleszcze okulistyczne	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fabryka instrumentów chirurgicznych	JD1050	Przytnij skórę
Nożyczki okulistyczne (10 cm)	Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. Fabryka narzędzi chirurgicznych	Y00030	Nacięcie skóry
SD samce szczurów	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd	SCXK2018-0004	Model zwierzęcy
Sterylne ostrza chirurgiczne (22 #)	Shanghai Pudong Jinhuan Produkty Medyczne Co., Ltd.	35T0707	Nacięcie mięśni Trymer
		dla małych zwierząt	Depilacja
Krem do depilacji Veet	RECKITT BENCKISER (India) Ltd		Depilacja
Nożyce Venus Sprzęt	medyczny Mingren	Długość: 12,5 cm	Nacięcie mięśni

Sprzęt