Method Article

Znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka

DOI:

10.3791/62605

⸱

May 14th, 2021

 ,  , 
1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół immunofluorescencyjnego znakowania zarówno białek wirusa roślinnego, jak i białek wektorów owadów w wyciętych jelitach owadów może być używany do badania interakcji między wirusem a owadami-wektorami, funkcji białek owadów i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transmisji wirusa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość wirusów roślinnych w naturze jest przenoszona z jednej rośliny na drugą przez owady pluskwiaków. Duże zagęszczenie populacji owadów-wektorów, które są bardzo skuteczne w przenoszeniu wirusa, odgrywa kluczową rolę w epidemiach wirusów na polach. Badanie interakcji wirus-owad może pogłębić naszą wiedzę na temat przenoszenia wirusów i epidemii w celu opracowania nowych strategii zwalczania wirusów roślinnych i ich owadów-wektorów. Znakowanie immunofluorescencyjne jest szeroko stosowane do analizy interakcji między patogenami a gospodarzami i jest stosowane w tym przypadku u skoczka białogrzbietego (WBPH, Sogatella furcifera), który skutecznie przenosi wirusa karłowatego czarnego pasma ryżu południowego (SRBSDV, rodzaj Fijivirus, rodzina Reoviridae), w celu zlokalizowania wirionów i białek owadów w komórkach nabłonka jelita środkowego. Za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej badaliśmy cechy morfologiczne komórek nabłonka jelita środkowego, lokalizację komórkową białek owadów oraz kolokalizację wirionów i białka owada. Protokół ten może być wykorzystany do badania aktywności wirusa u owadów, funkcji białek owadów oraz interakcji między wirusem a owadem wektorem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej opisane wirusy roślinne są przenoszone przez owady z rzędu Hemiptera, który obejmuje mszyce, mączliki, skoczki, skoczki i wciornastki1,2. Przeszywająco-ssące aparaty gębowe owadów pluskwiaków przebijają tkankę roślinną w celu odżywiania i wydzielania śliny, jednocześnie skutecznie przenosząc wirusa2. Opisano różne mechanizmy przenoszenia wirusów roślinnych przez owady wektorowe. Należą do nich nietrwałe, półtrwałe i trwałe. Trwały typ to albo niepropagacyjny, albo propagacyjny3,4, ale w przypadku obu tych typów przen....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla owadów niewirusowatych

  1. Zebrać WBPH z pól ryżowych i wyhodować z sadzonkami ryżu w szklanych zlewkach o pojemności 1 litra pokrytych siatką przeciw owadom w inkubatorze w temperaturze 28 °C, przy 16 godzinach światła i 8 godzinach ciemności. Ponieważ SRBSDV nie jest przenoszony przez jaja, nowo wyklute nimfy nie są zjadliwe.
  2. Za pomocą pisaka do szczotek delikatnie zetrzyj owady ze zlewki hodującej owady do nowej zlewki ze świeżymi sadzonkami ryżu co tydzień, aż wyklują się nimfy WBPH. Kontynuuj hodowlę tych wyklutych, niewirusowatych nimf do stadium 2- lub 3-calowego.
    UWAGA: Ostrożnie szczotkować, aby WBPH nie wylatywały ze zlewk....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 ilustruje wszystkie etapy tego protokołu: hodowlę owadów, nabycie wirusa, wycięcie jelita, znakowanie immunofluorescencyjne i wykonanie preparatu.

Wycięte jelita WBPH od dorosłych utrwalono w 4% (m/v) paraformaldehydzie, przesiąknięto 2% (v/v) Triton X-100, a następnie inkubowano z Dylight 633 phalloidin10,18. Skaningowy mikrograf konfokalny w Rysunek 2 pokazuje trzy części w.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych punktów. Po pierwsze, konieczny jest wysoki stosunek owadów zjadliwych w całej populacji. Chociaż minimalny AAP dla SRBSDV przez nimfy WBPH i dorosłe osobniki wynosi 5 min17, owadom należy pozwolić na żerowanie na świeżych roślinach ryżu zakażonych SRBSDV przez 2 dni, aby osiągnąć wydajność pozyskiwania do 80%. Ponieważ wiriony SRBSDV można wykryć w 80% jelit środkowych18, wycięliśmy i oznaczyliśmy zjadli.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31630058 dla X.W. i 31772134 dla W.L.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3% albumina surowicy byka (BSA)CoolaberSL1331Rozcieńczone przeciwciała
Szkło osłonoweSolarbioYA0771-18*18mmDo produkcji szkiełek
Mikroskop preparacyjnyBeitjaXTL-7045B1Do rozwarstwiania owadów
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyZeissZeiss LSM880Obserwuj sygnał fluorescencji
Szkiełka mikroskopoweSolarbioZBP-7105Do produkcji szkiełek
Podłoże montażowe z 4'6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI)AbcamAB104139Etykieta necleus
komórkowy ParaformaldehydSigma158127Do utrwalania tkanek
Falloidyna  InvitrogenA22284Etykieta aktyna epitieli jelita środkowego
Triton X-100Amresco0290C484Do przenikania tkanek
Pęseta (5-SA)AsOne6-7905-40Do preparacji owadów

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
  2. Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immunofluorescent LabelingPlant Virus ProteinsInsect Vector ProteinsHemipteran GutsVirus Insect InteractionConfocal MicroscopyMidgut Epithelial CellsVirus TransmissionProtein ColocalizationGut Dissection

Related Articles