Artykuł metodologiczny

Znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka

DOI:

10.3791/62605

⸱

14 maja 2021

 ,  , 
1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół immunofluorescencyjnego znakowania zarówno białek wirusa roślinnego, jak i białek wektorów owadów w wyciętych jelitach owadów może być używany do badania interakcji między wirusem a owadami-wektorami, funkcji białek owadów i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transmisji wirusa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość wirusów roślinnych w naturze jest przenoszona z jednej rośliny na drugą przez owady pluskwiaków. Duże zagęszczenie populacji owadów-wektorów, które są bardzo skuteczne w przenoszeniu wirusa, odgrywa kluczową rolę w epidemiach wirusów na polach. Badanie interakcji wirus-owad może pogłębić naszą wiedzę na temat przenoszenia wirusów i epidemii w celu opracowania nowych strategii zwalczania wirusów roślinnych i ich owadów-wektorów. Znakowanie immunofluorescencyjne jest szeroko stosowane do analizy interakcji między patogenami a gospodarzami i jest stosowane w tym przypadku u skoczka białogrzbietego (WBPH, Sogatella furcifera), który skutecznie przenosi wirusa karłowatego czarnego pasma ryżu południowego (SRBSDV, rodzaj Fijivirus, rodzina Reoviridae), w celu zlokalizowania wirionów i białek owadów w komórkach nabłonka jelita środkowego. Za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej badaliśmy cechy morfologiczne komórek nabłonka jelita środkowego, lokalizację komórkową białek owadów oraz kolokalizację wirionów i białka owada. Protokół ten może być wykorzystany do badania aktywności wirusa u owadów, funkcji białek owadów oraz interakcji między wirusem a owadem wektorem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najbardziej opisane wirusy roślinne są przenoszone przez owady z rzędu Hemiptera, który obejmuje mszyce, mączliki, skoczki, skoczki i wciornastki1,2. Przeszywająco-ssące aparaty gębowe owadów pluskwiaków przebijają tkankę roślinną w celu odżywiania i wydzielania śliny, jednocześnie skutecznie przenosząc wirusa2. Opisano różne mechanizmy przenoszenia wirusów roślinnych przez owady wektorowe. Należą do nich nietrwałe, półtrwałe i trwałe. Trwały typ to albo niepropagacyjny, albo propagacyjny3,4, ale w przypadku obu tych typów przenoszony wirus musi przemieszczać się po całym ciele owada. W trybie uporczywego rozmnażania wirusy początkowo infekują i replikują się w komórkach nabłonka jelita owada, a następnie rozprzestrzeniają się do różnych tkanek, a ostatecznie do gruczołów ślinowych, skąd mogą być następnie wprowadzane do rośliny przez ślinę podczas żerowania owadów5,6. Uporczywie przenoszone wirusy przemieszczają się przez różne narządy i replikują się w swoich owadach wektorach, co wymaga określonych interakcji między komponentami wirusa i wektora na różnych etapach7,8.

Białka wirusowe i białka owadów muszą ze sobą współdziałać, aby ułatwić krytyczne procesy rozpoznawania, infekcji, replikacji lub rozprzestrzeniania się wirusa u owadów wektorowych9,10. Chociaż mikroskopia optyczna może być używana do obserwacji struktur komórkowych owadów, nie może pokazać rozmieszczenia wirionów, lokalizacji komórkowej lub kolokalizacji białek wirusowych i białek owadów ani ultrastruktury tkanek i komórek owadów. Znakowanie immunofluorescencyjne zostało po raz pierwszy przeprowadzone przez Coonsa i wsp. w komórkach fagocytarnych myszy za pomocą znakowania specyficznych przeciwciał fluoresceinowych, a obecnie jest szeroko stosowane11. Technika immunofluorescencji, znana również jako technika przeciwciał fluorescencyjnych, jest jedną z najwcześniejszych opracowanych technik znakowania immunologicznego i opiera się na specyficznej reakcji wiązania między antygenem a przeciwciałem11,12. Znane przeciwciało jest najpierw znakowane fluoresceiną, która jest używana jako sonda do wykrywania odpowiednich antygenów w komórkach lub tkankach13,14. Po tym, jak przeciwciało znakowane fluoresceiną zwiąże się z odpowiednim antygenem w komórkach lub tkankach, sonda będzie emitować jasną fluorescencję, gdy zostanie naświetlana długościami fal wzbudzenia i oglądana za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu zlokalizowania antygenu15.

Większość owadów wektorowych wirusów roślinnych to pluskwiaki. Większe zagęszczenie populacji owadów-wektorów, które mają wysoką skuteczność transmisji wirusa roślinnego, może prowadzić do epidemii wirusów5. Wirus czarnej karłowatości ryżu południowego (SRBSDV, rodzaj Fijivirus, rodzina Reoviridae), jeden z najpoważniejszych patogenów ryżu, szybko rozprzestrzenił się na obszarach uprawy ryżu w Azji Wschodniej i Południowo-Wschodniej i spowodował poważne straty w plonach od 2010 roku16,17. Dorosłe osobniki i nimfy skoczka białogrzbietego (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) przenoszą SRBSDV na ryż w sposób trwale rozmnażający się z wysoką wydajnością. Badania terenowe wykazały, że ogniska choroby karłowatej z czarnymi smugami ryżu wywołanej przez SRBSDV zwykle zbiegają się z masową migracją WBPH na duże odległości, co jest kluczowym czynnikiem epidemii SRBSDV7,8,18. Białko błonowe 7 związane z pęcherzykami (VAMP7) jest rozpuszczalnym receptorem białka przyłączającego czynnik wrażliwy na N-etylomaleimid (SNARE), który może pośredniczyć w transporcie substancji poprzez fuzję pęcherzyków. VAMP7 oddziałuje z zewnętrznym głównym białkiem kapsydu SRBSDV in vitro, co wskazuje, że VAMP7 może być ściśle związany z transmisją wirusa16.

W przedstawionym tutaj protokole wycięliśmy jelito z wiruliferycznego WBPH jako przykład do oznaczania wirionów SRBSDV i VAMP7 w komórkach nabłonka jelita środkowego16. Jako początkowe miejsce inwazji wirusa, nabłonek jelita środkowego odgrywa istotną rolę w infekcji, replikacji i przenoszeniu wirusa. Po pierwsze, szczegółowo opisaliśmy kroki, które należy wykonać, aby wyciąć jelita od nimf i dorosłych osobników WBPH. Po drugie, użyliśmy specyficznych przeciwciał znakowanych fluoresceiną do znakowania wirionów SRBSDV i VAMP7 w komórkach nabłonka jelitowego. Następnie obserwowaliśmy komórki nabłonkowe i lokalizację komórkową wirionów i VAMP7 za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Wyniki wykazały, że wiriony SRBSDV i VAMP7 mogą kolokalizować się w cytoplazmie komórek nabłonka jelita środkowego, co sugeruje, że specyficzna funkcja VAMP7 może być związana z rozprzestrzenianiem się wirionów z komórek nabłonka jelita środkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla owadów niewirusowatych

  1. Zebrać WBPH z pól ryżowych i wyhodować z sadzonkami ryżu w szklanych zlewkach o pojemności 1 litra pokrytych siatką przeciw owadom w inkubatorze w temperaturze 28 °C, przy 16 godzinach światła i 8 godzinach ciemności. Ponieważ SRBSDV nie jest przenoszony przez jaja, nowo wyklute nimfy nie są zjadliwe.
  2. Za pomocą pisaka do szczotek delikatnie zetrzyj owady ze zlewki hodującej owady do nowej zlewki ze świeżymi sadzonkami ryżu co tydzień, aż wyklują się nimfy WBPH. Kontynuuj hodowlę tych wyklutych, niewirusowatych nimf do stadium 2- lub 3-calowego.
    UWAGA: Ostrożnie szczotkować, aby WBPH nie wylatywały ze zlewki ani nie uszkadzały ich.

2. Pozyskiwanie wirusów i zbieranie wirusowych owadów

  1. Przenieść owady niewirusożerne ze szklanych zlewek na świeże rośliny ryżu zakażone SRBSDV pokryte siatką odporną na owady przez 2-dniowy okres dostępu do nabycia wirusa (AAP) poprzez żerowanie na roślinach. Następnie zbierz owady w szklanych zlewkach zawierających świeże sadzonki ryżu.
  2. Po 2 dniach zebrać owady ze szklanych zlewek za pomocą ręcznego aspiratora w celu wypreparowania i wycięcia jelita.
    UWAGA: Minimalny AAP SRBSDV wynosi 5 minut zarówno dla nimf WBPH, jak i dorosłych, ale owady powinny mieć możliwość żerowania na świeżych roślinach ryżu zakażonych SRBSDV przez 2 dni, aby osiągnąć skuteczność pozyskiwania do 80%.

3. Przygotowanie odczynnika

  1. Rozpuścić 8,5 g NaCl, 3,5 g Na2HPO4·12H2O i 0,25 g NaH2PO4 w 1 ml ddH2O, aby przygotować 0,01 M roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Dodać 4 g paraformaldehydu do 100 ml PBS, aby otrzymać 4% (m/v) paraformaldehydu w PBS.
  3. Dodaj 2 ml Triton X-100 do 98 ml PBS, aby przygotować 2% (v/v) Triton X-100.

4. Sekcja dorosłych i wycięcie wnętrzności

  1. Za pomocą pipety umieścić 100 μl PBS na szkiełku podstawowym (PBS). Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu optycznego.
  2. Zebrać dorosłe osobniki zakażone SRBSDV ze szklanych zlewek za pomocą ręcznego aspiratora i umieścić je w probówkach o pojemności 1,5 ml. Umieść rurki na lodzie, aby sparaliżować owady, a następnie przenieś sparaliżowaną osobę dorosłą do 100 μl PBS na szkiełku z brzuchem do góry.
    UWAGA: Owady zostaną całkowicie sparaliżowane po 5 minutach na lodzie.
  3. Użyj pęsety w jednej ręce, aby zacisnąć ciało, a następnie zdejmij głowę za pomocą innego zestawu pęsety w drugiej ręce.
  4. Zaciśnij boki brzucha jednym zestawem pęsety i zaciśnij pokładełko lub narząd kopulacyjny ogona drugim zestawem. Następnie ostrożnie odciągnij błonę międzysegmentową jednego segmentu brzusznego i powoli odsłaniaj jelito w jamie brzusznej.
  5. Kontynuuj odrywanie błony i stopniowo wyciągaj całe jelito z brzucha. Delikatnie oderwij ogon, który jest połączony z końcem jelita, aby usunąć całe jelito.
    UWAGA: Pociągnij bardzo ostrożnie, w przeciwnym razie jelito zostanie uszkodzone.
  6. Umieść wycięte wnętrzności w probówce wirówkowej o pojemności 200 μl, dodaj 200 μl PBS do probówki i delikatnie odsysaj-uwalniaj roztwór za pomocą pipety, aby dokładnie umyć wnętrzności.

5. Sekcja nimf i wycięcie wnętrzności

UWAGA: Ciała nimf są bardziej kruche niż ciała dorosłych, a jelita łatwo ulegają uszkodzeniu, gdy są ściągane z ogona. Dlatego najbardziej niezawodną metodą wycięcia jelita nimfy jest pociągnięcie od głowy.

  1. Za pomocą pipety umieścić 100 μl PBS na szkiełku podstawowym (PBS). Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu optycznego.
  2. Zebrać nimfy zakażone SRBSDV ze szklanych zlewek za pomocą ręcznego aspiratora i umieścić je w probówkach o pojemności 1,5 ml. Umieść rurki na lodzie, aby sparaliżować owady. Następnie przenieś sparaliżowaną nimfę do 100 μl buforu na szkiełku z brzuchem skierowanym do góry.
  3. Użyj pęsety, aby odczepić ogon nimfy. Następnie zaciśnij ciało owada, aby delikatnie przymocować i użyj drugiego zestawu, aby zacisnąć głowę. Delikatnie odciągnij głowę od ciała, nadal utrzymując jej przyczepienie do jelita, tak aby głowa była odłączona od ciała, ale jelito było nadal przyczepione do klatki piersiowej i brzucha.
    UWAGA: Po oderwaniu głowy ciało adiposum nimfy wypłynie, powodując zmętnienie PBS. Usunąć mętny roztwór PBS i zastąpić go 100 μl świeżego PBS.
  4. Gdy pęseta nadal zaciska ciało, użyj drugiego zestawu, aby ostrożnie przesunąć głowę i stopniowo wyciągaj jelito.
  5. Delikatnie odłącz jelito od głowy za pomocą pęsety i ostatecznie uzyskaj nienaruszone jelito bez uszkadzania ciała skoczka.
  6. Wycięte wnętrzności umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 200 μl, dodać 200 μl PBS do probówki i delikatnie odssać roztwór za pomocą pipety, aby dokładnie umyć wnętrzności.
    UWAGA: Wycięte jelita należy dobrze oczyścić PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczające ciała tłuszczowe z jamy brzusznej; Mogą zakłócać protokół barwienia.

6. Protokoły znakowania wirionów SRBSDV i białka owada

  1. Przygotować przeciwciała i pożywkę montażową używane w tym teście. Przeciwciała to przeciwciało anty-SRBSDV znakowane Dylight 549 (czerwony) przeciwko wirionom SRBSDV 18, przeciwciało anty-VAMP7 znakowane Dylight 488 (zielony) przeciwko białku owadziemu VAMP716,19, Dylight 633 falloidyna (niebieska) i pożywka montażowa zawierająca 4,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI, niebieski).
  2. Świeżo wycięte i umyte PBS wnętrzności WBPH należy natychmiast umieścić w 100 μl 4% (m/v) paraformaldehydu w probówce wirówkowej o pojemności 200 μl i trzymać przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Świeżo wycięte jelita WBPH nie powinny być moczone w PBS przez dłuższy czas, w przeciwnym razie komórki nabłonkowe zostaną uszkodzone.
  3. Usunąć 4% (m/v) paraformaldehydu za pomocą pipetora, a następnie dodać 200 μl PBS do probówki wirówkowej o pojemności 200 μl. Po 10 minutach usunąć PBS za pomocą pipety, aby wyeliminować wszelkie paraformaldehydy.
  4. Powtórz ten krok prania PBS dwukrotnie.
  5. Usuń PBS i dodaj 200 μl niejonowego detergentu Triton X-100 (2%, v/v). Próbki należy przepuszczać w niejonowym detergencie przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć 2% (v/v) Triton X-100 za pomocą pipetora, a następnie zmyć pozostały detergent trzema 10-minutowymi płukaniami z użyciem 200 μl PBS (patrz kroki 6.3 i 6.4).
  7. Rozcieńczone przeciwciało anty-SRBSDV znakowane Dylight 549 (czerwony) i przeciwciało anty-VAMP7 znakowane Dylight 488 (zielony) 1:50 z 50 μl albuminy surowicy byka (3%, m/v).
  8. Dodać rozcieńczone przeciwciała do probówki i inkubować próbki przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Usunąć rozcieńczalnik przeciwciał za pomocą pipetora, a następnie zmyć pozostały rozcieńczalnik przeciwciał trzema 10-minutowymi płukaniami z 200 μl PBS.
  10. Rozcieńczyć 1 μl falloidyny Dylight 633 z 50 μl PBS.
  11. Dodać 50 μl rozcieńczonej falloidyny do probówki i inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  12. Usunąć rozcieńczalnik falloidyny za pomocą pipetora, a następnie zmyć pozostałą falloidynę trzema 10-minutowymi płukaniami 200 μl PBS.
    UWAGA: Dokładne pranie ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia tła i niespecyficznego wiązania.
  13. Umieść kroplę podłoża montażowego zawierającego DAPI na szkiełku mikroskopowym i przenieś wnętrzności do podłoża.
    UWAGA: Delikatnie rozłóż każde jelito pęsetą i unikaj tworzenia bąbelków. Na jednym slajdzie przypada około 15 wnętrzności.
  14. Delikatnie umieść szkło nakrywkowe na próbkach, nie tworząc pęcherzyków.
    UWAGA: Szkiełko należy trzymać w temperaturze 4 °C w ciemności, aby zahamować wygaszanie fluorescencji przed obserwacją za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.
  15. Zobacz wszystkie próbki za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Uchwyć obrazy za pomocą niebieskiego światła i zapisz pliki na komputerze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 ilustruje wszystkie etapy tego protokołu: hodowlę owadów, nabycie wirusa, wycięcie jelita, znakowanie immunofluorescencyjne i wykonanie preparatu.

Wycięte jelita WBPH od dorosłych utrwalono w 4% (m/v) paraformaldehydzie, przesiąknięto 2% (v/v) Triton X-100, a następnie inkubowano z Dylight 633 phalloidin10,18. Skaningowy mikrograf konfokalny w Rysunek 2 pokazuje trzy części w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych punktów. Po pierwsze, konieczny jest wysoki stosunek owadów zjadliwych w całej populacji. Chociaż minimalny AAP dla SRBSDV przez nimfy WBPH i dorosłe osobniki wynosi 5 min17, owadom należy pozwolić na żerowanie na świeżych roślinach ryżu zakażonych SRBSDV przez 2 dni, aby osiągnąć wydajność pozyskiwania do 80%. Ponieważ wiriony SRBSDV można wykryć w 80% jelit środkowych18, wycięliśmy i oznaczyliśmy zjadli...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31630058 dla X.W. i 31772134 dla W.L.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3% albumina surowicy byka (BSA)CoolaberSL1331Rozcieńczone przeciwciała
Szkło osłonoweSolarbioYA0771-18*18mmDo produkcji szkiełek
Mikroskop preparacyjnyBeitjaXTL-7045B1Do rozwarstwiania owadów
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyZeissZeiss LSM880Obserwuj sygnał fluorescencji
Szkiełka mikroskopoweSolarbioZBP-7105Do produkcji szkiełek
Podłoże montażowe z 4'6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI)AbcamAB104139Etykieta necleus
komórkowy ParaformaldehydSigma158127Do utrwalania tkanek
Falloidyna  InvitrogenA22284Etykieta aktyna epitieli jelita środkowego
Triton X-100Amresco0290C484Do przenikania tkanek
Pęseta (5-SA)AsOne6-7905-40Do preparacji owadów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
  2. Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
  3. Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069(2020).
  4. Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
  5. Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  6. Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
  7. Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
  8. Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262(2021).
  9. Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
  10. Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201(2018).
  11. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
  12. Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
  13. Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591(2017).
  14. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909(2018).
  15. Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728(2020).
  16. Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445(2016).
  17. Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
  18. Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
  20. Ammar, E. D. Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. Nault, L. R., Rodriquez, J. G. , Wiley. New York. 1(1985).
  21. Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563(1996).
  22. Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
  23. Kruse, A., et al. Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531(2017).
  24. Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
  25. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bia ka wirus w ro lininterakcje wirus owadmikroskopia konfokalnakom rki nab onka jelita rodkowegotransmisja wirusakolokalizacja bia eksekcja jelita

Powiązane artykuły