Wieloczynnikowa ocena zachowań motorycznych u szczurów po jednostronnym urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego

Podsumowanie

Udostępniamy protokół oceny zachowań motorycznych za pomocą baterii testów behawioralnych u szczurów po urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego.

Streszczenie

Indukcja uszkodzenia nerwów obwodowych jest szeroko stosowaną metodą w neurobiologii, między innymi do oceny mechanizmów naprawczych i bólowych. Ponadto, w dziedzinie badań nad zaburzeniami ruchowymi, uraz kulszowy został wykorzystany do wywołania fenotypu podobnego do dystonii w genetycznie predysponowanych modelach dystonii gryzoni DYT-TOR1A. Aby osiągnąć spójne, powtarzalne i porównywalne wyniki po urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego, oprócz standaryzowanej charakterystyki fenotypowej niezbędna jest znormalizowana metoda wywoływania zmiażdżenia nerwu. Należy zwrócić uwagę nie tylko na konkretny asortyment testów behawioralnych, ale także na wymagania techniczne, prawidłowe wykonanie i ciągłą analizę danych. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak wykonać uraz zmiażdżenia nerwu kulszowego i zapewnia baterię testów behawioralnych do oceny deficytów motorycznych u szczurów, która obejmuje test na otwartym polu, analizę chodu CatWalk XT, zadanie chodzenia po belce i zadanie chodzenia po szczeblach drabiny.

Wprowadzenie

Gryzonie są doskonałymi organizmami modelowymi do pogłębiania wiedzy o chorobach ludzkich^1,2 poprzez testowanie hipotez na wielu poziomach biologicznych. Jednym z podstawowych poziomów biologicznych do charakterystyki modeli gryzoni jest poziom fenotypu, mierzony za pomocą ocen behawioralnych. W zależności od modelu zwierzęcego i pytania naukowego, wybór potężnej i niezawodnej baterii testów behawioralnych jest niezbędny, aby objąć szeroki zakres aspektów behawioralnych, takich jak modele zwierzęce choroby Parkinsona i dystonii^3,4,5,6.

Nerw kulszowy jest największym nerwem w ludzkim ciele z włóknami motorycznymi i czuciowymi. Urazy nerwu kulszowego mogą łatwo wynikać z różnych zdarzeń, takich jak wypadki drogowe i operacje^7,8. W związku z tym działania badawcze z wykorzystaniem modeli gryzoni z uszkodzeniami nerwu kulszowego mają wartość translacyjną. Mimo że translacyjny aspekt regeneracji nerwów od szczura do człowieka musi być traktowany krytycznie⁹, uszkodzenie mięśnia kulszowego (axonotmesis) w modelach gryzoni jest powszechnie stosowaną metodą analizy procesów degeneracji i regeneracji nerwów obwodowych^10,11. W przypadku zmiażdżenia nerw nie jest całkowicie przecięty. Uszkadza akson, powodując blok przewodzenia bezpośrednio po urazie zgniecenia, po którym następują procesy regeneracyjne ^4,12,13.

Ponadto, w badaniach nad dystonią, jednostronne uszkodzenie nerwu kulszowego jest uznaną metodą wywoływania ruchów podobnych do dystonii (DLM) w genetycznie predysponowanych modelach gryzoni z dystonią, które nie pokazują DLM per se4^,14. Zakłada się, że uraz nerwu obwodowego zaburza integrację sensomotoryczną, wpływając na włókna nerwu kulszowego, które są odpowiedzialne za funkcje motoryczne i czuciowe¹⁵.

Przedstawiamy tutaj szczegółowy opis standaryzowanego uszkodzenia nerwu kulszowego oraz zestaw ocen zachowań motorycznych, który składa się z testu otwartego pola (OFT), analizy chodu CatWalk XT, zadania chodzenia po belce i zadania chodzenia po drabinie u naiwnych szczurów typu dzikiego (wt) (n = 8-9) i szczurów wt pięć tygodni po jednostronnym urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego (n = 10). OFT dostarcza informacji o ogólnej aktywności lokomotorycznej, podczas gdy szczegółowa analiza chodu jest osiągana przez zautomatyzowany system analizy chodu CatWalk XT. Zadanie chodzenia na belce służy do oceny koordynacji ruchowej poprzez ocenę czasu przejścia przez belkę i liczby błędów ułożenia stopy. Do analizy wydajności chodu zadanie chodzenia po szczeblach drabiny dostarcza informacji o ułożeniu stopy lub łapy oraz błędach w aparacie na poziomym szczeblu drabiny ze stałym, ale nieregularnym wzorcem szczebli.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalne władze w Regierung von Unterfranken (Würzburg, Niemcy) i przeprowadzone zgodnie z obowiązującymi międzynarodowymi, krajowymi i/lub instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt.

1. Uszkodzenie nerwu kulszowego

UWAGA: Utrzymuj sterylne środowisko podczas całego zabiegu chirurgicznego. Ustaw stół operacyjny z niezbędnym sprzętem.

1. Głęboko znieczulić szczura w zamkniętej komorze izofluranem 3,0% w_O2 (2 l/min). Wyjmij szczura z szafki. Ogol rozległy obszar prawej kończyny tylnej.
2. Umieścić szczura w masce anestezjologicznej i kontynuować głębokie znieczulenie izofluranem 2,0% w_O2 (2 l/min). Kontroluj głębokość znieczulenia, ściskając taśmę międzypalcową tylnych stóp. Brak odruchów odstawienia wskazuje na odpowiednie znieczulenie.
3. Przymocuj tułów i obie tylne kończyny szczura taśmą. Ustaw obie tylne kończyny w symetrycznej i wyciągniętej pozycji, obracając łapę płasko na stole operacyjnym.
4. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec suchości oczu. Zdezynfekuj skórę ogolonego obszaru środkiem antyseptycznym.
5. Poszukaj wcięcia kulszowego kości biodrowej.
6. Wykonaj nacięcie skóry od wcięcia w rwę kulszową w kierunku łapy za pomocą skalpela. Nacięcie skóry powinno być jak najmniejsze (około 1 do 2 cm).
7. Jeśli kończyny tylne są unieruchomione, a nacięcie skóry jest wykonane prawidłowo, można zobaczyć jamę w płaszczyźnie powięziowej między mięśniem pośladkowym wielkim a mięśniem dwugłowym uda, która przypomina "białą linię". Włóż zamknięte bardzo cienkie kleszcze hemostatyczne (nr 5) do jamy i rozłóż kleszcze. Płaszczyzna powięziowa powinna się otworzyć bez uszkadzania tkanki mięśniowej.
8. Umieść zwijacze gumowej opaski pod mięśniami, aby nacięcie skóry było otwarte.
9. Delikatnie usuń otaczające tkanki i naczynia krwionośne z nerwu kulszowego, aż nerw zostanie całkowicie odsłonięty. Ważne jest, aby podczas całego zabiegu nie rozciągać ani nie ciągnąć nerwu.
10. Zmiażdż nerw kulszowy nieząbkowanym zaciskiem (ultra-cienki hemostat) ze stałym i powtarzalnym naciskiem. W tym celu otwórz zacisk, umieść nerw na dolnej szczęce zacisku i zamknij zacisk, blokując go w pierwszej pozycji trzy razy po dziesięć sekund. Pozycja zmiażdżenia nerwu kulszowego znajduje się blisko wcięcia kulszowego, proksymalnie do miejsca podziału głównego pęczka nerwu kulszowego. Po zmiażdżeniu ponownie otwórz zacisk ostrożnie. Miejsce zmiażdżenia nerwu kulszowego wydaje się półprzezroczyste.
11. Zdejmij zwijacze z gumową opaską.
12. Zamknij nacięcie płaszczyzny powięziowej wchłanialnym szwem 4-0. Zamknij nacięcie skóry zszywkami do skóry ciała.
13. Preparat Rimadyl należy stosować zgodnie z wytycznymi GV-SOLAS (5 mg/kg masy ciała, wstrzyknięcie podskórne) w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego co 24 godziny po zabiegu przez dwa dni.
14. Usuń szczura z zestawu chirurgicznego. Umieść szczura w czystej klatce bez ściółki na płycie grzewczej (37 °C), aż szczur się obudzi. Przenieś szczura z powrotem do czystej klatki domowej.
15. Usuń zszywki skóry ciała od czterech do sześciu dni po zabiegu.

2. Test w otwartym polu (OFT)

UWAGA: Aktywność lokomotoryczna, jak również aktywność behawioralna mogą być analizowane przez OFT.

1. Instalacji
   1. Ustaw OFT (Rysunek 1A) w ciemnym i cichym otoczeniu. Składa się z automatycznego systemu śledzenia wideo EthoVision XT (komputer, oprogramowanie z licencją) oraz areny o wymiarach 58,5 cm (długość) x 58,5 cm (szerokość) x 45 cm (wysokość) z odporną na zarysowania, nadającą się do czyszczenia czarną powierzchnią. powierzchnia jest ważna, aby zwiększyć kontrast podczas śledzenia białych zwierząt.
2. ocena
   1. Ustaw arenę i kamerę we właściwej pozycji. Dostosuj kamerę, aby nagrywane było całe otwarte pole o najlepszej rozdzielczości. Przeprowadź eksperyment w ciemnym otoczeniu. Jeśli do konfiguracji potrzebne jest światło, użyj małego i rozproszonego światła, aby uniknąć jasnych plam, odbić i cieni na arenie. Zapewnij równe warunki oświetleniowe, mierząc natężenie oświetlenia za pomocą luksomierza w różnych obszarach areny.
   2. Zainstaluj oprogramowanie EthoVision XT. Najważniejsze ustawienia są wymienione poniżej. W ustawieniach eksperymentu wybierz opcję Śledzenie na żywo dla źródła wideo i wykrywanie punktu środkowego dla śledzonych obiektów. Sprawdź rozmiar areny w ustawieniach areny. Ustaw warunek rozpoczęcia zbierania danych na trzy sekundy po umieszczeniu szczura na środku areny, a całkowity czas trwania na pięć minut w ustawieniach kontroli próbnej. Wybierz opcję Odejmowanie statyczne dla metody w Ustawieniach wykrywania. Zaznacz pole wyboru Zapisz wideo dla metody w Ustawieniach pozyskiwania.
   3. Delikatnie umieść szczura na środku areny testowej (Rysunek 1B).
   4. Naciśnij przycisk Rozpocznij wersję próbną w Kontroli pozyskiwania, aby rozpocząć nagrywanie.
   5. Podczas nagrywania trzymaj się z dala od konfiguracji OFT, aby nie rozpraszać szczura.
   6. Po każdej próbie delikatnie usuń szczura z areny testowej i wyczyść konfigurację 0,1% kwasem octowym, aby uniknąć rozproszenia przez zapach wcześniej zarejestrowanego szczura.
3. analiza danych
   1. Aby przeprowadzić analizę danych OFT za pomocą oprogramowania EthoVision XT, przejdź do sekcji Analiza na pasku po lewej stronie i wybierz Wizualizacja ścieżki w zakładce Wyniki (Rysunek 1C). Następnie wyeksportuj potrzebne parametry do programu Excel. W oprogramowaniu wybierz szereg zmiennych z różnych kategorii do analizy danych. Ważnymi zmiennymi dla tego konkretnego celu naukowego są "Przebyta odległość" i "Prędkość" w kategorii "Odległość i czas". Wykonaj analizę statystyczną wybranych parametrów (Rysunek 1D).

3. Analiza chodu CatWalk XT

UWAGA: Analiza chodu za pomocą systemu CatWalk XT może pomóc ocenić wiele różnych parametrów dotyczących śladów, postawy i chodu modeli zwierzęcych. Szklany chodnik jest oświetlony zielonym światłem, a światło rozproszone przez ślady stóp zwierząt jest rejestrowane za pomocą szybkiej kamery wideo, która znajduje się pod chodnikiem. Sygnały mogą być analizowane za pomocą oprogramowania CatWalk XT.

1. Instalacji
   1. Do analizy chodu za pomocą CatWalk XT użyj systemu CatWalk i odpowiedniego oprogramowania (komputer, oprogramowanie z licencją) (Rysunek 2A).
   2. Eksperyment należy przeprowadzić w ciemnych warunkach, ponieważ akwizycja danych zależy od oświetlenia chodnika systemu CatWalk zielonym światłem LED. Aby ułatwić procedurę eksperymentalną w ciemnych warunkach, oświetl pomieszczenie eksperymentalne czerwonym światłem.
   3. Użyj zdefiniowanego chodnika, który mierzy 65 cm długości i 7 cm szerokości, jednak rozmiar chodnika zależy od wielkości szczurów. Ustaw chodnik tak duży, jak to możliwe, aby zarejestrować jak najwięcej odcisków stóp dla każdej łapy.
   4. Uchwyć co najmniej trzy ślady stóp na łapę dla każdego biegu. Określając długość chodnika, należy wziąć pod uwagę ciało i ogon szczura, ponieważ sygnał startu lub końca może nie zostać prawidłowo wykryty, a biegi mogą nie zostać sklasyfikowane jako zgodne, jeśli ciało/ogon wejdzie lub pozostanie na zdefiniowanym chodniku przed lub po zakończeniu biegu.
2. Szkolenie
   UWAGA: Szkolenie szczurów do systemu CatWalk jest konieczne, aby przyzwyczaić zwierzęta do konfiguracji i umożliwić im naukę przechodzenia przez chodnik bez żadnych zakłóceń. Właściwe szkolenie zapewnia korzyści w postaci oszczędności czasu podczas oceny eksperymentalnej i uzyskania lepszych wyników. Rozpoczęcie zbierania danych przez system CatWalk podczas sesji treningowych pozwala szczurom przyzwyczaić się do warunków oceny (hałas/światło).
   1. Rozpocznij konfigurację systemu CatWalk.
      1. Wyczyść szklany chodnik wodą destylowaną i niestrzępiącą się miękką szmatką. Na początku i na końcu eksperymentu lub pomiędzy, jeśli szklany chodnik jest brudny, użyj płynu do czyszczenia szkła i niestrzępiącej się miękkiej szmatki do czyszczenia szklanego chodnika. Po użyciu płynu do czyszczenia szkła należy oczyścić chodnik z wszelkich pozostałości płynu, aby nie rozpraszał on zwierzęcia.
      2. Wybierz ustawienia eksperymentalne. Ważnym parametrem są kryteria uruchamiania. Ustaw odpowiednie wartości w polach Minimalny czas trwania przebiegu, Maksymalny czas trwania przebiegu i Minimalna liczba zgodnych przebiegów do uzyskania, które są specyficzne dla każdego projektu badawczego. Zaznacz pole wyboru Użyj maksymalnej dozwolonej zmiany prędkości i ustaw wartość. Kryteria uruchamiania można zignorować przez pierwsze cztery do pięciu dni trenowania.
      3. Ustaw aparat w odpowiedniej pozycji i wyreguluj ostrość. Znajdź optymalną pozycję kamery, aby uzyskać odpowiednią długość chodnika i najlepszą rozdzielczość zarejestrowanych łap jednocześnie. Oznacz pozycję kamery w systemie CatWalk, aby zapewnić identyczne rozmieszczenie kamery między nagraniami.
      4. Skonfiguruj ustawienia wykrywania przy użyciu automatycznego wykrywania dla nowego eksperymentu. Upewnij się, że wszystkie ślady stóp można wykryć przy minimalnym szumie tła. W razie potrzeby zoptymalizuj ustawienia wykrywania ręcznie i zmień zielony próg intensywności. Użyj tych samych ustawień wykrywania dla całego eksperymentu.
      5. Skonfiguruj ściany korytarzy systemu CatWalk. Ściany korytarza powinny znajdować się jak najbliżej szczura. Upewnij się, że ściany korytarza pozostają równoległe do chodnika.
      6. Określ długość chodnika: Kliknij ikonę Zdefiniuj chodnik. Dostosuj rozmiar białego prostokąta pod względem długości i szerokości, zgodnie z konkretnym projektem badawczym. Kliknij przycisk OK.
      7. Kalibrowanie chodnika: Kliknij w ikonę Kalibruj chodnik. Umieść prostokątny arkusz kalibracyjny o wymiarach 20 x 10 cm na środku chodnika. Dostosuj rozmiar białego prostokąta do arkusza kalibracyjnego. Kliknij przycisk OK.
      8. Następnie zrób zdjęcie tła: Sprawdź wcześniej, czy chodnik jest czysty i pusty. Kliknij przycisk Przyciągaj tło, aby wygenerować obraz tła.
   2. Trenuj zwierzęta przez co najmniej osiem dni przed rozpoczęciem właściwego eksperymentu. Zalecany jest trening w kolejnych dniach.
      1. Dzień 1 treningu: Aby szczury przyzwyczaiły się do systemu CatWalk, pozwól zwierzęciu swobodnie eksplorować chodnik i pole bramek. Pozwól szczurom poćwiczyć przechodzenie przez chodnik i wejście do pola bramkowego. Podnieś szczura na końcu chodnika lub w polu bramki i przyprowadź szczura z powrotem do punktu początkowego chodnika. Na pierwszy dzień treningu zaleca się wykonanie pięciu przejazdów bez konieczności stosowania się do ustawień eksperymentalnych.
      2. Dzień 2 treningu: Szczury mogą swobodnie eksplorować chodnik i skrzynkę bramkową. Zaleca się pięć przebiegów bez zgodności z ustawieniami eksperymentalnymi.
      3. Dzień 3 treningu: Zaleca się osiem przejazdów bez zgodności z ustawieniami eksperymentalnymi.
      4. Dzień 4 treningu: Zaleca się dziesięć przejazdów bez przestrzegania ustawień eksperymentalnych.
      5. 5 dzień treningu: Zalecane jest dziesięć biegów. Należy pamiętać o ustawieniach eksperymentalnych. Zmotywuj szczury do przechodzenia przez chodnik bez żadnych zakłóceń.
      6. 6 dzień treningu: Zalecane jest dziesięć biegów. Należy pamiętać o ustawieniach eksperymentalnych. Zmotywuj szczury do przechodzenia przez chodnik bez żadnych zakłóceń.
      7. 7 dzień treningu: Zalecanych jest dziesięć biegów. Należy wykonać co najmniej trzy zgodne przebiegi. Dodaj więcej biegów dla zwierząt, jeśli nie były w stanie osiągnąć tego celu.
      8. Dzień 8 treningu: Zalecanych jest dziesięć biegów. Należy wykonać co najmniej trzy zgodne przebiegi. Dodaj więcej biegów dla zwierząt, jeśli nie były w stanie osiągnąć tego celu.
3. ocena
   1. Zgodnie ze zdefiniowanymi kryteriami uruchamiania wykonaj trzy zgodne przebiegi na szczura w celu analizy danych. Aby dokonać oceny, wykonaj kroki 3.2.1. - 3.2.1.8. zgodnie z opisem w sekcji Szkolenie. Nawet jeśli szczur osiągnie trzy zgodne z przepisami serie w ciągu pierwszych trzech biegów, wykonuj co najmniej sześć przebiegów na sesję/tydzień w celach treningowych.
   2. Wykonaj co najmniej jedną sesję (treningową) z sześcioma biegami w tygodniu, aby uzyskać stabilny wzorzec chodu do eksperymentów z wieloma punktami czasowymi. Ustawienia eksperymentalne i wykrywania pozostają spójne dla całego eksperymentu.
4. analiza danych
   1. W przypadku analizy danych oceń tylko zgodne przebiegi. Usuń niezgodne przebiegi.
   2. Sprawdź próg intensywności zieleni i w razie potrzeby zwiększ lub zmniejsz próg intensywności zieleni przed klasyfikacją odcisków łap. Zielony próg intensywności musi być spójny dla wszystkich zwierząt i wszystkich wybiegów.
   3. Klasyfikuj odciski łap automatycznie za pomocą oprogramowania CatWalk XT (Rysunek 2B).
   4. Przejrzyj ręcznie etykiety do drukowania łap. Koryguj nieprawidłowe etykiety odcisków łap, dodawaj etykiety niewykrytych odcisków łap oraz ręcznie usuwaj szumy i niewłaściwe etykiety. Przesuń film w miejsce, które ma zostać przejrzane ręcznie. Aby skorygować nieprawidłowo oznaczone odciski łap, wybierz prostokąt określonego odcisku łapy, kliknij przycisk Resetuj, ponownie wybierz ten sam prostokąt i przypisz poprawną etykietę z listy. Aby oznaczyć niewykryte odciski łap, narysuj prostokąt wokół niewykrytej łapy, kliknij przycisk Dodaj wydruk, wybierz nowo wygenerowany prostokąt i przypisz odpowiednią etykietę z listy. W przypadku, gdy oprogramowanie oznaczone nosem lub ciałem drukuje automatycznie, wybierz prostokąt określonej etykiety i kliknij Usuń wydruk.
   5. Przejrzyj wyniki numeryczne. Wyniki liczbowe są wyświetlane w arkuszu Excela, pokazującym szereg podstawowych parametrów. Wybierz predefiniowane parametry szczegółowe, w zależności od zainteresowania badawczego i przeprowadź analizę statystyczną jak zwykle (Rysunek 2D).
   6. Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat każdego odcisku stopy, sklasyfikuj palce tylnych łap. Do tej analizy wymagany jest moduł Interaktywne Pomiary Śladu.
      1. W razie potrzeby dostosuj próg intensywności zieleni do analizy interaktywnych pomiarów śladu węglowego. Zielony próg intensywności musi być spójny dla wszystkich zwierząt i wszystkich wybiegów.
      2. Ustaw znaczniki do analizy footprintu ręcznie. Przeanalizuj każdy odcisk tylnej łapy we wszystkich trzech zgodnych przebiegach. Narysuj linię od środka pierwszego palca u nogi do środka piątego palca, aby zmierzyć "Rozpiętość palców". Narysuj linię od środka drugiego palca u nogi do środka czwartego palca, aby zmierzyć "Pośredni rozstaw palców". Narysuj linię od środka trzeciego palca u nogi do pięty tylnej łapy, aby zmierzyć "Długość wydruku ręcznego" (Rysunek 2C).
      3. Zapoznaj się z numerycznymi wynikami "Interaktywnych pomiarów śladu" wyświetlanymi w osobnym arkuszu. Wybierz określone parametry "Interaktywne pomiary śladu" i przeprowadź analizę statystyczną jak zwykle (Rysunek 2E).

4. Zadanie chodzenia po belce

UWAGA: Deficyty chodu mogą być określone przez zadanie chodzenia z belką. Zadanie chodu z użyciem belki w tym konkretnym temacie badawczym skupi się na analizie koordynacji ruchowej, definiowanej jako zdolność do koordynowania aktywacji mięśni z wielu części ciała, a nie na ocenie równowagi motorycznej, definiowanej jako zdolność do kontroli postawy podczas ruchów ciała.

1. Instalacji
   1. Do zadania chodzenia po belce użyj belki, elementu dystansowego, stołu, jednolitego tła i kamery (Rysunek 3A).
   2. Użyj drewnianej belki o długości 90 cm, szerokości 1,7 cm i wysokości 2 cm. Zalecana jest platforma o długości 20,5 cm, szerokości 15 cm i wysokości 2 cm na obu końcach belki. Użyj tego samego materiału na platformy i belkę, unikaj wszelkich barier między platformami a belką.
   3. Odległość między belką a stołem powinna wynosić co najmniej 44 cm. Znajome środowisko, takie jak klatka domowa, motywuje szczury do przekraczania belki, którą można umieścić na końcu platformy belki.
2. szkolenie
   1. Ustaw belkę z przekładką i klatką domową na stole.
   2. Trenuj zwierzęta przez siedem dni. Zalecany jest trening w kolejnych dniach.
      1. Dzień 1 szkolenia
         1. Umieść wszystkie szczury z jednej klatki domowej na platformie startowej belki.
         2. Pozwól szczurom eksplorować otoczenie (platforma/belka).
         3. Trzymaj ostrożnie jednego szczura za ogon i poprowadź go do belki, delikatnie popychając szczura na belkę.
         4. Pomóż szczurowi w pokonywaniu belki, trzymając szczura za ogon przez co najmniej dwa biegi.
         5. Pozwól szczurowi przejść przez belkę przez kolejne trzy biegi bez pomocy. Obserwuj szczura i w razie potrzeby udziel pomocy. Jeśli szczur nie przejdzie przez belkę, przechwyć upadek, aby uniknąć obrażeń i rozwoju strachu przed przejściem przez belkę.
         6. Kontynuuj tę procedurę dla wszystkich szczurów.
            UWAGA: Czasami szczury podążają za sobą, aby przejść przez wiązkę, w takim przypadku nie jest potrzebna żadna pomoc. Ważne jest jednak, aby obserwować szczury, przechwytywać upadki i w razie potrzeby udzielać pomocy.
      2. Dzień 2 szkolenia
         1. Umieść wszystkie szczury z jednej klatki domowej na platformie startowej belki.
         2. Pozwól szczurom przejść przez belkę sześć razy.
         3. W razie potrzeby udziel pomocy i przechwyć upadki.
      3. 3 dzień szkolenia
         1. Umieść jednego szczura na platformie startowej belki.
         2. Pozwól szczurowi przejść przez belkę sześć razy.
         3. W razie potrzeby udziel pomocy i przechwyć upadki.
      4. Dzień 4-7 szkolenia
         1. Umieść jednego szczura na platformie startowej belki.
         2. Pozwól szczurowi przejść przez belkę dziesięć razy.
         3. W razie potrzeby udziel pomocy i przechwyć upadki.
         4. Pod koniec treningu szczur powinien przechodzić przez belkę bez przerwy przez co najmniej trzy biegi. Dopuszczalne jest delikatne popchnięcie szczura na platformę startową, aby wywołać inicjację ruchu.
3. ocena
   1. Ustaw belkę z przekładką i klatką domową na stole.
   2. Ustaw kamerę w odpowiedniej pozycji, ustawionej równolegle do wiązki, tak aby zwierzę było w centrum uwagi. Kamera powinna być ustawiona jak najbliżej zwierzęcia, aby uzyskać optymalną rozdzielczość rejestrowanych ruchów. Wiązka i części obu platform powinny zostać uchwycone przez nagranie.
   3. Rozpocznij nagrywanie i najpierw zidentyfikuj sesję i zwierzę.
   4. Umieść szczura na platformie startowej belki.
   5. Szczur powinien przejść przez belkę trzy razy bez żadnej przerwy. Nawet jeśli szczur osiągnie trzy zgodne przebiegi w ciągu pierwszych trzech przebiegów, wykonaj co najmniej sześć do dziesięciu przebiegów, aby zapewnić ciągłą wydajność zadania.
   6. Zawsze obserwuj zwierzę i w razie potrzeby przechwytuj upadki.
   7. Po wykonaniu zadania wyczyść belkę i stół 0,1% kwasem octowym, aby uniknąć rozpraszania się zapachem wcześniej nagranego szczura.
      UWAGA: W ciągu pierwszych dwóch tygodni po urazie zmiażdżenia nerwu szczury nie są w stanie przejść przez belkę bez pomocy. Dlatego należy zapewnić pomoc przez sześć do ośmiu biegów w ciągu pierwszych dwóch tygodni po urazie zmiażdżenia nerwu. Od trzeciego do piątego tygodnia pięć przejazdów wykonuje się z pomocą, a dziesięć kolejnych przebiegów wykonuje się bez pomocy.
4. analiza danych
   1. Skorzystaj z bezpłatnego oprogramowania do analizy wideo Kinovea do analizy danych.
   2. Wybierz sekwencje wideo z trzech zgodnych przebiegów z nagrania. W tym celu wybierz pierwsze trzy zgodne z przepisami biegi, które zostały wykonane bez pomocy zwierzęcia. Bądź konsekwentny w wyborze zgodnego biegu dla wszystkich szczurów.
   3. Zdefiniuj początkowy punkt czasowy i punkt końcowy wybranych trzech zgodnych przebiegów (Rysunek 3D-E). W tej konfiguracji punkt startu był oznaczony czarną linią na belce, a umieszczenie pierwszej tylnej kończyny za czarną linią określało punkt startowy biegu. Umieszczenie pierwszej kończyny tylnej na platformie na końcu belki określa punkt czasu końcowego.
   4. Następnie oblicz czas potrzebny szczurowi na przejście przez belkę. Raportuj dane jako czas opóźnienia do przecięcia wiązki w ciągu kilku sekund i przeprowadź analizę statystyczną jak zwykle (Rysunek 3B).
   5. Oceń liczbę kroków i błędów z trzech zgodnych przebiegów dla obu kończyn tylnych osobno, korzystając z funkcji powiększania i zwolnionego tempa w oprogramowaniu. Błędy obejmują całkowite poślizgnięcia stóp i połowy stopy. Całkowity poślizg stopy definiuje się jako ułożenie stopy, po którym następuje głęboki poślizg powodujący utratę kontaktu dotkniętej łapy z belką (Rysunek 3F). Półpoślizg definiuje się jako łapę zsuwającą się ze ściany bocznej belki bez utraty całkowitego kontaktu z belką (Rysunek 3G).
   6. Obliczyć procent poślizgnięć stopy w stosunku do liczby kroków do skrzyżowania z belką ((liczba poślizgnięć kończyny x 100%)/ liczba kroków tej samej kończyny). Przedstaw dane jako procentowe poślizgnięcia stóp i przeprowadź analizę statystyczną jak zwykle (Rysunek 3C).

5. Zadanie chodzenia po szczeblach drabiny

UWAGA: Zadanie chodzenia po szczeblach drabiny może ocenić funkcje motoryczne, ułożenie kończyn przednich i tylnych oraz koordynację międzykończynową.

1. Instalacji
   1. Do tego testu behawioralnego użyj przyrządu ze szczeblem drabiny, przekładką, stołem, jednolitym tłem i kamerą (Rysunek 4A). Aparat do poziomego szczebla drabiny składa się z metalowych szczebli i przezroczystych ścian bocznych z poliwęglanu. Aparat ma długość 119,5 cm, a szerokość jest dostosowana do 7,4 cm. Chodnik do analizy ma długość 100 cm.
   2. Oznacz punkt początkowy i końcowy czarną linią na ścianie bocznej. Umieść symbole zastępcze dla szczebli na aparacie w odstępach 1 cm. Ułóż nieregularny wzór szczebli dla chodnika o długości 100 cm z zachowaniem odległości od 1 do 5 cm między szczeblami. Pierwsze 10 cm na początku i ostatnie 9,5 cm na końcu aparatu, które są wyłączone z analizy, mają regularny wzór szczebli w odległości 1 cm.
   3. Użyj odległości między chodnikiem a stołem około 30 cm (Rysunek 4A-B). Skrzynka na bramki lub znajome otoczenie na końcu aparatu, takie jak klatka domowa, motywuje szczury do przekraczania szczebla drabiny.
2. szkolenie
   1. Ustaw na stole przyrząd do drabiny z przekładką i skrzynką na bramki.
   2. Trenuj zwierzęta przez osiem dni. Zalecany jest trening w kolejnych dniach.
      1. Dzień 1 szkolenia
         1. Umieść wszystkie szczury z jednej klatki domowej na aparacie na szczeblu drabiny.
         2. Pozwól szczurom eksplorować otoczenie (drabina, szczebel, aparat/skrzynka na bramki).
         3. Delikatnie popchnij szczury w kierunku skrzynki bramkowej. Pomóż szczurom wejść w pole bramki. Pozwól szczurom przez chwilę zbadać pole bramki.
         4. W końcu szczury weszły do pola bramkowego. Weź pierwszego szczura z pola bramki i ponownie umieść go w strefie startowej urządzenia. Kontynuuj tę samą procedurę dla wszystkich szczurów w jednej klatce domowej. Delikatnie popchnij szczury w kierunku pola bramki i w razie potrzeby udziel pomocy w wejściu do pola bramki.
         5. Pozwól szczurowi przejść przez aparat cztery razy.
      2. Dzień 2 szkolenia
         1. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem, który jest wymieniony dla pierwszego dnia treningu.
         2. Pozwól szczurowi przejść przez aparat sześć razy.
      3. 3 dzień szkolenia
         1. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem, który jest wymieniony dla pierwszego dnia treningu.
         2. Pozwól szczurowi przejść przez aparat osiem razy.
      4. 4 dzień szkolenia
         1. Umieść jednego szczura na początku aparatu drabiny.
         2. Jeśli szczur nie przejdzie przez urządzenie i dobrowolnie wejdzie do pola bramkowego, udziel pomocy, delikatnie popychając szczura od tyłu.
         3. Pozwól szczurowi przejść przez aparat osiem razy.
      5. Dzień 5-8 szkolenia
         1. Umieść jednego szczura na początku aparatu do drabiny.
         2. Jeśli szczur nie przejdzie przez urządzenie i dobrowolnie wejdzie do pola bramkowego, udziel pomocy, delikatnie popychając szczura od tyłu.
         3. Pozwól szczurowi przejść przez aparat dziesięć razy.
         4. Pod koniec treningu szczur powinien być w stanie przejść chodnik bez żadnych przerw i pomocy przez co najmniej trzy biegi. Dopuszczalne jest delikatne popchnięcie szczura w strefie startowej, aby wywołać inicjację ruchu.
3. ocena
   1. Ustaw na stole przyrząd do drabiny z przekładką i skrzynką na bramki.
   2. Ustaw kamerę w odpowiedniej pozycji, równolegle do aparatu, z ustawioną ostrością na zwierzę. Ustaw kamerę jak najbliżej zwierzęcia, aby uzyskać optymalną rozdzielczość rejestrowanych ruchów i upewnij się, że cały szczebel drabiny został uchwycony na nagraniu.
   3. Rozpocznij nagrywanie i najpierw zidentyfikuj sesję i zwierzę.
   4. Umieść szczura w strefie startowej aparatu na szczeblu drabiny.
   5. Szczur musi trzykrotnie bez przerwy przejść przez 100-centymetrowy chodnik drabiny, aby zakwalifikować się jako bieg spełniający wymagania. Nawet jeśli szczur osiągnie trzy zgodne przebiegi w ciągu pierwszych trzech przebiegów, należy przeprowadzić co najmniej dziesięć przebiegów w celu ciągłego wykonywania zadania.
   6. Po wykonaniu zadania wyczyść aparat i stół 0,1% kwasem octowym, aby uniknąć rozproszenia przez zapach wcześniej nagranego szczura.
4. analiza danych
   1. Skorzystaj z bezpłatnego oprogramowania do analizy wideo Kinovea do analizy danych.
   2. Wybierz sekwencje wideo z trzech zgodnych przebiegów z nagrania. Wybierz pierwsze trzy zgodne przebiegi na potrzeby analizy danych.
   3. Zdefiniuj punkt czasowy rozpoczęcia i punkt czasowy końca wybranych trzech zgodnych przebiegów. Umieszczenie pierwszej kończyny tylnej za pierwszą czarną linią na ścianie bocznej aparatu, która oznacza punkt czasowy rozpoczęcia chodnika o długości 100 cm, określa punkt czasowy rozpoczęcia biegu. Umieszczenie pierwszej kończyny przedniej za drugą czarną linią na bocznej ścianie aparatu, która wyznacza punkt końcowy chodnika o długości 100 cm, określa punkt czasowy zakończenia biegu.
   4. Zidentyfikuj punkt czasowy rozpoczęcia i zakończenia. Następnie oblicz czas trwania biegu w poprzek chodnika. Raportuj dane jako czas opóźnienia do pokonania chodnika w ciągu kilku sekund i przeprowadź analizę statystyczną jak zwykle (Rysunek 4C).
   5. Oceń trzy zgodne przebiegi za pomocą 7-kategorii skali Metz et al., korzystając z funkcji slow motion lub klatka po klatce oprogramowania (Rysunek 5)^16,17. Określić liczbę kroków i liczbę błędów zgodnie z kategoriami skali dla każdej kończyny z osobna. Skala rozróżnia następujące kategorie: (0) całkowite chybienie, (1) głęboki poślizg, (2) lekki poślizg, (3) wymiana, (4) korekta, (5) częściowe umieszczenie, oraz (6) prawidłowe umieszczenie. Oceniany był tylko błąd kończyny inicjującej. Dalsze błędy, wywołane błędem początkowym, nie powinny być oceniane.
   6. Oblicz błędy/krok, biorąc pod uwagę następujące wymagania. Kategorie (0) całkowite chybienie (1) głęboki poślizg (2) niewielki poślizg liczą się jako błąd. Podziel liczbę błędów przez liczbę kroków dla każdej kończyny tylnej i każdego biegu osobno. Określ średnią wartość wszystkich trzech zgodnych serii dla każdego zwierzęcia i każdej kończyny tylnej osobno i przeprowadź analizę statystyczną jak zwykle (Rysunek 4D).

Wyniki

Reprezentatywne wyniki pięciominutowego OFT pokazują, że uraz zmiażdżenia nerwu pięć tygodni po operacji nie ma wpływu na aktywność lokomotoryczną (Rysunek 1).

Analiza chodu za pomocą systemu CatWalk XT (Rysunek 2) generuje wiele różnych parametrów. Parametry selekcyjne analizowano statystycznie, porównując szczury nieleczone wcześniej z szczurami z uszkodzonymi nerwami pięć tygodni po zmiażdżeniu nerwu (Ryc. 2D). Znaczące zmiany można było wykryć w średniej prędkości biegu, długości kroku i obszarze odcisku uszkodzonej nerwu (prawej) tylnej łapy. Bardziej szczegółową analizę uszkodzonej przez nerw tylnej łapy przeprowadzono za pomocą modułu "Interaktywne pomiary śladów stóp". U szczurów z uszkodzonymi nerwami zaobserwowano znaczące zmniejszenie parametrów rozpiętości palców, pośredniego rozstawu palców i długości odcisku u nogi w porównaniu ze szczurami nieleczonymi wt. Ponadto oś kąta łapy ciała i wektor ruchu kąta łapy znacznie się różnią, gdy porównuje się szczury wt z uszkodzonymi nerwami ze szczurami naiwnymi (Rysunek 2E).

Rysunek 3 przedstawia dane dotyczące koordynacji ruchowej uzyskane dzięki ocenie zadania chodzenia z belką. Szczury z uszkodzonymi nerwami wykazały znacznie dłuższy czas opóźnienia w przekroczeniu wiązki w porównaniu ze szczurami, które nie miały wcześniej użycia, pięć tygodni po urazie (Rysunek 3B). Jako dodatkowy odczyt zadania chodzenia po belce, pełne poślizgnięcia i połowiczne poślizgi kończyny tylnej z uszkodzeniem nerwu zostały policzone i uznane za błąd do analizy statystycznej. Odsetek błędów na krok uszkodzonej przez nerwy (prawej) kończyny tylnej był znacznie zwiększony u szczurów z uszkodzonymi nerwami w porównaniu ze szczurami nieleczonymi wt.

Reprezentatywne dane zadania chodzenia po drabinie (Rysunek 4) nie pokazują znaczących zmian w czasie opóźnienia do przejścia przez chodnik drabiny (Rysunek 4C) ani w procentowym odsetku błędów na krok uszkodzonej nerwowo (prawej) kończyny tylnej (Rysunek 4D). Analiza procentu błędu na krok kończyny tylnej z uszkodzeniem nerwu uwzględniała tylko wynik od 0 do 2 w skali 7 kategorii z Metz i wsp. Rozkład wszystkich kategorii punktacji na krok z 7-stopniowej skali kończyny tylnej z uszkodzeniem nerwu i kończyny tylnej bez uszkodzenia nerwu (lewej) jest zilustrowany w Rysunek 4E.

Rysunek 1: Ocena aktywności lokomotorycznej podczas testu w otwartym polu. (A) Zdjęcie stanowiska do badania w terenie otwartym. Wybrane zdjęcie odjęte z nagranego filmu podczas testu w otwartym polu, pokazujące szczura na arenie na otwartym polu bez (B) i ze śledzeniem (C). (D) Prędkość podczas pięciominutowego nagrania z testu w otwartym polu została zbadana u szczurów nieleczonych wcześniej i szczurów wt pięć tygodni po urazie zmiażdżenia nerwu. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu niesparowanego testu t danych o rozkładzie normalnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza chodu za pomocą systemu CatWalk XT. (A) Zdjęcie aparatu CatWalk XT. (B) Przykłady widoku wydruku pokazującego oznaczone odciski łap w trybie fałszywych kolorów oraz przykłady widoku czasowego pokazującego oparty na czasie diagram chodu szczurów nieleczonych wt i szczurów wt pięć tygodni po urazie zmiażdżenia nerwu. (C) Przykłady klasyfikacji palców u nóg przedstawiających rozstaw palców (TS), pośredni rozstaw palców (ITS) i długość odcisku (PL), a także przykłady widoku osi ciała pokazującego oś ciała (biała linia) i wektor ruchu (czerwona linia) szczurów nieleczonych wt i szczurów wt pięć tygodni po urazie zmiażdżenia nerwu. (D) Dane wybranych parametrów z "standardowej" klasyfikacji, porównujące szczury nieleczone wt i szczury wt pięć tygodni po urazie zmiażdżenia nerwów. (E) Dane wybranych parametrów z modułu "Interactive Footprint Measurement" porównującego szczury nieleczone wt i szczury wt pięć tygodni po urazie zmiażdżenia nerwu. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu niesparowanego testu t danych o rozkładzie normalnym, testu t bez par z poprawką Welcha dla danych o rozkładzie normalnym o nierównej wariancji oraz testu U Manna-Whitneya dla danych o rozkładzie nienormalnym. Wartość p < 0,05 zdefiniowano jako statystycznie istotną oznaczoną jako *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza chodu z zadaniem chodzenia po belce. (A) Rysunki obrazkowe i schematyczne przedstawiające konfigurację zadania chodzenia po belce. Czas opóźnienia do przejścia przez belkę (B) i procentowe błędy poślizgnięcia się stopy na krok kończyny tylnej z uszkodzeniem nerwu podczas zadania chodzenia po belce (C) analizowano u szczurów nieleczonych wcześniej i szczurów wt pięć tygodni po urazie zmiażdżenia nerwu. Reprezentatywny obraz dla pozycji czasu rozpoczęcia (D) i pozycji czasu zakończenia (E) zadania chodzenia po belce. Reprezentatywna sekwencja obrazów błędu pełnego poślizgu (F) i połowy błędu poślizgu (G) zadania chodzenia po belce. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu testu U Manna-Whitneya danych o rozkładzie nienormalnym. Wartość p < 0,05 zdefiniowano jako istotną statystycznie oznaczoną jako *p < 0,05, **p < 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza chodu za pomocą zadania chodzenia po drabinie. Zdjęcie (A) i schematyczne rysunki (B) przedstawiające ustawienie zadania chodzenia po szczeblach drabiny. U szczurów nieleczonych wcześniej i szczurów wt pięć tygodni po urazie zmiażdżenia nerwu oceniano czas opóźnienia przechodzenia przez aparat szczebla drabiny (C) oraz procentowe błędy poślizgu stopy na krok kończyny tylnej uszkodzonej podczas zadania chodzenia po szczeblu drabiny (D). (E) Procentowy rozkład kategorii punktacji na stopień zgodnie ze skalą 7 kategorii z Metz i wsp. Dla lewej i prawej kończyny tylnej szczurów nieleczonych WT i szczurów WT pięć tygodni po urazie zmiażdżenia nerwu. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu niesparowanego testu t danych o rozkładzie normalnym oraz testu U Manna-Whitneya danych o rozkładzie nienormalnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykładowa reprezentacja każdej kategorii według skali 7 kategorii od Metz et al. podczas zadania chodzenia po szczeblach drabiny. Reprezentatywna sekwencja obrazów z prawej kończyny tylnej kategorii 0 - całkowite chybienie, kategoria 1 - głęboki poślizg, kategoria 2 - lekki poślizg, kategoria 3 - wymiana, kategoria 4 - korekcja, podczas zadania chodzenia po szczeblach drabiny. Reprezentatywne zdjęcia dla kategorii 5 - częściowe umieszczenie i kategorii 6 - prawidłowe umieszczenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ten protokół oceny behawioralnej zawiera przegląd zalet i wad, a także możliwe odczyty wybranej baterii testów behawioralnych w modelu gryzoni po urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego.

Aby uzyskać porównywalny wynik uszkodzenia nerwu kulszowego, obowiązkowa jest konsekwentna technika zgniatania. Użycie nieząbkowanego zacisku (Ultra Fine Hemostat) zamiast kleszczy może poprawić konsystencję zgniatania. Użyj tego samego zacisku, a także tej samej pozycji zgniatania, aby zagwarantować równomierny ucisk nerwów. Wyłączne użycie zacisku w przypadku zmiażdżenia i ostrożne obchodzenie się z zaciskiem poprawia konsystencję. Również ostrożnie wykonuj procedurę zmiażdżenia. Dodatkowe uszkodzenie nerwu podczas operacji, takie jak niepożądana trakcja nerwu, może prowadzić do niepożądanych skutków ubocznych, takich jak autookaleczenie. Dlatego zaleca się staranne przygotowanie nerwów, a także podawanie leku przeciwbólowego przez co najmniej dwa dni.

Wieloczynnikowa ocena zachowań motorycznych może scharakteryzować fenotyp po urazie zmiażdżenia nerwu u szczurów na różnych poziomach. Użyliśmy OFT, analizy chodu CatWalk XT, zadania chodzenia po belce i zadania chodzenia po szczeblach drabiny. Zaślepiona procedura eksperymentalna i analiza danych dla grup eksperymentalnych jest niezbędna dla tych eksperymentów. Przed oceną zachowania zwierzęta aklimatyzowano się w pomieszczeniu testowym w warunkach testowych przez co najmniej 30 minut. Wszystkie zastosowane w niniejszym dokumencie testy behawioralne mają tę zaletę, że nie jest wymagane pozbawienie jedzenia lub wody. We wszystkich opisanych testach behawioralnych wykorzystano ten sam zestaw zwierząt grupowych. Dla każdego zwierzęcia wykonywano maksymalnie dwa różne testy behawioralne dziennie. Jeśli testy behawioralne są wykonywane w regularnych odstępach czasu, zwróć uwagę na porównywalną procedurę, taką jak wykonywanie testu w tej samej kolejności zwierząt i o tej samej porze dnia. Kolejnym ważnym aspektem analizy behawioralnej jest cykl dnia i nocy szczurów. Rozważ odwrócony cykl dnia i nocy, aby uzyskać bardziej naturalny i wyższy poziom aktywności w cyklu dnia (cykl ciemny). Należy to wziąć pod uwagę zwłaszcza w przypadku pomiaru spontanicznych zachowań, takich jak OFT. W tym eksperymencie nie udało się zastosować odwróconego cyklu dnia i nocy, ale zapewniono odpowiednią aklimatyzację do warunków testowych. Doskonałe oświetlenie jest niezbędne w przypadku filmów w wysokiej rozdzielczości do zadania chodzenia po belce i zadania chodzenia po szczeblach drabiny. Tak wysokiej jakości wideo nie można osiągnąć podczas wykonywania eksperymentów w ciemności.

Ocena chodu wymaga ciągłego wykonywania zadań. Pierwszym ważnym aspektem ciągłego wykonywania zadań jest przekonanie zwierząt do przekroczenia ustawienia. Aby zwiększyć motywację, umieść małe granulki jedzenia (45 mg) na końcu zestawu. Aby zwierzęta mogły zapoznać się z granulkami żywności, przed badaniem należy je im podać. Pomocne może być również pole bramki na końcu konfiguracji. Konfiguracja CatWalk zawiera już skrzynkę na bramki, ale szczury czasami wahają się, czy wejść do skrzynki bramkowej. Alternatywnie możesz dodać małą klatkę do pola bramkowego, ale klatka domowa ze szczurów nie pasuje do skrzynki bramkowej. Pozwól szczurowi przyzwyczaić się w klatce na kilka minut przed nabyciem. Dodatkowo inny szczur z tej samej klatki domowej może zostać umieszczony w polu bramkowym lub w klatce wewnątrz pola bramkowego. Upewnij się, że drugi szczur pozostaje w polu karnym i nie blokuje wejścia do pola bramkowego. Co więcej, możliwe jest również wyjęcie skrzynki na bramkę z systemu CatWalk i umieszczenie klatki domowej dla szczurów na końcu chodnika, co pozwala szczurowi wejść na swoje "terytorium domowe" po każdym biegu. Aby skonfigurować zadanie chodzenia po belce i zadania chodzenia po szczeblach drabiny, zalecamy dodanie skrzynki na bramkę lub klatki domowej na końcu konfiguracji. Aby zapewnić spójność, CatWalk, zadanie chodzenia po belce i zadanie chodzenia po szczeblach drabiny powinny być wykonywane co najmniej raz w tygodniu z sześcioma do dziesięciu biegami.

Chociaż nie każda analiza przyniosła znaczące różnice w tym badaniu, należy wziąć pod uwagę, że włączenie genetycznie zmodyfikowanych zwierząt lub grup leczonych może dostarczyć cennych danych, które mogą rozróżnić grupy z tych samych testów behawioralnych.

Uszkodzenie nerwu nie miało wpływu na aktywność lokomotoryczną szczura, która została zmierzona w ciągu pięciu minut OFT. Analiza chodu Catwalk XT jest bardziej obiektywnym i czułym narzędziem do analizy chodu, ułożenia łap i palców. Po intensywnym treningu szczury uczą się przechodzić przez chodnik aparatu CatWalk XT do ustawień domyślnych. Uszkodzenie nerwu nie zmniejsza zdolności szczurów do przechodzenia przez chodnik. Automatyczne obliczanie różnych parametrów przedstawia dane w obiektywny sposób. Dodatkowe informacje można uzyskać za pomocą modułu "Interaktywne pomiary śladów stóp" i rzeczywiście, analizy te przyniosły znaczące różnice w różnych parametrach rozpiętości palców, długości odcisku i kąta łapy do osi ciała, porównując szczury z uszkodzeniem nerwów i bez niego.

Szczury można łatwo wyszkolić do zadania chodzenia po belce. Różnice w czasie opóźnienia do przejścia przez belkę i w liczbie poślizgnięć stóp na krok kończyny tylnej z uszkodzonymi nerwami wykryto, porównując szczury naiwne z zranionymi przez zmiażdżenie. Wadą analizy szczurów z uszkodzeniem nerwów za pomocą zadania chodzenia po belce jest rozmiar belki. W ciągu pierwszych dwóch tygodni po urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego szczury potrzebują pomocy, aby przejść przez belkę, ponieważ ich równowaga jest zaburzona. Chociaż niektóre szczury mogą być w stanie przejść przez belkę, ryzyko obrażeń spowodowanych upadkiem jest wysokie. W związku z tym zwierzętom ze zmiażdżonymi nerwami należy pomagać w przekraczaniu belki przez pierwsze dwa tygodnie po urazie zmiażdżenia nerwu kulszowego lub dłużej, jeśli to konieczne. Trudno jednak porównywać biegi z pomocą i bez niej. Równowaga motoryczna jest również ważnym parametrem ocenianym przez zadanie chodzenia po belce. Uznaliśmy, że ten parametr nie jest istotny dla naszego modelu szczura z miażdżeniem nerwów. W związku z tym wyniki opisane przez Ohwatashi i wsp. oraz Johansson & Ohlsson nie mogły być użyte, a przebiegi z niepełnym trawersem belki zostały wykluczone z analizy danych^18,19.

Skala 7-kategoriowa Metza i wsp. może analizować zarówno kończyny przednie, jak i tylne oraz rozróżniać różne poziomy nasilenia błędów wszystkich kończyn podczas zadania chodzenia po drabinie^16,17. Analizując najbardziej widoczne błędy, które obejmują kategorie od 0 do 2, nie można było wykryć żadnych różnic w błędach na krok w kończynie tylnej podczas porównywania szczurów z uszkodzonymi nerwami z naiwnymi szczurami wt. Co więcej, czas utajenia przechodzenia przez aparat szczebla drabiny nie różnił się między szczurami z uszkodzeniem nerwów a szczurami nieleczonymi wcześniej. Modele głębokiego uczenia mogą usprawnić i przyspieszyć analizę danych dotyczących zadania chodzenia po szczeblach drabiny dzięki zautomatyzowanemu podejściu.

Należy wspomnieć, że uraz zmiażdżenia nerwu, jak również wszystkie opisane testy behawioralne, można łatwo przełożyć na myszy, dostosowując ustawienia i rozmiary konfiguracji. Wykorzystanie myszy jako organizmu modelowego ma korzystny wpływ na to, że istnieją transgeniczne modele wielu chorób ludzkich.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas octowy, ≥ 99.8%	Sigma-Aldrich	33209-1L
Zszywacz do skóry Appose ULC 35W	Covidien	8886803712
Beam	samodzielnie wykonany
krem pod oczy Bepanthen	Bayer Vital GmbH	81552983
Pudełko do	samodzielnie wykonanej
GC-PX100	JVC
Catwalk XT	Noldus		konfiguracja i oprogramowanie
Komora do izofluranu	GT-Labortechnik		na zamówienie
Skalpel jednorazowy nr 11	Pióro	20.001.30.011
Drä ger Vapor 19.3 system izofluranu	Dr. Wilfried Mü ller GmbH
Dumont #2 - kleszcze do laminektomii	Fine Science Tools	11223-20
kleszcze Dumont #5	Fine Science Tools	11251-30	bardzo drobne
bezpyłowe granulki precyzyjne 45 mg	Bio-Serv	F0021
EthoVision XT	Noldus		konfiguracja i oprogramowanie
Kleszcze 160 mm	Hartenstein	PZ09
Maska do znieczulenia gazowego, szczur	Dr. Wilfried Mü ller GmbH
Skrzynka na bramkę do drabiny szczebel chodzenia aparatura do zadań	własnej produkcji
Maszynka do strzyżenia włosów Magnum 5000	Wahl GmbH
Hartowane drobne nożyczki	Fine Science Tools	14090-11
Stół grzewczy	MEDAX	13801
Isofluran CP 1ml/ml, 250 ml	cp-pharma	1214	wymagana recepta
Kinovea	www.kinovea.org
Drabina szczebelkowa do chodzenia przyrząd do samodzielnego	wykonania
Uchwyt na igły	KLS Martin	20-526-14-07
Octeniderm	Schü lke	118211
Rimadyl 50 mg / ml, do wstrzykiwań	Zoetis		Carprofen, wymagana recepta
Zwijacze gumki	własnej produkcji
Przekładka do belki	samodzielnie wykonana
Przekładka do drabiny szczebelka chodzenie aparatura do samodzielnego	wykonania
Szew Silkam 4/0 DS 19	B. Braun	C0762202
Ultra drobne hemostatyki (zacisk nieząbkowany)	Fine Science Tools	13020-12