Method Article

Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego

DOI:

10.3791/62608

⸱

September 14th, 2021

 ,  , 
1Institute for Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin, 2International Max-Planck Research School for Biology and Computation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj ustalamy protokół jednoczesnej wizualizacji i analizy wielu kompleksów SMAD za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (PLA) w komórkach śródbłonka narażonych na patologiczne i fizjologiczne warunki stresu ścinającego płyny.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) sygnalizacja jest ściśle regulowana i zrównoważona podczas rozwoju i homeostazy układu naczyniowego Dlatego deregulacja w tym szlaku sygnałowym powoduje poważne patologie naczyniowe, takie jak nadciśnienie tętnicze płucne, dziedziczne teleangiektazje krwotoczne i miażdżyca. Komórki śródbłonka (EC), jako najbardziej wewnętrzna warstwa naczyń krwionośnych, są stale narażone na naprężenia ścinające płynów (SS). Wykazano, że nieprawidłowe wzorce płynnego SS wzmacniają sygnalizację TGFβ / BMP, która wraz z innymi bodźcami indukuje miażdżycę. W związku z tym stwierdzono, że atheropronowe, niskolaminarne SS wzmacnia sygnalizację TGFβ / BMP, podczas gdy aterrotekcyjne, wysoko laminarne SS, zmniejsza tę sygnalizację. Aby skutecznie analizować aktywację tych szlaków, zaprojektowaliśmy przepływ pracy do badania tworzenia kompleksów czynników transkrypcyjnych w warunkach niskiego laminarnego SS i wysokiego laminarnego SS przy użyciu dostępnego na rynku systemu pomp pneumatycznych i testu ligacji zbliżeniowej (PLA).

Aktywna sygnalizacja TGFβ/BMP wymaga utworzenia trimerycznych kompleksów SMAD składających się z dwóch regulatorowych SMAD (R-SMAD); SMAD2/3 i SMAD1/5/8 odpowiednio dla sygnalizacji TGFβ i BMP) ze wspólnym mediatorem SMAD (co-SMAD; SMAD4). Stosując PLA ukierunkowane na różne podjednostki trimerycznego kompleksu SMAD, tj. R-SMAD/co-SMAD lub R-SMAD/R-SMAD, tworzenie aktywnych kompleksów czynników transkrypcyjnych SMAD można zmierzyć ilościowo i przestrzennie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Użycie suwaków przepływu z 6 małymi równoległymi kanałami, które mogą być połączone szeregowo, pozwala na badanie tworzenia kompleksu czynników transkrypcyjnych i włączenie niezbędnych kontroli.

Opisany tutaj przepływ pracy można łatwo dostosować do badań ukierunkowanych na bliskość SMAD do innych czynników transkrypcyjnych lub do kompleksów czynników transkrypcyjnych innych niż SMAD, w różnych warunkach płynnego SS. Przedstawiony tutaj przepływ pracy pokazuje szybki i skuteczny sposób badania indukowanej płynem sygnalizacji TGFβ / BMP w EC indukowanej przez SS, zarówno ilościowo, jak i przestrzennie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka z nadrodziny transformujących czynników wzrostu beta (TGFβ) to plejotropowe cytokiny o różnych członkach, w tym TGFβ, białka morfogenetyczne kości (BMP) i Activins1,2. Wiązanie ligandów indukuje tworzenie oligomerów receptorowych, co prowadzi do fosforylacji, a tym samym aktywacji cytozolowego regulatorowego SMAD (R-SMAD). W zależności od podrodziny ligandów aktywowane są różne R-SMAD1,2. Podczas gdy TGFβ i aktywiny głównie indukują fosforylację SMAD2 / 3, BMP indukują fosforylację SMAD1 / 5/8. Istnieją jednak coraz więcej dowodów na to, że BMP i TGFβs/Activins aktywują również R-SMAD odpowiedniej innej podrodziny, w procesie określanym jako "sygnalizacja boczna"3,4,5,6,7,8 i że istnieją mieszane kompleksy SMAD składające się zarówno z członków SMAD1/5, jak i SMAD2/33,9. Dwa aktywowane R-SMAD tworzą następnie kompleksy trimeryczne ze wspólnym mediatorem SMAD4. Te kompleksy czynników transkrypcyjnych są następnie zdolne do translokacji do jądra i regulowania transkrypcji docelowych genów. SMAD mogą wchodzić w interakcje z wieloma różnymi koaktywatorami i korepresorami transkrypcji, co prowadzi do dywersyfikacji możliwości regulacji docelowych genów10. Deregulacja sygnalizacji SMAD ma poważne implikacje w różnych chorobach. W związku z tym niezrównoważona sygnalizacja TGFβ/BMP może prowadzić do poważnych patologii naczyniowych, takich jak nadciśnienie tętnicze płucne, dziedziczne krwotoczne teleangiektazje lub miażdżyca3,11,12,13,14.

Komórki śródbłonka (EC) tworzą najbardziej wewnętrzną warstwę naczyń krwionośnych i dlatego są narażone na naprężenia ścinające (SS), siłę tarcia wywieraną przez lepki przepływ krwi. Co ciekawe, EC znajdujące się w częściach układu krwionośnego, które są narażone na wysoki poziom jednolitego, laminarnego SS, są utrzymywane w stanie homeostatycznym i spoczynkowym. W przeciwieństwie do tego, EC, które doświadczają niskiego, niejednorodnego SS, np. przy rozwidleniach lub mniejszej krzywiźnie łuku aorty, są proliferacyjne i aktywują szlaki zapalne15. Z kolei miejsca dysfunkcyjnych EC są podatne na rozwój miażdżycy. Co ciekawe, EC w tych obszarach miażdżycowych wykazują nieprawidłowo wysoki poziom aktywowanych SMAD2/3 i SMAD1/516,17,18. W tym kontekście stwierdzono, że wzmocniona sygnalizacja TGFβ/BMP jest wczesnym wydarzeniem w rozwoju zmian miażdżycowych19 i stwierdzono, że interferencja z sygnalizacją BMP znacznie zmniejsza stan zapalny naczyń krwionośnych, tworzenie się miażdżycy i związane z tym zwapnienie20.

Test ligacji zbliżeniowej (PLA) to technika biochemiczna do badania interakcji białko-białko in situ21,22. Opiera się ona na specyficzności przeciwciał różnych gatunków, które mogą wiązać docelowe białka będące przedmiotem zainteresowania, umożliwiając wysoce specyficzne wykrywanie endogennych interakcji białkowych na poziomie pojedynczej komórki. W tym przypadku przeciwciała pierwszorzędowe muszą związać się ze swoim docelowym epitopem w odległości mniejszej niż 40 nm, aby umożliwić detekcję23. Dlatego PLA jest bardzo korzystny w porównaniu z tradycyjnymi podejściami do koimmunoprecypitacji, w których do wykrycia endogennych interakcji białek potrzeba kilku milionów komórek. W PLA specyficzne dla gatunku przeciwciała drugorzędowe, kowalencyjnie połączone z fragmentami DNA (określane jako sondy Plus i Minus), wiążą przeciwciała pierwszorzędowe, a jeśli białka będące przedmiotem zainteresowania wchodzą w interakcję, sondy Plus i Minus znajdują się w bliskiej odległości. W następnym kroku DNA zostaje podwiązane i możliwa jest amplifikacja kolistego DNA w toczeniu koła. Podczas amplifikacji znakowane fluorescencyjnie komplementarne oligonukleotydy wiążą się ze zsyntetyzowanym DNA, umożliwiając wizualizację tych interakcji białkowych za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej.

Opisany tutaj protokół umożliwia naukowcom ilościowe porównanie liczby aktywnych kompleksów transkrypcyjnych SMAD w warunkach miażdżycowych i miażdżycowych SS in vitro przy użyciu PLA. SS jest generowany przez programowalny system pomp pneumatycznych, który jest w stanie generować laminarny jednokierunkowy przepływ o zdefiniowanych poziomach i umożliwia stopniowe zwiększanie natężeń przepływu. Metoda ta pozwala na detekcję oddziaływań pomiędzy SMAD1/5 lub SMAD2/3 a SMAD4, a także mieszanymi kompleksami R-SMAD. Można go łatwo rozszerzyć o analizę interakcji SMAD ze współregulatorami transkrypcji lub kompleksami czynników transkrypcyjnych innymi niż SMAD. Rysunek 1 pokazuje główne kroki protokołu przedstawionego poniżej.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie opisanego protokołu. (A) Komórki wysiane w szkiełkach 6-kanałowych są poddawane naprężeniom ścinającym za pomocą pneumatycznego systemu pomp. (B) Stałe ogniwa są używane do eksperymentu PLA lub do warunków kontrolnych. (C) Obrazy eksperymentów z PLA są pozyskiwane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i analizowane za pomocą oprogramowania do analizy ImageJ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i ekspozycja na naprężenia ścinające płynów

UWAGA: Ludzkie EC żyły pępowinowej (HUVEC) zostały użyte jako przykład do badania indukowanej SS interakcji SMAD. Opisany poniżej protokół można zastosować do każdego typu komórki reagującej na SS.

  1. Pokryj 6-kanałowy szkiełko 0,1% żelatyną ze skóry świń w PBS przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  2. Nasiona HUVEC w wstępnie powlekanych szkiełkach 6-kanałowych o gęstości 2,5 x 106 komórek na ml w 30 μl pełnego podłoża M199.
    UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat rozsiewania komórek na slajdzie przepływu, zobacz reference24.
  3. Pozostawić komórki na 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze.
  4. Dodać 60 μl wstępnie podgrzanej pożywki M199 do każdego ze zbiorników.
  5. Hodowla przez 2 dni, z delikatną wymianą pożywki raz dziennie, w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze.
    1. Całkowicie zassać zbiorniki, dodać 120 μl wstępnie podgrzanej pożywki M199 do jednego ze zbiorników i zassać z drugiej strony.
    2. Dodać 60 μl wstępnie podgrzanej pożywki M199 do obu zbiorników.
  6. Zmontuj i uruchom konfigurację przepływu zgodnie z opisem w reference25.
    1. Zamontuj rurki na jednostkach hydraulicznych. W tym przypadku rurki silikonowe o średnicy 0,8 mm i 1,6 mm służą do przyłożenia naprężeń ścinających odpowiednio 1 dyn/cm2 i 30 dyn/ cm 2.
      UWAGA: Materiał i długość rurki powinny pozostać stałe, ponieważ zmiany mogą wpływać na powstałe naprężenia ścinające. Ogólnie rzecz biorąc, można stosować inne kombinacje systemów pompowych i przewodów, o ile znane jest wynikowe naprężenie ścinające, a pompa wytwarza stały przepływ laminarny.
    2. Napełnij zbiorniki odpowiednią ilością wstępnie podgrzanego pełnego podłoża M199 (minimum 10 ml).
    3. Podłącz jednostki hydrauliczne z rurkami do układu pompy i wykonaj wstępny rozruch bez komórek, aby zrównoważyć medium i usunąć resztki powietrza25.
    4. Połącz szeregowo pojedyncze kanały na 6-kanałowej prowadnicy ze sobą za pomocą rurki do połączeń szeregowych. Pierwszy i ostatni kanał na suwaku zostaną podłączone do rurki zmontowanej w 1.6.1 (patrz Rysunek 1A dla schematu). Należy uważać, aby nie wprowadzać powietrza do systemu, ponieważ może to poważnie uszkodzić ogniwa. Więcej informacji na temat połączenia szeregowego można znaleźć w reference26.
    5. W przypadku narażenia komórek na wysokie poziomy naprężeń ścinających (>20 dyn/cm2) należy zastosować fazę narastania, tj. zwiększać naprężenie ścinające stopniowo wraz z fazami adaptacji. Kroki można ustawiać w krokach co 5 dyn/cm2 na 30 minut.

2. Fiksacja

  1. Odłączyć szkiełka od pomp po wystawieniu płynu na działanie SS. Użyj zacisków na wężyku podczas odłączania, aby uniknąć rozlania medium w inkubatorze.
  2. Natychmiast przenieś przepływ ślizga się po lodzie, podczas gdy pozostała rurka jest odłączana sekwencyjnie. Podczas wyjmowania rurki ze zbiorników, zbiornik po drugiej stronie powinien być zamknięty palcem, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza w kanale. Może to kolidować z krokami fiksacji.
  3. Trzymając komórki na lodzie, ostrożnie odessać pożywkę ze zbiorników, ale nie z kanału, w którym znajdują się komórki. Następnie przemyć próbki zimnym, sterylnym PBS (4 °C) o trzykrotnie większej objętości kanału (90 μl). Dodaj PBS do jednego zbiornika i ostrożnie odessaj z drugiego zbiornika. Powtórz ten krok w każdym z 6 kanałów na slajd.
    UWAGA: Dla wszystkich etapów przemywania i inkubacji odpowiedni roztwór jest dodawany do jednego ze zbiorników, co prowadzi do wymiany roztworów w kanale. Aby umożliwić całkowite zastąpienie roztworów w kanale, nadmiar roztworu jest następnie zasysany z drugiego zbiornika. Roztwór na górze komórek w kanale nie jest usuwany. Komórki nie powinny wysychać w żadnym momencie. Dlatego ważne jest, aby myć ostrożnie, bez wprowadzania pęcherzyków powietrza do szkiełek.
  4. Utrwalić komórki, dodając 90 μl buforowanego 4% roztworu PFA w tym samym zbiorniku, w którym wcześniej dodano PBS i podobnie odessać ciecz z drugiego zbiornika. Powtórz ten krok w każdym kanale na każdym slajdzie. Po dodaniu roztworu PFA przenieść próbki z lodu do temperatury pokojowej (RT) i inkubować przez 20 min.
    UWAGA: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Używaj rękawiczek i pracuj pod wyciągiem.
  5. Przemyj komórki 3x PBS (RT), dodając go do jednego zbiornika i ostrożnie zasysając z drugiego zbiornika. Opróżnij tylko zbiorniki, uważając, aby nie wysuszyć kanału. Powtórz ten krok dla każdego z 6 kanałów na slajdzie.
  6. Utrwalanie PFA należy ugasić przez dodanie 90 μl 50 mM chlorku amonu w temperaturze otoczenia do PBS w jednym ze zbiorników. Odessać nadmiar roztworu z drugiego zbiornika. Powtórz te czynności dla każdego kanału na slajdzie. Inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Umyć zgodnie z opisem w kroku 2.5.
    UWAGA: W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc lub protokół może być natychmiast kontynuowany z blokowaniem i inkubacją przeciwciał pierwotnych (patrz krok 3).

3. Blokowanie i inkubacja przeciwciał pierwotnych

  1. Aby przepuszczalność komórek, dodaj 90 μl 0,3% Triton-X-100 w PBS do opróżnionego zbiornika i odessaj z drugiego zbiornika dla każdego kanału. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Umyć zgodnie z opisem w kroku 2.5.
  3. Dodać 90 μl sterylnego roztworu blokującego PLA do jednego zbiornika kanału i odessać z drugiej strony. Powtórz ten krok dla każdego kanału. Blok przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.
    1. Aby przygotować nawilżoną komorę, użyj 10 cm naczynia z mokrą chusteczką uszczelnioną folią woskową i umieść naczynie w inkubatorze. Alternatywnie można zastosować inne formaty komór wilgotnościowych, które zapewniają wilgotną atmosferę.
      UWAGA: Alternatywnie można użyć samodzielnie przygotowanego roztworu blokującego (np. 3% (w/v) BSA w PBS, sterylnie przefiltrowany).
  4. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe (1:100) w rozcieńczalniku przeciwciał PLA. Przygotować 30 μl roztworu na kanał. Dodaj oba przeciwciała pierwszorzędowe jednocześnie i vortex.
    UWAGA: Alternatywnie można użyć samodzielnie wykonanego rozcieńczalnika przeciwciał (np. 1% (w/v) BSA w PBS). Stosowane tutaj przeciwciała to kombinacje SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 i fosfo-SMAD1/5-SMAD4. Szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów.
  5. Przed zastosowaniem przeciwciał pierwszorzędowych należy odessać roztwór blokujący ze zbiorników, a także ostrożnie z kanału. Odpipetować 30 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego natychmiast do pustego kanału, przechylając kanał podczas dodawania roztworu.
    UWAGA: Usuń roztwór blokujący i dodaj roztwór przeciwciała kanał po kanale, aby upewnić się, że komórki nie wyschną pomiędzy nimi.
  6. Próbki z przeciwciałami pierwszorzędowymi inkubować przez noc w wilgotnych komorach w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Inkubację można również przeprowadzać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, jeśli jesteś zainteresowany kontynuowaniem następujących kroków tego samego dnia.

4. Inkubacja sondy PLA

UWAGA: Dla wszystkich kroków w sekcji 4.1-7.3, myjące A i B są przechowywane w temperaturze 4 °C i muszą być podgrzane do temperatury RT przed użyciem.

  1. Rozcieńczyć sondy PLA (+) -mysz i (-)-królik w stosunku 1:5 w roztworze rozcieńczalnika przeciwciał PLA (lub 1% BSA). Przygotuj 30 μl na kanał.
  2. Przemywać próbki 2x przez 5 minut przy użyciu 90 μl buforu płuczącego A w temperaturze pokojowej, dodając go do jednego ze zbiorników i ostrożnie zasysając z drugiego zbiornika. Powtórz ten krok dla każdego z 6 kanałów na slajdzie.
  3. Ostrożnie odessać bufor płuczący A i dodać 30 μl roztworu sondy PLA (przygotowanego w kroku 4.1), podobnie jak w przypadku dodawania przeciwciał pierwszorzędowych w kroku 3.5.
  4. Inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.

5. Podwiązanie

  1. Przemywać próbki 2 razy przez 5 minut, używając 90 μl buforu A do przemywania w temperaturze pokojowej, jak opisano w ppkt 4.2.
  2. Przygotować bufor do podwiązania w stosunku 1:5 w wodzie dejonizowanej. Użyj tego buforu, aby rozcieńczyć enzym ligazy do 1:40 (na lodzie). Użyj 30 μl na kanał.
  3. Całkowicie odessać bufor płuczący A i dodać roztwór do podwiązywania zgodnie z opisem w ppkt 3.5.
  4. Próbki inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.

6. Wzmocnienie

  1. Przemywać próbki 2 razy przez 2 minuty, używając 90 μl buforu płuczącego A w temperaturze pokojowej, jak opisano w ppkt 4.2.
  2. Przygotować bufor amplifikacyjny, rozcieńczając go w stosunku 1:5 w wodzie dejonizowanej i użyć go do rozcieńczenia enzymu polimerazy do 1:80 (na lodzie). Chronić przed światłem. Przygotuj 30 μl na kanał.
  3. Całkowicie odessać bufor płuczący A i natychmiast dodać przygotowany roztwór wzmacniający do pustego kanału, jak opisano w ppkt 3.5. Próbki inkubować przez 100 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze.

7. Montaż

  1. Przemywać próbki 2x przez 10 minut, używając 90 μl buforu płuczącego B w temperaturze pokojowej, jak opisano w ppkt 4.2. Dodać DAPI (1:500) z 1 mg/ml roztworu podstawowego (w wodzie dejonizowanej) w pierwszym płukaniu, aby zabarwić jądra. Nie susz kanału.
  2. Rozcieńczyć bufor B do przemywania w wodzie dejonizowanej (1:10) i przemyć 1x 90 μl 0,1x roztworu buforu B, jak opisano w 4.2.
  3. Całkowicie odessać bufor płuczący B i natychmiast dodać 2-3 krople płynnego medium montażowego do jednego zbiornika. Rozprowadź go w kanale, przechylając suwak. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w wilgotnym środowisku do czasu wykonania obrazowania.

8. Akwizycja obrazu

  1. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Upewnij się, że dostępne są odpowiednie filtry pasujące do fluorescencyjnych sond PLA.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, korzystne jest użycie mikroskopu konfokalnego, ponieważ uzyskane plamki PLA są bardziej zdefiniowane. Wspiera to również dalsze przetwarzanie obrazu i analizę danych.

9. Analiza obrazu i kwantyfikacja za pomocą ImageJ/FIJI

  1. Przetwarzaj wyeksportowane obrazy (.tiff) za pomocą programu do przetwarzania obrazów, takiego jak ImageJ27.
    UWAGA: Wszystkie skrypty używane w tym badaniu, które są niezbędne do automatycznego zliczania zdarzeń komórkowych, jądrowych i wszystkich zdarzeń PLA (na komórkę) można znaleźć w repozytorium GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Wykonaj analizę statystyczną za pomocą dowolnego odpowiedniego programu lub narzędzia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej używaliśmy PLA do wykrywania interakcji różnych białek SMAD3 i analizowaliśmy zmiany w fosforylacji SMAD wywołane naprężeniami ścinającymi28.

Tutaj obie metody zostały połączone z protokołem opisanym powyżej. HUVEC poddano naprężeniom ścinającym 1 dyn/cm2 i 30 dyn/cm2 i przeanalizowano pod kątem interakcji czynników transkrypcyjnych SMAD. Pokazujemy, że w porównaniu z wysokim naprężeniem ścinającym (30 dyn/cm2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół oparty na PLA oferuje skuteczny sposób określania bliskiej odległości dwóch białek (np. ich bezpośredniej interakcji) w EC narażonych na naprężenia ścinające z rozdzielczością ilościową i przestrzenną. Dzięki zastosowaniu szkiełek przepływowych z wieloma równoległymi kanałami, w identycznych warunkach mechanicznych można jednocześnie badać kilka różnych oddziaływań białkowych w komórkach. W przeciwieństwie do tego, niestandardowe systemy komór przepływowych często wykorzystują pojedynczy kanał, któ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Marii Reichenbach i dr Christianowi Hiepenowi za wsparcie w systemie konfiguracji przepływu oraz Eleanor Fox i Yunyun Xiao za krytyczne przeczytanie manuskryptu. Projekt P-L.M. został sfinansowany przez międzynarodową Szkołę Badawczą im. Maxa Plancka IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). PK otrzymała dofinansowanie z DFG-SFB1444. Rysunek 1 został stworzony przy użyciu BioRender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
µ-Slide VI 0.4ibidi806066-kanałowy suwak
Chlorek amonuCarl RothK298.1Hartowanie
albuminy surowicy bydlęcejCarl Roth8076.4Blokowanie
DAPISigma Aldrich / MerckD9542Barwienie DNA/Jądra
DPBSPAN BiotechP04-53500PBS
Duolink In Odczynniki do wykrywania situ Zestaw GreenSigma Aldrich / MerckDUO92014PLA zawierający ligazę, bufor ligacyjny, polimerazę i bufor amplifikacyjny (z oligonukleotydami oznaczonymi na zielono)
Sonda Duolink In Situ PLA Anti-Mouse MINUSSigma Aldrich / MerckDUO92004Sonda
MINUS Duolink In Situ PLA Anti-Rabbit PLUSSonda
Sigma Aldrich / Merck DUO92002 PLUSdo płukania Duolink In situ, fluorescencyjnepłuczące Sigma Aldrich / MerckDUO82049PLA A i B
Suplement na wzrost komórek śródbłonkaSuplement Corningdla pożywki (EKGS)
Cielęta płodu Suplement surowicydla pożywki
Oprogramowanie do analizy obrazuFIJI
Roztwór formaldehydu 4% buforowanyKLINIPATH/VWRVWRK4186. BO1PFA
Pełna pożywkaM199 pożywka podstawowa +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 &mikro; g/mL HEP +    50 &mikro; g/ml EKG
Żelatyna ze skóry świni, typ ASigma AldrichG2500Stosować 0,1% w PBS do powlekania kanałów przepływowych
GraphPad Prism v.7GarphPadużywany do wykresów i obliczeń statystycznych
Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świńSigma AldrichH4784-250MGsuplement do pośrednich (Hep)
HUVECs
ibidi Medium montażoweibidi50001Medium do montażu cieczy
System pomp ibidiPompa pneumatyczna ibidi10902Mikroskop
konfokalnyLeicaTCS SP8
L-Glutamina 200mMPAN BiotechP04-80100suplement do podłoża (L-Glu)
Medium 199Sigma AldrichM2154Podłoże bazowe
mysie przeciwciało anty-SMAD1Abcamab53745Nadaje się do
mysiego przeciwciała anty-SMAD2/3PLA BD Bioscience610843Nie nadaje się do PLA w połączeniu z CST 9515
mousee anty-SMAD4Przeciwciało Sanata Cruz Biotechnologysc-7966Nadaje się do PLA
Penicylina 10.000U/ml / Streptomycyna 10mg/mlPAN BiotechP06-07100suplement do podłoża (P/ S)
Zestaw perfuzyjny BIAŁYibidi10963Rurki używane do 1 dyn / cm2
Zestaw perfuzyjny ŻÓŁTY i ZIELONYibidi10964Rurki używane do 30 dyn / cm2< / sup>królik
Technologie sygnalizacji komórkowejprzeciwciała SMAD1 / 59516Nadaje się do PLA
królika anty-SMAD2 / 3 XPTechnologie sygnalizacji komórkowej8685Nadaje się dla PLA
królik anty-SMAD4Technologie sygnalizacji komórkowej9515Nie nadaje się do PLA w połączeniu z BD
610843 Złącze szeregowe do &mikroszkiełekRurki połączenioweszeregowe ibidi10830
Triton X-100Carl Roth6683.1Permeabilizacja
Program statystyczny przeciwciał przeciwciał

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
  2. Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  3. Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557(2019).
  4. Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
  5. Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
  6. Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
  7. Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
  8. Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756(2018).
  9. Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
  10. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. Dijke, P. T., Heldin, C. -H. , Springer Netherlands. Dordrecht. 277-293 (2006).
  11. Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989(2018).
  12. Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  13. Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
  14. MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
  15. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  16. Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980(2019).
  17. Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
  18. Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
  19. van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
  20. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
  21. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  22. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  23. Alam, M. S. Proximity Ligation Assay (PLA). Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58(2018).
  24. Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012).
  25. Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019).
  26. ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. Advanced Biology. 5 (2), 2000051(2021).
  29. Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TGF Beta SignalingBMP SignalingSMAD ComplexesFluid Shear StressProximity Ligation AssayEndothelial CellsTranscription Factor ComplexesMicrofluidic Flow ChannelsFluorescence MicroscopyVascular Biology

Related Articles