Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego

Summary

Tutaj ustalamy protokół jednoczesnej wizualizacji i analizy wielu kompleksów SMAD za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (PLA) w komórkach śródbłonka narażonych na patologiczne i fizjologiczne warunki stresu ścinającego płyny.

Abstract

Transforming Growth Factor β (TGFβ)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) sygnalizacja jest ściśle regulowana i zrównoważona podczas rozwoju i homeostazy układu naczyniowego Dlatego deregulacja w tym szlaku sygnałowym powoduje poważne patologie naczyniowe, takie jak nadciśnienie tętnicze płucne, dziedziczne teleangiektazje krwotoczne i miażdżyca. Komórki śródbłonka (EC), jako najbardziej wewnętrzna warstwa naczyń krwionośnych, są stale narażone na naprężenia ścinające płynów (SS). Wykazano, że nieprawidłowe wzorce płynnego SS wzmacniają sygnalizację TGFβ / BMP, która wraz z innymi bodźcami indukuje miażdżycę. W związku z tym stwierdzono, że atheropronowe, niskolaminarne SS wzmacnia sygnalizację TGFβ / BMP, podczas gdy aterrotekcyjne, wysoko laminarne SS, zmniejsza tę sygnalizację. Aby skutecznie analizować aktywację tych szlaków, zaprojektowaliśmy przepływ pracy do badania tworzenia kompleksów czynników transkrypcyjnych w warunkach niskiego laminarnego SS i wysokiego laminarnego SS przy użyciu dostępnego na rynku systemu pomp pneumatycznych i testu ligacji zbliżeniowej (PLA).

Aktywna sygnalizacja TGFβ/BMP wymaga utworzenia trimerycznych kompleksów SMAD składających się z dwóch regulatorowych SMAD (R-SMAD); SMAD2/3 i SMAD1/5/8 odpowiednio dla sygnalizacji TGFβ i BMP) ze wspólnym mediatorem SMAD (co-SMAD; SMAD4). Stosując PLA ukierunkowane na różne podjednostki trimerycznego kompleksu SMAD, tj. R-SMAD/co-SMAD lub R-SMAD/R-SMAD, tworzenie aktywnych kompleksów czynników transkrypcyjnych SMAD można zmierzyć ilościowo i przestrzennie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Użycie suwaków przepływu z 6 małymi równoległymi kanałami, które mogą być połączone szeregowo, pozwala na badanie tworzenia kompleksu czynników transkrypcyjnych i włączenie niezbędnych kontroli.

Opisany tutaj przepływ pracy można łatwo dostosować do badań ukierunkowanych na bliskość SMAD do innych czynników transkrypcyjnych lub do kompleksów czynników transkrypcyjnych innych niż SMAD, w różnych warunkach płynnego SS. Przedstawiony tutaj przepływ pracy pokazuje szybki i skuteczny sposób badania indukowanej płynem sygnalizacji TGFβ / BMP w EC indukowanej przez SS, zarówno ilościowo, jak i przestrzennie.

Introduction

Białka z nadrodziny transformujących czynników wzrostu beta (TGFβ) to plejotropowe cytokiny o różnych członkach, w tym TGFβ, białka morfogenetyczne kości (BMP) i Activins^1,2. Wiązanie ligandów indukuje tworzenie oligomerów receptorowych, co prowadzi do fosforylacji, a tym samym aktywacji cytozolowego regulatorowego SMAD (R-SMAD). W zależności od podrodziny ligandów aktywowane są różne R-SMAD^1,2. Podczas gdy TGFβ i aktywiny głównie indukują fosforylację SMAD2 / 3, BMP indukują fosforylację SMAD1 / 5/8. Istnieją jednak coraz więcej dowodów na to, że BMP ....

Protocol

1. Hodowla komórkowa i ekspozycja na naprężenia ścinające płynów

UWAGA: Ludzkie EC żyły pępowinowej (HUVEC) zostały użyte jako przykład do badania indukowanej SS interakcji SMAD. Opisany poniżej protokół można zastosować do każdego typu komórki reagującej na SS.

1. Pokryj 6-kanałowy szkiełko 0,1% żelatyną ze skóry świń w PBS przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
2. Nasiona HUVEC w wstępnie powlekanych szkiełkach 6-kanałowych o gęstości 2,5 x 10⁶ komórek na ml w 30 μl pełnego podłoża M199.
   UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat rozsiewania komórek na slajdzie przepływu, zobacz reference

Results

Wcześniej używaliśmy PLA do wykrywania interakcji różnych białek SMAD³ i analizowaliśmy zmiany w fosforylacji SMAD wywołane naprężeniami ścinającymi²⁸.

Tutaj obie metody zostały połączone z protokołem opisanym powyżej. HUVEC poddano naprężeniom ścinającym 1 dyn/^cm2 i 30 dyn/^cm2 i przeanalizowano pod kątem interakcji czynników transkrypcyjnych SMAD. Pokazujemy, że w porównaniu z wysokim naprężeniem ścinającym (30 dyn/cm^2.......

Discussion

Opisany tutaj protokół oparty na PLA oferuje skuteczny sposób określania bliskiej odległości dwóch białek (np. ich bezpośredniej interakcji) w EC narażonych na naprężenia ścinające z rozdzielczością ilościową i przestrzenną. Dzięki zastosowaniu szkiełek przepływowych z wieloma równoległymi kanałami, w identycznych warunkach mechanicznych można jednocześnie badać kilka różnych oddziaływań białkowych w komórkach. W przeciwieństwie do tego, niestandardowe systemy komór przepływowych często wykorzystują pojedynczy kanał, któ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide VI 0.4	ibidi	80606	6-kanałowy suwak
Chlorek amonu	Carl Roth	K298.1	Hartowanie
albuminy surowicy bydlęcej	Carl Roth	8076.4	Blokowanie
DAPI	Sigma Aldrich / Merck	D9542	Barwienie DNA/Jądra
DPBS	PAN Biotech	P04-53500	PBS
Duolink In Odczynniki do wykrywania situ Zestaw Green	Sigma Aldrich / Merck	DUO92014	PLA zawierający ligazę, bufor ligacyjny, polimerazę i bufor amplifikacyjny (z oligonukleotydami oznaczonymi na zielono)
Sonda Duolink In Situ PLA Anti-Mouse MINUS	Sigma Aldrich / Merck	DUO92004	Sonda
MINUS Duolink In Situ PLA Anti-Rabbit PLUS	Sonda
Sigma Aldrich / Merck DUO92002 PLUSdo płukania Duolink In situ, fluorescencyjne	płuczące Sigma Aldrich / Merck	DUO82049	PLA A i B
Suplement na wzrost komórek śródbłonka	Suplement Corning		dla pożywki (EKGS)
Cielęta płodu Suplement surowicy			dla pożywki
Oprogramowanie do analizy obrazu	FIJI
Roztwór formaldehydu 4% buforowany	KLINIPATH/VWR	VWRK4186. BO1	PFA
Pełna pożywka			M199 pożywka podstawowa +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu +  25 &mikro; g/mL HEP +    50 &mikro; g/ml EKG
Żelatyna ze skóry świni, typ A	Sigma Aldrich	G2500	Stosować 0,1% w PBS do powlekania kanałów przepływowych
GraphPad Prism v.7	GarphPad		używany do wykresów i obliczeń statystycznych
Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń	Sigma Aldrich	H4784-250MG	suplement do pośrednich (Hep)
HUVECs
ibidi Medium montażowe	ibidi	50001	Medium do montażu cieczy
System pomp ibidi	Pompa pneumatyczna ibidi	10902	Mikroskop
konfokalny	Leica		TCS SP8
L-Glutamina 200mM	PAN Biotech	P04-80100	suplement do podłoża (L-Glu)
Medium 199	Sigma Aldrich	M2154	Podłoże bazowe
mysie przeciwciało anty-SMAD1	Abcam	ab53745	Nadaje się do
mysiego przeciwciała anty-SMAD2/3	PLA BD Bioscience	610843	Nie nadaje się do PLA w połączeniu z CST 9515
mousee anty-SMAD4	Przeciwciało Sanata Cruz Biotechnology	sc-7966	Nadaje się do PLA
Penicylina 10.000U/ml / Streptomycyna 10mg/ml	PAN Biotech	P06-07100	suplement do podłoża (P/ S)
Zestaw perfuzyjny BIAŁY	ibidi	10963	Rurki używane do 1 dyn / cm2
Zestaw perfuzyjny ŻÓŁTY i ZIELONY	ibidi	10964	Rurki używane do 30 dyn / cm2< / sup>królik
Technologie sygnalizacji komórkowej	przeciwciała SMAD1 / 5	9516	Nadaje się do PLA
królika anty-SMAD2 / 3 XP	Technologie sygnalizacji komórkowej	8685	Nadaje się dla PLA
królik anty-SMAD4	Technologie sygnalizacji komórkowej	9515	Nie nadaje się do PLA w połączeniu z BD
610843 Złącze szeregowe do &mikroszkiełek	Rurki połączeniowe	szeregowe ibidi	10830
Triton X-100	Carl Roth	6683.1	Permeabilizacja