Korzystanie z poszycia bazowego i miniskopu wstępnie zakotwiczonego z soczewką obiektywową do badań nad stanami przejściowymi wapnia u myszy

Yi-Tse Hsiao; Angela Yu-Chi Wang; Ting-Yen Lee; Ching-Yuan Chang

doi:10.3791/62611

Artykuł metodologiczny

Korzystanie z poszycia bazowego i miniskopu wstępnie zakotwiczonego z soczewką obiektywową do badań nad stanami przejściowymi wapnia u myszy

DOI:

10.3791/62611

⸱

5 czerwca 2021

Yi-Tse Hsiao¹ , Angela Yu-Chi Wang¹ , Ting-Yen Lee¹ , Ching-Yuan Chang¹

¹Department of Veterinary Medicine, School of Veterinary Medicine, National Taiwan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kurczenie się cementu dentystycznego podczas utwardzania powoduje przemieszczenie płyty podstawy. Protokół ten minimalizuje problem poprzez stworzenie początkowego fundamentu z cementu dentystycznego, który pozostawia miejsce na zacementowanie płyty podstawy. Kilka tygodni później płyta podstawy może zostać zacementowana na rusztowaniu przy użyciu niewielkiej ilości nowego cementu, zmniejszając w ten sposób skurcz.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurobiolodzy używają miniaturowych mikroskopów (miniskopów) do obserwacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się zwierząt. Zespół Miniskopów Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles (UCLA) zapewnia naukowcom otwarte zasoby do samodzielnego budowania miniskopów. Miniskop V3 UCLA jest jednym z najpopularniejszych obecnie używanych miniskopów typu open source. Pozwala na obrazowanie przejściowych stanów fluorescencji emitowanych przez genetycznie zmodyfikowane neurony przez soczewkę obiektywną wszczepioną w korę powierzchowną (system jednosoczewkowy) lub w głębokich obszarach mózgu poprzez kombinację soczewki przekaźnikowej wszczepionej w głęboki mózg i soczewki obiektywnej, która jest wstępnie zakotwiczona w miniskopie w celu obserwacji przekazywanego obrazu (system dwusoczewkowy). Nawet w optymalnych warunkach (gdy neurony wyrażają wskaźniki fluorescencji, a soczewka przekaźnikowa została prawidłowo wszczepiona), zmiana objętości cementu dentystycznego między płytką bazową a jej przyczepieniem do czaszki po utwardzeniu cementu może spowodować niewspółosiowość ze zmienioną odległością między soczewkami obiektywu i przekaźnika, co skutkuje słabą jakością obrazu. Płytka bazowa to płytka, która pomaga zamontować miniskop na czaszce i ustala odległość roboczą między obiektywem a soczewkami przekaźnikowymi. W ten sposób zmiany objętości cementu dentystycznego wokół płytki podstawy zmieniają odległość między soczewkami. Niniejszy protokół ma na celu zminimalizowanie problemu niewspółosiowości spowodowanego zmianami objętości cementu dentystycznego. Protokół zmniejsza niewspółosiowość poprzez zbudowanie początkowego fundamentu z cementu dentystycznego podczas implantacji soczewki przekaźnikowej. Czas rekonwalescencji po implantacji jest wystarczający, aby fundament z cementu dentystycznego całkowicie utwardził płytę podstawy, dzięki czemu płytkę podstawy można zacementować na tym rusztowaniu przy użyciu jak najmniejszej ilości nowego cementu. W niniejszym artykule opisujemy strategie baseplatingu u myszy, aby umożliwić obrazowanie aktywności neuronalnej za pomocą soczewki obiektywu zakotwiczonej w miniskopie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reportery aktywności fluorescencyjnej są idealne do obrazowania aktywności neuronalnej, ponieważ są czułe i mają duże zakresy dynamiki¹^,²^,³. Dlatego coraz więcej eksperymentów wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną do bezpośredniej obserwacji aktywności neuronalnej¹^,²^,³^,⁴^,5^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. Pierwszy zminiaturyzowany jednofotonowy mikroskop fluorescencyjny (miniskop) został zaprojektowany w 2011 roku przez Marka Schnitzera i wsp.⁵. Ten miniskop umożliwia naukowcom monitorowanie dynamiki fluorescencji komórek móżdżku u swobodnie zachowujących się zwierząt⁵ (tj. bez żadnych fizycznych ograniczeń, krępowania głowy, sedacji lub znieczulenia zwierząt). Obecnie technika ta może być stosowana do monitorowania powierzchownych obszarów mózgu, takich jak kora⁶^,⁸^,¹⁵^,¹⁶; obszary podkorowe, takie jak grzbietowy hipokamp⁸^,¹¹^,¹³^,¹⁴ i striatum⁶^,¹⁷; oraz głębokie obszary mózgu, takie jak brzuszny hipokamp¹⁴, amygdala¹⁰^,¹⁸ i hypothalamus⁸^,¹².

W ostatnich latach opracowano kilka miniskopów o otwartym kodzie źródłowym⁴^,5^,6^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁷^,¹⁹. Miniskop może być ekonomicznie zmontowany przez badaczy, jeśli będą postępować zgodnie z wytycznymi krok po kroku dostarczonymi przez zespół Miniscope Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles (UCLA)⁴^,⁷^,¹¹^,¹³. Ponieważ optyczne monitorowanie aktywności neuronalnej jest ograniczone przez ograniczenia transmisji światła⁷ do i z populacji neuronów będących przedmiotem zainteresowania, zaprojektowano miniskop, który wymaga wstępnego zakotwiczenia soczewki o indeksie refrakcyjnym gradientu (GRIN) (lub soczewki obiektywowej) na dole miniskopu w celu powiększenia pola widzenia, które jest przekazywane z soczewki przekaźnikowej GRIN (lub soczewki przekaźnikowej)⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. Ta soczewka przekaźnikowa jest wszczepiana do docelowego obszaru mózgu w taki sposób, że aktywność fluorescencyjna docelowego obszaru mózgu jest przekazywana na powierzchnię soczewki przekaźnika⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. Około 1/4 pełnego sinusoidalnego okresu światła przechodzi przez soczewkę obiektywu GRIN (skok ~ 0,25) (Rysunek 1A1), co daje powiększony obraz fluorescencyjny⁶^,⁷. Soczewka obiektywu nie zawsze jest zamocowana na dole miniskopu ani nie jest konieczne wszczepienie soczewki przekaźnikowej⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵. W szczególności istnieją dwie konfiguracje: jedna ze stałą soczewką obiektywu w miniskopie i soczewką przekaźnikową wszczepioną w mózg⁸^,¹⁰^,¹²^,¹⁴^,¹⁶ (Rysunek 1B1) oraz druga tylko ze zdejmowaną soczewką obiektywu⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ (Rysunek 1B2). W projekcie opartym na kombinacji obiektywu stałego i wszczepionej soczewki przekaźnikowej, sygnały fluorescencyjne z mózgu są doprowadzane do górnej powierzchni soczewki przekaźnika (Rysunek 1A1)⁷^,⁸^,¹⁰^,¹²^,¹⁴^,¹⁶. Następnie soczewka obiektywu może powiększać i przesyłać pole widzenia z górnej powierzchni soczewki przekaźnikowej (Rysunek 1A2). Z drugiej strony, konstrukcja soczewki GRIN z wymiennym obiektywem jest bardziej elastyczna, co oznacza, że preimplantacja soczewki przekaźnikowej do mózgu nie jest obowiązkowa (Rysunek 1B2)⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵. Korzystając z miniskopu opartego na zdejmowanej soczewce obiektywu, badacze nadal muszą wszczepić soczewkę do docelowego obszaru mózgu, ale mogą wszczepić soczewkę obiektywu⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ lub soczewkę przekaźnikową w mózgu⁶^,⁷. Wybór obiektywu lub soczewki przekaźnikowej do implantacji determinuje konfigurację miniskopu, której badacz musi użyć. Na przykład miniskop V3 UCLA jest oparty na zdejmowanej konstrukcji soczewki obiektywu GRIN. Badacze mogą zdecydować się na bezpośrednie wszczepienie soczewki obiektywu w obszarze mózgu będącym przedmiotem zainteresowania i zamontowanie "pustego" miniskopu na soczewce obiektywu⁶^,⁷^,¹¹^,¹³^,¹⁵ (system z jedną soczewką; Rysunek 1B2) lub wszczepić soczewkę przekaźnikową do mózgu i zamontować miniskop, który jest wstępnie zakotwiczony w soczewce obiektywu⁶^,⁷ (system dwusoczewkowy; Rysunek 1B1). Miniskop działa następnie jako kamera fluorescencyjna, rejestrując na żywo obrazy fluorescencji neuronów wytwarzanej przez genetycznie kodowany wskaźnik wapnia¹^,²^,³. Po podłączeniu miniskopu do komputera, te obrazy fluorescencyjne mogą być przesyłane do komputera i zapisywane jako klipy wideo. Naukowcy mogą badać aktywność neuronalną, analizując względne zmiany fluorescencji za pomocą niektórych pakietów analitycznych²⁰^,²¹ lub napisać swoje kody do przyszłej analizy.

Miniskop V3 UCLA zapewnia użytkownikom elastyczność w określaniu, czy obrazować aktywność neuronalną za pomocą systemu jedno- czy dwusoczewkowego⁷. Wybór systemu rejestracji zależy od głębokości i wielkości docelowego obszaru mózgu. Krótko mówiąc, system jednosoczewkowy może obrazować tylko obszar, który jest powierzchowny (mniej niż około 2,5 mm głębokości) i stosunkowo duży (większy niż około 1,8 x 1,8 mm²), ponieważ producenci produkują tylko określony rozmiar soczewki obiektywowej. W przeciwieństwie do tego, system dwóch soczewek może być zastosowany do dowolnego docelowego obszaru mózgu. Jednak cement dentystyczny do przyklejania płytki bazowej ma tendencję do powodowania niewspółosiowości przy zmienionej odległości między soczewkami obiektywu i przekaźnika, co skutkuje słabą jakością obrazu. Jeśli używany jest system dwóch soczewek, dwie odległości robocze muszą być precyzyjnie wybrane, aby osiągnąć optymalną jakość obrazowania (Rysunek 1A). Te dwie krytyczne odległości robocze znajdują się między neuronami a dolną powierzchnią soczewki przekaźnika oraz między górną powierzchnią soczewki przekaźnika a dolną powierzchnią soczewki obiektywu (Rysunek 1A1). Jakakolwiek niewspółosiowość lub niewłaściwe umieszczenie soczewki poza odległością roboczą powoduje awarię obrazowania (Rysunek 1C2). W przeciwieństwie do tego, system z jedną soczewką wymaga tylko jednej precyzyjnej odległości roboczej. Jednak rozmiar soczewki obiektywu ogranicza jego zastosowanie do monitorowania głębokich obszarów mózgu (soczewka obiektywu pasująca do miniskopu ma około 1,8 ~ 2,0 mm⁶^,¹¹^,¹³^,¹⁵). W związku z tym wszczepienie soczewki obiektywnej jest ograniczone do obserwacji powierzchni i stosunkowo dużych obszarów mózgu, takich jak kora⁶^,¹⁵ i grzbietowy róg amonisa 1 (CA1) u myszy¹¹^,¹³ . Ponadto duży obszar kory mózgowej musi być odessany, aby celować w grzbietowy CA1¹¹^,¹³. Ze względu na ograniczenie konfiguracji z jedną soczewką, która uniemożliwia obrazowanie głębokich obszarów mózgu, komercyjne systemy miniskopowe oferują tylko konstrukcję z kombinacją soczewek obiektywowych i przekaźników (dwusoczewkowych). Z drugiej strony, miniskop V3 UCLA może być zmodyfikowany do systemu jedno- lub dwusoczewkowego, ponieważ jego soczewka obiektywu jest wymienna⁶^,¹¹^,¹³^,¹⁵. Innymi słowy, użytkownicy miniskopu V3 UCLA mogą korzystać z wymiennej soczewki, wszczepiając ją do mózgu (tworząc system jednosoczewkowy), podczas wykonywania eksperymentów obejmujących powierzchowne obserwacje mózgu (poniżej 2,5 mm głębokości) lub poprzez wstępne zakotwiczenie jej w miniskopie i wszczepienie soczewki przekaźnikowej do mózgu (tworząc system dwóch soczewek), podczas wykonywania eksperymentów obejmujących głębokie obserwacje mózgu. System dwóch soczewek może być również stosowany do powierzchownej obserwacji mózgu, ale badacz musi znać dokładne odległości robocze między soczewką obiektywu a soczewką przekaźnikową. Główną zaletą systemu z jedną soczewką jest to, że istnieje mniejsze prawdopodobieństwo pominięcia odległości roboczych niż w przypadku systemu z dwiema soczewkami, biorąc pod uwagę, że istnieją dwie odległości robocze, które muszą być precyzyjnie wycelowane, aby osiągnąć optymalną jakość obrazowania w systemie dwusoczewkowym (Rysunek 1A). Dlatego zalecamy stosowanie systemu jednosoczewkowego do powierzchownych obserwacji mózgu. Jeśli jednak eksperyment wymaga obrazowania w głębokim obszarze mózgu, badacz musi nauczyć się unikać niewspółosiowości dwóch soczewek.

Podstawowy protokół konfiguracji miniskopów z dwoma soczewkami do eksperymentów obejmuje implantację soczewek i baseplate⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. Baseplating to przyklejenie płytki bazowej do głowy zwierzęcia, tak aby miniskop mógł być ostatecznie zamontowany na zwierzęciu i nagrywał sygnały fluorescencyjne neuronów (Rysunek 1B). Procedura ta polega na użyciu cementu dentystycznego do przyklejenia płytki bazowej do czaszki (Rysunek 1C), ale kurczenie się cementu dentystycznego może spowodować niedopuszczalne zmiany odległości między wszczepioną soczewką przekaźnikową a soczewką obiektywu8^,¹⁷. Jeśli przesunięta odległość między dwoma obiektywami jest zbyt duża, nie można ustawić ostrości na komórkach.

Szczegółowe protokoły eksperymentów z głębokim obrazowaniem wapnia w mózgu przy użyciu miniskopów zostały już opublikowane⁸^,¹⁰^,¹⁶^,¹⁷. Autorzy tych protokołów korzystali z systemu Inscopix⁸^,¹⁰^,¹⁶ lub innych niestandardowych projektów¹⁷ i opisali eksperymentalne procedury selekcji wirusów, chirurgii i mocowania płytki podstawowej. Jednak ich protokoły nie mogą być precyzyjnie stosowane do innych systemów open source, takich jak system V3 UCLA Miniscope, NINscope⁶ i Finchscope¹⁹. Niewspółosiowość dwóch soczewek może wystąpić podczas nagrywania w konfiguracji z dwoma obiektywami za pomocą miniskopu UCLA ze względu na rodzaj cementu dentystycznego, który jest używany do przymocowania płytki bazowej do czaszki⁸^,¹⁷ (Rysunek 1C). Obecny protokół jest potrzebny, ponieważ odległość między wszczepioną soczewką przekaźnikową a soczewką obiektywu jest podatna na przesuwanie się z powodu niepożądanego skurczu cementu dentystycznego podczas procedury powlekania podstawy. Podczas powlekania bazowego należy znaleźć optymalną odległość roboczą między wszczepioną soczewką przekaźnika a soczewką obiektywu, regulując odległość między miniskopem a górną częścią soczewki przekaźnika, a następnie przykleić płytkę bazową w tym idealnym miejscu. Po ustawieniu prawidłowej odległości między soczewką obiektywu a wszczepioną soczewką przekaźnikową, można uzyskać pomiary podłużne w rozdzielczości komórkowej (Rysunek 1B; Nagrywanie in vivo). Ponieważ optymalny zakres odległości roboczych soczewki przekaźnikowej jest mały (50 - 350 μm)⁴^,⁸, nadmierny skurcz cementu podczas utwardzania może utrudnić utrzymanie soczewki obiektywu i wszczepionej soczewki przekaźnikowej w odpowiednim zakresie. Ogólnym celem tego raportu jest opracowanie protokołu mającego na celu zmniejszenie problemów z kurczeniem się⁸^,¹⁷, które występują podczas procedury powlekania bazowego, oraz zwiększenie wskaźnika powodzenia miniskopowych zapisów sygnałów fluorescencyjnych w konfiguracji dwusoczewkowej. Udane nagranie miniskopowe definiuje się jako nagranie na żywo zauważalnych względnych zmian we fluorescencji poszczególnych neuronów u swobodnie zachowującego się zwierzęcia. Chociaż różne marki cementu dentystycznego mają różne współczynniki skurczu, badacze mogą wybrać markę, która została wcześniej przetestowana⁶^,⁷^,⁸^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,²². Jednak nie każda marka jest łatwa do zdobycia w niektórych krajach/regionach ze względu na przepisy importowe dotyczące materiałów medycznych. Dlatego opracowaliśmy metody testowania szybkości skurczu dostępnych cementów dentystycznych i, co ważne, zapewniamy alternatywny protokół, który minimalizuje problem skurczu. Przewagą nad obecnym protokołem powlekania bazowego jest zwiększenie wskaźnika powodzenia obrazowania wapnia za pomocą narzędzi i cementu, które można łatwo uzyskać w laboratoriach. Jako przykład używany jest miniskop UCLA, ale protokół ma również zastosowanie do innych miniskopów. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowaną procedurę powlekania podstawowego, a także zalecamy kilka strategii montażu systemu dwóch soczewek miniskopu UCLA (Rysunek 2A). Przedstawiono zarówno przykłady udanej implantacji (n = 3 myszy), jak i przykłady nieudanej implantacji (n = 2 myszy) dla konfiguracji dwusoczewkowej z miniskopem UCLA wraz z omówieniem przyczyn sukcesów i porażek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego (nr zatwierdzenia: NTU-109-EL-00029 i NTU-108-EL-00158).

1. Ocena zmiany objętości cementu dentystycznego

UWAGA: Zmiany w objętości cementu dentystycznego występują podczas procesu utwardzania. Przetestuj zmiany objętości cementu dentystycznego przed implantacją i płytą bazową. Naukowcy mogą przetestować dowolną markę cementu dentystycznego i użyć marki o najmniejszej zmianie objętości do zacementowania płytki podstawowej. Przykład jest pokazany w Rysunek 3.

Odważyć 0,5 g każdego proszku cementu dentystycznego i wymieszać go z odpowiednim roztworem (1 ml).
UWAGA: Zalecany stosunek proszku do cieczy w instrukcjach dotyczących cementu dentystycznego wynosi 0,5 g proszku na 0,25 ml roztworu w celu uzyskania postaci stałej. W tym protokole testowym rozcieńcza się stosunek do 0,5 g/ml, tak aby mieszanina mogła być zasysana w postaci płynnej w celu zmierzenia zmiany objętości końcówek pipet.
Użyj końcówek do pipet o pojemności 0,1-10 μl, aby usunąć 2,5 μl mieszanki cementu dentystycznego, a następnie uszczelnij końcówkę pipety lekko utwardzalnym klejem.
Umieść końcówki na stojaku, zaznacz najwyższe poziomy mieszanki cementu dentystycznego i zmierz poziom mieszanki cementu dentystycznego po 40 minutach (film uzupełniający S1).
Oprócz monitorowania zmian poziomu podczas utwardzania cementu dentystycznego w końcówkach, należy zmierzyć pozostałą gęstość suchego cementu dentystycznego. Aby obliczyć gęstość, zmierz wagę cementu dentystycznego i zmierz objętość zgodnie z zasadą Archimedesa.
1. Krótko mówiąc, umieść pozostały suchy cement dentystyczny w kubku wypełnionym wodą i zważ przelewającą się wodę.
Używaj cementu dentystycznego o najmniejszym skurczu dla wszystkich protokołów opisanych poniżej.

2. Znieczulenie, chirurgiczne wszczepienie, iniekcja wirusowa i pozorowanie

podłoża

Anesthesia
UWAGA: Niniejszy raport ma na celu optymalizację procedury chirurgicznej i podstawowej dla miniskopu UCLA; W związku z tym założono, że znane jest optymalne miano wirusa do zakażenia docelowych obszarów mózgu. Metody znajdowania optymalnego miana wirusa można znaleźć w krokach od 1 do 5 w Resendez et al.⁸. Po zoptymalizowaniu rozcieńczenia wirusa można rozpocząć implantację chirurgiczną.
1. Umieść mysz w pojemniku indukcyjnym i zapewnij tlen (100% przy natężeniu przepływu powietrza 0,2 l/min). Wstępnie dotlenij mysz przez 5 do 10 minut.
2. Podawaj 5% izofluranu zmieszanego ze 100% tlenem (szybkość przepływu powietrza: 0,2 l/min), aż mysz zacznie tracić równowagę i ostatecznie zostanie znieczulona.
3. Wyjąć mysz z komory indukcyjnej i wstrzyknąć atropinę (0,04 mg/kg; wstrzyknięcie podskórne), aby zapobiec gromadzeniu się śliny i buprenorfiny (0,03 mg/kg; wstrzyknięcie podskórne) jako środek przeciwbólowy.
4. Ogol głowę myszy.
5. Noś maskę, sterylny fartuch i rękawiczki. Przygotuj sterylną przestrzeń i sterylne narzędzia chirurgiczne do operacji. Ustabilizuj głowę myszy (na tym etapie utrzymuj znieczulenie 3 do 2,5% izofluranem) na aparacie stereotaksyjnym. Po zabiegach przeciwbólowych i znieczulających upewnij się, że nauszniki bezpiecznie stabilizują głowę. Zapewnij wsparcie termiczne.
6. Upewnij się, że głowa jest ustawiona w pozycji prostej, wysterylizuj ogoloną głowę betadyną, a następnie spryskaj głowę ksylokainą (10%), miejscowym środkiem przeciwbólowym.
7. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
  UWAGA: Używaj maści okulistycznej do ochrony oczu podczas wszystkich zdarzeń anestezjologicznych, aby zapobiec urazom oczu.
8. Przetestuj głęboki odruch bólu zwierzęcia, szczypiąc go w tylną łapę. Gdy zwierzę nie wykaże odruchu wycofania łapy, przystąp do zabiegów chirurgicznych.
9. Wykonaj małe nacięcie wzdłuż środkowej płaszczyzny strzałkowej czaszki (zaczynając od około 2 mm przed bregmą i kończąc około 6 mm za bregmą). Następnie oczyść tkankę łączną czaszki i zakotwicz trzy ze stali nierdzewnej na lewej kości czołowej i międzyciemieniowej.
  1. W tym momencie zmniejsz izofluran do 1-2%. Monitoruj częstość oddechów podczas całego zabiegu chirurgicznego. Jeśli częstość oddechów jest zbyt wolna (około 1/s, w zależności od zwierzęcia), należy zmniejszyć stężenie izofluranu.
10. Wykonaj kraniotomię w celu implantacji soczewki przekaźnikowej pod mikroskopem chirurgicznym lub mikroskopem stereoskopowym za pomocą wiertła do zadziorów o średnicy końcówki 0,7 mm. Użyj mikrowiertła, aby chwycić wiertło do zadziorów i narysuj kontur zamierzonego obszaru okręgu (nie trzeba penetrować całej grubości kalwarii).
  UWAGA: Soczewka przekaźnikowa używana w niniejszym protokole miała średnicę 1,0 mm, długość ~ 9,0 mm, skok 1 i zakres odległości roboczej ~100 μm - 300 μm; W związku z tym kraniotomia miała średnicę 1,2 mm.
  1. Delikatnie pogłębij kontur, aż opona twarda zostanie odsłonięta.
  2. Przygotuj 3 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej w strzykawce o pojemności 3 ml i ostudź go w wiaderku z lodem. Często spłukuj odsłonięty obszar 0,1 ml soli fizjologicznej ze strzykawki, aby schłodzić obszar i zapobiec uszkodzeniom cieplnym i krwotokom.
11. Delikatnie podnieś i oderwij oponę twardą za pomocą igły 27G.
12. Umieść oznaczenie na igle 27 G w odległości 1 mm od końcówki i użyj go do ostrożnego zassania kory mózgowej w celu stworzenia okna do wszczepienia soczewki⁸^,¹¹^,¹³^,¹⁷ (Rysunek 2B1). W razie potrzeby należy wykonać igłę, szlifując końcówkę igły iniekcyjnej o sile 27 g papierem ściernym. Następnie podłącz igłę do strzykawki, podłącz strzykawkę do rurki i podłącz rurkę do źródła ssania, aby wytworzyć podciśnienie.
  UWAGA: Soczewka przekaźnika jest i uciska tkankę mózgową, gdy zostanie umieszczona w głębokim obszarze mózgu. W ten sposób aspiracja kory zmniejsza uszkodzenia tkanek spowodowane implantacją soczewki przekaźnikowej. Kora ma grubość około 1 mm u myszy, ale jest trudna do uwidocznienia pod mikroskopem stereoskopowym. Znak tworzy punkt orientacyjny, który pozwala na dokładniejsze określenie głębokości igły niż w przypadku samego mikroskopu stereoskopowego. Ponadto można określić, czy obszar kory został osiągnięty lub przekroczony, w zależności od oporu; Górna część kory jest stosunkowo miękka, podczas gdy obszar podkorowy jest gęsty. Dlatego, gdy tekstura zacznie wydawać się gęstsza, zatrzymaj aspirację (Rysunek 2B3).
13. Przygotuj 3 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej w strzykawce o pojemności 3 ml i ostudź go w wiaderku z lodem. Spłucz obszar solą fizjologiczną, aby zatrzymać krwawienie i zmniejszyć możliwość obrzęku mózgu.
Wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem (AAV)
UWAGA: W niniejszym eksperymencie użyto AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE. jGCaMP7s to genetycznie kodowany wskaźnik wapnia, który emituje zieloną fluorescencję³. Ponieważ w niniejszym badaniu wykorzystano mysz typu dzikiego jako badanego, potrzebny był wektor wirusowy, aby transfekować neurony za pomocą genu zielonofluorescencyjnego wskaźnika wapnia i umożliwić ekspresję. Naukowcy wykorzystujący transgeniczne myszy wykazujące ekspresję zielonofluorescencyjnego wskaźnika wapnia jako ich badani mogą pominąć protokół 2.2.
1. Zamontuj wewnętrzną igłę cewnika dożylnego (dożylnego) 20 G na ramieniu stereotaktycznym i powoli nakłuwaj (~100 - 200 μm/min) mózg na odpowiednich współrzędnych (tych samych współrzędnych, które są używane podczas implantacji soczewki przekaźnikowej) (Rysunek 2B3).
2. Opuścić igłę do mikroiniekcji z prędkością 100-200 μm/min do brzusznego CA1 i wlać (~ 25 nL/min) 200 nL wektora wirusowego do obszaru docelowego (-3,16 mm AP, 3,25 mm ML i -3,50 mm DV z bregmy).
3. Odczekaj 10 minut, aby wirus mógł się rozproszyć i zminimalizować przepływ wsteczny.
4. Pobrać (~100-200 μm/min) igłę do mikroiniekcji.
Wszczepienie soczewki przekaźnikowej
1. Zdezynfekuj soczewkę przekaźnika 75% alkoholem¹⁰^,¹⁶, a następnie spłucz solą fizjologiczną bez pirogenów. Namocz soczewkę w zimnej soli fizjologicznej wolnej od pirogenów do czasu implantacji.
  UWAGA: Zimna soczewka minimalizuje obrzęk mózgu po umieszczeniu w mózgu.
2. Przytrzymaj soczewkę przekaźnika za pomocą zacisku mikro buldoga (Rysunek 2B3), którego zęby zostały pokryte rurką termokurczliwą.
  UWAGA: Buldog clamp może mocno trzymać obiektyw bez jego uszkodzenia. Zapoznaj się z Resendez et al.⁸, aby zapoznać się z metodą wykonania zacisku bulldog pokrytego rurką.
3. Powoli umieść (~100 - 200 μm/min) soczewkę przekaźnika na górze obszaru docelowego (-3.16 mm AP, 3.50 mm ML i -3.50 mm DV od bregmy) i ustabilizuj ją cementem dentystycznym.
Atrapa podstawy
UWAGA: Celem "pozorowania podłoża" podczas zabiegu implantacji jest stworzenie podstawy z cementu dentystycznego w celu zmniejszenia ilości cementu dentystycznego, który należy nałożyć podczas prawdziwej procedury poszycia kilka tygodni później. W ten sposób minimalizuje się ryzyko zmiany objętości cementu dentystycznego.
1. Zamocuj soczewkę obiektywu na spodzie miniskopu i zamontuj płytkę bazową na miniskopie (na tym etapie montaż zakotwiczonej soczewki obiektywu, płytki bazowej i miniskopu nie został jeszcze umieszczony nad czaszką myszy).
2. Owiń 10 cm folii parafinowej wokół zewnętrznej strony płytki bazowej (Rysunek 4A).
3. Przytrzymaj miniskop z sondą ramienia stereotaktycznego za pomocą klejącej glinki wielokrotnego użytku.
4. Ustaw soczewkę obiektywu na górze soczewki przekaźnika, zachowując jak najmniejszą przestrzeń między soczewkami (Rysunek 4B).
5. Użyj cementu dentystycznego, aby zabezpieczyć położenie płyty bazowej (tak, aby cement dotykał tylko filmu parafinowego).
6. Gdy cement dentystyczny wyschnie, usuń folię.
7. Zdejmij płytkę podstawy i miniskop. Podstawa cementu dentystycznego jest pusta (Rysunek 4B).
8. Aby chronić soczewkę przekaźnika przed codziennymi czynnościami i zarysowaniem przez mysz, uszczelnij soczewkę przekaźnika gumą silikonową, aż soczewka przekaźnika zostanie zakryta, a następnie przykryj gumę silikonową cienką warstwą cementu dentystycznego (Rysunek 4B).
9. Odłącz mysz od instrumentów stereotaktycznych i umieść ją w komorze odzyskiwania.
10. Wstrzyknąć karprofen (5 mg/kg; wstrzyknięcie podskórne) lub meloksykam (1 mg/kg; wstrzyknięcie podskórne) w celu znieczulenia i ceftazydym (25 mg/kg; wstrzyknięcie podskórne) w celu zapobieżenia zakażeniu.
  UWAGA: Stosowanie antybiotyków nie jest alternatywą dla techniki aseptycznej. Antybiotyki okołooperacyjne (tj. ceftazydym) mogą być wskazane w pewnych okolicznościach, takich jak długotrwałe operacje lub umieszczanie przewlekłych implantów.
11. Obserwuj zwierzę, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
12. Myszy domowe pojedynczo i wstrzykiwać meloksykam (1 mg/kg; wstrzyknięcie podskórne; co 24 godziny) przez tydzień w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Sprawdzaj zwierzę codziennie po operacji, aby upewnić się, że normalnie je, pije i wypróżnia się.
13. Wykonaj baseplat po 3 lub więcej tygodniach.

3. Podłoże

UWAGA: Zazwyczaj procedura bazowania (Rysunek 5) nie może być wykonana w ciągu 2-3 tygodni od początkowej procedury ze względu na czas rekonwalescencji i inkubacji wirusa. Procedury indukcji dla posiewu bazowego są podobne do opisanych w krokach 2.1.1 do 2.1.8. Jednak baseplating nie jest zabiegiem inwazyjnym, a zwierzę wymaga jedynie lekkiej sedacji. Dlatego wystarczy 0,8-1,2% izofluranu, o ile zwierzę nie może poruszać się po ramie stereotaktycznej. Ponadto, stosunkowo lekkie znieczulenie izofluranem może również pomóc w ułatwieniu ekspresji przejściowych stanów fluorescencji neuronów podczas monitorowania⁸ (Dodatkowe wideo S2).

Ostrożnie odetnij cienką warstwę dachu z cementu dentystycznego za pomocą kostnego rongeura i usuń gumę silikonową. Oczyść powierzchnię soczewki przekaźnika 75% alkoholem.
Dokręć ustalającą obok płyty podstawy, aby przymocować ją do dolnej części miniskopu (Rysunek 5A1).
UWAGA: Płytka bazowa musi być mocno dokręcona pod spodem miniskopu, ponieważ różnica między dokręconą a lekko zamocowaną płytką podstawy może spowodować niespójną odległość.
Ustaw suwak ostrości tak, aby znajdował się w odległości około 2,7 - 3 mm od głównej obudowy (Rysunek 5A2).
UWAGA: Chociaż długość można dodatkowo regulować podczas procedury baseplate, należy ją ustalić na około 2,7 mm, ponieważ jednoczesna regulacja długości miniskopu i optymalnej długości między wszczepioną soczewką przekaźnikową a wstępnie zakotwiczoną soczewką obiektywu jest bardzo myląca.
Podłącz miniskop do płytki akwizycji danych i podłącz go do portu USB 3.0 (lub nowszego) w komputerze.
Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych opracowane przez zespół UCLA.
Dostosuj ekspozycję na 255, wzmocnienie na 64x, a diodę LED wzbudzenia na 5%. Te ustawienia są zalecane do początkowego powlekania bazowego; Konkretne ustawienia będą się różnić w zależności od regionów mózgu i poziomów ekspresji genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia.
Kliknij przycisk Połącz, aby podłączyć miniskop do oprogramowania do akwizycji danych i oglądać transmisję na żywo.
Ręcznie dopasuj soczewkę obiektywu miniskopu do soczewki przekaźnika i rozpocznij wyszukiwanie sygnałów fluorescencyjnych (Rysunek 5B₁).
UWAGA: Początkowo ręczne wyszukiwanie sygnału fluorescencji ułatwia regulację. Ponieważ system AAV został użyty do ekspresji genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia, zarówno typ promotora, jak i serotyp AAV wpłynęły na skuteczność transfekcji²³^,²⁴. Naukowcy powinni sprawdzić ekspresję wskaźnika wapnia, znajdując pojedyncze neurony, które wykazują zmiany we fluorescencji, zanim przystąpią do przyszłych eksperymentów.
Wywierć cement dentystyczny w dowolnym miejscu, w którym blokuje miniskop (opcjonalnie).
Oglądaj transmisję na żywo z oprogramowania do akwizycji danych i wykorzystaj margines soczewki przekaźnika jako punkt orientacyjny (Dodatkowy film S2). Margines soczewki przekaźnika pojawia się na monitorze jako szary okrąg przypominający księżyc (Rysunek 5B1; białe strzałki).
Po znalezieniu soczewki przekaźnika ostrożnie wyreguluj różne kąty i odległości miniskopu, aż zostaną znalezione sygnały fluorescencyjne.
UWAGA: Obrazy neuronów są bielsze niż tło. Precyzyjny kształt neuronu wskazuje, że neurony leżą idealnie na płaszczyźnie ogniskowej soczewki przekaźnikowej. Okrągłe neurony sugerują, że znajdowały się w pobliżu płaszczyzny ogniskowej. Kształt neuronu jest różny w całym mózgu, tutaj jako przykład pokazano brzuszny CA1.
Jeśli żaden pojedynczy neuron nie wykazuje zmian we fluorescencji w funkcji czasu, ponownie uszczelnij podstawę gumą silikonową. Fluorescencja nie jest obserwowana, ponieważ okres inkubacji jest również zależny od właściwości wirusa²³^,²⁴. Wykonaj kroki 3.1-3.12 po dodatkowym tygodniu. (Jest to opcjonalne).
Przytrzymaj miniskop w optymalnej pozycji i przesuń ramię stereotaktyczne za pomocą klejącej gliny wielokrotnego użytku w kierunku miniskopu (Rysunek 5B2). Przyklej miniskop do ramienia stereotaktycznego za pomocą gliny klejącej wielokrotnego użytku.
Nieznacznie dostosuj ramiona x, y i z, aby wyszukać najlepszy widok (Dodatkowy film S2). Następnie wyreguluj kąt między powierzchnią soczewki obiektywu a soczewką przekaźnika, obracając listwę douszną, listwę zębatą lub glinkę klejącą wielokrotnego użytku na osi z. Ekspresja wirusa i implantacja soczewki jest skuteczna, gdy co najmniej jedna komórka wykazuje przejściowe stany przejściowe fluorescencji (Rysunek 6A; Dodatkowe wideo S2) podczas powlekania bazowego (co również zależy od obszaru mózgu, takiego jak CA1).
UWAGA: Jeśli monitor pokazuje tylko białe komórki, ale nie ma stanów nieustalonych, istnieje inna przyczyna (patrz Rysunek 6B, C, dodatkowe filmy S4, S5, sekcja Wyniki i sekcja rozwiązywania problemów).
Zacementuj płytkę podstawy (Rysunek 5B2) cementem dentystycznym.
Monitoruj obszar zainteresowania podczas cementowania, aby upewnić się, że optymalna pozycja nie ulega zmianie.
Użyj najmniejszej możliwej ilości cementu, jednocześnie mocno przyklejając płytkę bazową do podstawy cementu dentystycznego (Rysunek 5B2). Nałóż drugą i trzecią warstwę cementu wokół płyty podstawy, ale uważaj, aby nie wpłynąć na soczewkę GRIN.
UWAGA: Nakładanie cementu na płytę podstawy jest łatwiejsze na tym etapie, ponieważ podstawa płyty bazowej została uformowana podczas procedury poszycia atrapy.
Ostrożnie odłącz miniskop od płyty podstawy, gdy cement się utwardzi. Następnie przykręć nasadkę ochronną.
Przenieś zwierzę do klatki ratunkowej. Obserwuj zwierzę, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
Myszy domowe indywidualnie. Upewnij się, że codziennie je, pije i wypróżnia się normalnie. Odczekaj 5 dni, aż mysz w pełni wyzdrowieje, a następnie sprawdź obrazowanie wapnia.
UWAGA: Płytka podstawy jest utrzymywana tylko w niewielkiej ilości cementu dentystycznego. Dlatego, jeśli płytka bazowa znacznie się przesunęła od czasu procedury powlekania podłoża, usuń cement dentystyczny za pomocą wiertła i ponownie wykonaj procedurę powlekania podstawy.
Znieczulenie (przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy (87 mg/kg) / ksylazyny (13 mg/kg)) i perfuse²⁵ zwierzęcia po zakończeniu wszystkich eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena zmiany objętości cementu dentystycznego
Ponieważ objętość cementu dentystycznego zmienia się podczas procesu utwardzania, może to znacząco wpłynąć na jakość obrazowania, biorąc pod uwagę, że odległość robocza soczewki GRIN wynosi około 50 do 350 μm⁴^,⁸. Dlatego w tym przypadku przetestowano dwa dostępne na rynku cementy dentystyczne, Tempron i Tokuso, przed zabiegiem implantacji i platerowania (Rysunek 5). Najpierw oc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy raport opisuje szczegółowy protokół eksperymentalny dla badaczy korzystających z dwusoczewkowego systemu miniskopów UCLA. Narzędzia zaprojektowane w naszym protokole są stosunkowo przystępne cenowo dla każdego laboratorium, które chce wypróbować obrazowanie wapnia in vivo . Niektóre protokoły, takie jak wstrzykiwanie wirusa, implantacja soczewek, posiewanie pozorów i powlekanie podstawowe, mogą być również stosowane w innych wersjach systemu miniskopowego w celu poprawy wskaźnika powodzenia obrazowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie jest to badanie wspierane przez przemysł. Autorzy nie informują o finansowych konfliktach interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wiertło 0,7 mm	#19008-07	Narzędzia do nauki precyzyjnej; USA	na chirurgię
0.1– 10 μ l końcówki do pipet	104-Q; QSP	Fisher Naukowy; Singapur	do testowania cementu dentystycznego
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation; Tokio, Japonia	do chirurgii
Igła 27 G	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation; Tokio, Japonia	do operacji
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9; 1,5*10^13	Preparat wirusowy Addgene; MA, USA	do wstrzykiwań wirusowych
Siarczan		Astart; Hsinchu, Tajwan	do chirurgii/poszycia manekina/poszycia podłoża
Płytka	bazowa V3	http://miniscope.org	do poszycia manekine/podłoża
BLU TACK	#30840350	Bostik; Chelsea, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Klejąca glina wielokrotnego użytku; do chirurgii/poszycia manekine/podłoża
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener; Tuttlingen, Niemcy	do powlekania bazowego
buprenorfiny		INDIVIOR; Wielka Brytania	na chirurgię
Carprofen	Rimadyl	Zoetis; Exton, PA	analgezja
Ceftazydym		Tajwan Biotech; Tajwan	zapobiega infekcji
Płytka PCB do miniskopu UCLA	zakupiona na https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		do podłoża
Zestaw cementu dentystycznego	Tempron	GC Corp; Tokio, Japonia	do testowania cementu dentystycznego
Zestaw cementu dentystycznego	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.; Tokio, Japonia	do testowania cementu dentystycznego / chirurgii / poszycia manekina / podłoża
Dual Lab Standard z adapterami myszy i szczurów	#51673	Stoelting Co; Illinois, USA	do zabiegu chirurgicznego/poszycia pozorowanego/podłoża
maści		Alcon; Genewa, Szwajcaria	do chirurgii/poszycia pozoru/podłoża
Ibuprofen		YungShin; Tajwańska	analgezja
Isoflurane		Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Tajwan	do chirurgii/poszycia pozorów/powłok bazowych
Inscopix	nVista System	Inscopix; Palo Alto, Kalifornia	dla porównania z V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer; NY, NY	do eutanazji
Sól fizjologiczna			zwykła do operacji
Zaciski Microbulldog	# 12.102.04	Dimedo; Tuttlingen, Niemcy	do implantacji soczewek
Mikrostrzykawki mikrolitrowe, 2,0 i mikro; L, 25 gauge	#88400	Hamilton; Bonaduz, Szwajcaria	do formowania wtryskowego wirusów
Kauczuk silikonowy	ZA22 Thixo	Zhermack; Badia Polesine, Włochy	za soczewkę
indeksem gradientu obiektywu (GRIN)	#64519	Edmund Optics; NJ, USA	do powlekania manekine/powlekania bazowego
Parafilm	#PM996	Bemis; Neenah, USA	dla manekina podstawy
Przenośne ssanie	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Tajwan	do chirurgii
Relay GRIN lens	#1050-002177	Inscopix; Palo Alto, CA, USA	do poszycia manekina / podstawy
kotwiące ze stali nierdzewnej	o średnicy 1,00 mm, długość całkowita 3,00 mm		do chirurgii
Mikroskop stereoskopowy	#SL720	Sage Vison; Nowe Tajpej, Tajwan	do chirurgii / poszycia pozorów / poszycia bazowego
Aparat stereotaktyczny	# 51673	Stoelting; IL, USA	do chirurgii / poszycia manekina / podłoża
Klej utwardzający UV #	3321	Loctite; Dü sseldorf, Niemcy	do testowania cementu dentystycznego
V3 UCLA Miniskop	zakupiony w dniu https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components		do zabiegu chirurgicznego/poszycia poszycia maneki/podłoża
Ksylazyna	X1126	Sigma-Aldrich; St. Louis, MO	do eutanazji
Spray z pompką Xylocaine 10%		AstraZeneca; Sö dertä lje, Szwecja	na zabieg chirurgiczny

atropiny Duratear z do atrapy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals. Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).
Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987(2020).
Aharoni, D., Hoogland, T. M. Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141(2019).
Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
Lee, H. S., Han, J. H. Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse. Journal of Visualized Experiments. (162), e61659(2020).
Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
Chen, K. S., et al. A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep. Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).
Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
Jimenez, J. C., et al. Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit. Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).
Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions. Journal of Neuroscience. , 2548(2020).
Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (124), e55579(2017).
Zhang, L., et al. Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).
Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. An open source, wireless capable miniature microscope system. Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001(2017).
Lu, J., et al. MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173(2019).
Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. Whole-cell recordings in freely moving rats. Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).
Burger, C., et al. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system. Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).
Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Research. 1190, 15-22 (2008).
Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).
Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Miniscope Imaging Calcium Transients Baseplating Mice Relay Lens Implantation Dental Cement Fluorescence Signals Stereotaxic Surgery Neural Activity Imaging Viral Vector Injection

Korzystanie z poszycia bazowego i miniskopu wstępnie zakotwiczonego z soczewką obiektywową do badań nad stanami przejściowymi wapnia u myszy

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły