Zastosowanie techniki patch-clamp do badania termogenicznej zdolności mitochondriów

Podsumowanie

Ten artykuł o metodzie szczegółowo opisuje główne etapy pomiaru przecieku H⁺ przez wewnętrzną błonę mitochondrialną za pomocą techniki patch-clamp, nowego podejścia do badania termogenicznej zdolności mitochondriów.

Streszczenie

Termogeneza mitochondrialna (znana również jako rozprzęganie mitochondriów) jest jednym z najbardziej obiecujących celów dla zwiększenia wydatku energetycznego w celu zwalczania zespołu metabolicznego. Tkanki termogeniczne, takie jak tłuszcze brązowe i beżowe, rozwijają wysoce wyspecjalizowane mitochondria do produkcji ciepła. Mitochondria innych tkanek, które przede wszystkim produkują ATP, również przekształcają do 25% całkowitej produkcji energii mitochondrialnej w ciepło i dlatego mogą mieć znaczący wpływ na fizjologię całego organizmu. Termogeneza mitochondrialna jest nie tylko niezbędna do utrzymania temperatury ciała, ale także zapobiega otyłości wywołanej dietą i zmniejsza produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) w celu ochrony komórek przed uszkodzeniem oksydacyjnym. Ponieważ termogeneza mitochondriów jest kluczowym regulatorem metabolizmu komórkowego, mechanistyczne zrozumienie tego podstawowego procesu pomoże w opracowaniu strategii terapeutycznych w celu zwalczania wielu patologii związanych z dysfunkcją mitochondriów. Co ważne, dokładne mechanizmy molekularne, które kontrolują ostrą aktywację termogenezy w mitochondriach, są słabo poznane. Ten brak informacji wynika w dużej mierze z braku metod bezpośredniego pomiaru białek rozprzęgających. Niedawny rozwój metodologii patch-clamp zastosowanej do mitochondriów umożliwił po raz pierwszy bezpośrednie zbadanie zjawiska leżącego u podstaw termogenezy mitochondriów, wycieku H⁺ przez IMM oraz pierwszą biofizyczną charakterystykę odpowiedzialnych za to transporterów mitochondrialnych, białka rozprzęgającego 1 (UCP1), specyficznego dla tłuszczów brunatnych i beżowych, oraz transportera ADP/ATP (AAC) dla wszystkich innych tkanek. To unikalne podejście dostarczy nowych informacji na temat mechanizmów kontrolujących wyciek H⁺ i termogenezę mitochondriów oraz tego, w jaki sposób można je ukierunkować w walce z zespołem metabolicznym. W artykule opisano metodologię patch-clamp zastosowaną do mitochondriów w celu zbadania ich zdolności termogenicznej poprzez bezpośredni pomiar prądów H⁺ przez IMM.

Wprowadzenie

Mitochondria słyną z tego, że są siłą napędową komórki. Rzeczywiście, są one głównym źródłem energii chemicznej, ATP. Mniej znane jest to, że mitochondria również wytwarzają ciepło. W rzeczywistości każde mitochondrium stale generuje dwa rodzaje energii (ATP i ciepło), a delikatna równowaga między tymi dwiema formami energii definiuje homeostazę komórek metabolicznych (Rysunek 1). To, w jaki sposób mitochondria rozprowadzają energię między ATP a ciepłem, jest z pewnością najbardziej fundamentalnym pytaniem w dziedzinie bioenergetyki, choć nadal jest w dużej mierze nieznane. Wiemy, że zwiększenie produkcji ciepła w mitochondriach (zwanej termogenezą mitochondrialną), a w konsekwencji zmniejszenie produkcji ATP zwiększa wydatek energetyczny i jest to jeden z najlepszych sposobów walki z zespołem metabolicznym¹.

Termogeneza mitochondrialna wywodzi się z przecieku H⁺ przez wewnętrzną błonę mitochondrialną (IMM), co prowadzi do rozłączenia utleniania substratu i syntezy ATP, a w konsekwencji do produkcji ciepła, stąd nazwa "rozprzęganie mitochondriów"1 (Rysunek 1). Ten wyciek H⁺ zależy od transporterów mitochondrialnych zwanych białkami rozprzęgającymi (UCP). UCP1 był pierwszym zidentyfikowanym UCP. Wyraża się tylko w tkankach termogenicznych, brunatnym tłuszczu i beżowym tłuszczu, w których mitochondria są wyspecjalizowane w produkcji ciepła^2,3,4. Tożsamość UCP w tkankach nietłuszczowych, takich jak mięśnie szkieletowe, serce i wątroba, pozostaje kontrowersyjna. Mitochondria w tych tkankach mogą mieć około 25% całkowitej energii mitochondrialnej zamienionej na ciepło, co może znacząco wpłynąć na fizjologię całego ciała¹. Oprócz utrzymywania temperatury głębokiej ciała, termogeneza mitochondrialna zapobiega również otyłości wywołanej dietą poprzez redukcję kalorii. Ponadto zmniejsza produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) przez mitochondria w celu ochrony komórek przed uszkodzeniem oksydacyjnym¹. Tak więc termogeneza mitochondrialna bierze udział w normalnym starzeniu się, zaburzeniach zwyrodnieniowych związanych z wiekiem i innych stanach związanych ze stresem oksydacyjnym, takich jak niedokrwienie-reperfuzja. Dlatego termogeneza mitochondrialna jest potężnym regulatorem metabolizmu komórkowego, a mechanistyczne zrozumienie tego podstawowego procesu będzie sprzyjać rozwojowi strategii terapeutycznych w celu zwalczania wielu patologii związanych z dysfunkcją mitochondriów.

Oddychanie mitochondrialne było pierwszą techniką, która ujawniła kluczową rolę termogenezy mitochondrialnej w metabolizmie komórkowym i nadal jest najpopularniejsze w społeczności¹. Technika ta opiera się na pomiarze zużycia tlenu przez mitochondrialny łańcuch transportu elektronów (ETC), który zwiększa się, gdy aktywowany jest mitochondrialny wyciek H⁺. Technika ta, choć kluczowa, nie może bezpośrednio badać mitochondrialnego wycieku H⁺ przez IMM¹, co utrudnia precyzyjną identyfikację i charakterystykę białek odpowiedzialnych za to, szczególnie w tkankach nietłuszczowych, w których produkcja ciepła jest wtórna w porównaniu z produkcją ATP. Niedawny rozwój techniki patch-clamp zastosowanej do mitochondriów zapewnił pierwsze bezpośrednie badanie wycieku H⁺ przez cały IMM w różnych tkankach5^,6,7.

Mitochondrialny patch-clamp całego IMM został po raz pierwszy ustanowiony w powtarzalny sposób przez Kirichoka i wsp.⁸. Opisali oni pierwszy bezpośredni pomiar mitochondrialnych prądów uniportera wapnia (MCU) w 2004 roku przy użyciu mitoplastów z linii komórkowych COS-7⁸. Później laboratorium Kirichok wykazało prądy wapnia z IMM mouse⁹ i Drosophila tissues⁹. Inne laboratoria rutynowo używają tej techniki do badania właściwości biofizycznych MCU^{10,11,12,13,14}. Możliwa jest również pełna analiza IMM patch-clamp przewodnictwa potasu i chlorków, o której wspomniano w kilku artykułach, ale nie była jeszcze głównym tematem publikacji^6,7,9. Pierwszy pomiar prądów H⁺ w IMM został zgłoszony w 2012 r. z mitochondriów brązowego tłuszczu myszy⁶, a z mitochondriów mysiego beżowego tłuszczu w 2017 r.⁷. Prąd ten jest spowodowany specyficznym białkiem rozprzęgającym tkanki termogeniczne, UCP1^6,7. Ostatnie prace opublikowane w 2019 roku scharakteryzowały AAC jako główne białko odpowiedzialne za mitochondrialny wyciek H⁺ w tkankach nietłuszczowych, takich jak serce i mięśnie szkieletowe⁵.

To unikalne podejście pozwala teraz na bezpośrednią, funkcjonalną analizę mitochondrialnych kanałów jonowych i transporterów odpowiedzialnych za termogenezę mitochondriów w wysokiej rozdzielczości. Aby ułatwić rozszerzenie metody i uzupełnić inne badania, takie jak oddychanie mitochondrialne, poniżej opisano szczegółowy protokół pomiaru prądów H⁺ przenoszonych przez UCP1 i AAC. Opisano trzy ważne kroki: 1) izolację mitochondriów z brunatnego tłuszczu myszy w celu analizy prądu H⁺ zależnego od UCP1 i izolację mitochondriów od serca w celu analizy prądu H⁺ zależnego od AAC, 2) przygotowanie mitoplastów za pomocą prasy francuskiej do mechanicznego pęknięcia zewnętrznej błony mitochondrialnej (OMM), 3) zapisy patch-clamp prądów H⁺ zależnych od UCP1 i AAC na całym IMM.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach, które zostały przeprowadzone, są zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

UWAGA: Procedura izolacji mitochondriów opiera się na wirowaniu różnicowym i różni się nieznacznie w zależności od tkanki. Na przykład, ponieważ brunatna tkanka tłuszczowa jest niezwykle bogata w lipidy, wymaga dodatkowego etapu, aby oddzielić resztki komórek i organelle od fazy lipidowej przed zbiorem mitochondriów. Aby uniknąć nieporozumień, dwie procedury izolacji mitochondriów (jedna z brązowego tłuszczu, a druga z serca) są szczegółowo opisane poniżej.

1. Izolacja mitochondrialna z brązowego tłuszczu międzyłopatkowego myszy (zmodyfikowana z Bertholet et al. 2020)¹⁵

1. Eutanazja samca myszy C57BL/6 przy użyciu uduszenia CO₂ i późniejszego zwichnięcia szyjki macicy, zgodnie z zaleceniami Panelu Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych i Komitetu IACUC.
2. Po ustawieniu myszy brzuchem skierowanym w stronę stołu, spryskaj włosy alkoholem, aby je oczyścić i zwilżyć (zmodyfikowane z Mann et al., 2014)¹⁶.
3. Wykonaj nacięcie o długości 2 cm w górnej części pleców po uchwyceniu skóry pęsetą.
4. Wyodrębnij brązowy tłuszcz międzyłopatkowy myszy, który odpowiada dwupłatowemu narządowi o kształcie motyla¹⁶.
5. Przenieść brązowy tłuszcz na szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną 5 ml zimnego buforu izolacyjnego (tabela 1) uprzednio umieszczonego na lodzie.
6. Oczyść brązowy tłuszcz z białego tłuszczu pod lornetką.
7. Przenieś brązowy tłuszcz do 10 ml zlewki z 5 ml zimnego buforu izolacyjnego (Tabela 1), aby posiekać go na cienkie kawałki. Przenieść do chłodzonego lodem homogenizatora szklanego o pojemności 10 ml (tłuczek z tworzywa sztucznego z politetrafluoroetylenu (PTFE)).
8. Użyj mieszadła górnego, aby homogenizować wstępnie przyciętą tkankę na lodzie sześcioma delikatnymi ruchami z kontrolowaną prędkością 275 obrotów/min.
9. Odwirować homogenat o stężeniu 8 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w lodowatej probówce stożkowej o pojemności 15 ml. Odrzucić sklarowany nad osadem zawierający fazę lipidową.
10. Zawiesić osad w 5 ml lodowatego buforu izolacyjnego (tabela 1) i homogenizować zawiesinę na lodzie po raz drugi sześcioma powolnymi ruchami z prędkością 275 obrotów/min.
11. Przenieść homogenat do lodowatej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować go przy 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia wszystkich jąder i nieuszkodzonych komórek.
12. Zebrać supernatant do świeżej probówki o pojemności 15 ml i umieścić go na lodzie.
13. Odwirować sklarowany osad o stężeniu 8 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania osadu zawierającego mitochondria.
14. Zawiesić osad zawierający mitochondria w 3,8 ml lodowatego buforu hipertonicznego mannitolu (Tabela 2) i inkubować zawiesinę mitochondrialną na lodzie przez 10-15 minut.

2. Izolacja mitochondrialna od serca myszy (zmodyfikowana z Garg et al. 2019)¹⁷

1. Eutanazja samca myszy C57BL/6 przy użyciu uduszenia CO₂ i późniejszego zwichnięcia szyjki macicy, zgodnie z zaleceniami Panelu Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych i Komitetu IACUC.
2. Po ułożeniu myszy na grzbiecie spryskaj ją alkoholem, aby oczyścić i zwilżyć włosy. Następnie wykonaj 2 cm nacięcie na klatce piersiowej po uchwyceniu skóry pęsetą.
3. Wyciąć serce z klatki piersiowej zwierzęcia i wypłukać je w celu usunięcia całej krwi w zlewce o pojemności 10 ml z 5 ml roztworu do izolacji zimna (Tabela 1).
4. Gdy serce zostanie oczyszczone ze śladów krwi, przenieś je do innej zlewki o pojemności 10 ml zawierającej 5 ml zimnego buforu izolacyjnego (Tabela 1), aby posiekać je na cienkie kawałki. Następnie przenieść do chłodzonego lodem szklanego homogenizatora o pojemności 10 ml (tłuczek z PTFE).
5. Użyj mieszadła górnego, aby homogenizować wstępnie przyciętą tkankę na lodzie sześcioma delikatnymi ruchami z kontrolowaną prędkością 275 obrotów/min.
6. Przenieść homogenat do lodowatej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować go przy 700 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania osadzaków jąder i nieuszkodzonych komórek.
7. Zebrać supernatant do świeżej probówki o pojemności 15 ml i umieścić go na lodzie.
8. Odwirować sklarowany osad o stężeniu 8 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania osadu zawierającego mitochondria.
9. Zawiesić osad mitochondrialny w 3,8 ml lodowatego buforu hipertonicznego mannitolu (Tabela 2) i inkubować zawiesinę mitochondrialną na lodzie przez 10-15 minut.

3. Przygotowanie mitoplastów za pomocą prasy francuskiej do mechanicznego pęknięcia OMM.

UWAGA: Procedura francuskiego pressingu pozwala na zwolnienie IMM z OMM z zachowaniem jego integralności, w tym matrycy i crista (Rysunek 2)¹⁸. Mitochondria są wstępnie inkubowane w buforze hipertonicznym mannitolu (Tabela 2) i poddawane niższemu ciśnieniu podczas procedury tłoczenia francuskiego, aby uniknąć drastycznego rozciągnięcia IMM po pęknięciu OMM.

1. Napełnij zawiesinę mitochondrialno-hipertoniczno-mannitolową do chłodzonej mini komory ciśnieniowej (średnica tłoka 3/8") prasy francuskiej (Rysunek 3A).
2. Wybierz tryb Medium French Press i skompresuj zawiesinę przez mini komórkę ciśnieniową pod kątem 110 na tarczy French Press dla mitochondriów brązowego tłuszczu i pod 140 dla mitochondriów serca (~ 2,000 psi). Upewnij się, że zawiesina wydostaje się z mini komory ciśnieniowej z szybkością około 1 kropli / s.
3. Zbierz krople w stożkowej probówce o pojemności 15 ml chłodzonej lodem.
4. Odwirować zawiesinę o sile 10 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
5. Zawiesić osad mitoplastów w 0,5-2 ml lodowatego buforu Hypertonic-KCl (Tabela 3) i przechowywać zawiesinę na lodzie.
   UWAGA: Brązowe mitoplasty tłuszczu i serca są gotowe do zapisów typu patch-clamp i powinny pozostać użyteczne przez około 3-6 godzin.

4. Zapisy elektrofizjologiczne H⁺ przeciekają przez UCP1 i AAC^5,7,15

UWAGA: Użyj następującej konfiguracji elektrofizjologicznej (Rysunek 3B): odwrócony mikroskop z różnicowym kontrastem interferencyjnym (DIC), 60-krotny obiektyw zanurzeniowy w wodzie, stół do izolacji drgań i klatka Faradaya, standardowy wzmacniacz obsługujący nagrania o niskim poziomie szumów, standardowy digitizer używany do konfiguracji elektrofizjologicznej, pClamp 10, mikromanipulator, elektroda referencyjna do kąpieli (3 M mostek solny KCl-agar umieszczony w uchwycie mikroelektrody zawierający granulkę srebra/chlorku srebra uformowaną w korpusie uchwytu (opisaną w Liu et al. 2021)¹⁹, komora perfuzyjna z dnem ze szkła nakrywkowego o grubości 0,13 mm, podłączona do grawitacyjnego systemu perfuzyjnego.

1. Wyciągnij włókna ze szkła borokrzemianowego w dniu nagrywania za pomocą ściągacza do mikropipet. Ustaw program na ściągaczu używanym do generowania pipet o wysokim stopniu odtwarzalności²⁰.
   UWAGA: Ten projekt programu wymaga kilku prób uzyskania pipet zoptymalizowanych pod kątem zacisku krosowego IMM. Standardowa pipeta ma cienkie końcówki o progresywnym stożkowym kształcie.
2. Włóż jeden szklany filament do ściągacza i pociągnij, aby uzyskać prawie dwie identyczne pipety do plastrów z jednego włókna borokrzemianowego.
3. Dostosuj program, gdy pipety stają się niespójne między cyklami ciągnięcia z powodu starzenia się żarnika skrzynki grzewczej ściągacza.
4. Umieść pipetę wewnątrz polerki do pipet i umieść końcówkę w pobliżu filamentu pod 100-krotnym powiększeniem, aby ją wypolerować.
5. Naciśnij pedał nożny kilka razy, aby podgrzać filament bez zatykania lub uszkadzania krzywizny końcówki.
6. Polerować do momentu uzyskania pipet o rezystancji od 25 do 35 MΩ po napełnieniu roztworem do pipet na bazie TMA (TMA dla wodorotlenku tetrametyloamonu, tabela 4).
7. Szkiełka nakrywkowe należy wstępnie inkubować (o średnicy 5 mm, grubości 0,1 mm) z 0,1% żelatyną w celu zmniejszenia adhezji mitoplastów i przepłukać je roztworem kąpieli KCl (Tabela 5) przed nałożeniem zawiesiny mitoplastu.
8. Przygotować surowe rozcieńczenie, mieszając ~35 μl stężonej zawiesiny mitoplastu z 500 μl roztworu kąpieli KCl (tabela 5) i umieścić go na szkiełkach nakrywkowych uprzednio umieszczonych w studzience na płytce 4-dołkowej.
9. Inkubować na lodzie przez 15 do 20 minut, aby mitoplasty osiadły na szkiełku nakrywkowym.
10. Napełnić całkowicie komorę kąpieli ~50 μl roztworu do kąpieli KCl (tabela 5).
11. Przenieś szkiełko nakrywkowe z mitoplastami w komorze za pomocą cienkiej pęsety do mikrodysekcji z zagiętą końcówką.
12. Ułóż szkiełko nakrywkowe na dnie komory. Nie należy perfować komory, aby mitoplasty były stabilne na szkiełku nakrywkowym.
13. Wybierz indywidualny nieprzywierny mitoplast w kształcie 8, skanując szkiełko nakrywkowe pod mikroskopem za pomocą obiektywu 60x.
14. Załadować pipetę roztworem do pipet (~50 μl) i umieścić ją w uchwycie na pipety.
15. Wprowadzić pipetę do roztworu kąpieli za pomocą mikromanipulatora i zbliżyć się do niej tuż nad wybranym mitoplastem, aby zbliżyć się do IMM. Program wzmacniacza podaje rezystancję pipety, gdy znajdzie się ona w roztworze kąpieli. Utrzymuj potencjał membrany na poziomie 0 mV i stosuj impulsy 10 mV za pomocą polecenia testu membrany w programie wzmacniacza.
16. Zastosuj lekkie podciśnienie, aby szybko utworzyć gigaseal za pomocą IMM (Rysunek 2B).
17. Podnieś pipetę z dołączonym mitoplastem, aby trzymać ją z dala od szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć pęknięcia uszczelki z powodu dryftu pipety podczas eksperymentu.
18. Skompensuj stany przejściowe pojemności błądzącej za pomocą polecenia "test membrany" w programie wzmacniacza przed przetestowaniem konfiguracji całego mitoplastu, aby uzyskać prawidłowy pomiar pojemności (Cm) dla membrany mitoplastu po włamaniu.
19. Zastosuj krótkotrwałe (5-15 ms) impulsy napięciowe (250-600 mV) za pomocą programu wzmacniacza, aby rozerwać łatkę membranową pod szklaną pipetą i uzyskać konfigurację całego mitoplastu (Rysunek 2C). Udane włamanie znajduje odzwierciedlenie w ponownym pojawieniu się stanów przejściowych pojemności.
20. Po włamaniu dopasuj stany przejściowe pojemności do opcji testu membrany programu wzmacniacza, aby ocenić pojemność membrany (odzwierciedlającą rozmiar mitoplastu) i jej rezystancję dostępu Ra (odzwierciedlającą jakość konfiguracji całego mitoplastu). Po włamaniu Ra powinno wynosić od 40 do 80 MΩ. Mitopasty (o wielkości 2-6 μm) używane do eksperymentów z zaciskiem krosowym mają zwykle pojemność membrany 0,5-1,1 pF.
21. Natychmiast po włamaniu zastąpić roztwór do kąpieli KCl (tabela 5) roztworem do kąpieli HEPES (tabela 6), rozpoczynając perfuzję.
22. Zastosuj protokół rampy 850 ms zaprojektowany za pomocą programu wzmacniacza, od -160 mV do +100 mV w odstępie 5 s, utrzymując mitoplast na poziomie 0 mV. Ten protokół działa dla UCP1^6,7,15 i AAC5 studies (Rysunek 4 i Rysunek 5).
    UWAGA: Zaleca się, aby do pomiarów prądu H⁺ zależnych od UCP1 i AAC uzyskać wszystkie dane elektrofizjologiczne przy 10 kHz i filtrować przy 1 kHz za pomocą odpowiedniego oprogramowania sterującego wzmacniaczem i digitizerem.

Wyniki

Rozwój metodologii patch-clamp zastosowanej do mitochondriów dostarczył pierwszego bezpośredniego badania wycieku H⁺ przez IMM i transportery mitochondrialne, UCP1 i AAC, które są za to odpowiedzialne. Analiza elektrofizjologiczna nieszczelności H⁺ zależnych od UCP1 i AAC może dostarczyć pierwszego spojrzenia na termogeniczną zdolność mitochondriów. W sekcji wyników opisano standardowe procedury pomiaru wycieku H⁺ za pomocą UCP1 i AAC.

Pomiar prądu H

Dyskusja

Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie techniki patch-clamp zastosowanej ostatnio do mitochondriów, nowego podejścia do bezpośredniego badania wycieku H⁺ przez IMM odpowiedzialnego za termogenezę mitochondriów 5,6,7,15. Technika ta nie ogranicza się do tkanek i może być również stosowana do analizy przecieku H⁺ i innych przewodnictw IMM w różnych standardowych modelac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,1% żelatyny	Millipore	ES-006-B
60X obiektyw zanurzeniowy w wodzie, apertura numeryczna 1,20	Wzmacniacz Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B	Urządzenia molekularne Kapilary
ze szkła borokrzemianowego	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Urządzenia molekularne
Klatka Faradaya	Domowa
francuska prasa	Glen Mills	5500-000011
Mieszadło
Mikroskop odwrócony	Olympus	IX71 lub IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Mikromanupulator MPC-385	Sutter Instrumenty	FG-MPC325
Uchwyt mikroelektrody do mostu agarowego	World Precision Instruments	MEH3F4515
Ściągacz do mikropipet	(Sutter Instruments)	P97
Mini komórka do prasy francuskiej	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Obiektyw 100-krotne powiększenie	Obiektyw Nikon	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Urządzenia molekularne Komora
perfuzyjna	Warner Instruments	RC-24E
Homogenizator Potter-Elvehjem 10 ml	Wheaton	358039
Wirówka z chłodzeniem SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Małe okrągłe szkiełka nakrywkowe: średnica 5 mm, grubość 0,1 mm	Warner Instruments	640700
Stół wibroizolacyjny	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
Kwas D-glukonowy	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA&	nbsp; Sigma Aldrich	3777
HEPES&	nbsp; Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sacharoza	Sigma Aldrich	S7903
TMA&	nbsp; Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253