Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe chromosomów ludzkich zarodków przedimplantacyjnych przy użyciu zużytej pożywki hodowlanej: pobieranie próbek i analiza ploidalności chromosomów

DOI:

10.3791/62619

⸱

7 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education, Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research, Yikon Genomics Co. Ltd.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie przedstawia protokół badań przesiewowych chromosomów ludzkich embrionów, który wykorzystuje zużytą pożywkę hodowlaną, co pozwala uniknąć biopsji zarodka i umożliwia identyfikację ploidalności chromosomów za pomocą NGS. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółową procedurę, w tym przygotowanie pożywki hodowlanej, amplifikację całego genomu (WGA), przygotowanie biblioteki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) oraz analizę danych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W klinicznym zapłodnieniu in vitro (IVF), dominująca metoda PGT-A wymaga biopsji kilku komórek z trofektodermy (TE). Jest to linia, która tworzy łożysko. Ta metoda wymaga jednak specjalistycznych umiejętności, jest inwazyjna i cierpi z powodu wyników fałszywie dodatnich i ujemnych, ponieważ liczba chromosomów w TE i wewnętrzna masa komórkowa (ICM), która rozwija się w płód, nie zawsze są takie same. NICS, technologia wymagająca sekwencjonowania DNA, które uwalnia się do pożywki hodowlanej zarówno z TE, jak i ICM, może stanowić wyjście z tych problemów, ale wcześniej wykazano, że ma ograniczoną skuteczność. W niniejszym badaniu przedstawiono pełny protokół NICS, który obejmuje metody pobierania próbek pożywki hodowlanej, amplifikację całego genomu (WGA) i przygotowanie biblioteki oraz analizę danych NGS za pomocą oprogramowania analitycznego. Biorąc pod uwagę różne czasy kriokonserwacji w różnych laboratoriach zarodkowych, embriolodzy mają dwie metody pobierania pożywki do hodowli zarodków, które można wybrać zgodnie z rzeczywistymi warunkami laboratorium IVF.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie wspomaganego rozrodu (ARTs) są coraz częściej stosowane w leczeniu niepłodności. Jednak wskaźnik powodzenia ART, takich jak IVF, jest ograniczony, a wskaźnik utraty ciąży jest znacznie wyższy niż w normalnej populacji1. Główną przyczyną tych problemów są nieprawidłowości chromosomalne, które często występują w preimplantacyjnych ludzkich embrionach2. PGT-A to skuteczna metoda badań przesiewowych zarodków pod kątem równowagi chromosomowej przed implantacją3,4. Niektóre badania dowiodły, że PGT-A może zmniejszyć wskaźnik aborcji i poprawić wskaźnik ciąż5,6,7,8. PGT-A wymaga jednak złożonej wiedzy technicznej, która wymaga specjalistycznego szkolenia i doświadczenia. Inwazyjna procedura biopsji zarodka może również potencjalnie spowodować uszkodzenie zarodków9. Badania wykazały, że biopsja blastomerów może utrudniać późniejszy rozwój, a liczba biopsji TE może wpływać na wskaźniki implantacji10. Chociaż kwestia długoterminowego bezpieczeństwa biologicznego biopsji zarodka nie została jeszcze dokładnie oceniona u ludzi, badania na zwierzętach wykazały jej negatywny wpływ na rozwój zarodka11,12,13.

Poprzednie raporty wskazywały, że śladowe ilości materiałów DNA były wydzielane do pożywki hodowlanej podczas rozwoju zarodka, i podjęto wysiłki w celu przeprowadzenia kompleksowych badań przesiewowych chromosomów (CCS) przy użyciu zużytego podłoża do hodowli zarodków14,15,16,17,18. Jednak wskaźniki wykrywalności i dokładność testów nie spełniły wymagań dotyczących szerokiego zastosowania klinicznego. W niniejszym badaniu wykazano poprawę w teście NICS w celu zwiększenia wskaźników wykrywalności, a także dokładności testu NICS19. W ostatnich latach płyn blastocoele (BF) był badany jako próbka analityczna małoinwazyjnego PGT-A. Jednak odsetek udanej amplifikacji całego genomu i wykrywalnego DNA w próbkach płynu blastocysty waha się od 34,8% do 82%20,21,22. Objętość BF zgłaszana w różnych badaniach waha się od 0,3 nL do 1 μL. Ze względu na niską ilość DNA w BF możliwe jest zwiększenie ilości DNA bezkomórkowego poprzez zmieszanie płynu blastocysty i pożywki hodowlanej w celu poprawy wskaźnika powodzenia i spójności wykrywania. Kuznietsov i wsp.23 i Li et al.24 potraktowali osłonę przejrzystą laserem i uwolnili płyn blastocysty do pożywki, aby poprawić całkowitą ilość embrionalnego DNA, a szybkość amplifikacji próbek połączonej pożywki/BF po WGA wynosiła odpowiednio 100% i 97,5%. Jiao et al.25 również uzyskali 100% wskaźnik sukcesu amplifikacji przy użyciu tej samej metody.

Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół, który obejmuje przygotowanie próbki zużytego nośnika, przygotowanie NGS i analizę danych. Ostrożnie usuwając wzgórki z oocytów, w niniejszym badaniu przeprowadzono docytoplazmatyczne wstrzyknięcie pojedynczego plemnika (ICSI) i hodowlę blastocyst. Pożywka spędzona w dniu 4-dniowym 5/dniu 6 została zebrana w celu przygotowania biblioteki WGA i NGS. Dzięki zastosowaniu technologii NICS w niniejszym badaniu usprawniono etapy przygotowania biblioteki WGA i NGS w ciągu około 3 godzin i uzyskano wyniki CCS w sposób nieinwazyjny w ciągu około 9 godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzyskano zgodę etyczną od Komisji Etyki Trzeciego Szpitala Uniwersytetu Pekińskiego.

1. Przygotowanie

UWAGA: Wymagane materiały i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

  1. Odczynniki
    1. Wstępnie podgrzej i zrównoważ (zbilansowane) 20-30 μl pożywki gametowej/pożywki do nawożenia i pożywki do hodowli w fazie rozszczepienia/blastocysty (pokrytej olejem mineralnym) i hialuronidazy (w szczelnie zamkniętej probówce) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 5%O2 w inkubatorze trójgazowym na noc przed użyciem.
    2. Rozgrzej hialuronidazę do temperatury 37 °C na powierzchni roboczej w dygestorium.
    3. Przygotować bufor do witryfikacji i odczynniki do pobierania próbek zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Narzędzia
    1. Przygotuj pipety do pobierania i przenoszenia próbek (średnica wewnętrzna od ~200 do 250 μm), pipety do denudacji/strippera (średnica wewnętrzna ≥150 μm, ~130-140 μm i ~120 μm) oraz pipety do mycia (średnica wewnętrzna ~150 μm), ciągnąc szklane pipety Pasteura, aby uzyskać polerowane ogniowo, otwarte, cienkie końcówki.
      UWAGA: Pipety używane do pobierania/przenoszenia próbek, denudacji i mycia można zakupić bezpośrednio. Igły do trzymania i igły do wstrzykiwań można również kupić bezpośrednio.

2. Protokół 1: Pobieranie próbek

  1. Wstępne leczenie kompleksu oocyty-korona-wzgórek (OCCC) przed trawieniem hialuronidazą
    1. Osiągnij stymulację jajników zarówno za pomocą hormonu folikulotropowego (FSH), jak i preparatów ludzkiej gonadotropiny menopauzalnej (hMG). Gdy pęcherzyk ołowiowy ma >18 mm, użyj 10 000 IU gonadotropiny kosmówkowej (hCG) do ostatecznego dojrzewania oocytów.
    2. Pobrać oocyty po 36 godzinach od strzału ze spustu. Pobrać i przenieść oocyty do szalek do hodowli tkankowych z 2,5 ml wstępnie podgrzanego m-HTF pokrytego olejem mineralnym.
    3. Szybko przenieść OCCC do centralnej studzienki narządowej naczynia do hodowli narządów zawierającej 1 ml pożywki do zapłodnienia za pomocą pipety transferowej, a następnie inkubować z oocytami w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i 5% O2 przez 2-4 godziny.
  2. Trawić OCCC za pomocą hialuronidazy, dodając 1 ml wstępnie podgrzanej hialuronidazy o temperaturze 37 °C (80 j.m./ml) do centralnego dołka naczynia do hodowli narządów zawierającego OCCC (etap 2.1.3). Utrzymuj końcowe stężenie hialuronidazy na poziomie 40 j.m./ml i dokładnie wymieszaj.
    1. Inkubować OCCC na platformie termicznej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Obserwuj zmiany pod mikroskopem co 30 s, aż pozostaną tylko 1-2 warstwy komórek ziarnistych.
  3. Denudacja komórek ziarnistych
    1. Szybko przenieś strawione OCCC do naczynia hodowlanego w celu obsługi oocytów i przykryj olejem mineralnym w każdym dołku.
    2. Obserwuj oddzielone komórki ziarniste pod mikroskopem. Delikatnie zassaj i uwolnij oocyty 5 razy, aby usunąć resztki komórek ziarnistych wokół oocytów.
    3. Powtórz poprzedni krok w pozostałych 3 dołkach, aby całkowicie usunąć komórki ziarniste.
      UWAGA: Powyższe kroki (2.1-2.3) można wykonać zgodnie z rutynową operacją każdego laboratorium.
  4. Ocena oocytu
    1. Oceń kompletność usuwania komórek ziarnistych za pomocą mikroskopu. Jeśli komórek nie można całkowicie usunąć, dopuszczalne jest obecnie zachowanie 5 lub mniej komórek ziarnistych.
      UWAGA: Jeśli komórki wzgórka są nadal przyczepione do oocytu, pozostałość można usunąć później w 3 dniu, zanim zarodek zostanie przeniesiony z pożywki hodowlanej w fazie rozszczepienia na pożywkę w stadium blastocysty.
  5. Po wykonaniu docytoplazmatycznego wstrzyknięcia plemnika (ICSI)26, przenieść oocyty do mikrokropelek pożywki do hodowli zarodków o pojemności 20-30 μl (jedna komórka jajowa odpowiada jednej mikrokropli) za pomocą pipet transferowych i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 5% O2 .
    1. Zapisz dzień ICSI jako dzień 0. Sprawdź zarodki i uzyskaj wynik zgodnie z warsztatami konsensusu w Stambule na temat oceny zarodków w dniu 1 do zapłodnienia (około 18 godzin), dniu 2 (około 45 godzin) i dniu 3 (około 68 godzin) pod kątem rozszczepienia zarodka27.
  6. Mycie zarodków
    1. Przygotować 20-30 μl mikrokropelek pożywki do hodowli blastocyst dla każdego zarodka pokrytego olejem mineralnym na szalkach do hodowli tkankowych w dniu 2 w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 5% O2 .
    2. Przygotuj kolejne trzy mikrokropelki pokryte olejem mineralnym i oznacz nowe naczynia do hodowli tkankowych do mycia nr 1-3.
    3. Przenieś zarodki z 3 dnia do myjących mikrokropel. Delikatnie odessać i uwolnić zarodki 3 razy w każdej kropli za pomocą pipet do denudacji.
      UWAGA: Ta procedura może również pomóc w usunięciu resztek komórek ziarnistych przyczepionych do zarodka.
    4. Obserwuj i oceń zarodki pod mikroskopem w 3 dniu przed zmianą pożywki z pożywki do hodowli w fazie rozszczepienia na pożywkę do hodowli blastocyst w celu oceny morfologicznej. Jeśli komórki wzgórka były nadal przyczepione do zarodka, odpowiednio pipetować w górę i w dół w innej wstępnie podgrzanej i zrównoważonej pożywce do hodowli blastocyst pokrytej olejem mineralnym za pomocą pipety do strippera, aż komórki wzgórka zostaną całkowicie usunięte.
      UWAGA: Wszystkie przyczepione komórki wzgórka musiały zostać całkowicie usunięte w 3 dniu, zanim zarodek został przeniesiony z płytki pożywki do hodowli w fazie rozszczepienia na płytkę pożywki do hodowli w stadium blastocysty. Wszelkie pozostałe komórki wzgórka będą przeszkadzać w końcowej analizie i dadzą fałszywie ujemne wyniki.
  7. Dwie opcje kolekcji pożywki hodowlanej
    UWAGA: Centrum IVF może wybrać jedną z dwóch metod pobierania pożywek hodowlanych w oparciu o zasoby, wymagania i preferencje ośrodka.
    1. Opcja 1: Mycie i hodowla zarodków
      UWAGA: Ta opcja jest przeznaczona dla laboratoriów IVF, które wykonują witryfikację rano 5 dnia.
      1. Przenieść zarodek do wstępnie podgrzanych (37 °C) mikrokropelek pożywki hodowlanej i delikatnie przemyć każdy zarodek kolejno w 3 mikrokropelkach, pipetując w dniu 4 po południu.
      2. Przenieść każdy zarodek do unikalnego, wstępnie ogrzanego (37 °C) pojedynczego mikrokropelka pożywki hodowlanej w celu pobrania próbki. Objętość pojedynczej kropli pożywki hodowlanej nie może przekraczać 25 μl.
      3. Przeprowadzić hodowlę zarodków blastocysty w 5 dniu/dniu 6 w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 5% O2 .
    2. Opcja 2: Mycie i hodowla zarodków
      UWAGA: Ta opcja jest przeznaczona dla laboratoriów IVF, które wykonują witryfikację w dniu 5 po południu lub w dniu 6.
      1. Przenieść zarodek do wstępnie ogrzanych (37 °C) mikrokropelek z 10-15 μl pożywki hodowlanej i delikatnie przemyć każdy zarodek kolejno w 3 mikrokropelkach przez pipetowanie w 5 dniu.
      2. Przenieść każdy zarodek do unikalnego, wstępnie ogrzanego (37 °C) pojedynczego mikrokropelka pożywki hodowlanej w celu pobrania próbki. Objętość pojedynczej kropli pożywki hodowlanej nie może przekraczać 15 μl.
      3. Przeprowadzić hodowlę zarodków blastocysty w 5 dniu/dniu 6 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  8. Pobieranie próbek
    1. Delikatnie wyreguluj ICM w znacznej odległości od docelowego punktu wiązki laserowej, która skupia się na połączeniu komórkowym trofektodermy, aby wytworzyć mały otwór w trofektodermie, aby uwolnić płyn z jamy blastocoelu. Następnie zarodki są przenoszone do roztworu do zamrażania w celu kriokonserwacji zgodnie z konwencjonalnym procesem.
    2. Przenieść pożywkę hodowlaną z każdego hodowanego zarodka do probówki PCR wolnej od RNazy/DNaz zawierającej 5 μl buforu do lizy komórek.
    3. Pobrać taką samą ilość pożywki hodowlanej, która nie jest używana do hodowli zarodków, co w przypadku kontroli ujemnej. Wszystkie pobrane próbki należy natychmiast zamrozić w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C po pobraniu do czasu poddania ich testowi NICS.
  9. Wykonaj witryfikację zgodnie z opisem w protokole.

3. Protokół 2: Budowa biblioteki

  1. Liza pożywki hodowlanej
    1. Rozcieńczyć 1 μl kontroli dodatniej (10 ng ludzkiego gDNA) 199 μl świeżej pożywki hodowlanej. Dokładnie wymieszaj i krótko odwiruj probówkę (200 x g przez 5 s).
    2. Przenieś 10 μl pożywki do hodowli blastocyst dnia 5-6, rozcieńczonej kontroli pozytywnej i świeżej pożywki hodowlanej do nowych probówek PCR o pojemności 0,2 ml.
    3. Dodać 1 μl mieszanki enzymatycznej MT do każdej probówki PCR i dokładnie wymieszać przez pipetowanie i natychmiast odwirować przez 2-3 s przy 200 x g.
    4. Umieścić probówkę (probówki) PCR z kroku 3.1.3 w podgrzanej stacji przygotowania próbek NICS i uruchomić program lizy w następujący sposób: 10 minut w temperaturze 75 °C; 4 minuty w temperaturze 95 °C; utrzymać w temperaturze 22 °C.
      UWAGA: Stacja przygotowywania próbek jest porównywalna ze standardową maszyną do PCR.
      1. Kliknij ikonę Lysis, aby przejść do ekranu konfiguracji.
      2. Wybierz Rurka dla Tryb sterowania; wprowadź 10 μL dla objętości próbki; wybierz Włącz dla sterowania Hotlid i wprowadź 105 °C jako temperaturę. Wybierz Nie dla opcji Wstrzymaj w pierwszym seg. Kliknij przycisk OK, aby kontynuować.
      3. Poczekaj, aż czas pozostania pokaże --:--:--, co oznacza koniec programu, a następnie kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zakończyć program.
    5. Zatrzymaj program po zakończeniu procesu. Natychmiast przejdź do następnego kroku.
  2. Przygotowanie biblioteki
    1. Rozmrozić bufor Pre-Lib do temperatury pokojowej. Dokładnie wymieszać pipetując i natychmiast odwirować przez 2-3 s przy 200 x g.
    2. Przygotować mieszankę wzorcową do reakcji prebibliotecznej w następujący sposób: dodać 2 μl mieszanki enzymatycznej Pre-Lib do 60 μl buforu pre-lib, dokładnie wymieszać reakcję i krótko odwirować.
    3. Dodać 60 μl mieszanki reakcyjnej przed biblioteką do każdej próbki pożywki poddanej działaniu środka z poprzedniego etapu. Dokładnie wymieszać pipetując i natychmiast odwirować przez 2-3 s przy 200 x g.
    4. Umieścić probówkę (probówki) PCR z kroku 3.2.3 w stacji przygotowania próbki i uruchomić program biblioteki wstępnej w następujący sposób: 95 °C przez 2 min; 12 cykli po 15 °C przez 40 s, 22 °C przez 40 s, 33 °C przez 30 s, 65 °C przez 30 s, 72 °C przez 40 s, 95 °C przez 10 s i 63 °C przez 10 s; i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
      1. Kliknij ikonę Pre_Lib, aby przejść do ekranu konfiguracji.
      2. Wybierz rurkę dla trybu sterowania; wprowadź 70 μl dla objętości próbki; wybierz Włącz dla sterowania gorącą pokrywą i wprowadź 105 °C jako temperaturę. Wybierz Nie dla opcji Wstrzymaj w pierwszym seg. Kliknij przycisk OK, aby kontynuować.
      3. Poczekaj, aż czas pozostania pokaże --:--:--, co oznacza koniec programu, a następnie kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zakończyć program.
    5. Zatrzymaj program po zakończeniu procesu. Natychmiast przejdź do następnego kroku.
  3. Przygotowanie biblioteki
    1. Rozmrozić bufor biblioteczny do temperatury regulowanej. Dokładnie wymieszać pipetując i natychmiast odwirować przez 2-3 s przy 200 x g.
    2. Przygotować mieszankę wzorcową do reakcji bibliotecznej w następujący sposób: dodać 1,6 μl mieszanki enzymów bibliotecznych do 60 μl bufora bibliotecznego, dokładnie wymieszać reakcję i krótko odwirować.
    3. Dodać 60 μl bibliotecznej mieszaniny reakcyjnej i 2 μl podkładu do kodów kreskowych do każdego produktu prebibliotecznego z kroku 3.2.3. Dokładnie wymieszaj reakcję i krótko odwiruj.
    4. Umieścić probówkę (probówki) PCR z kroku 3.2.3 w termocyklerze i uruchomić program przygotowania biblioteki w następujący sposób: 94 °C przez 30 s; 17 cykli po 94 °C przez 25 s, 62 °C przez 30 s i 72 °C przez 45 s); a następnie utrzymać w temperaturze 4 °C.
      1. Kliknij ikonę Lib_Prep, aby przejść do ekranu konfiguracji.
      2. Wybierz Probówkę dla trybu sterowania; wprowadź 130 μL dla objętości próbki; wybierz Włącz dla sterowania Hotlid i wprowadź 105 °C dla odpowiedniej temperatury. Wybierz Nie dla opcji Wstrzymaj w pierwszym seg. Kliknij przycisk OK, aby kontynuować.
      3. Poczekaj, aż czas pozostania pokaże --:--:--, co oznacza koniec programu, a następnie kliknij przycisk Zatrzymaj, aby zakończyć program.
  4. Oczyszczanie biblioteki
    1. Wyjąć granulki Magbeads z magazynu w temperaturze 2-8 °C na co najmniej 20 minut przed etapem oczyszczania. Wiruj i mieszaj Magbeads przez 20 s. Dozuj wystarczającą ilość kulek do etapu oczyszczania do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i ciepłych kulek do RT.
    2. Dodaj 1x Magbeads do każdej biblioteki. Mieszać pipetując w górę i w dół ≥10 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut
      UWAGA: Na przykład dodaj 100 μl Magbeads do 100 μL próbki bibliotecznej.
    3. Po inkubacji krótko odwirować probówkę i umieścić na stojaku magnetycznym.
    4. Odczekaj około 5 minut, aż roztwór stanie się klarowny. Trzymając probówkę na stojaku magnetycznym, ostrożnie zassać roztwór i wyrzucić.
    5. Do probówki dodać 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s i ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz jeszcze raz.
    6. Usuń etanol tak całkowicie, jak to możliwe. Suszyć koraliki na powietrzu na stojaku magnetycznym przez około 5-10 minut w temperaturze RT.
    7. Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego, dodaj 17,5 μl buforu elucyjnego i zawiruj probówkę, aby ponownie zawiesić kulki. Krótko odwirować probówkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    8. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny. Ostrożnie przenieść 15 μl supernatantu do nowej probówki.
  5. Kwantyfikacja biblioteki
    1. Określ ilościowo oczyszczone biblioteki za pomocą fluorometru zgodnie z instrukcją obsługi zestawów testowych kubitu dsDNA HS 28. Wydajność bibliotek waha się od ~15 do 300 ng.
  6. Łączenie bibliotek
    1. Do łączenia należy użyć 10 nanogramów z każdej próbki z biblioteki.
  7. Sekwencjonowanie
    1. Zapoznaj się z instrukcją obsługi sekwencjonowania (15027617 v01)29.
    2. Oczyszczone sekwencje biblioteczne o wartości 50 pz na pojedynczym końcu platformy dały około 2 miliony odczytów dla każdej próbki, przy czym zalecano głębokość sekwencjonowania 0,03 ×.
  8. analiza danych
    1. Wprowadź nazwę użytkownika i hasło na stronie logowania
    2. Po zalogowaniu się do systemu kliknij Analiza, a pojawi się nowa strona. Kliknij przycisk Create Submission (Utwórz zgłoszenie) na karcie NICS-A (NICS-A). Następnie wybierz NGS dla platformy, wybierz korporację, wybierz NICSnst dla odczynnika, wprowadź informacje o projekcie w polu pod identyfikatorem projektu, ustaw preferencje analizy i prześlij pliki. Po pomyślnym przesłaniu wszystkich plików sekwencjonowania kliknij przycisk Prześlij, aby rozpocząć analizę (Rysunek 3A).
    3. Kliknij przycisk Wyświetl zgłoszenia, aby wyświetlić listę przesłanych projektów. Po zakończeniu analizy status projektu zmieni się na Ukończony, a w polu raportu pojawi się przycisk Pokaż. Kliknij przycisk Pokaż, aby wyświetlić tabelę podsumowującą analizę NICS (Rysunek 3B).
    4. Kliknij przycisk Eksportuj raport, aby zapisać raporty (Rysunek 3C).
      UWAGA: Dla każdej analizy zostaną wyeksportowane trzy typy plików. Plik graficzny zawierający wszystkie wykresy zmienności liczby kopii (CNV) dla każdego chromosomu i całego genomu, który będzie przechowywany w folderze "graph"; arkusz kalkulacyjny zawierający przykładowe szczegóły kontroli jakości tego przebiegu analizy; plik dokumentu, który zawiera raporty NICS dostosowane przez użytkownika; oraz arkusz kalkulacyjny zawierający przykładowe informacje podsumowujące ten przebieg analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym badaniu zastosowano proponowaną metodę do pacjenta. Zatwierdzenie IRB i świadoma zgoda uzyskano przed zastosowaniem analizy NICS. W niniejszym badaniu uzyskano 6 blastocyst od pacjentów i wykonano NICS na wszystkich 6 zarodkach od 4 do 5 dnia. Nieprawidłowości chromosomowe spowodowane zrównoważoną translokacją rodziców wykryto w pięciu chromosomach za pomocą testu NICS; dlatego nie można ich było użyć do transferu (Rysunek 4A-E). Wyniki NICS obu zarodków wykazały ten sam kar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Jeśli wyniki NICS są zanieczyszczone rodzicielskim materiałem genetycznym, upewnij się, że wszystkie komórki cumulus-corona radiata zostały usunięte i upewnij się, że ICSI jest wykonywane w celu zapłodnienia. Unika się niewłaściwego przechowywania pożywki lub procesów przygotowania matrycy, które mogą powodować degradację DNA. Przestrzeń robocza została dokładnie oczyszczona odczynnikami do dekontaminacji DNazy i RNazy. Aby uniknąć zaniecz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang i Sijia Lu są pracownikami Yikon Genomics Co., Ltd.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Shiping Bo i Shujie Ma za pomoc w analizie danych NGS. Finansowanie: praca została wsparta przez Krajowy Program Badań Naukowych i Prac Rozwojowych (Grant nr 2018YFC1003100).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
probówki EPR o pojemności 1,5 ml, probówki do PCR o pojemności 0,2 mlAxygenMCT-150-C, PCR-02-Cwolne od DNaz/RNaz, probówki PCR o niskiej zawartości wiązania i probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
10 &mikro; L, 200 i mikro; L, 1000 i mikro; L DNaza / Końcówki bez RNazAxygenT-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-SMożna to zastąpić inną marką / Do transferu próbki
100 % etanolSinopharm Chemical10009218Można to zastąpić inną marką / Do oczyszczania biblioteki DNA
Elementarz kodów kreskowych1-48Odczynnik Yikon Genomicsw zestawie do przygotowania biblioteki NICSInstDo amplificaton biblioteczny
BD Falcon Naczynie do hodowli narządów, Sterylne363037 BD BioscienceMożna to zastąpić inną marką/Do hodowli zarodków
BD Falcon Naczynia do hodowli tkanek (Easy Grip) , SterylneBD Bioscience353001Można to zastąpić inną marką/Do hodowli zarodków
BD Falcon Naczynia do hodowli tkankowej, Sterylne353002 BD BioscienceMożna to zastąpić inną marką/Do hodowli zarodków
Bufor do lizy komórekYikon Odczynnik Genomicsw NICSnst zestaw do przygotowania bibliotekiDo wstępnej obróbki pożywki
Enzym do lizy komórekOdczynnik Yikon Genomicsw NICSnst zestaw do przygotowania bibliotekiDo wstępnej obróbki pożywki
Oprogramowanie ChromGoYikon GenomicsAnaliza danych
CMPure MagbeadsYikon GenomicsOdczynnik w NICSnst zestaw do przygotowania bibliotekiDo oczyszczania biblioteki
Otwarty system Cryotop  KITAZATO BioPharma81110Można to zastąpić inną marką/Do witryfikacji zarodków
Odczynnik do wody destylowanejYikon Genomicsw bibliotece NICSInst zestaw przygotowawczydo rozpuszczenia DNA
ES (zestaw do witryfikacji)  Zestaw do inwitryfikacji odczynnikówMożna go zastąpić inną marką/Do witryfikacji zarodków
HOLDNIGORIGIOMPH-MED-35Można go zastąpić innym
marki/Dla
roztworu hialuronidazy ICSI, 80 U/mlSAGEART4007-AMożna go zastąpić inną marką/Digest kompleks oocyt-korona-cumulus
ICSIORIGIOMPH-35-35Można to zastąpić inną marką/Dla ICSI
Illumina MiSeq® SystemIlluminaSY-410-1001Do sekwencjonowania bibliotecznego
InkubatorLabotectInkubator C16Można go zastąpić inną marką/Do hodowli zarodków
Bufor bibliotecznyOdczynnik Yikon Genomicsw NICSInst zestaw do przygotowania bibliotekiDo amplificatonu bibliotecznego
Biblioteka Enzyme MixYikon GenomicsOdczynnik w NICSnst zestaw do przygotowania bibliotekiDla biblioteki amplificaton
Stojak magnetycznyDynaMagTM-212321DDo oczyszczania biblioteki
MikroskopOLYMPUS1X71Można go zastąpić inną marką/Do obserwacji zarodków
Mini-wirówkaESSENSCIENELF6Do separacji
MT Enzyme MixOdczynnik Yikon Genomicsw bibliotece NICSnst zestaw do przygotowaniapożywki hodowlanej
Zestaw do przygotowania biblioteki NICSnstYikon GenomicsKT1000800324Amplifikacja całego genomu i budowa biblioteki
NICSInst Sample Prep StationYikon Genomics  ME1001003Amplificate DNA
Nunc IVF 4-dołkowe naczynieThermo Scientific 144444Można to zastąpić inną marką/Do mycia zarodków i hodowli blastocyst
Pipeta PasteuraOirgio  MXL3-IND-135Może być zastąpiony przez inną markę/Do pipet Pasteura do tansferu zarodków
ORIGIOPP-9-1000Można to zastąpić inną marką/Do laboratorium IVF
Odczynnik Pre-LibBuffer Yikon Genomicsw zestawie do przygotowania biblioteki NICSInstPrzygotowanie biblioteki
Przygotowanie biblioteki Pre-Lib EnzymeYikon Genomicsw zestawie do przygotowania biblioteki NICSInstPrzygotowanie biblioteki
Qubit® 3.0 FluorometrThermo ScientificQ33216Do kwantyfikacji biblioteki
Quinn's Advantage Blastocyst MediumSAGEART-1029Do hodowli blastocysty zarodka
Quinn's Advantage Cleavage MediumSAGEART-1026Można to zastąpić inną marką/Do hodowli na etapie rozszczepienia zarodka
Zapłodnienie Quinn's Advantage MediumSAGEART-1020Można to zastąpić inną marką/Do zapłodnienia oocytów i plemników
Quinn's Advantage m-HTF Medium z HEPESSAGEART-1023Można to zastąpić inną marką/Do zarodków clutrure
Quinn's Advantage SPS Zestaw substytutów białka surowicySAGEART-3010Można to zastąpić inną marką/Aby usunąć oocyt
Quinn's Advantage Olej mineralny do hodowli tkankowychSAGEART-4008PMożna go zastąpić inną marką/Aby pokryć podłoże hodowlane
WSKAZÓWKI DO USUWANIA IZOLACJIORIGIOMXL3-IND-135Można to zastąpić inną marką/Do denulegacji komórek ziarnistych
Witryfikacja Cryotop Open systermKIZTAZATO81111Można to zastąpić inną marką/Do witryfikacji zarodków Zestaw
do witryfikacji  KITAZATO BioPharmaVT101Można go zastąpić inną marką/Do witryfikacji zarodków
VortexerQilinbeierDNYS8Mieszanka próbek
VS (zestaw do witryfikacji)  Zestawdo inwitryfikacji odczynnikówMożna go zastąpić inną marką/Do witryfikacji zarodków
System laserowy ZILOS-tkHamilton ThorneKLASA 1Można go zastąpić inną marką / Do sztucznego zapadania się blastocoele
Zalecane są KITAZATO BioPharma KITAZATO BioPharma Laser

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
  2. Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
  3. Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
  4. Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
  5. Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
  6. Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
  7. Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
  8. Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24(2012).
  9. Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075(2016).
  10. Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  11. Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
  12. Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117(2013).
  13. Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
  14. Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
  15. Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
  16. Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
  17. Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
  18. Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Medicine. 94 (12), e669(2015).
  19. Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
  20. Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  21. Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
  22. Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid? Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
  23. Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262(2018).
  24. Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275(2018).
  25. Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
  26. Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter's syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
  27. Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
  28. Thermo Fisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015).
  29. Miseq system use guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system user _ guide 15027617.html (2016).
  30. Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
  31. Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
  32. Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
  33. Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
  34. Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Data analysis software screenshots, report export, computational results, chromatography data analysis.
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Data analysis software interface for embryo implantation potential; input form, result summary, export options.
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

Tagi

Nieinwazyjne badanie chromosom wamplifikacja ca ego genomuprzygotowanie bibliotekisekwencjonowanie nowej generacjipo ywka do hodowli embrion wwykrywanie aneuploidii

Powiązane artykuły