Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana mikroskopowa metoda oceny ognisk γ-H2AX w ludzkich limfocytach krwi obwodowej

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62623

⸱

25 grudnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Radiation Biophysics Division, Nuclear Medicine Department, iThemba LABS, 2Department of Biotechnology, University of the Western Cape, 3Department of Medical Biosciences, University of the Western Cape, 4Division of Medical Physiology, Department of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 5Biodosimetry Service, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable and Academic Unit on Radiation Protection, Faculty of Medicine, University of the Republic, 6MetaSystems Hard & Software GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia przygotowanie preparatu i automatyczną ocenę testu ognisk γ-H2AX na limfocytach krwi obwodowej. Aby zilustrować metodę i czułość testu, izolowane limfocyty napromieniano in vitro. Ta zautomatyzowana metoda wykrywania DNA DSB jest przydatna w szybkich i wysokowydajnych zastosowaniach dozymetrii biologicznej.

Streszczenie

Promieniowanie jonizujące jest silnym induktorem uszkodzeń DNA i dobrze udokumentowanym czynnikiem rakotwórczym. Dozymetria biologiczna polega na wykrywaniu skutków biologicznych wywołanych narażeniem na promieniowanie jonizujące w celu dokonania indywidualnej oceny dawki. Jest to istotne w ramach nagłych wypadków radiacyjnych, w których ocena stanu zdrowia i planowanie leczenia klinicznego dla narażonych ofiar ma kluczowe znaczenie. Ponieważ pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB) są uważane za najbardziej śmiertelną formę uszkodzenia DNA wywołanego promieniowaniem, protokół ten przedstawia metodę wykrywania DNA DSB w próbkach krwi. Metodologia opiera się na wykrywaniu znakowanego fluorescencyjnie, fosforylowanego białka naprawy DNA, a mianowicie γ-H2AX. Zastosowanie zautomatyzowanej platformy mikroskopowej do oceny liczby ognisk γ-H2AX na komórkę pozwala na standaryzowaną analizę przy znacznym skróceniu czasu realizacji. Dlatego test γ-H2AX ma potencjał, aby stać się jednym z najszybszych i czułych testów w dozymetrii biologicznej. W tym protokole próbki krwi pełnej od zdrowych dorosłych ochotników zostaną przetworzone i napromienione in vitro w celu zilustrowania zastosowania zautomatyzowanego i czułego testu ognisk γ-H2AX do zastosowań biodozymetrycznych. Zastosowano zautomatyzowany system skanowania preparatów i platformę analityczną ze zintegrowanym mikroskopem fluorescencyjnym, który umożliwia szybką, automatyczną ocenę DNA DSB przy zmniejszonym stopniu odchylenia.

Wprowadzenie

Od momentu odkrycia, promieniowanie jonizujące (IR) stało się nieodzownym narzędziem w obecnych praktykach medycznych i przemysłowych, a także w zastosowaniach rolniczych i wojskowych. Jednak szerokie zastosowanie podczerwieni zwiększa również ryzyko nadmiernej ekspozycji na promieniowanie zarówno dla zawodowych pracowników zajmujących się promieniowaniem, jak i dla osób postronnych. IR jest dobrze znanym fizycznym czynnikiem rakotwórczym, który może indukować uszkodzenia DNA w sposób bezpośredni lub pośredni, prowadząc do znacznych zagrożeń dla zdrowia 1,2. Dlatego ważne jest, aby dokonać oceny dawki, ponieważ stopień narażenia stanowi ważny wstępny krok w postępowaniu w przypadku awarii radiacyjnej 1.

W przypadku dużych zagrożeń jądrowych lub radiologicznych, liczba ocen dawek, które należy przeprowadzić, może wahać się od kilku do tysięcy osób, w zależności od wielkości wypadku3. W tych scenariuszach dozymetria fizyczna może być również niejednoznaczna (np. jeśli dozymetr nie jest prawidłowo noszony) lub niedostępna, gdy zaangażowani są członkowie społeczeństwa. Chociaż objawy kliniczne mogą być wykorzystane do selekcji, niekoniecznie są one specyficzne dla promieniowania i mogą skutkować fałszywą diagnozą. Dlatego zaleca się stosowanie dozymetrii biologicznej wraz z dozymetrią fizyczną i ocenami klinicznymi. Metoda ta pozwala na analizę zmian wywołanych promieniowaniem na poziomie komórkowym i umożliwia jednoznaczną identyfikację osób narażonych na promieniowanie, które wymagają leczenia4. Lekarz może następnie wykorzystać tę ocenę dawki biologicznej do uzupełnienia rekonstrukcji dawki fizycznej i innych diagnoz klinicznych, w celu przepisania odpowiedniej opieki medycznej5. Zapotrzebowanie na dozymetrię biologiczną będzie szczególnie duże w przypadku segregacji i postępowania medycznego z ofiarami, gdy scenariusz narażenia nie jest dobrze znany i gdy ofiarami są członkowie społeczeństwa. Głównym celem triażu jest skuteczne odróżnienie osób "dobrze zaniepokojonych", które mogły mieć objawy prodromalne, ale nie otrzymały dużej dawki, od osób narażonych wymagających natychmiastowej pomocy medycznej i specjalistycznej opieki. Progowy poziom dawki promieniowania, która może powodować chorobę popromienną, wynosi około 0,75 - 1,00 Gy. Następnie osoby, które otrzymują > 2 Gy ekspozycji, są bardziej narażone na ostry zespół popromienny i powinny otrzymać natychmiastowe leczenie6,7. Kluczowe znaczenie ma terminowe i dokładne oszacowanie dawki biologicznej dla ofiar, które znalazły się w krzyżowym ogniu takich katastrof. Dodatkowo może również uspokajać i uspokajać ofiary w minimalnym stopniu8.

Organy ochrony przed promieniowaniem używają różnych markerów biodozymetrycznych, które głównie opierają się na wykrywaniu uszkodzeń cytogenetycznych, takich jak dwucentryczne chromosomy lub mikrojądra, w hodowanych ludzkich limfocytach9. Wykrywanie uszkodzeń cytogenetycznych można również przeprowadzić za pomocą fluorescencyjnego testu translokacji hybrydyzacji in situ (FISH)10. Jednak główną wadą konwencjonalnych metod cytogenetycznych jest długi czas oczekiwania na wyniki w sytuacji awaryjnej8.

Jednym z najwcześniejszych etapów w procesie rozpoznawania DNA DSB jest fosforylacja wariantu histonu H2AX, prowadząca do powstania γ-H2AX, a następnie rekrutacji czynników naprawczych. W ciągu ostatniej dekady wykrywanie ognisk γ-H2AX wywołanych promieniowaniem w limfocytach krwi obwodowej za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej zyskało coraz większą uwagę jako niezawodne narzędzie dozymetrii biologicznej11,12,13,14,15. W zależności od jakości promieniowania i typu ogniwa, maksymalna wydajność ognisk γ-H2AX jest wykrywana w ciągu 0,5 - 1 godziny po napromieniowaniu16,17. Przewiduje się, że istnieje ścisła korelacja między liczbą ognisk DNA DSB i γ-H2AX, a także między zanikiem ognisk a naprawą DSB. Eksperymenty z nożycami laserowymi z pulsacyjną mikrowiązką laserową wykazały, że ogniska γ-H2AX lokalizują się w miejscach DNA DSB18. Chociaż pozostaje to tematem aktywnej debaty, jedno z najwcześniejszych badań z 125I zasugerowało korelację jeden do jednego między obliczoną liczbą rozpadów na komórkę (reprezentowaną dla liczby DNA DSB wywołanego promieniowaniem) a liczbą ognisk γ-H2AX, które zostały ocenione19,20.

W ciągu ostatniej dekady Unia Europejska sfinansowała projekty MULTIBIODOSE (Multi-disciplinary biodosimetric tools to manage high scale radiological casualties) i RENEB (Realizing the European Network of Biodosimetry) w celu stworzenia trwałej sieci w dozymetrii biologicznej i retrospektywnej21,22. W ramach tego projektu wzięły udział różne laboratoria z całej Europy, które miały ocenić możliwości reagowania w sytuacjach awaryjnych w przypadku zagrożenia radiologicznego14,21,22. Test ognisk γ-H2AX ma wiele istotnych zalet, takich jak szybki czas przetwarzania, potencjał przetwarzania wsadowego pozwalający na wysoką przepustowość, a także wysoka czułość, jeśli jest stosowany w ciągu kilku godzin po ekspozycji13,23,24. Wysoka czułość testu w zakresie niskich dawek zaowocowała wieloma badaniami, w których test ognisk γ-H2AX został wykorzystany jako wskaźnik wpływu ekspozycji na promieniowanie medyczne, zarówno w radioterapii, jak i w zastosowaniach diagnostyki obrazowej25,26,27,28,29,30. Te cechy sprawiają, że test ogniskowy γ-H2AX jest wysoce konkurencyjną alternatywą dla innych metod wczesnej selekcji w dużych awariach jądrowych w celu oddzielenia osób krytycznie narażonych od osób niskiego ryzyka. Kilka eksperymentów optymalizacyjnych wykazało, że możliwe jest wykonanie testu ognisk γ-H2AX z małymi objętościami krwi, takich jak badanie Moqueta i wsp., którzy stwierdzili, że możliwe jest wykonanie testu ognisk γ-H2AX przy użyciu tylko kropli krwi (nakłucie palca)31. Podobne podejście zastosowano przy opracowywaniu w pełni zautomatyzowanego, wysokowydajnego systemu RABIT (Rapid Automated Biodosimetry Tool), który został zoptymalizowany pod kątem pomiaru wydajności γ-H2AX z próbek krwi pochodzących z opuszki palca32,33. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki badań porównawczych MULTIBIODOSE i RENEB sugerują, że test ognisk γ-H2AX może być bardzo użytecznym narzędziem do selekcji po niedawnym (do 24 godzin) narażeniu na ostre promieniowanie12,13,14. W badaniu porównawczym z niskim zakresem dawek można było odróżnić dawkę tak niską jak 10 mGy od próbek kontrolnych napromieniowanych pozorem, podkreślając czułość testu w niskim zakresie dawek34. Należy zauważyć, że wysoka czułość testu jest szczególnie prawdziwa w przypadku limfocytów, co czyni je jednym z najbardziej odpowiednich typów komórek do oceny ekspozycji na niskie dawki. Limfocyty są głównie komórkami niecyklicznymi i reprezentują populację synchroniczną. Ten ostatni pozwala uniknąć ekspresji γ-H2AX jest związany z replikacją DNA, co znacznie zmniejsza czułość testu na wykrywanie DSB wywołanego promieniowaniem podczas fazy G2 i S cyklu komórkowego35. Oprócz wrażliwości na niskie dawki limfocytów, czas realizacji testu ognisk γ-H2AX jest znacznie szybszy niż technik cytogenetycznych, takich jak test dicentryczny i mikrojądrowy, ponieważ nie wymaga stymulacji limfocytów. W związku z tym wyniki można uzyskać w ciągu kilku godzin, w porównaniu do kilku dni w przypadku technik cytogenetycznych. Główną wadą testu jest szybki zanik sygnału ognisk γ-H2AX, który zwykle zostanie zredukowany do poziomu wyjściowego w ciągu kilku dni po ekspozycji na promieniowanie, w zależności od kinetyki naprawy DNA36. Dlatego najodpowiedniejszym zastosowaniem testu w kontekście biodozymetrii jest wstępna selekcja i priorytetowe traktowanie bardziej czasochłonnych obserwacji dozymetrii biologicznej cytogenetycznej u niektórych ofiar. Jednak w celu uzyskania precyzyjnej biodozymetrii retrospektywnej i długoterminowych efektów należy polegać na technikach cytogenetycznych, takich jak trójkolorowe analizy FISH w celu wykrycia stabilnych aberracji chromosomowych w przypadku, gdy ekspozycja miała miejsce kilka lat temu10.

W ramach kilku inicjatyw biodozymetrycznych, wiele testów zostało ocenionych do celów triażu obok testu ognisk γ-H2AX do selekcji osób w nagłych wypadkach radiologicznych na dużą skalę; takich jak test dicentryczny, test mikrojądrowy z blokiem cytokinezy, rezonans paramagnetyczny elektronów (EPR), test białka surowicy (SPA), test plamek skóry (SSA), optycznie stymulowana luminescencja (OSL), a także analiza ekspresji genów 37, 38. Test ognisk γ-H2AX może być używany ilościowo do oceny powstawania i naprawy DNA DSB39. Jednak test jest zależny od czasu, ponieważ poziom ognisk γ-H2AX zmienia się w czasie po napromieniowaniu ze względu na kinetykę naprawy DNA DSB40. Badanie porównawcze wykazało, że mikroskopowe punktowanie ze zdolnością stopnia z oferuje najdokładniejsze wyniki po 1 Gy napromieniowania, podczas gdy cytometria przepływowa daje wiarygodne wyniki tylko przy wyższych dawkach IR41. Istnieje wiele doniesień o rozwoju rozwiązań do analizy obrazu do użytku w zautomatyzowanym ocenianiu42,43,44,45,46. W tym protokole zautomatyzowana, wysokoprzepustowa platforma mikroskopii fluorescencyjnej jest wykorzystywana do analizy ognisk γ-H2AX w limfocytach krwi obwodowej. Zastosowanie automatycznego systemu punktacji pozwala uniknąć błędu systematycznego zarówno między laboratoriami, jak i między obserwatorami, a jednocześnie pozwala na wystarczającą czułość do wykrywania dawek poniżej 1 Gy47. Podstawową zaletą tego systemu w porównaniu z darmowym oprogramowaniem typu open source do oceny ognisk jest fakt, że cały proces od skanowania slajdów do przechwytywania i oceniania jest zautomatyzowany. Koncepcja klasyfikatorów definiowanych i zapisywanych przez użytkownika gwarantuje powtarzalność, która dodaje bezstronny stopień jakości do wyników. W związku z tym praca ta ilustruje, w jaki sposób można uzyskać wyniki ognisk γ-H2AX przy użyciu zautomatyzowanej metody skanowania mikroskopowego i oceniania, która może być stosowana, gdy próbki krwi od osób potencjalnie nadmiernie narażonych są odbierane przez laboratoria radiobiologiczne do celów dozymetrii biologicznej.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Biomedycznych Komitetu Etyki Uniwersytetu Prowincji Przylądkowej Zachodniej - Kod BM18/6/12.

1. Przygotowanie rozwiązań48

  1. Roztwór do utrwalania komórek (3% PFA w PBS)
    1. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i pracując pod wyciągiem, dodać 20 g paraformaldehydu do 200 ml destylowanegoH2O. Podgrzać mieszaninę do 60 °C, aby ułatwić rozpuszczenie.
    2. Po rozpuszczeniu PFA ostrożnie dodać 40 kropli 5 N NaOH przez 30 minut i schłodzić do temperatury pokojowej. Doprowadzić do pH 7 przy użyciu 1 M HCl i uzupełnić do końcowej objętości 250 ml destylowanymH2O(podwielokrotności można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 rok). Dodaj 25 ml z tego roztworu do 41,7 ml PBS, aby uzyskać 3% roztwór PFA.
  2. 1% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA): Dodać 10 g BSA do 1000 ml PBS i mieszać aż do rozpuszczenia. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia (maksymalnie 72 godziny).
  3. Roztwór Triton-X w stężeniu 1:500: Dodać 1 μl Triton-X do 500 μl PBS, przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia (maksymalnie 24 godziny).
  4. Roztwory przeciwciał
    1. Przeciwciało pierwszorzędowe - Anty-γ-H2AX w stężeniu 1:500: Dodać 1 μl anty-γ-H2AX do 500 μl 1% roztworu BSA, przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia (maksymalnie 24 godziny).
    2. Przeciwciało drugorzędowe - DAM-TRITC w stężeniu 1:1000: Dodać 1 μl DAM-TRITC do 1000 μL 1% roztworu BSA, przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia (maksymalnie 24 godziny).
  5. Kompletne media Instytutu Pamięci Roswell Park (cRPMI)
    1. Dodać przefiltrowaną płodową surowicę bydlęcą (FBS) i penicylinę-streptomycynę do pożywki RPMI 1640 w sterylnej butelce, aby uzyskać końcowe stężenie 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny.

2. Przygotowanie próbek

UWAGA: Dla tego protokołu, próbki krwi pełnej z obwodów są pobierane przez nakłucie żyły w probówkach do pobierania heparyny litowej od zdrowych dorosłych ochotników (za świadomą zgodą - BM18/6/12 Komitet Etyki Badań Biomedycznych Uniwersytetu Prowincji Przylądkowej Zachodniej). Przed rozpoczęciem upewnij się, że krew i podłoże o gęstości 1.077 g/ml są przystosowane do temperatury pokojowej.

  1. W przygotowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego rozcieńczyć obwodową krew pełną w objętości 1:1 za pomocą PBS i delikatnie ułożyć rozcieńczoną krew w równej objętości do dwóch objętości pożywki o gęstości 1,077 g/ml. Ważne jest, aby stopniowo nakładać krew na podłoże o dużej gęstości, trzymając probówkę nachyloną pod kątem 45°, upewniając się, że krew i podłoże o dużej gęstości nie mieszają się.
  2. Ostrożnie przenieść zawiesinę do wirówki i wirować z prędkością 900 x g przez 20 minut. Następnie pipetować "mętną" warstwę tylko do nowej sterylnej stożkowej probówki i napełniać probówkę PBS i wirować przez 10 minut przy 1000 x g. Następnie odessać supernatant za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć osadu, ostrożnie zawiesić osad PBMC w 1 ml PBS i napełnić probówkę PBS.
  3. Powtórz powyższy krok prania jeszcze dwa razy, aby uzyskać w sumie trzy prania.
  4. Policz liczbę PBMC za pomocą hemocytometru, mając świadomość, że każdy ml krwi obwodowej od dorosłego dawcy da przybliżoną średnią 1 - 1,5 x 106 PBMCs49. Po zliczeniu rozcieńczyć osad PBMC do stężenia 8 x 105 limfocytów w 1 ml cRPMI. Następnie dodać około 2 x 106 PBMC lub 2,5 ml z wyizolowanego roztworu PBMC do sterylnej, stożkowej probówki do napromieniania.

3. Próbki napromieniania

UWAGA: Z jednostką promieniowania należy obchodzić się zgodnie z wytycznymi ochrony przed promieniowaniem i zawsze nosić fizyczny dozymetr. Należy upewnić się, że stosowany system napromieniania jest skalibrowany i skonfigurowany w taki sposób, aby osiągnąć prawidłowe oczekiwane dawki.

  1. Napromieniować PBMC w temperaturze pokojowej przy użyciu źródła 60Co. Kalibracja (protokół TRS-398) za pomocą komory Farmer 117, dla której współczynnik kalibracji komory uzyskany z Narodowego Instytutu Metrologii Republiki Południowej Afryki (NMISA)50.
    1. W tym teście należy umieścić stożkowe rurki między arkuszem akrylowym o grubości 5 mm (używanym do budowania wiązki) a materiałem rozpraszającym wstecznie o średnicy 50 mm o obecnej dawce źródła 60Co wynoszącej 0,57 Gy/min dla jednorodnej wielkości pola 300 mm × 300 mm przy odległości od źródła do powierzchni 750 mm.
  2. Napromieniować PBMC dawkami o stopniowanych dawkach 0,125, 0,500, 1,000, 1,500 i 2,000 Gy i utrzymywać napromieniowane pozorem próbki kontrolne w sterowni, otrzymując jedynie ekspozycję na promieniowanie otoczenia.
  3. Inkubować napromieniowane próbki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w zwilżonym inkubatorze z 5% stężeniemCO2 w celu osiągnięcia maksymalnej liczby ognisk γ-H2AX.
    UWAGA: Czas inkubacji można modyfikować zgodnie z projektem eksperymentalnym.

4. Przygotowanie slajdów

UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla ustawień slajdów.

  1. Przygotuj 3 szkiełka podstawowe (powtórzenia techniczne) przy użyciu szkiełek pokrytych dodatnio naładowaną powierzchnią, aby poprawić przyczepność na warunki napromieniowania (lub na rurkę stożkową). Umieść szkiełko w uchwycie klipsa, dodaj na niego kartę filtra, a na końcu lejek. Zabezpiecz klipsy szkiełkowe i umieść je w cytowirówce.
  2. Dodać 250 μl zawiesiny komórkowej do lejka (200 000 komórek/szkiełko) i wirować przez 30 x g przez 5 minut za pomocą cytowirówki.
  3. Po cytowirowaniu wyjmij szkiełko z uchwytu klipsa i za pomocą hydrofobowego pisaka narysuj okrąg wokół miejsca, w którym znajdują się komórki, aby zachować barwnik immunofluorescencyjny na związanych komórkach podczas procesu barwienia.

5. Utrwalanie i immunofluorescencja barwienia γ-H2AX

UWAGA: Wszystkie roztwory są starannie dodawane bezpośrednio do obszaru komórki, który jest oznaczony hydrofobowym okręgiem. Roztwory barwiące są dozowane nieco powyżej szkiełka, nie dopuszczając do tego, aby końcówka pipety naruszyła komórki. Rozwiązania NIE są dodawane do całego slajdu.

  1. Utrwal szkiełka w świeżo przygotowanym 3% PFA na 20 minut.
    UWAGA: Preparaty można przechowywać w PBS zawierającym 0,5% PFA w temperaturze 4 °C maksymalnie 2 dni przed wykonaniem barwienia immunologicznego. Następnie myj szkiełka w słoiku Coplin z PBS przez 5 minut, a następnie przykryj komórki 100 μl zimnego roztworu Triton-X przez 10 minut, aby umożliwić przepuszczalność.
  2. Wylej roztwór Triton-X na bibułę i myj szkiełka trzykrotnie w 1% roztworze BSA przez 10 minut. Ma to na celu zapobieganie niepożądanemu tłu poprzez blokowanie niespecyficznego wiązania przeciwciał.
  3. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej ze 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała anty-γ-H2AX rozcieńczonego w stosunku 1:500 przez 1 godzinę w komorze nawilżającej, co można łatwo osiągnąć, dodając mokrą bibułkę u podstawy prostokątnego pudełka do przechowywania szkiełek.
    1. Wylej roztwór przeciwciała na bibułę i wykonaj trzy płukania 1% roztworem BSA przez 10 minut w słoiku Coplin, aby usunąć niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe i zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała drugorzędowego.
  4. Inkubować szkiełka z 100 μl rozcieńczonego w stosunku 1:1000 wtórnego roztworu przeciwciała DAM-TRITC przez 1 godzinę w komorze nawilżającej. Wylej roztwór przeciwciała na bibułę i umyj szkiełka w PBS przez 10 minut trzy razy.
  5. Na koniec wysuszyć szkiełka poza kręgiem hydrofobowym miękką, odpylającą bibułę i dodać 1-2 krople DAPI rozpuszczonej w wodnym podłożu montażowym i delikatnie przykryć szkiełko szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 x 50 mm, upewniając się, że nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza i wstawić na noc do lodówki w temperaturze 4 °C. Preparaty można przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 2 tygodnie przed skanowaniem.

6. Automatyczne skanowanie i ocenianie slajdów

UWAGA: System skanowania musi mieć mikroskop fluorescencyjny, kamerę CCD o wysokiej rozdzielczości (naładowane sprzężone urządzenie) podłączoną do frame grabbera do digitalizacji obrazów wideo w czasie rzeczywistym, stolik skanujący, trackball do ręcznych ruchów, mysz 3D, szybki komputer i monitor oraz dysk twardy do archiwizacji (Rysunek 2).

  1. Konfiguracja klasyfikatora
    UWAGA: Klasyfikator to zestaw parametrów określających, w jaki sposób system wykrywa komórki. Wynika to z treningu w oparciu o wstępnie sklasyfikowane pola obrazu. Klasyfikator jest specyficzny dla powiększenia mikroskopu, typu komórki i laboratorium. Klasyfikatory mogą zatem wymagać modyfikacji poniższych parametrów w celu dostosowania ich do aktualnych warunków. Zaleca się przetestowanie ustawień za pomocą slajdu referencyjnego przed oceną.
    1. Akwizycja obrazu: Do obrazowania należy używać suchego obiektywu z powiększanym rozmiarem 40x. Aby uzyskać porównywalną jakość obrazu we wszystkich komórkach, ustaw czas integracji kamery na tryb automatyczny. Ustaw maksymalny czas integracji na co najmniej 1 sekundę dla obu kanałów kolorów (wzmocnienie kamery 4.0). Kanał sygnałowy jest odbierany z 10 płaszczyznami ostrości i 14/40 μm między płaszczyznami.
    2. Wybór komórek: wykrywane są PBMC w zakresie od 20,00μm2 do 76,00μm2. Ustaw maksymalną głębokość wklęsłości na 0,05, a maksymalny współczynnik proporcji na 1,4. Ustaw względny próg poziomu szarości na 20%.
    3. Przetwarzanie komórek: Przetwarzaj kanał DAPI przeciwbarwny za pomocą algorytmu maksymalnego histogramu, aby zmniejszyć tło. Kanał sygnałowy jest przetwarzany za pomocą filtra TopHat (siła 7, współczynnik wygładzania 0) w celu zmniejszenia tła i wzmocnienia sygnałów.
    4. Zliczanie sygnałów: Zliczanie ognisk za pomocą funkcji Object Count urządzenia. Aby uniknąć fałszywie dodatniej oceny pozostałych sygnałów tła, zliczane są tylko te sygnały, które wykazują co najmniej 30% intensywności w porównaniu z najjaśniejszym obiektem w komórce.
  2. Włóż/umieść szkiełka na zautomatyzowanej platformie skanującej lub stoliku przesuwnym, po delikatnym oczyszczeniu 70% etanolem, aby usunąć kurz.
  3. Ustawienia slajdu - Otwórz menu dialogowe ustawień slajdu (Rysunek 3)
    1. Wybierz poprawną ścieżkę danych, która określa, gdzie są przechowywane pliki slajdów wynikające z wyszukiwania.
    2. Nadaj slajdowi nazwę, każdy slajd musi mieć unikalną nazwę. Jeśli seria slajdów jest wprowadzona w formie listy wyliczeniowej, znak "?" może być używany jako symbol wieloznaczny dla numeru slajdu.
    3. Wybierz odpowiedni klasyfikator, zgodnie z opisem w sekcjach 1.1 - 1.4 (Rysunek 4).
    4. Wybierz okno wyszukiwania i wybierz opcję Wstępnie zdefiniowane, jeśli istnieje definicja okna wyszukiwania pasująca do okręgu komórki cytowirówki, wybierz odpowiednią definicję w kolumnie Rozmiar lub wybierz opcję Ręcznie, jeśli nie jest dostępna żadna wstępnie zdefiniowana definicja okna wyszukiwania. W takim przypadku kolumna Rozmiar nie musi być ustawiona.
    5. Wybierz opcję Maksymalna liczba komórek i dodaj maksymalną liczbę komórek wymaganych do skanowania. Wyszukiwanie jest przerywane, nawet jeśli wybrane okno wyszukiwania nie zostało jeszcze w pełni przeskanowane, gdy tylko zostanie osiągnięta maksymalna liczba komórek. W przypadku zastosowań biodozymetrycznych wystarczająca jest automatyczna ocena 1000 komórek na szkiełko, biorąc pod uwagę, że przygotowywane są 3 szkiełka na próbkę krwi. Kliknij przycisk OK, aby potwierdzić ustawienia.
  4. Konfiguracja skanowania slajdów
    1. Kliknij w przycisk Szukaj na pasku bocznym. Jeśli ustawienie Okno wyszukiwania ręcznego zostało wybrane w ustawieniach slajdu, otworzy się okno dialogowe umożliwiające określenie obszaru skanowania (Rysunek 5). Korzystając z obiektywu 10x, wybierz interaktywnie prostokątny obszar wyszukiwania na slajdzie, ustalając dwa rogi pola wyszukiwania za pomocą lewego przycisku myszy. Można to potwierdzić przyciskiem OK. Jeśli okno wyszukiwania odwołuje się do wstępnie zdefiniowanego okna wyszukiwania, ten krok zostanie pominięty.
    2. Użytkownik zostanie poproszony o dostosowanie pozycji początkowej ostrości. Obiekt referencyjny zostanie następnie wybrany automatycznie, oprogramowanie poprosi użytkownika o ustawienie ostrości i wyśrodkowanie jądra odniesienia (przy użyciu obiektywu 40x) dla każdego slajdu oraz potwierdzenie ustawień za pomocą OK. System automatycznie przejdzie sekwencyjnie do wszystkich slajdów. Jeśli to konieczne, dostosuj Live Image Setup - Integration Time dla tego kroku (Rysunek 5).
    3. Sprawdź wszystkie ustawienia mikroskopu i potwierdź monit systemu przyciskiem OK. System rozpocznie procedurę automatycznego ustawiania ostrości i skanowania. Po zakończeniu skanowania dane są zapisywane na komputerze w celu analizy. System skanowania wyłącza się automatycznie po zakończeniu skanowania.
      UWAGA: Upewnij się, że dźwignia tubusu mikroskopu znajduje się w pozycji, która kieruje całe światło na aparat.
    4. Wyszukiwanie Koniec, wyszukiwanie jest przerywane, jeśli całe wyszukiwanie zostało przeskanowane, jeśli osiągnięto maksymalną liczbę komórek lub jeśli wyszukiwanie zostało anulowane.
  5. Analiza slajdów
    UWAGA: Ukończone skanowanie jest reprezentowane przez Rysunek 6.
    1. Po zakończeniu skanowania kliknij przycisk Galeria na pasku bocznym. Przejrzyj galerię, która składa się z małych obrazów wykrytych komórek. W tym oknie (Rysunek 7) określ, czy komórki przechowywane w galerii według kryterium mają być wybrane z rozwijanego menu. Komórki są zazwyczaj wyświetlane w kolejności, w jakiej zostały wykryte.
    2. Kliknij na Histogram Jakości/Wykres Wartości Cech (Rysunek 8), aby podać rozkład miary jakości dla wykrytych komórek, a także średnie i odchylenie standardowe punktowanych ognisk.

Wyniki

W ramach niniejszego protokołu ludzkie mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) wyizolowano z krwi pełnej czterech zdrowych dorosłych ochotników i poddano działaniu dawek promieniowania 0,125, 0,250, 0,500, 1,000 oraz 2,000 Gy. Następnie próbki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5% CO2. Po utrwaleniu i barwieniu immunofluorescencyjnym preparaty są automatycznie skanowane i oceniane. Ryciny 6, 7 i 8 przedstawiają wyniki generowane przez oprogramowanie dla użytkownika. Po zakończeniu skanowania pojawia się okno analizy, zapewniające przegląd ocenionych ognisk. Galeria prezentuje wszystkie ocenione ogniska wraz z interaktywnym menu umożliwiającym usunięcie wartości odstających, a na koniec wyświetlany jest histogram ze szczegółowym podsumowaniem danych.

Liczba ognisk γ-H2AX po ekspozycji na promienie γ została przedstawiona na Ryc. 9. Odnotowano stopniowy wzrost liczby ognisk γ-H2AX wraz ze wzrostem dawki. Wykres ten nie tylko obrazuje zależność od dawki oraz czułość analizy, ale dopasowanie może być również wykorzystane do oszacowania dawki w przypadku otrzymania próbki od osoby, która została poddana działaniu nieznanej dawki. Należy zauważyć, że w takim przypadku nie będzie dostępnej kontroli pozornej (sham-irradiated control) ani poziomu tła dla danej osoby. Dlatego Ryc. 9 uwzględnia wartość 0 Gy dla próbek kontrolnych poddanych pozornemu napromieniowaniu, która dla czterech dorosłych dawców w niniejszym badaniu wynosiła 0,57 ± 0,23 Gy.

Schemat procesu wirowania ilustrujący przygotowanie próbek, sprzęt i układ wyników.
Rysunek 1: Przygotowanie szkiełek do cytowirowania. Włóż szkiełko do uchwytu z zaciskami, nałóż na nie karton filtracyjny, a na koniec lejek. Zabezpiecz zaciski szkiełka i umieść całość w cytowirówce. Po cytowirowaniu wyjmij szkiełko z uchwytu i obrysuj okręgiem obszar z komórkami, używając pisaka hydrofobowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ mikroskopowy do obrazowania fluorescencyjnego; analiza optyczna, wizualizacja danych na ekranie.
Rycina 2: Zautomatyzowana platforma skanująca wykorzystana w niniejszym protokole, zawierająca automatyczny skaner podłączony do mikroskopu fluorescencyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Interfejs oprogramowania do analizy obrazów dla zautomatyzowanego przetwarzania danych mikroskopowych; konfiguracja MetaSystems.
Rysunek 3: Menu konfiguracji preparatu. Otwórz okno dialogowe, klikając przycisk SETUP w pasku bocznym. Wybierz lub wprowadź katalog docelowy dla plików z wynikami Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Interfejs oprogramowania do mikroskopii fluorescencyjnej pokazujący parametry analizy komórek i dane dotyczące barwienia DAPI.
Rysunek 4: Menu konfiguracji klasyfikatora. Należy upewnić się, że wybrane ustawienia klasyfikatora są zgodne z aktualnym typem komórek, warunkami preparatyki oraz wzorami barwienia próbki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Interfejs oprogramowania MetaSystems do analizy obrazów mikroskopowych, pokazujący konfigurację okna ręcznego wyszukiwania.
Rysunek 5: Menu konfiguracji dla okna ręcznego wyszukiwania (Manual Search Window). W ustawieniach preparatu wybrano okno; pojawi się okno dialogowe umożliwiające określenie obszaru skanowania. Przy użyciu obiektywu 10x prostokątny obszar wyszukiwania na preparacie jest wybierany interaktywnie poprzez wyznaczanie dwóch narożników pola wyszukiwania lewym przyciskiem myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Interfejs oprogramowania analitycznego MetaCyte; wyniki obrazowania komórek, analiza danych z histogramu, konfiguracja mikroskopii.
Rysunek 6: Okno analizy; po zakończeniu skanowania w oknie analizy wyświetlane są wyniki skanowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza rozkładu metafaz z wykorzystaniem systemu Metafer 4; wyniki obrazowania komórek do oceny uszkodzeń DNA.
Rysunek 7: Widok galerii dla wybranego preparatu. Karta Gallery znajduje się na pasku bocznym. Galeria obrazów składa się z małych zdjęć wykrytych komórek, przedstawionych jako połączony obraz DAPI-TRITC. W lewym i prawym dolnym rogu każdego obrazu wyświetlane są bezpośrednia liczba ognisk oraz skorygowana liczba ognisk. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Interfejs oprogramowania do analizy danych mikroskopowych do liczenia komórek; wykres histogramu; intensywności.
Rycina 8: Obrazy histogramów dla wybranego preparatu. Okno to otwiera się poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy na histogramie. Po kliknięciu na histogram, karta histogramu wyświetla podsumowanie danych, w którym wymienione są wartości średnia, odchylenie standardowe, współczynnik zmienności, minimum, maksimum oraz mediana analizowanych komórek. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Zależność odpowiedzi od dawki promieniowania; wykres, obrazy mikroskopowe; analiza liczby ognisk na komórkę; wykres dawki w funkcji średniej liczby ognisk.
Rysunek 9: Liczba ognisk γ-H2AX w funkcji dawki dla limfocytów naświetlonych promieniami γ 60Co. Słupki błędów przedstawiają odchylenia standardowe obrazujące zmienność międzyosobniczą wśród dawców. Dane reprezentują średnią liczbę ognisk γ-H2AX ± odchylenie standardowe dla czterech zdrowych ochotników. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół ten opisuje krokową procedurę automatycznej oceny punktowej testu ognisk γ-H2AX opartej na mikroskopii fluorescencyjnej. Ilustruje to użyteczność testu ogniskowego jako efektywnej czasowo metody analizy liczby indukowanych promieniowaniem DNA DSB w limfocytach krwi obwodowej w celu przeprowadzenia oceny dawki biologicznej w scenariuszu wypadku radiacyjnego, w którym osoby mogą być narażone na nieznane poziomy podczerwieni.

W tym konkretnym protokole PBMC poddano napromienianiu in vitro , aby naśladować ekspozycję na promieniowanie in vivo . Po zakończeniu naświetlania i czasu inkubacji wynoszącego jedną godzinę, preparaty są wykonywane przy użyciu cytowirówki, aby stworzyć punkt koncentracji komórek na szkiełku. Zastosowanie cytowirówki jest niezbędne do osiągnięcia ustandaryzowanych warunków do automatycznego oceniania. Po zakończeniu używa się pisaka hydrofobowego do wykonania okręgu wokół komórek, aby zmniejszyć marnotrawstwo odczynników, umożliwiając użytkownikowi zlokalizowanie odczynników barwiących. Ten typ wstrzykiwacza może być stosowany w różnych technikach barwienia immunologicznego, takich jak skrawki parafinowe, skrawki zamrożone i preparaty cytologiczne. Ponadto ważne jest, aby wybrać długopis hydrofobowy, który jest kompatybilny z systemami detekcji opartymi na enzymach i fluorescencyjnych. Po przygotowaniu szkiełek nastąpiło utrwalenie i barwienie immunofluorescencyjne γ-H2AX. W tym protokole komórki są utrwalane za pomocą 3% PFA w roztworze PBS przez 20 minut. Aby barwienie immunologiczne zakończyło się sukcesem, konieczne jest zachowanie morfologii komórek i dostęp do miejsc antygenowych dla stosowanych odczynników wykrywających. PFA jest stosunkowo łagodnym środkiem do utrwalania i stabilizuje komórki, zachowując struktury białkowe51. Eksperymenty optymalizacyjne z wyższymi stężeniami PFA i dłuższymi czasami utrwalania miały negatywny wpływ na jakość szkiełka, ale dalsze przechowywanie (przez noc) w 0,5% PFA do 24 godzin przyniosło dobre wyniki.

Pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne 2F3 zastosowane w tym protokole reaguje na wariant histonu H2AX po fosforylacji w serynie 139 po indukcji DNA DSB. Przeciwciało jest w stanie wiązać się z fosforylowaną resztą bez reaktywności krzyżowej z innymi fosforylowanymi histonami52. Ponieważ jest to pierwotne mysie przeciwciało monoklonalne, przeciwciało drugorzędowe wybrano przeciwko gatunkowi gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego podczas hodowli w alternatywnym gospodarzu, a mianowicie osła-anty-myszy (DAM)-TRITC. Podczas gdy barwienie immunofluorescencyjne opiera się na specyficznym wiązaniu przeciwciało-epitop, kilka sił międzycząsteczkowych może również powodować niespecyficzne barwienie tła. W celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania ważne jest stosowanie odczynnika blokującego w protokołach barwienia immunofluorescencyjnego53; skorzystaliśmy z rozwiązania BSA. Ponadto należy przeznaczyć wystarczająco dużo czasu na ten etap blokowania, pozostawiając szkiełka w roztworze na co najmniej 20 minut przed pierwotnym i wtórnym barwieniem przeciwciał. Ponadto roztwór BSA powinien być również stosowany jako rozcieńczalnik dla przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. W zależności od przeciwciała anty-γ-H2AX i przeciwciała drugorzędowego, które jest używane do barwienia, należy rozważyć przetestowanie różnych rozcieńczeń przeciwciał w celu określenia optymalnego stężenia. W celu uzyskania bardziej precyzyjnej oceny można przeprowadzić podwójne barwienie, dodając dodatkowe przeciwciała przeciwko białku naprawczemu DNA DSB.

Główną wadą tego typu analizy jest konieczność pobrania próbek krwi tak szybko, jak to możliwe po ekspozycji, ponieważ wiadomo, że maksymalna liczba ognisk zmniejsza się z powrotem do normalnego poziomu w ciągu 48 godzin po napromienianiu. W związku z tym, gdy znany jest czas wypadku radiacyjnego i późniejszego pobrania krwi, przydatna może być praca z różnymi krzywymi kalibracyjnymi, które zostały ustalone w różnych punktach czasowych po napromienianiu in vitro (np. 4, 8, 12 i 24 godziny). Jednak, jak już wspomniano we wstępie do manuskryptu, siła testu ognisk γ-H2AX leży w początkowych, szybkich celach selekcji i powinna być wykorzystana do priorytetowego traktowania bardziej czasochłonnej cytogenetycznej dozymetrii biologicznej. Połączony scenariusz, w którym równolegle wykorzystuje się wiele biomarkerów biodozymetrycznych, pozwoli na uzyskanie najbardziej wiarygodnego oszacowania dawki, a różne laboratoria biodozymetryczne na całym świecie połączyły siły w celu utworzenia ogólnokrajowych sieci, które mogą być aktywowane i wykorzystywane w celu umożliwienia wielu, równoległych ocen biodozymetrycznych przez laboratoria o różnej wiedzy specjalistycznej 37,54,55. Ponadto trwają prace nad superszybką analizą, takie jak mobilne laboratorium na miejscu wypadkunr 56 lub w jego pobliżu. Stale opracowywane są nowe, obiecujące metody biodozymetrii, które, miejmy nadzieję, zaowocują w przyszłości jeszcze szybszą i bardziej niezawodną przepustowością57 .

W przypadku zautomatyzowanego systemu analizy obrazu preparaty są wkładane lub umieszczane na zautomatyzowanej platformie skanującej lub stoliku do slajdów. Następnie nazwij i zapisz szczegóły slajdu w odpowiednim folderze na podłączonym komputerze. W tym eksperymencie automatyczne wykrywanie jąder i ognisk opiera się na odpowiednich ustawieniach klasyfikatora. Podczas tworzenia klasyfikatora upewnij się, że wybrane ustawienia klasyfikatora są zgodne z bieżącym typem komórki, warunkami przygotowania i barwieniem immunofluorescencyjnym próbki. W klasyfikatorze ustawia się odpowiednie kanały fluorescencyjne pasujące do widma wzbudzenia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. Klasyfikator pozwala na ustawienie dodatkowych parametrów punktacji, jeśli jest to wymagane (np. wielkość jądra, natężenie fluorescencji, jak opisano w sekcji 6.1). Jeśli dwa lub więcej białek naprawy DNA (np. γ-H2AX i 53BP1) zostanie połączonych w eksperymencie, system jest również w stanie wykryć kolokalizacje sygnałów. Po pierwsze, system pozyskuje obrazy DAPI, stosuje przetwarzanie obrazu i identyfikuje jądra za pomocą kryteriów morfologicznych określonych w klasyfikatorze. Sygnały TRITC są odbierane za pomocą 10 stosów z krokiem 0,35 mm między płaszczyznami ogniskowymi47. Klasyfikator wykorzystał liczbę ognisk bezpośrednich, w której oceniana jest liczba odrębnych sygnałów TRITC w jądrze. W tym miejscu należy wziąć pod uwagę, że wraz ze wzrostem dawki promieniowania, sygnały ogniskowe mają tendencję do łączenia się w większe obiekty, co skutkuje niedoszacowaniem rzeczywistej liczby ognisk, jeśli obiekty są liczone bezpośrednio. Nie było to wymagane do opisanej tutaj analizy, ale można zaimplementować dodatkowy krok z poprawioną liczbą ognisk, aby rozwiązać ten problem. Ten ostatni pozwala systemowi uzyskać rozmiary wykrytych sygnałów i odpowiednio je zważyć. Zastosowanie obu metod liczenia może zapewnić bardziej realistyczne oszacowanie rzeczywistej liczby ognisk przy wyższych dawkach.

Aby rozpocząć automatyczne skanowanie, obszar skanowania jest określany za pomocą obiektywu 10x mikroskopu w celu utworzenia prostokątnego obszaru wyszukiwania, ustalając dwa rogi pola wyszukiwania za pomocą lewego przycisku myszy (Rysunek 5), a następnie ustawiając ostrość w pozycji początkowej. Obiekt referencyjny jest wybierany automatycznie, a oprogramowanie monituje użytkownika o ustawienie ostrości i wyśrodkowanie jądra referencyjnego (przy użyciu obiektywu 40x) dla każdego slajdu. Po rozpoczęciu wyszukiwania system przesunie się na środek okna wyszukiwania pierwszego wybranego slajdu i poprosi o wyśrodkowanie i skoncentrowanie obiektu referencyjnego. Ten obiekt będzie później używany jako odniesienie do pozycji w celu skorygowania wszelkich przesunięć w pozycjach komórki. Drugim celem pola odniesienia jest automatyczna regulacja światła, w trybie światła przechodzącego światło jest regulowane aż do osiągnięcia optymalnego poziomu światła. W trybie fluorescencji poziom światła jest stały, ale czas integracji kamery CCD można wydłużyć do momentu zmierzenia wymaganego sygnału. Aby umożliwić prawidłową regulację światła, odniesienie powinno zawierać obiekty z typowymi zabarwieniami. Ważne jest, aby nie używać pola, w którym znajdują się artefakty o bardzo dużej intensywności barwienia. Po regulacji światła system uruchamia autofokus siatki w pozycji siatki najbliżej pola odniesienia. Nadal skupia pola na regularnej siatce, poruszając się meandrem w kierunku przodu i tyłu okna wyszukiwania. Skanowanie rozpoczyna się po zakończeniu autofokusa siatki. Stolik jest przesuwany w układzie meandrowym pole po polu w celu przechwycenia danych. Po wykryciu komórki jej pozycja i obraz z galerii są zapisywane i wyświetlane na ekranie, a liczba komórek jest aktualizowana. Jeśli wystąpi błąd mikroskopu, stolika lub podajnika, wyszukiwanie jest automatycznie anulowane. Jedynym krokiem, w którym operator musi interweniować ręcznie, jest konfiguracja skanowania slajdów. Jest to również punkt, w którym odbywa się szybka kontrola jakości (pęcherzyki powietrza, niska liczba komórek, blaknięcie artefaktów barwienia sygnału fluorescencyjnego) i gdzie można podjąć decyzję o przerwaniu skanowania szkiełka gorszej jakości. Wyszukiwanie jest przerywane, jeśli cały slajd został zeskanowany, jeśli osiągnięto maksymalną liczbę komórek lub jeśli wyszukiwanie zostało anulowane. Po zakończeniu skanowania dane są prezentowane tak, jak pokazano na rysunku 6. Aby wyświetlić zeskanowane komórki, zostanie otwarte okno Galeria, w którym można wyświetlić każdą komórkę (Rysunek 7). Jest to kolejny punkt, w którym operator może przeprowadzić kontrolę jakości, sprawdzając ostrość obrazów galerii i całkowitą liczbę komórek, które zostały ocenione. Jeżeli zbyt wiele komórek jest nieostrych lub system wykrył zbyt mało komórek, aby dokonać realistycznego oszacowania dawki (np. 100 komórek zamiast zamierzonych 1000 komórek), należy podjąć decyzję o wykluczeniu preparatu i automatycznego wyniku z oceny końcowej. Wszystkie dane są podsumowane na histogramach (ryc. 8), wraz z informacjami na temat rozkładu, średnich i odchylenia standardowego ognisk uzyskanych dla każdej komórki. Histogramy mogą być również wykorzystywane do wybierania i wyświetlania subpopulacji jąder w oparciu o automatyczne wyniki do przeglądu. Analizy statystyczne wyników przeprowadza się po ręcznym zarejestrowaniu rozkładu, średniej i odchylenia standardowego liczby ognisk na komórkę. Wykres może być wykorzystany jako krzywa kalibracyjna do oszacowania dawki próbki biodozymetrycznej. Można tego dokonać za pomocą równania linii trendu, aby dokonać przybliżonego oszacowania otrzymanej dawki. Co więcej, rysunek 9 pokazuje, że automatyczne skanowanie jest wystarczająco czułe, aby wykryć ogniska indukowane przy niskich dawkach. Co więcej, wyniki wskazują na wyraźny liniowy wzrost liczby ognisk na komórkę wraz z dawką. Należy zauważyć, że wyniki są reprezentatywne tylko dla zastosowanego klasyfikatora, wyniki będą się różnić dla różnych parametrów klasyfikatora. Dlatego w przypadku analizy biodozymetrycznej ważne jest, aby do próbek biodozymetrycznych stosowano ten sam klasyfikator i preparat do szkiełek, co te, które zostały użyte do wyznaczenia krzywej kalibracyjnej, która jest używana do oszacowania dawki. Chociaż nie było to objęte zakresem tego badania, ważne jest, aby pamiętać, że test ognisk γ-H2AX może być również stosowany do określania częściowego napromieniowania ciała. Większość przypadkowych ekspozycji na promieniowanie to niejednorodne lub częściowe narażenie ciała, w którym tylko zlokalizowany obszar ciała został narażony na wysoką dawkę. W kilku badaniach wykazano, że możliwe jest zastosowanie testu ognisk γ-H2AX do oszacowania frakcji ciała, która została napromieniowana, oraz dawki do napromieniowanej frakcji42. Kiedy ma miejsce napromienianie całego ciała, nastąpi losowa indukcja DNA DSB we wszystkich komórkach i można spodziewać się znalezienia rozkładu Poissona. Podobnie jak w przypadku metod cytogennych, w których indukcja aberracji chromosomowych ma tendencję do nadmiernego rozproszenia w limfocytach krwi obwodowej, w których występuje duża obfitość komórek z wieloma aberracjami i komórek z normalnymi metafazami, analiza dyspersji ognisk γ-H2AX przy użyciu zanieczyszczonej metody Poissona sugerowała rozproszone rozkłady ognisk58. To ostatnie zostało również potwierdzone w eksperymentach in vivo na świnkach miniaturowych i makakach rezusach59.

Oświadczenia

C. Schunck jest pracownikiem MetaSystems Hard & Software GmbH, Altlussheim, Niemcy.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować uczestnikom badania za ich oddanie krwi, a także pielęgniarce V. Prince za pobranie próbki krwi. Niniejszym potwierdza się pomoc finansową Południowoafrykańskiej Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) na rzecz tych badań. Wyrażone opinie i wyciągnięte wnioski są opiniami autorów i niekoniecznie należy je przypisywać NRF. Prace te były wspierane finansowo przez Międzynarodową Agencję Energii Atomowej (MAEA) w ramach Projektu Współpracy Technicznej (numer: URU6042) wspierającego W. Martíneza-Lópeza, a także Koordynowanego Projektu Badawczego E35010 (numer umowy: 22248).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina surowicy bydlęcej - BSAMerckA3059
Coplin JarSigmaS6016
Szkiełka nakrywkowe (rozmiar 24 x 50 mm)LasecGlass2C29M2450Rec
Fiolki kriogeniczne (1,2 ml)BiałeSci607101
CytospinHealthcare TechnologiesJC370-12-L
Cytospin ClipsOpieka zdrowotna TechnologieJC302
Karty filtracyjne CytospinTechnologie opieki zdrowotnejJC307
Lejki CytospinTechnologie opieki zdrowotnejJC372
DAM-TRITCInvitrogenA16022
DAPI-FluroshieldSigma/MerckF6057
Filtr etanolowyKimixETD901
wskazówkiWhiteSci  200ul (312012) i 1000ul (313012)
Kwas solny - HClMerck
HistopaqueSigma / Merck10771
lit– probówki do pobierania heparynyGrupa Naukowa367526
MetaSystems - MetaferMetasystemsAzio Imager Z2: 195-041848
NaOHMerck221465
NovoPenLeica BiosystemsNCL-PEN
ParaformaldehydSigma/Merck158127
Tabletkisoli fizjologicznej buforowanej fosforanamiSeparacjeSH30028,02
PipetyWhiteSciP11037 i P1033X-tra Clipped Corner Slides są przycinane pod kątem 45°, aby zmniejszyć pękanie szkła.
Oczyszczone przeciwciało anty-H2A.X Phospho (Ser139)Biolegend613402 / 100 μ g
RPMI mediumWhiteSciBE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9)Sigma/MerckT-9284
Tubes (15ml)WhiteSci
X-Tra – przycięte narożnikiSMM Technologies3800200E
Szkiełka samoprzylepne 601002

Bibliografia

  1. Barnes, J. L., et al. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).
  2. Little, J. B. Radiation carcinogenesis. Carcinogenesis. 21 (3), 397-404 (2000).
  3. Barquinero, J. F., et al. Lessons from past radiation accidents: Critical review of methods addressed to individual dose assessment of potentially exposed people and integration with medical assessment. Environment International. 146, 106175(2021).
  4. International Atomic Energy Agency. Radiotherapy in Cancer Care: Facing The Global Challenge. International Atomic Energy Agency. , IAEA. Vienna. (2017).
  5. Achel, D. G., et al. Towards establishing capacity for biological dosimetry at Ghana Atomic Energy commission. Genome Integrity. 7 (1), 1-5 (2016).
  6. Sullivan, J. M., et al. Assessment of biodosimetry methods for a mass-casualty radiological incident: Medical response and management considerations. Health Physics. 105 (6), 540-554 (2013).
  7. Rea, M. E., et al. Proposed triage categories for large-scale radiation incidents using high-accuracy biodosimetry methods. Health Physics. 98 (2), 136-144 (2010).
  8. Swartz, H. M., et al. A critical assessment of biodosimetry methods for large-scale incidents. Health Physics. 98 (2), 95-108 (2010).
  9. International Atomic Energy Agency. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. International Atomic Energy Agency. , IAEA. Vienna. (2011).
  10. Grégoire, E., et al. Twenty years of FISH-based translocation analysis for retrospective ionizing radiation biodosimetry. International Journal of Radiation Biology. 94 (3), 248-258 (2018).
  11. Moroni, M., et al. Evaluation of the gamma-H2AX assay for radiation biodosimetry in a swine model. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14119-14135 (2013).
  12. Rothkamm, K., et al. Laboratory Intercomparison on the γ-H2AX Foci Assay. Radiation Research. 180 (2), 149(2013).
  13. Barnard, S., et al. The first gamma-H2AX biodosimetry intercomparison exercise of the developing european biodosimetry network RENEB. Radiation Protection Dosimetry. 164 (3), 265-270 (2015).
  14. Moquet, J., et al. The second gamma-H2AX assay inter-comparison exercise carried out in the framework of the European biodosimetry network (RENEB). International Journal of Radiation Biology. 93 (1), 58-64 (2017).
  15. Vinnikov, V., et al. Clinical Applications of Biomarkers of Radiation Exposure: Limitations and Possible Solutions Through Coordinated Research. Radiation Protection Dosimetry. 186 (1), 3-8 (2019).
  16. Mariotti, L. G., et al. Use of the γ-H2AX assay to investigate DNA repair dynamics following multiple radiation exposures. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
  17. Ivashkevich, A. N., et al. γH2AX foci as a measure of DNA damage: A computational approach to automatic analysis. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 711 (1-2), 49-60 (2011).
  18. Rogakou, E. P., et al. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-915 (1999).
  19. Sedelnikova, O. A., et al. Quantitative Detection of 125 IdU-Induced DNA Double-Strand Breaks with γ-H2AX Antibody. Radiation Research. 158 (4), 486-492 (2002).
  20. Han, J., et al. Quantitative analysis reveals asynchronous and more than DSB-associated histone H2AX phosphorylation after exposure to ionizing radiation. Radiation Research. 165 (3), 283-292 (2006).
  21. Jaworska, A., et al. Operational guidance for radiation emergency response organisations in Europe for using biodosimetric tools developed in EU multibiodose project. Radiation Protection Dosimetry. 164 (1-2), 165-169 (2015).
  22. Kulka, U., et al. Realising the european network of biodosimetry RENEB - status quo. Radiation protection dosimetry. 164 (1), 42-45 (2015).
  23. Sánchez-Flores, M., et al. γH2AX assay as DNA damage biomarker for human population studies: Defining experimental conditions. Toxicological Sciences. 144 (2), 406-413 (2015).
  24. Raavi, V., et al. Potential application of γ-H2AX as a biodosimetry tool for radiation triage. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 787, 108350(2020).
  25. Lassmann, M., et al. In vivo formation of γ-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  26. Vandevoorde, C., et al. γ-H2AX foci as in vivo effect biomarker in children emphasize the importance to minimize x-ray doses in paediatric CT imaging. European Radiology. 25 (3), 800-811 (2015).
  27. Beels, L., et al. γ-H2AX foci as a biomarker for patient X-ray exposure in pediatric cardiac catheterization: Are we underestimating radiation risks. Circulation. 120 (19), 1903-1909 (2009).
  28. Bogdanova, N. V., et al. Persistent DNA double-strand breaks after repeated diagnostic CT scans in breast epithelial cells and lymphocytes. Frontiers in Oncology. 11, 1-14 (2021).
  29. Schumann, S., et al. DNA damage in blood leukocytes of prostate cancer patients undergoing PET/CT examinations with [68Ga]Ga-psma. Cancers. 12 (2), 1-14 (2020).
  30. Ivashkevich, A., et al. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
  31. Moquet, J., et al. Gamma-H2AX biodosimetry for use in large scale radiation incidents: Comparison of a rapid "96 well lyse/fix" protocol with a routine method. PeerJ. 2014 (1), 1-11 (2014).
  32. Turner, H. C., et al. Adapting the γ-H2AX Assay for Automated Processing in Human Lymphocytes. Radiation Research. 175 (3), 282-290 (2008).
  33. Sharma, P. M., et al. High Throughput Measurement of γ H2AX DSB Repair Kinetics in a Healthy Human Population. PLoS ONE. 10 (3), 0121083(2015).
  34. Vandevoorde, C., et al. EPI-CT: In vitro assessment of the applicability of the γ-H2AX-foci assay as cellular biomarker for exposure in a multicentre study of children in diagnostic radiology. International Journal of Radiation Biology. 91 (8), 653-663 (2015).
  35. MacPhail, S. H., et al. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: Reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiation Research. 159 (6), 759-767 (2003).
  36. Barnard, S., et al. The shape of the radiation dose response for DNA double-strand break induction and repair. Genome Integrity. 4 (1), 1(2013).
  37. Kulka, U., et al. Biodosimetry and biodosimetry networks for managing radiation emergency. Radiation Protection Dosimetry. 182 (1), 128-138 (2018).
  38. Macaeva, E., et al. Gene expression-based biodosimetry for radiological incidents: assessment of dose and time after radiation exposure. International Journal of Radiation Biology. 95 (1), 64-75 (2018).
  39. Khanna, K. K., et al. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
  40. Rothkamm, K., et al. γ-H2AX as protein biomarker for radiation exposure. Annali dell'Istituto Superiore di Sanita. 45 (3), 265-271 (2009).
  41. Borràs, M., et al. Comparison of methods to quantify histone H2AX phosphorylation and its usefulness for prediction of radiosensitivity. International Journal of Radiation Biology. 91 (12), 915-924 (2015).
  42. Horn, S., et al. Gamma-H2AX-based dose estimation for whole and partial body radiation exposure. PLoS ONE. 6 (9), 1-8 (2011).
  43. Costes, S. V., et al. Imaging Features that Discriminate between Foci Induced by High- and Low-LET Radiation in Human Fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
  44. Leatherbarrow, E. L., et al. Induction and quantification of γ-H2AX foci following low and high LET-irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (2), 111-118 (2006).
  45. Mistrik, M., et al. Low-dose DNA damage and replication stress responses quantified by optimized automated single-cell image analysis. Cell Cycle. 8 (16), 2592-2599 (2009).
  46. Oeck, S., et al. The Focinator - a new open-source tool for high-throughput foci evaluation of DNA damage. Radiation Oncology. 10 (1), 1-11 (2015).
  47. Vandersickel, V., et al. Early increase of radiation-induced γH2AX foci in a humanku70/80 knockdown cell line characterized by an enhanced radiosensitivity. Journal of Radiation Research. 51 (6), 633-641 (2010).
  48. Sambrook, J., et al. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
  49. Rifai, A., et al. B and T lumphocytes. Recent Advances in IgA Nephropathy. (6), 193-210 (2009).
  50. Andreo, P., et al. Absorbed dose determination in external beam radiotherapy: An international code of practice for dosimetry based on absorbed dose to water. International Atomic Energy Agency. , Technical Report Series No. 398 (2001).
  51. Jamur, M. C., et al. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  52. Rogakou, E. P., et al. DNA Double-stranded Breaks Induce DNA Double-stranded Breaks Induce Histone H2AX Phosphorylation on Serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 1-12 (1998).
  53. Kyuseok, I. An introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  54. Ainsbury, E. A., et al. Multibiodose radiation emergency triage categorization software. Health Physics. 107 (1), 83-89 (2014).
  55. Ainsbury, E. A., et al. Dose estimation software for radiation biodosimetry. Health Physics. 98 (2), 290-295 (2010).
  56. Turner, H. C., et al. The RABiT: High-throughput technology for assessing global DSB repair. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 265-272 (2014).
  57. Wang, Q., et al. Development of the FAST-DOSE assay system for high-throughput biodosimetry and radiation triage. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  58. Rothkamm, K., et al. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: A quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  59. Redon, C. E., et al. an analysis method for partial-body radiation exposure using γ-H2AX in nonhuman primate lymphocytes. Radiation Measurements. 46 (9), 877-881 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza gamma H2AXp kni cia dwuniciowe DNAautomatyczna mikroskopiadozymetria biologicznamikroskopia fluorescencyjnabarwienie immunofluorescencyjnesystem skanowania preparat wocena nara enia na promieniowanieizolacja limfocyt w
Zautomatyzowana mikroskopowa metoda oceny ognisk γ-H2AX w ludzkich limfocytach krwi obwodowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.