Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowy in vitro biomimetyczny model neuroblastomu z wykorzystaniem rusztowań na bazie kolagenu

DOI:

10.3791/62627

⸱

9 lipca 2021

 ,  ,  ,  , 
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland, 4National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland, 5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland, 6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland

* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł wymienia kroki wymagane do zasiewu linii komórek neuroblastoma na wcześniej opisanych trójwymiarowe szkieletach opartych na kolagenie, utrzymanie wzrostu komórek przez określony czas i odzyskanie szkieletów do kilku analiz wzrostu komórek i zachowania komórek oraz zastosowań wtórnych, przystosowanych do zaspokojenia szerokiego zakresu celów eksperymentalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroblastoma jest najczęstszym pozaczaszkowym guzem stałym u dzieci, odpowiadającym za 15% ogółu zgonów z powodu raka u dzieci. Tkanka guzów macierzystych jest złożonym trójwymiarowym (3D) mikrośrodowiskiem zawierającym warstwy komórek rakowych i nierakowych, otoczone macierzą pozakomórkową (ECM). ECM zapewnia fizyczne i biologiczne wsparcie oraz przyczynia się do postępu choroby, rokowania pacjenta i odpowiedzi terapeutycznej.

Niniejszy artykuł opisuje protokół montażu 3D systemu opartego na szkielecie, aby naśladować mikrośrodowisko neuroblastoma za pomocą linii komórek neuroblastoma i szkieletów opartych na kolagenie. Szkielety są uzupełniane nanohydroksyapatytem (nHA) lub glikozaminoglikanami (GAGs), naturalnie występującymi w wysokich stężeniach w kości i rdzeniu kostnym, najczęstszych miejscach przerzutów neuroblastoma. 3D porowata struktura tych szkieletów umożliwia przyczepianie, proliferację i migrację komórek neuroblastoma oraz tworzenie klasteronów komórek. W tym 3D macierzy reakcja komórek na leczenie jest bardziej zgodna z sytuacją in vivo.

System kultury oparty na szkielecie może utrzymywać wyższą gęstość komórek niż konwencjonalne dwuwymiarowe (2D) hodowlenie komórek. Dlatego protokoły optymalizacji początkowej liczby siewianych komórek zależą od pożądanych terminów eksperymentu. Model jest monitorowany poprzez ocenę wzrostu komórek za pomocą ilościowej analizy DNA, żywotności komórek za pomocą testów metabolicznych i rozmieszczenia komórek w szkieletach za pomocą barwienia histologicznego.

Zastosowania tego modelu obejmują ocenę profili ekspresji genów i białek, a także badanie cytotoksyczności za pomocą konwencjonalnych leków i miRNA. System 3D kultury pozwala na precyzyjne manipulowanie komórkami i składnikami ECM, tworząc środowisko bardziej fizjologicznie podobne do macierzystej tkanki guza. Dlatego ten 3D in vitro model poszerzy rozumienie patogenezy choroby i poprawi korelacje pomiędzy wynikami uzyskanymi in vitro, in vivo w modelach zwierzęcych i badaniach na ludziach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuroblastoma jest dziecięcym rakiem układu nerwowego współczulnego powstającym w czasie rozwoju zarodkowego lub wczesnego życia pourodzeniowego w wyniku transformacji komórek grzebienia nerwowego1. Jest to najczęstszy stały guz pozaczaszkowy u dzieci, stanowi 8% złośliwych nowotworów zdiagnozowanych u pacjentów poniżej 15 roku życia i jest odpowiedzialny za 15% wszystkich zgonów z powodu raka u dzieci. Choroba wykazuje bardzo niejednorodne zachowanie kliniczne z powodu specyficznych zmian chromosomowych, genetycznych i epigenetycznych oraz cech histopatologicznych.

Zmiany te przyczyniają się do agresywności neuroblastoma i złych wyników u pacjentów pediatrycznych. Dlatego obecne terapie okazują się nieskuteczne w długim okresie dla prawie 80% pacjentów z klinicznie agresywną chorobą2, co podkreśla fakt, że leczenie tej grupy pacjentów pozostaje wyzwaniem. Jest to prawdopodobnie spowodowane mechanizmami heterogeniczności neuroblastoma i przerzutów, które nadal nie są w pełni rozumiane. Jednak mikrośrodowisko nowotworowe (TME) jest obecnie powszechnie uważane za odgrywające rolę w postępowaniu wielu nowotworów; jednakże pozostaje ono słabo badane w neuroblastomie3,4.

Natywne TME to złożone 3D środowisko zawierające komórki nowotworowe i nienowotworowe otoczone przez ECM. ECM odnosi się do bezkomórkowego składnika tkanki, który zapewnia strukturalne i biochemiczne wsparcie dla jej komórkowych mieszkańców i przyczynia się do progresji choroby, rokowania pacjenta i odpowiedzi terapeutycznej5. To wspieranie progresji choroby jest spowodowane "dynamiczną wzajemnością" lub ciągłą dwukierunkową komunikacją między komórkami a ECM6,7,8. W miarę postępu nowotworu, stromalne kolageny są reorganizowane często w liniowych wzorach prostopadłych do styku stroma-rak, które komórki nowotworowe wykorzystują jako ścieżkę migracji do przerzutów9,10,11.

Główne składniki tego natywnego funkcjonalnego biologicznego szkieletu obejmują włókniste sieci kolagenów typu I i II oraz inne białka, w tym elastynę, glikoproteiny takie jak laminina, a także szereg proteoglikanów i inne rozpuszczalne składniki12,13. Te białka natywnego ECM stały się teraz atrakcyjnymi naturalnymi biocząsteczkami do opracowywania 3D modeli in vitro3. Zastosowanie 3D szkieletów do hodowli komórek in vitro zyskują na popularności ze względu na większe fizjologiczne przedstawienie TME w porównaniu z tradycyjną 2D hodowlą monowarstwową. Wyprodukowane 3D szkielety wspomagają przyleganie komórek, proliferację, migrację, metabolizm i reakcję na bodźce obserwowane w in vivo systemach biologicznych.

Głównym składnikiem tych 3D szkieletów jest kolagen, który jest kluczowym graczem w wielu normalnych procesach biologicznych, w tym naprawie tkanek, angiogenesie, morfogenezie tkanek, adhezji i migracji komórek11. 3D macierze oparte na kolagenie wykazały swoją solidną funkcjonalność w modelowaniu ECM, działając jako in vitro środowisko biomimetyczne, umożliwiając jednocześnie interakcje komórka-ECM oraz migrację i inwazję komórek. Te 3D macierze zapewniają również bardziej dokładną analizę reakcji komórek na leki chemioterapeutyczne niż tradycyjna 2D lub "płaska" hodowla w wielu modelach nowotworów14,15,16, w tym neuroblastomie17,18. Analiza genetyczna 3D kultur komórek wykazała wyższą korelację z profilem ludzkiej tkanki nawet w porównaniu z modelami zwierzęcymi19. Ogólnie rzecz biorąc, kamieniem węgielnym tych 3D szkieletów jest zapewnienie komórkom odpowiedniego in vitro środowiska, które odzwierciedla natywną architekturę tkanki i ułatwia dwukierunkową molekularną wymianę informacji8.

Aby zwiększyć złożoność modeli opartych na kolagenie, inne typowe składniki ECM są włączane w proces inżynierii tkankowej, tworząc w ten sposób bardziej fizjologicznie odpowiednie modele, aby odzwierciedlić niszowe TME różnych tkanek. Na przykład, GAG, ujemnie naładowane polisakicharydy obecne we wszystkich ssaczych tkankach20, ułatwiają przyleganie komórek, migrację, proliferację i różnicowanie. Siarczan chondroityny jest specyficznym typem GAG znajdującym się w kościach i chrząstce, który był wcześniej stosowany w zastosowaniach inżynierii tkankowej do naprawy kości21,22,23,24,</

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie eksperymentu

UWAGA: Liczba wymaganych szkieletonów i komórek dla każdego eksperymentu będzie zależna od skali eksperymentu i może być obliczona przy użyciu narzędzi w tej sekcji dotyczącej projektowania eksperymentu.

  1. Wymagana liczba szkieletonów
    1. Wyznacz ogólny harmonogram eksperymentu i okresy oceny zmian w biologii komórek (np. wzrost i metabolizm komórek).
      UWAGA: Na przykład czas trwania eksperymentu wynosi 14 dni, z oceną wzrostu komórek co 7 dni. Tym samym punkty czasowe eksperymentu to dni 1, 7, 14, co daje łącznie 3 punkty czasowe.
    2. Następnie zdecyduj, ile zastosowań eksperymentalnych ma być zastosowanych w każdym punkcie czasowym. Staraj się przeprowadzać te same analizy w każdym punkcie czasowym, aby monitorować zmiany.
      UWAGA: Typowe analizy wzrostu komórek na szkieletonach obejmują testy żywotności komórek, ilościową ocenę DNA, barwienie i obrazowanie histologiczne oraz analizę ekspresji genów. Te zostaną szczegółowo omówione w sekcji 5.
    3. Zdecyduj, kiedy używać tego samego szkieletu na wiele zastosowań wtórnych, na przykład po ocenie żywotności komórek przy użyciu odpowiedniego testu, ponownie użyj szkieletu do izolowaniu DNA/RNA (omówione w 5.1.11).
    4. Przechowuj minimum 3 repliki biologiczne dla każdego zastosowania, na przykład 3 szkielety do oceny żywotności komórek i ilości DNA, 3 do histologii i 3 do analizy ekspresji genów. Ponieważ to daje 9 szkieletonów na punkt czasowy, zaplanuj użycie 27 szkieletonów na 3 punkty czasowe.
    5. Wreszcie pomnóż tę liczbę przez liczbę parametrów eksperymentu lub warunków (np. ocena wielu linii komórkowych, początkowych zagęszczeń siewu, składów szkieletu).
      UWAGA: W tym protokole oceniono 4 różne początkowe zagęszczenia siewu dla jednej linii komórek, co dało 108 (27 szkieletonów x 4 warunki) wymaganych szkieletonów. Aby uwzględnić błąd ludzki i zapewnić dodatkową pokrycie, dodaj ~10% do tej liczby, na przykład jeśli wymagane są 108 szkieletonów, przygotuj 120 szkieletonów.
  2. Wymagana liczba komórek
    UWAGA: Zaleca się objętość 20 μL zawiesiny komórek do zasiewu komórek na cylindrycznym szkieletonie (średnica 6 mm, wysokość 4 mm) w dniu 0. Liczba komórek na tych 20 μL zawiesiny komórek jest dostosowywana zgodnie z projektem eksperymentu, obliczanym w sekcji 1.1. Typowa początkowa gęstość siewu to 2 × 105 komórek na 20 μL, używana jako przykład dla poniższego protokołu.
    1. Aby obliczyć całkowitą liczbę komórek wymaganą do eksperymentu, pomnóż początkowe 2 × 105 komórek na 20 μL przez wymaganą liczbę szkieletonów.
      ​UWAGA: Na przykład 30 szkieletonów pomnożonych przez 20 μL daje całkowity objętość 600 μL. Jeśli każdy szkieleton wymaga 2 × 105 komórek, 600 μL zawiesiny zawiera łącznie 6 × 106 komórek (2 × 105 × 30), co daje końcową wymagalność 6 × 106 komórek w 600 μL. Liczba parametrów eksperymentu będzie decydować o całkowitej liczbie komórek. Ten protokół zatem opisuje hodowlę komórek przy użyciu wielowarstwowego flaszka hodowlowego, który może pomieścić taką samą liczbę komórek jak 10 tradycyjnych flaszek 175 cm2.

2. Przygotowanie szkieletonów na bazie kolagenu

UWAGA: Cylindryczne szkieletony Coll-I-nHA i Coll-I-GAG (średnica 6 mm, wysokość 4 mm) są przygotowywane według ustanowionej metody15,21,27. Po chemicznym usieciowanyu zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami17, szkieletony muszą być używane w ciągu tygodnia.

  1. Po wytworzeniu szkieletonów o pożądanych właściwościach mechanicznych, upewnij się, że szkieletony są w pełni nawodnione i dokładnie umyte w buforze fosforanowym (PBS).
    UWAGA: Zazwyczaj trwa to ~12 godzin po usieciowania szkieletonów i można je przeprowadzić w 100 mL pojemnikach na odpady kultury tkankowej w 4 °C, z maksymalnie 50 szkieletonów na pojemnik i 2 mL PBS na szkieleton.
  2. Przechowuj szkieletony w PBS w 4 °C, aż będą gotowe do użycia.

3. Hodowla komórek neuroblastomu w wielowarstwowym flaszku do hodowl tkankowej

UWAGA: Optymalna gęstość siewu dla wielowarstwowego flaszka będzie różna. Dla flaszka użytego w tym eksperymencie, optymalna gęstość

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj model struktury nośnej oparty na kolagenie ma wiele zastosowań, od badania biologii neuroblastomatu po przesiewowe badanie leków przeciwnowotworowych w środowisku bardziej zbliżonym fizjologicznie do rodzimych guzów niż konwencjonalna kultura komórkowa 2D. Przed przetestowaniem danego pytania badawczego, kluczowe jest uzyskanie pełnej charakterystyki przyczepiania komórek, proliferacji i infiltracji w pożądanym czasie eksperymentu. Warunki wzrostu będą zależały od biologii każdej konkretnej linii komórkowej. Co ważne, należy zastosować kilka metod oceny wzrostu komórek, aby określić optymalne warunki i efektywne działanie.

Tutaj, żywotność komórek neuroblastomatu hodowanych na strukturach nośnych została oceniona za pomocą kolorymetrycznej metody oceny żywotności komórkowej. Tę metodę można wykonać tak często, jak jest to pożądane w trakcie trwania eksperymentu. W opisanym eksperymencie ocena żywotności komórek została przeprowadzona w dniach 1, 7 i 14 dla dwóch linii komórek neuroblastomatu, KellyLuc i IMR32, hodowanych na strukturach nośnych Coll-I-nHA przy 4 różnych gęstościach (Rysunek 6). Żywotność w dniu 1 została ustalona jako wartość referencyjna do porównania wszystkich kolejnych pomiarów. Szybkość zmniejszania się reagentu do oceny żywotności komórek odzwierciedla biologię komórek i ich charakterystyki wzrostu, w tym ich tempo proliferacji i metabolizm. Oczekiwano korelacji między liczbą komórek wysiewanych na strukturach nośnych a poziomem zmniejszenia. W tym eksperymencie, zmniejszenie reagentu do oceny żywotności komórek ogólnie wzrastało wraz z każdym punktem czasowym dla obu linii komórek przy wszystkich gęstościach, zgodnie z oczekiwaniami.

Każda gęstość została następnie oceniona indywidualnie dla obu linii komórek, aby porównać zmniejszenie w różnych punktach czasowych. Jednokierunkowa ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya została przeprowadzona, aby wykryć istotne różnice w zmniejszeniu między punktami czasowymi (Rysunek 7). Dla obu linii komórek i wszystkich gęstości siewu, stwierdzono istotny wzrost (P<0,05) w zmniejszeniu reagentu do oceny żywotności komórek podczas porównywania dnia 1 z dniem 14. Wskazało to istotny wzrost liczby metabolicznie aktywnych komórek obecnych na strukturach nośnych. Ten wzrost nie był istotny we wszystkich przypadkach przy ocenianiu 7-dniowych przedziałów (dzień 1 w porównaniu z dniem 7, dzień 7 w porównaniu z dniem 14), co pokazuje znaczenie optymalizacji gęstości siewu w celu osiągnięcia pożądanego okna wzrostu.

Aby potwierdzić wyniki badania żywotności komórek, wzrost komórek na strukturach nośnych można również pośrednio mierzyć poprzez ilościową ocenę dsDNA wyciągniętego ze struktur nośnych za pomocą fluorescencyjnego barwnika dsDNA (Rysunek 8A). Podobnie jak w przypadku żywotności komórek, ocena ilości dsDNA może być przeprowadzana tak często, jak jest to pożądane w ramach harmonogramu eksperymentu. Jednakże, ta analiza wymaga całkowitego pobrania struktur nośnych i zakończenia wzrostu komórek, dlatego musi być uwzględniona w planowaniu eksperymentu, jak omówiono w sekcji 1. W tym eksperymencie, ilość DNA została oceniona w dniach 1, 7 i 14 dla dwóch linii komórek neuroblastomatu, KellyLuc i IMR32, hodowanych na strukturach nośnych Coll-I-nHA przy 4 różnych gęstościach. Ponieważ znane są średnie stężenia dsDNA na jedną komórkę dla tych linii komórek, możliwe było wyznaczenie liczby komórek na próbkę na podstawie ocenionej ilości DNA (Rysunek 8B).

Ocena ilości DNA dała wyższą zmienność między powtórzeniami biologicznymi niż ocena żywotności komórek, ale ogólnie zwiększała się dla każdego punktu czasowego, przy czym najwyższe poziomy zostały zmierzone w dniu 14. Wydaje się, że komórki IMR32 osiągają wyższą liczbę komórek na strukturach nośnych Coll-I-nHA, jak wskazuje stężenie DNA, niż komórki KellyLuc. Każda gęstość została następnie oceniona indywidualnie dla dwóch linii komórek, aby porównać zmniejszenie w różnych punktach czasowych. Jednokierunkowa ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya została przeprowadzona, aby wykryć istotne różnice w zmniejszeniu między punktami czasowymi (Rysunek 8B).

Dla obu linii komórek i wszystkich gęstości siewu, stwierdzono istotny wzrost (P<0,05) liczby komórek przy porównaniu dnia 1 z dniem 14, z wyjątkiem KellyLuc przy gęstości siewu 4 (1 × 105 komórek/struktura nośna), która nie wykazała istotnego wzrostu w żadnym z punktów czasowych. Podobnie jak w przypadku wyników dotyczących żywotności komórek, wzrosty nie były istotne we wszystkich przypadkach przy ocenianiu 7-dniowych przedziałów (dzień 1 w porównaniu z dniem 7, dzień 7 w porównaniu z dniem 14). Porównując trendy

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model 3D szkieletu-komurek nowotworowych został udowodniony jako wartościowe i wszechstronne narzędzie do uzyskania mechanistycznych informacji o wzroście komórek neuroblastoma, ich żywotności i infiltracji w uproszczonym środowisku TME32. Opisany tutaj model 3D neuroblastoma naśladuje minimalne środowisko TME i zapewnia bardziej fizjologicznie istotne dane niż 2D hodowla monowarstw. Główną wadą 3D hodowli komórkowej jest zwiększona złożoność eksperymentu i dłuższe ramy czasowe. Opisany tutaj jest zoptymalizowany protokół do sadzenia, wzrostu i utrzymania komórek neuroblastoma na szkieletach opartych na kolagenie, z kolejnymi analizami i zastosowaniami, co daje solidną charakterystykę wzrostu komórek. Celem było zdobycie informacji o optymalnej gęstości sadzenia komórek na szkielecie, aby stworzyć przewidywalne i kontrolowalne środowisko do oceny leczenia przeciwnowotworowego w krótkim 14-dniowym oknie eksperymentalnym. Kombinacja wszystkich tych opisanych prostych protokołów zapewnia wszechstronną ocenę wzrostu komórek neuroblastoma w systemie hodowli in vitro opartym na szkieletach.

Krytyczne punkty w konfiguracji protokołu zostały podkreślone, aby umożliwić naukowcom szybkie utworzenie takiego samego w swoich laboratoriach. Na przykład wskazane czasy inkubacji dla lepszej wydajności kolorymetrycznego testu żywotności komórek pozwalają na głębsze przenikanie reagentu do porów szkieletu, aby osiągnąć wszystkie komórki. Ponadto fluorescencyjna technika barwienia dsDNA jest solidna i prosta; jednak uwolnienie DNA z szkieletu wymaga intensywnego lizy komórek, ponieważ komórki są 'uwięzione' w włóknach kolagenowych.

Używając prostego testu ilościowego DNA, jak został opisany, możemy zidentyfikować fazę wzrostu logarytmicznego na szkieletach opartych na kolagenie do przesiewowych badań leków przeciwnowotworowych za pomocą tego modelu. W opisanym ustawieniu eksperymentalnym użyto 4 początkowych gęstości sadzenia komórek z ogólnym 14-dniowym okresem i punktami czasowymi analizy w dniach 1, 7 i 14. Zidentyfikowaliśmy, że komórki KellyLuc zasadowane na gęstości 4 x 105 komórek/szkielet mają najbardziej znacząco aktywne okno proliferacji między dniem 7 a 14. Te dane dotyczące fazy wzrostu logarytmicznego pozwolą na wiarygodne interpretację różnych eksperymentów cytotoksyczności komórek. Eliminuje to spekulacje na temat wszelkiego spadku wzrostu lub śmierci komórek wynikającej z tłumionego wzrostu na 3D porowatym podłożu, a nie z toksyczności leków. Żywotność komórek jest również szeroko stosowanym oceniem przydatności 3D platform do wspierania wzrostu różnych typów komórek33,34. Chociaż istnieje wiele testów do pomiaru żywotności komórek, w tym barwienie żywych/martwych, pomiar ATP, testy proliferacji, znaleźliśmy, że użycie kolorymetrycznego testu żywotności komórek Alamar Blue jest prostą i skuteczną techniką do wsparcia danych ilościowych DNA.

Połączone użycie ilościowego DNA i żywotności komórek dostarczyło uzupełniających dowodów, że średnio optymalna gęstość do sadzenia komórek na szkielecie, aby osiągnąć ciągły wzrost przez 14-dniowy okres, to 2-4 x 105 komórek/szkielet. Jednak ten protokół może łatwo zostać dostosowany, aby zaspokoić różne ramy czasowe eksperymentalne, punkty czasowe analizy i dalsze zastosowania. Chociaż ten protokół opisuje ocenę wzrostu monokultur komórek neuroblastoma na szkieletach, szkielety są łatwo przystosowane do użycia jako platforma do współhodowli, opisanej przez do Amaral i in., którzy wykorzystali szkielety kolagen-GAG do współhodowli keratynocytów i fibroblastów w badaniu gojenia ran35.

Opisany 3D model umożliwia wizualizacje wzrostu komórek i ich infiltracji za pomocą różnych dobrze znanych technik, takich jak immunofluorescencja i standardowe H&E. Ważne jest wizualizacja komórek wraz z charakteryzacją wzrostu za pomocą testów biochemicznych ze względu na różnorodność morfologii komórek i wzorców wzrostu na szkieletach. Zrozumienie wzorca wzrostu może dać wgląd w zachowanie wzrostu i przyszłą reakcję na leki przeciwnowotworowe. Na przykład wzrost IMR32 za pomocą ilościowego DNA daje podobne wzorce do Kelly, chociaż po wizualizacji za pomocą H&E, IMR32 rośnie w większych klastrach niż Kelly, który wyświetlał bardziej rozproszony wzrost (Rysunek 9). Te różne wzorce wzrostu linii komórek w szkieletach odzwierciedlają kliniczny scenariusz heterogeniczności nowotworu. Badanie reakcji na leki przeciwnowotworowe za pomocą panelu linii komórek o różnych morfologiach w 3D szkieletach zwiększy wartość predykcyjną dla reakcji pacjenta na te same leki.

Wykrycie ekspresji genu lub białka można również wykonać za pomocą innych podejść, takich jak RT-qPCR lub ELISA, jeśli badane białko jest wydzielane. Surogatowego markera progresji neuroblastoma, chromogranina A (CgA)36, została użyta do dodat

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez Narodowe Centrum Badań nad Dziećmi (NCRC), Irish Research Council (IRC) oraz Neuroblastoma UK. Ilustracje zostały stworzone za pomocą BioRender.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki
IMR-32ATCCCCL-127
KellyECACC82110411
KellyCis83Wytworzone w laboratorium – pochodzenie Kelly (Piskareva et al., 2015)-Wzrastająca ekspozycja na cisplatynę. Nabyte krzyżowe oporności
SH-SY5YATCCCRL-2266
Artykuły jednorazowego użytku
Filtrownik strzykawkowy 0,22 µmMillexSLHP033RS
Rurki Eppendorf 1,5 mLEppendorf0030 120.086
100 mL sterylny garnekStarstedt-
10 mL plastikowa pipetaCellstar607 180
15 mL probówka FalconStarstedt62.554.502
25 mL plastikowa pipetaCellstar760 180
50 mL probówka FalconStarstedt62.547.254
5 mL plastikowa pipetaCellstar606 180
6 mm igły biopsjiKai MedicalBP-60F
Foli aluminium--
PokrzywkaMenzel-Glaser-
HYPERflaskCorningCLS10030
Szkła mikroskopoweThermo ScientificJ1840AMNT
Czarna opakowująca płyta 96-dołkowaCostar3915
Steryle końcówki P10StarlabS1121-3810
Steryle końcówki P1000StarlabS1122-1830
Steryle końcówki P20StarlabS1123-1810
Steryle końcówki P200StarlabS1120-8810
T-175 (flask 175 cm2 )Sarstedt83.3912
T-75 (flask 75 cm2 )Sarstedt83.3911.302
Przeźroczysta płyta 96-dołkowaCellstar655180
Przeźroczyste płyty 24-dołkowe bez powłokiCellstar83.3922.500
Wyposażenie
AutoklawAstell-
Automatyczny procesor tkanekLeicaTP1020
Wirówka 5804Eppendorf-
HemocytometerHausser  Scientific-
InkubatorThermoScientific-
MikrotomLeicaRM2255
PiekarnikMemmertKalibrowany przez: Cruinn diagnostics Ltd
Pipeta P10Gilson
Pipeta P100Gilson
Pipeta P1000Gilson
Pipeta P20GilsonKalibrowany przez: Cruinn diagnostics Ltd
Pipeta P200GilsonKalibrowany przez: Cruinn diagnostics Ltd
Kąpiel flotacyjna do sekcjonowania parafinowegoElectrothermalMH8717Kalibrowany przez: Cruinn diagnostics Ltd
Elektroniczny dozownik pipetCorningStripipetterUltraKalibrowany przez: Cruinn diagnostics Ltd
Chłodnica płytekLeicaEG1140CKalibrowany przez: Cruinn diagnostics Ltd
Lodówka -20 °CLiebherr-
Lodówka -80 °CLiebherr-
Lodówka 4 °CLiebherr-
Seesaw RockerDLAbSK-D1807-E
Spektrofotometr – Victor3V PlatereaderPerkinElmer1420
Kupola do hodowli tkanek/kupola przepływowa laminarnaGMI8038-30-1044
Tissue LyserQiagenTissueLyser LT
Pęsety--
Kąpiel wodnyGrant-
Zanurzanie w woskuLeicaEG1140H
Materiały
1 L wodyAdrona - Biosciences568
1% Triton-XSigma Aldrich9002-93-1
Tabletki 10x PBSSigma AldrichP4417-100TAB
37% paraformaldehydSigma-AldrichF8775
Alamar Blue Cell Viability ReagentInvitrogenDAL1100
Podłoże kolagenowo-glikozaminoglikanoweTissue engineering research group (TERG)
Podłoże kolagenowo-nanohydroksyapatytoweTissue engineering research group (TERG)
dH20Adrona - Biosciences568
EozynaSigma-AldrichE4009Wykonane zgodnie z: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
EtOHSigma-Aldrich1.00983.2500Wykonane zgodnie z: (Cunniffe et al., 2010, Fitzgerald et al., 2015; O’Brien et al., 2005)
F12Gibco21765-029
FBSGibco10270-106
HemaytoksylinaSigma-AldrichHHS32-1L
L-GlutaminaGibco25030-024

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davidoff, A. M. Neuroblastoma. Seminars in Pediatric Surgery. 21 (1), 2-14 (2012).
  2. Matthay, K. K., et al. Neuroblastoma. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16078(2016).
  3. Costard, L. S., Hosn, R. R., Ramanayake, H., O'Brien, F. J., Curtin, C. M. Influences of the 3D microenvironment on cancer cell behaviour and treatment responsiveness: a recent update on lung, breast and prostate cancer models. Acta Biomaterialia. , (2021).
  4. Borriello, L., Seeger, R. C., Asgharzadeh, S., Declerck, Y. A. More than the genes, the tumor microenvironment in neuroblastoma. Cancer Letters. 380 (1), 304-318 (2016).
  5. Walker, C., Mojares, E., Del Río Hernández, A. Role of extracellular matrix in development and cancer progression. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3028(2018).
  6. Bissell, M. J., Hall, H. G., Parry, G. How does the extracellular matrix direct gene expression. Journal of Theoretical Biology. 99 (1), 31-68 (1982).
  7. Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Bornstein, P., Herman, I. M. Dynamic reciprocity in the wound microenvironment. Wound Repair and Regeneration. 19 (2), 134-148 (2011).
  8. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744(2020).
  9. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6, 11(2008).
  10. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4, 38(2006).
  11. Ouellette, J. N., et al. Navigating the collagen jungle: The biomedical potential of fiber organization in cancer. Bioengineering. 8 (2), 1-19 (2021).
  12. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  13. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  14. Hume, R. D., et al. Tumour cell invasiveness and response to chemotherapeutics in adipocyte invested 3D engineered anisotropic collagen scaffolds. Scientific Reports. 8 (1), 12658(2018).
  15. Fitzgerald, K. A., et al. The use of collagen-based scaffolds to simulate prostate cancer bone metastases with potential for evaluating delivery of nanoparticulate gene therapeutics. Biomaterials. 66, 53-66 (2015).
  16. Sapudom, J., Pompe, T. Biomimetic tumor microenvironments based on collagen matrices. Biomaterials Science. 6 (8), 2009-2024 (2018).
  17. Curtin, C., et al. A physiologically relevant 3D collagen-based scaffold-neuroblastoma cell system exhibits chemosensitivity similar to orthotopic xenograft models. Acta Biomaterialia. 70, 84-97 (2018).
  18. Gavin, C., et al. Neuroblastoma invasion strategies are regulated by the extracellular matrix. Cancers. 13 (4), 1-23 (2021).
  19. Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nature Medicine. 16 (12), 1450-1456 (2010).
  20. Casal, eJ., Crane, J. S. Biochemistry, Glycosaminoglycans. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2019).
  21. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26 (4), 433-441 (2005).
  22. O'Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. Influence of freezing rate on pore structure in freeze-dried collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 25 (6), 1077-1086 (2004).
  23. Haugh, M. G., Murphy, C. M., McKiernan, R. C., Altenbuchner, C., O'Brien, F. J. Crosslinking and mechanical properties significantly influence cell attachment, proliferation, and migration within collagen glycosaminoglycan scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 17 (9-10), 1201-1208 (2011).
  24. Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 31 (3), 461-466 (2010).
  25. Haugh, M. G., Jaasma, M. J., O'Brien, F. J. The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 89 (2), 363-369 (2009).
  26. Lowe, B., Hardy, J. G., Walsh, L. J. Optimizing nanohydroxyapatite nanocomposites for bone tissue engineering. ACS Omega. 5 (1), 1-9 (2020).
  27. Cunniffe, G. M., Dickson, G. R., Partap, S., Stanton, K. T., O'Brien, F. J. Development and characterisation of a collagen nano-hydroxyapatite composite scaffold for bone tissue engineering. Journal of Materials Science. Materials in Medicine. 21 (8), 2293-2298 (2010).
  28. DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of Pediatric Hematology/Oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
  29. Ryan, A. J., Gleeson, J. P., Matsiko, A., Thompson, E. M., O'Brien, F. J. Effect of different hydroxyapatite incorporation methods on the structural and biological properties of porous collagen scaffolds for bone repair. Journal of Anatomy. 227 (6), 732-745 (2015).
  30. Tierney, C. M., et al. The effects of collagen concentration and crosslink density on the biological, structural and mechanical properties of collagen-GAG scaffolds for bone tissue engineering. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 2 (2), 202-209 (2009).
  31. Cox, R. F., Jenkinson, A., Pohl, K., O'Brien, F. J., Morgan, M. P. Osteomimicry of mammary adenocarcinoma cells in vitro; increased expression of bone matrix proteins and proliferation within a 3D collagen environment. PLoS One. 7 (7), 41679(2012).
  32. Nolan, J. C., et al. Preclinical models for neuroblastoma: advances and challenges. Cancer Letters. 474, 53-62 (2020).
  33. Sirivisoot, S., Pareta, R., Harrison, B. S. Protocol and cell responses in threedimensional conductive collagen gel scaffolds with conductive polymer nanofibres for tissue regeneration. Interface Focus. 4 (1), 20130050(2014).
  34. Thevenot, P., Nair, A., Dey, J., Yang, J., Tang, L. Method to analyze three-dimensional cell distribution and infiltration in degradable scaffolds. Tissue Engineering. Part C-Methods. 14 (4), 319-331 (2008).
  35. do Amaral, R. J. F. C., et al. Functionalising collagen-based scaffolds with platelet-rich plasma for enhanced skin wound healing potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 371(2019).
  36. Gkolfinopoulos, S., Tsapakidis, K., Papadimitriou, K., Papamichael, D., Kountourakis, P. Chromogranin A as a valid marker in oncology: Clinical application or false hopes. World Journal of Methodology. 7 (1), 9-15 (2017).
  37. O'Brien, F. J., et al. The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering. Technology and Health Care. 15 (1), 3-17 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds
Posted by JoVE Editors on 6/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Three-dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma using Collagen-based Scaffolds. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Fergal J. O’Brien3,4,5
Olga Piskareva1,2,3,5,6
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
5Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
6National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

to:

Ciara Gallagher*1,2,3
Catherine Murphy*1,2,3
Graeme Kelly4
Fergal J. O’Brien3,5,6
Olga Piskareva1,2,3,6,7
1Cancer Bioengineering Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
2School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
3Tissue Engineering Research Group, Department of Anatomy and Regenerative Medicine, RCSI University of Medicine and Health Sciences, Dublin, Ireland
4Department of Chemistry, Royal College of Surgeons in Ireland (RCSI), 123 St. Stephen’s Green, Dublin 2, Ireland
5Trinity Centre for Bioengineering, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland
6Advanced Materials and Bioengineering Research Centre (AMBER), RCSI and TCD, Dublin, Ireland
7National Children’s Research Centre, Our Lady's Children's Hospital Crumlin, Dublin, Ireland
* These authors contributed equally

Tagi

Model neuroblastomarusztowania kolagenowehodowla tr jwymiarowamikro rodowisko nowotworowetest ywotno ci kom rekkwantyfikacja DNAbarwienie immunohistochemicznerusztowanie z glikozaminoglikan wrusztowanie z nanohydroksyapatytuproliferacja kom rek

Powiązane artykuły