Ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu Escherichia coli stresorem proteotoksycznym

Bakterie są nieuchronnie narażone na niezliczone stresy środowiskowe, w tym niskie pH (np. w żołądku ssaków)^1,2, reaktywne formy tlenu i chloru (ROS/RCS) (np. podczas wybuchu oksydacyjnego w fagocytach)3^,4,5, podwyższone temperatury (np. w gorących źródłach lub podczas szoku cieplnego)^6,7, oraz kilka silnych środków przeciwdrobnoustrojowych (np. AGXX używany w tym protokole)⁸. Białka są szczególnie podatne na którykolwiek z tych stresorów, a ekspozycja może wywołać nieprawidłowe fałdowanie białek, które następnie zasiewa agregację. Wszystkie organizmy wykorzystują systemy ochronne, które pozwalają im radzić sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek⁹. Jednak silny stres może przytłoczyć maszynerię kontroli jakości białek i zakłócić drugorzędową i/lub trzeciorzędową strukturę białek, co ostatecznie dezaktywuje białka. W konsekwencji agregaty białkowe mogą poważnie upośledzać krytyczne funkcje komórkowe niezbędne do wzrostu i przetrwania bakterii, odporności na stres i zjadliwości¹⁰. Dlatego badania koncentrujące się na agregacji białek i jej konsekwencjach u bakterii są istotnym tematem ze względu na ich potencjalny wpływ na kontrolę chorób zakaźnych.

Rozwijanie i agregacja białek wywołane ciepłem są często odwracalne⁷. W przeciwieństwie do tego, inne stresy proteotoksyczne, takie jak stres oksydacyjny, mogą powodować nieodwracalne modyfikacje białek poprzez utlenianie określonych łańcuchów bocznych aminokwasów, co skutkuje nieprawidłowym fałdowaniem białka i ostatecznie agregacją białek⁴. Indukowane stresem tworzenie nierozpuszczalnych agregatów białkowych zostało szeroko zbadane w kontekście molekularnych białek opiekuńczych i ich funkcji ochronnych u drożdży i bakterii^11,12,13. Opublikowano kilka protokołów, które wykorzystują różne techniki biochemiczne do izolacji i analizy nierozpuszczalnych agregatów białkowych^14,15,16,17. Istniejące protokoły były wykorzystywane głównie do badania agregacji białek bakteryjnych po szoku cieplnym i/lub identyfikacji molekularnych białek opiekuńczych. Chociaż protokoły te z pewnością stanowiły postęp w tej dziedzinie, istnieją pewne poważne niedogodności w procedurach eksperymentalnych, ponieważ wymagają one (i) dużej objętości hodowli bakteryjnej do 10 L^14,17, (ii) skomplikowane procesy fizycznego zakłócania pracy, w tym stosowanie substancji zakłócających funkcjonowanie komórek, prasy francuskiej i/lub sonikacji^14,15,17, lub (iii) czasochłonne, powtarzające się etapy mycia i inkubacji^15,16,17.

Ten artykuł opisuje zmodyfikowany protokół, który ma na celu rozwiązanie ograniczeń poprzednich podejść i pozwala na analizę ilości agregatów białkowych powstałych w dwóch różnych szczepach Escherichia coli po leczeniu proteotoksyczną powłoką przeciwbakteryjną. Powłoka składa się z metalu i srebra (Ag) i rutenu (Ru) kondycjonowanych kwasem askorbinowym, a jej aktywność przeciwdrobnoustrojową uzyskuje się poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu^8,18. Niniejszy dokument zawiera szczegółowy opis przygotowania kultury bakteryjnej po zastosowaniu związku przeciwdrobnoustrojowego oraz porównanie stanu agregacji białek po ekspozycji dwóch szczepów E. coli o różnych profilach podatności na rosnące stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego. Opisana metoda jest niedroga, szybka i powtarzalna i może być stosowana do badania agregacji białek w obecności innych związków proteotoksycznych. Ponadto protokół może być modyfikowany w celu analizy wpływu, jaki delecje określonych genów mają na agregację białek u wielu różnych bakterii.

1. Leczenie stresu szczepów E. coli MG1655 i CFT073

1. Zaszczepić 5 ml pożywki bulionu lizogennego (LB) pojedynczą kolonią komensalnego szczepu E. coli MG1655 i uropatogennego szczepu E. coli (UPEC) CFT073 i inkubować przez 14-16 godzin (przez noc) w temperaturze 37 °C i 300 obr./min.
   UWAGA: Escherichia coli CFT073 jest ludzkim patogenem. Obchodzenie się z CFT073 musi odbywać się z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium posiadającym certyfikat bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2.
2. Rozcieńczyć każdy szczep do kolby o pojemności 500 ml zawierającej 70 ml pożywki kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS)-glukozy (MOPS-g) (Tabela 1) do gęstości optycznej przy wartości 600 nm (OD₆₀₀) 0,1. Inkubować w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 300 obr./min aż do osiągnięcia środkowej fazy logarytmu (OD₆₀₀ = 0,5-0,55).
3. Przenieść 20 ml każdej kultury do trzech wstępnie podgrzanych kolb o pojemności 125 ml i inkubować w temperaturze 37 °C i 300 obr./min przez 2 min.
   UWAGA: Ponieważ wymagane jest terminowe przetwarzanie próbek, nie należy obchodzić się z więcej niż 6 kulturami na raz.
4. Przygotować roztwór związku przeciwdrobnoustrojowego w pożywce MOPS-g o stężeniu 2 mg/ml. Dodaj środek przeciwdrobnoustrojowy do każdej kultury, aby osiągnąć wskazane stężenia. W przypadku kontroli niepoddanej działaniu substancji dodać wymaganą objętość pożywki MOPS-g.
   UWAGA: Odwiruj roztwór przeciwdrobnoustrojowy o stężeniu 2 mg/ml, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie cząstek związku i uniknąć sedymentacji.
5. Inkubować kultury przez 45 minut w temperaturze 37 °C i 300 obr./min.

Rysunek 1: Leczenie stresu Escherichia coli. Kultury bakterii są hodowane w MOPS-g i poddawane działaniu wskazanych stężeń środka przeciwdrobnoustrojowego zawierającego srebro-ruten, gdy zostanie osiągnięta faza środkowego logarytmu. Skróty: LB = bulion lizogeniczny; Ag-Ru = srebro-ruten; MOPS-g = kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS)-glukoza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Pobieranie próbek komórek bakteryjnych

1. Po 45 minutach leczenia stresu określ OD₆₀₀ w każdej kulturze. Dla każdej próbki pobrać komórki w ilości odpowiadającej 4 ml OD₆₀₀ = 1 na 15 ml probówek wirówkowych przez odwirowanie przez 15 minut w temperaturze 3 000 × g i temperaturze 4 °C.
2. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 50 μl lodowatego buforu do lizy (Tabela 1). Inkubować próbki przez 30 minut na lodzie.
   UWAGA: Ten etap lizy degraduje warstwę peptydoglikanu. Zawsze używaj świeżo przygotowanego buforu do lizy.
3. Przenieść próbki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Zamrażać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

Rysunek 2: Pobieranie próbek bakteryjnych. Próbki komórek są zbierane przez wirowanie i ponownie zawieszane w buforze do lizy, a następnie przechowywane w temperaturze -80 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Ekstrakcja nierozpuszczalnych agregatów białkowych

1. Rozmrażanie próbek na lodzie.
   UWAGA: Cykl zamrażania i rozmrażania przyczynia się do lizy komórek.
2. Dodać 360 μl lodowatego buforu A (Tabela 1) i delikatnie wymieszać pipetując.
   UWAGA: Szok osmotyczny również przyczyni się do lizy komórek.
3. Przenieść próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej ~200 μl szklanych kulek o średnicy 0,5 mm. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 8 °C w termomikserze z wytrząsaniem przy 1 400 obr./min.
   UWAGA: Ten krok powoduje fizyczne zakłócenie komórki. Inhibitor proteazy może być stosowany w celu zminimalizowania degradacji białek. Zakłócenie można przeprowadzić w temperaturze 4 °C. Należy zauważyć, że doniesiono, że użycie szklanych kulek indukuje agregację małego podzbioru białek w drożdżach¹⁹.
4. Inkubować przez 5 minut na lodzie bez potrząsania, aby osadzić szklane kulki. Przenieść 200 μl lizatu komórkowego do probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
   UWAGA: Unikaj przenoszenia szklanych koralików.
5. Wirować w temperaturze 16 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Zebrać sklarowany sklarent zawierający rozpuszczalne białka i przejść do sekcji 4.
6. Zawiesić osad w 200 μl lodowatego buforu A (Tabela 1) za pomocą pipety. Wirować w temperaturze 16 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Ostrożnie usunąć supernatant w całości.
7. Dodać 200 μl lodowatego buforu B (patrz Tabela 1 i Tabela Materiałów) i ostrożnie zawiesić osad przez pipetowanie.
   UWAGA: Niejonowy detergent rozpuszcza białko błonowe.
8. Powtórzyć wirowanie w temperaturze 16 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Ostrożnie usunąć supernatant.
9. Zawiesić osad w 200 μl zimnego buforu A (Tabela 1) przez pipetowanie. Wirować w temperaturze 16 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Całkowicie usunąć supernatant.
10. Zawiesić osad w 100 μl 1x redukującego buforu do próbek SDS (tabela 1) i gotować przez 5 minut w temperaturze 95 °C w termomikserze.
11. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C w celu późniejszego kontynuowania lub natychmiast załadować ją na żel poliakrylamidowy SDS w celu oddzielenia.

Rysunek 3: Ekstrakcja nierozpuszczalnych agregatów białkowych. Ekstrakcja agregatów białkowych obejmuje szereg etapów, w tym rozerwanie komórek, oddzielenie agregatów białkowych od białek rozpuszczalnych, rozpuszczalność białek błonowych i mycie. Skrót: SDS = dodecylosiarczan sodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie próbki białka rozpuszczalnego

1. Zmieszać 1 objętość 100% kwasu trichlorooctowego (TCA) z 4 objętościami próbki białka rozpuszczalnego z kroku 3.6.
   UWAGA: Obchodzenie się z TCA wymaga dygestorium i środków ochrony osobistej oraz zatwierdzonej procedury usuwania odpadów.
2. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić wytrącenie białka.
   UWAGA: Biały osad pojawi się bardzo szybko.
3. Odwirować do wytrącania w temperaturze 21 000 × g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Umyj granulkę 200 μl lodowatego acetonu, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Odwirować w temperaturze 21 000 × g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Powtórz te czynności w kroku 4.3 w sumie trzy razy.
4. Umieścić probówki do mikrowirówek z otwartymi pokrywkami w termomikserze w temperaturze 37 °C, aby usunąć pozostały aceton z osadu.
   UWAGA: Inkubacja trwająca dłużej niż 5 minut może zmniejszyć rozpuszczalność osadu białkowego.
5. Dodać 100 μl 1x redukującego buforu SDS (Tabela 1) i całkowicie rozpuścić osad. Gotować próbkę przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
6. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C w celu późniejszego kontynuowania lub natychmiast załadować na SDS żel poliakryloamidowy w celu oddzielenia.

Rysunek 4: Przygotowanie rozpuszczalnych białek. Przygotowanie rozpuszczalnego białka polega na wytrącaniu kwasem trójchlorooctowym i wielokrotnym przemywaniu lodowatym acetonem. Skróty: TCA = kwas trichlorooctowy; SDS = dodecylosiarczan sodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Separacja i wizualizacja wyekstrahowanych agregatów białkowych za pomocą SDS-PAGE

1. Przygotuj 12% żel poliakryloamidowy SDS.
   1. W przypadku dwóch żeli separujących należy odpipetować 5,1 ml podwójnie destylowanej wody (ddH₂O), 3,75 ml Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 ml 20% (w/v) SDS, 6 ml 30% roztworu akryloamidu/bisakryloamidu (29:1), 75 ml 10% w/v nadsiarczanu amonu i 10 ml tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i delikatnie wymieszać bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Wlać żel za pomocą pipety o pojemności 1 ml do szklanych płytek, pozostawiając górne 2 cm wolne od mieszanki. Dodaj 70% etanolu na wierzch żelu separującego i zapewnij równomierne połączenie między dwiema warstwami.
   2. Po polimeryzacji żelu rozdzielającego należy przygotować żel do układania w stos, pipetując 1,535 ml ddH₂O, 625 ml Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 ml 20% (w/v) SDS, 335 ml 30% roztworu akryloamidu/bisakryloamidu (29:1), 12,5 ml 10% w/v nadsiarczanu amonu i 2,5 ml TEMED. Usunąć etanol z żeli rozdzielających i dodać roztwór żelu do układania w stosy. Włóż grzebień z żądaną liczbą kieszeni bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Pozostawić polimeryzację na 20-30 minut.
2. Załadować 4 μl każdej próbki i drabinki białkowej do oddzielnych studzienek i uruchomić żel(e) w buforze Tris-Glycine (Tabela 1) pod napięciem 144 V przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Przerwij żel, gdy pasmo bromofenolu ma zamiar wydostać się z żelu.
3. Zabarwić żel(e) we wstępnie podgrzanym roztworze Fairbanks A (Tabela 1) przez 30 minut na bujaku.
4. Odbarwić żel(e) we wstępnie podgrzanym roztworze Fairbanks D (Tabela 1) do uzyskania pożądanego tła (np. przez noc) na bujaku.

Rysunek 5: Separacja i wizualizacja białek. Próbki są rozdzielane za pomocą SDS-PAGE i wizualizowane za pomocą barwienia Coomassie. Skrót: SDS-PAGE = elektroforeza w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakrylamidu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki agregacji białek indukowanej przez środki przeciwdrobnoustrojowe w komensalnym szczepie Escherichia coli MG1655 i szczepie UPEC CFT073. Szczepy E. coli MG1655 i CFT073 hodowano w temperaturze 37 °C i 300 obr./min do OD600 = 0,5-0,55 w pożywce MOPS-g, zanim poddano je działaniu wskazanego stężenia (-, 0 mg/ml; +, 175 mg/mL; ++, 200 mg/mL) środka przeciwdrobnoustrojowego przez 45 min. Rozpuszczalne i nierozpuszczalne próbki białek przygotowano zgodnie z opisem w protokole i Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3, oraz Rysunek 4 i zwizualizowane na 12% żelu poliakrylamidowym SDS (Rysunek 5). Tworzenie agregatów białkowych (frakcja nierozpuszczalna) było zwiększone w obu szczepach w obecności środka przeciwdrobnoustrojowego, podczas gdy ilości rozpuszczalnych białek były zmniejszone. Ogólnie rzecz biorąc, środek przeciwdrobnoustrojowy miał znacznie silniejszy wpływ na MG1655 niż na CFT073. Skróty: M = marker białkowy; UPEC = uropatogenna E. coli; MOPS-g = kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS)-glukoza; SDS = dodecylosiarczan sodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tutaj użyto dwóch szczepów E. coli, które różnią się podatnością na proteotoksyczny środek przeciwbakteryjny zawierający srebro i ruten, aby zademonstrować ten protokół. Wstępne dane dotyczące przeżycia wykazały, że komensalny szczep E. coli MG1655 jest znacznie bardziej wrażliwy na środek przeciwdrobnoustrojowy wytwarzający ROS niż szczep UPEC CFT073 (danych nie pokazano). Oba szczepy były uprawiane na pożywkach MOPS-g w temperaturze 37 °C i 300 obr./min. W środkowej fazie logarytmicznej komórki pozostawiono nieleczone lub potraktowano odpowiednio 175 μg/ml i 200 μg/ml środka przeciwdrobnoustrojowego i inkubowano przez 45 minut. Następnie komórki poddano lizie, a agregaty białek komórkowych oddzielono od białek rozpuszczalnych. Białka w obu frakcjach zostały następnie oddzielone za pomocą SDS-PAGE i uwidocznione za pomocą barwienia Coomassie. Frakcja nierozpuszczalna pokazana w Rysunek 6 przedstawia ilość utworzonych agregatów białkowych, która zwiększyła się, gdy komórki były inkubowane w obecności środka przeciwdrobnoustrojowego w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Wzrost tworzenia agregatów białkowych był niezależny od tła szczepu, chociaż znacznie wyraźniejszy wzrost tworzenia agregatów wykryto w bardziej wrażliwym szczepie MG1655. I odwrotnie, po zastosowaniu środków przeciwdrobnoustrojowych komórek zaobserwowano mniejsze ilości rozpuszczalnych białek (frakcji rozpuszczalnej) w porównaniu z nieleczonym odpowiednikiem. Wynik ten był oczekiwany, biorąc pod uwagę wstępne dane, które wykazały znacznie wyższą tolerancję środka przeciwdrobnoustrojowego w CFT073 niż MG1655.

Tabela 1: Bufor, media i rozwiązania. Receptury, pożywek i roztworów używanych w tym protokole.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.