Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu Escherichia coli stresorem proteotoksycznym

DOI:

10.3791/62628

⸱

29 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, Illinois State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje ekstrakcję i wizualizację zagregowanych i rozpuszczalnych białek z Escherichia coli po leczeniu proteotoksycznym środkiem przeciwbakteryjnym. Postępowanie zgodnie z tą procedurą pozwala na jakościowe porównanie tworzenia agregatów białkowych in vivo w różnych szczepach bakteryjnych i/lub między zabiegami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narażenie organizmów żywych na stresy środowiskowe i komórkowe często powoduje zakłócenia homeostazy białek i może prowadzić do agregacji białek. Nagromadzenie agregatów białkowych w komórkach bakteryjnych może prowadzić do znaczących zmian w zachowaniu fenotypowym komórek, w tym do zmniejszenia tempa wzrostu, odporności na stres i zjadliwości. Istnieje kilka procedur eksperymentalnych do badania tych fenotypów, w których pośredniczą czynniki stresogenne. W tym artykule opisano zoptymalizowany test do ekstrakcji i wizualizacji zagregowanych i rozpuszczalnych białek z różnych szczepów Escherichia coli po potraktowaniu środkiem przeciwdrobnoustrojowym zawierającym srebro i ruten. Wiadomo, że związek ten wytwarza reaktywne formy tlenu i powoduje powszechną agregację białek.

Metoda łączy oparte na wirowaniu rozdzielanie agregatów białkowych i rozpuszczalnych białek z komórek traktowanych i nietraktowanych z późniejszym rozdzielaniem i wizualizacją za pomocą elektroforezy w żelu dodecylowo-poliakrylamidowym siarczanu sodu (SDS-PAGE) i barwienia Coomassie. Podejście to jest proste, szybkie i pozwala na jakościowe porównanie tworzenia agregatów białkowych w różnych szczepach E. coli. Metodologia ta ma szeroki zakres zastosowań, w tym możliwość badania wpływu innych proteotoksycznych środków przeciwdrobnoustrojowych na agregację białek in vivo w szerokim zakresie bakterii. Co więcej, protokół może być wykorzystany do identyfikacji genów, które przyczyniają się do zwiększonej odporności na substancje proteotoksyczne. Opaski żelowe mogą być wykorzystywane do późniejszej identyfikacji białek, które są szczególnie podatne na agregację.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie są nieuchronnie narażone na niezliczone stresy środowiskowe, w tym niskie pH (np. w żołądku ssaków)1,2, reaktywne formy tlenu i chloru (ROS/RCS) (np. podczas wybuchu oksydacyjnego w fagocytach)3,4,5, podwyższone temperatury (np. w gorących źródłach lub podczas szoku cieplnego)6,7, oraz kilka silnych środków przeciwdrobnoustrojowych (np. AGXX używany w tym protokole)8. Białka są szczególnie podatne na którykolwiek z tych stresorów, a ekspozycja może wywołać nieprawidłowe fałdowanie białek, które następnie zasiewa agregację. Wszystkie organizmy wykorzystują systemy ochronne, które pozwalają im radzić sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek9. Jednak silny stres może przytłoczyć maszynerię kontroli jakości białek i zakłócić drugorzędową i/lub trzeciorzędową strukturę białek, co ostatecznie dezaktywuje białka. W konsekwencji agregaty białkowe mogą poważnie upośledzać krytyczne funkcje komórkowe niezbędne do wzrostu i przetrwania bakterii, odporności na stres i zjadliwości10. Dlatego badania koncentrujące się na agregacji białek i jej konsekwencjach u bakterii są istotnym tematem ze względu na ich potencjalny wpływ na kontrolę chorób zakaźnych.

Rozwijanie i agregacja białek wywołane ciepłem są często odwracalne7. W przeciwieństwie do tego, inne stresy proteotoksyczne, takie jak stres oksydacyjny, mogą powodować nieodwracalne modyfikacje białek poprzez utlenianie określonych łańcuchów bocznych aminokwasów, co skutkuje nieprawidłowym fałdowaniem białka i ostatecznie agregacją białek4. Indukowane stresem tworzenie nierozpuszczalnych agregatów białkowych zostało szeroko zbadane w kontekście molekularnych białek opiekuńczych i ich funkcji ochronnych u drożdży i bakterii11,12,13. Opublikowano kilka protokołów, które wykorzystują różne techniki biochemiczne do izolacji i analizy nierozpuszczalnych agregatów białkowych14,15,16,17. Istniejące protokoły były wykorzystywane głównie do badania agregacji białek bakteryjnych po szoku cieplnym i/lub identyfikacji molekularnych białek opiekuńczych. Chociaż protokoły te z pewnością stanowiły postęp w tej dziedzinie, istnieją pewne poważne niedogodności w procedurach eksperymentalnych, ponieważ wymagają one (i) dużej objętości hodowli bakteryjnej do 10 L14,17, (ii) skomplikowane procesy fizycznego zakłócania pracy, w tym stosowanie substancji zakłócających funkcjonowanie komórek, prasy francuskiej i/lub sonikacji14,15,17, lub (iii) czasochłonne, powtarzające się etapy mycia i inkubacji15,16,17.

Ten artykuł opisuje zmodyfikowany protokół, który ma na celu rozwiązanie ograniczeń poprzednich podejść i pozwala na analizę ilości agregatów białkowych powstałych w dwóch różnych szczepach Escherichia coli po leczeniu proteotoksyczną powłoką przeciwbakteryjną. Powłoka składa się z metalu i srebra (Ag) i rutenu (Ru) kondycjonowanych kwasem askorbinowym, a jej aktywność przeciwdrobnoustrojową uzyskuje się poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu8,18. Niniejszy dokument zawiera szczegółowy opis przygotowania kultury bakteryjnej po zastosowaniu związku przeciwdrobnoustrojowego oraz porównanie stanu agregacji białek po ekspozycji dwóch szczepów E. coli o różnych profilach podatności na rosnące stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego. Opisana metoda jest niedroga, szybka i powtarzalna i może być stosowana do badania agregacji białek w obecności innych związków proteotoksycznych. Ponadto protokół może być modyfikowany w celu analizy wpływu, jaki delecje określonych genów mają na agregację białek u wielu różnych bakterii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Leczenie stresu szczepów E. coli MG1655 i CFT073

  1. Zaszczepić 5 ml pożywki bulionu lizogennego (LB) pojedynczą kolonią komensalnego szczepu E. coli MG1655 i uropatogennego szczepu E. coli (UPEC) CFT073 i inkubować przez 14-16 godzin (przez noc) w temperaturze 37 °C i 300 obr./min.
    UWAGA: Escherichia coli CFT073 jest ludzkim patogenem. Obchodzenie się z CFT073 musi odbywać się z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium posiadającym certyfikat bezpieczeństwa biologicznego na poziomie 2.
  2. Rozcieńczyć każdy szczep do kolby o pojemności 500 ml zawierającej 70 ml pożywki kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS)-glukozy (MOPS-g) (Tabela 1) do gęstości optycznej przy wartości 600 nm (OD600) 0,1. Inkubować w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 300 obr./min aż do osiągnięcia środkowej fazy logarytmu (OD600 = 0,5-0,55).
  3. Przenieść 20 ml każdej kultury do trzech wstępnie podgrzanych kolb o pojemności 125 ml i inkubować w temperaturze 37 °C i 300 obr./min przez 2 min.
    UWAGA: Ponieważ wymagane jest terminowe przetwarzanie próbek, nie należy obchodzić się z więcej niż 6 kulturami na raz.
  4. Przygotować roztwór związku przeciwdrobnoustrojowego w pożywce MOPS-g o stężeniu 2 mg/ml. Dodaj środek przeciwdrobnoustrojowy do każdej kultury, aby osiągnąć wskazane stężenia. W przypadku kontroli niepoddanej działaniu substancji dodać wymaganą objętość pożywki MOPS-g.
    UWAGA: Odwiruj roztwór przeciwdrobnoustrojowy o stężeniu 2 mg/ml, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie cząstek związku i uniknąć sedymentacji.
  5. Inkubować kultury przez 45 minut w temperaturze 37 °C i 300 obr./min.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Leczenie stresu Escherichia coli. Kultury bakterii są hodowane w MOPS-g i poddawane działaniu wskazanych stężeń środka przeciwdrobnoustrojowego zawierającego srebro-ruten, gdy zostanie osiągnięta faza środkowego logarytmu. Skróty: LB = bulion lizogeniczny; Ag-Ru = srebro-ruten; MOPS-g = kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS)-glukoza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Pobieranie próbek komórek bakteryjnych

  1. Po 45 minutach leczenia stresu określ OD600 w każdej kulturze. Dla każdej próbki pobrać komórki w ilości odpowiadającej 4 ml OD600 = 1 na 15 ml probówek wirówkowych przez odwirowanie przez 15 minut w temperaturze 3 000 × g i temperaturze 4 °C.
  2. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 50 μl lodowatego buforu do lizy (Tabela 1). Inkubować próbki przez 30 minut na lodzie.
    UWAGA: Ten etap lizy degraduje warstwę peptydoglikanu. Zawsze używaj świeżo przygotowanego buforu do lizy.
  3. Przenieść próbki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Zamrażać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Pobieranie próbek bakteryjnych. Próbki komórek są zbierane przez wirowanie i ponownie zawieszane w buforze do lizy, a następnie przechowywane w temperaturze -80 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Ekstrakcja nierozpuszczalnych agregatów białkowych

  1. Rozmrażanie próbek na lodzie.
    UWAGA: Cykl zamrażania i rozmrażania przyczynia się do lizy komórek.
  2. Dodać 360 μl lodowatego buforu A (Tabela 1) i delikatnie wymieszać pipetując.
    UWAGA: Szok osmotyczny również przyczyni się do lizy komórek.
  3. Przenieść próbkę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej ~200 μl szklanych kulek o średnicy 0,5 mm. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 8 °C w termomikserze z wytrząsaniem przy 1 400 obr./min.
    UWAGA: Ten krok powoduje fizyczne zakłócenie komórki. Inhibitor proteazy może być stosowany w celu zminimalizowania degradacji białek. Zakłócenie można przeprowadzić w temperaturze 4 °C. Należy zauważyć, że doniesiono, że użycie szklanych kulek indukuje agregację małego podzbioru białek w drożdżach19.
  4. Inkubować przez 5 minut na lodzie bez potrząsania, aby osadzić szklane kulki. Przenieść 200 μl lizatu komórkowego do probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
    UWAGA: Unikaj przenoszenia szklanych koralików.
  5. Wirować w temperaturze 16 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Zebrać sklarowany sklarent zawierający rozpuszczalne białka i przejść do sekcji 4.
  6. Zawiesić osad w 200 μl lodowatego buforu A (Tabela 1) za pomocą pipety. Wirować w temperaturze 16 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Ostrożnie usunąć supernatant w całości.
  7. Dodać 200 μl lodowatego buforu B (patrz Tabela 1 i Tabela Materiałów) i ostrożnie zawiesić osad przez pipetowanie.
    UWAGA: Niejonowy detergent rozpuszcza białko błonowe.
  8. Powtórzyć wirowanie w temperaturze 16 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Ostrożnie usunąć supernatant.
  9. Zawiesić osad w 200 μl zimnego buforu A (Tabela 1) przez pipetowanie. Wirować w temperaturze 16 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Całkowicie usunąć supernatant.
  10. Zawiesić osad w 100 μl 1x redukującego buforu do próbek SDS (tabela 1) i gotować przez 5 minut w temperaturze 95 °C w termomikserze.
  11. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C w celu późniejszego kontynuowania lub natychmiast załadować ją na żel poliakrylamidowy SDS w celu oddzielenia.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Ekstrakcja nierozpuszczalnych agregatów białkowych. Ekstrakcja agregatów białkowych obejmuje szereg etapów, w tym rozerwanie komórek, oddzielenie agregatów białkowych od białek rozpuszczalnych, rozpuszczalność białek błonowych i mycie. Skrót: SDS = dodecylosiarczan sodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie próbki białka rozpuszczalnego

  1. Zmieszać 1 objętość 100% kwasu trichlorooctowego (TCA) z 4 objętościami próbki białka rozpuszczalnego z kroku 3.6.
    UWAGA: Obchodzenie się z TCA wymaga dygestorium i środków ochrony osobistej oraz zatwierdzonej procedury usuwania odpadów.
  2. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić wytrącenie białka.
    UWAGA: Biały osad pojawi się bardzo szybko.
  3. Odwirować do wytrącania w temperaturze 21 000 × g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Umyj granulkę 200 μl lodowatego acetonu, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Odwirować w temperaturze 21 000 × g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i usunąć supernatant. Powtórz te czynności w kroku 4.3 w sumie trzy razy.
  4. Umieścić probówki do mikrowirówek z otwartymi pokrywkami w termomikserze w temperaturze 37 °C, aby usunąć pozostały aceton z osadu.
    UWAGA: Inkubacja trwająca dłużej niż 5 minut może zmniejszyć rozpuszczalność osadu białkowego.
  5. Dodać 100 μl 1x redukującego buforu SDS (Tabela 1) i całkowicie rozpuścić osad. Gotować próbkę przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
  6. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C w celu późniejszego kontynuowania lub natychmiast załadować na SDS żel poliakryloamidowy w celu oddzielenia.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Przygotowanie rozpuszczalnych białek. Przygotowanie rozpuszczalnego białka polega na wytrącaniu kwasem trójchlorooctowym i wielokrotnym przemywaniu lodowatym acetonem. Skróty: TCA = kwas trichlorooctowy; SDS = dodecylosiarczan sodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Separacja i wizualizacja wyekstrahowanych agregatów białkowych za pomocą SDS-PAGE

  1. Przygotuj 12% żel poliakryloamidowy SDS.
    1. W przypadku dwóch żeli separujących należy odpipetować 5,1 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O), 3,75 ml Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 ml 20% (w/v) SDS, 6 ml 30% roztworu akryloamidu/bisakryloamidu (29:1), 75 ml 10% w/v nadsiarczanu amonu i 10 ml tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i delikatnie wymieszać bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Wlać żel za pomocą pipety o pojemności 1 ml do szklanych płytek, pozostawiając górne 2 cm wolne od mieszanki. Dodaj 70% etanolu na wierzch żelu separującego i zapewnij równomierne połączenie między dwiema warstwami.
    2. Po polimeryzacji żelu rozdzielającego należy przygotować żel do układania w stos, pipetując 1,535 ml ddH2O, 625 ml Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 ml 20% (w/v) SDS, 335 ml 30% roztworu akryloamidu/bisakryloamidu (29:1), 12,5 ml 10% w/v nadsiarczanu amonu i 2,5 ml TEMED. Usunąć etanol z żeli rozdzielających i dodać roztwór żelu do układania w stosy. Włóż grzebień z żądaną liczbą kieszeni bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Pozostawić polimeryzację na 20-30 minut.
  2. Załadować 4 μl każdej próbki i drabinki białkowej do oddzielnych studzienek i uruchomić żel(e) w buforze Tris-Glycine (Tabela 1) pod napięciem 144 V przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Przerwij żel, gdy pasmo bromofenolu ma zamiar wydostać się z żelu.
  3. Zabarwić żel(e) we wstępnie podgrzanym roztworze Fairbanks A (Tabela 1) przez 30 minut na bujaku.
  4. Odbarwić żel(e) we wstępnie podgrzanym roztworze Fairbanks D (Tabela 1) do uzyskania pożądanego tła (np. przez noc) na bujaku.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Separacja i wizualizacja białek. Próbki są rozdzielane za pomocą SDS-PAGE i wizualizowane za pomocą barwienia Coomassie. Skrót: SDS-PAGE = elektroforeza w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakrylamidu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki agregacji białek indukowanej przez środki przeciwdrobnoustrojowe w komensalnym szczepie Escherichia coli MG1655 i szczepie UPEC CFT073. Szczepy E. coli MG1655 i CFT073 hodowano w temperaturze 37 °C i 300 obr./min do OD600 = 0,5-0,55 w pożywce MOPS-g, zanim poddano je działaniu wskazanego stężenia (-, 0 mg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodologię analizy tworzenia agregatów białkowych po potraktowaniu różnych szczepów E. coli proteotoksycznym środkiem przeciwdrobnoustrojowym. Protokół pozwala na jednoczesną ekstrakcję nierozpuszczalnych i rozpuszczalnych frakcji białkowych z leczonych i nietraktowanych komórek E. coli. W porównaniu z istniejącymi protokołami izolacji agregatów białkowych z komórek 14,15,16,20, metoda ta ma kilka zalet: (i) potrzebne są tylko małe objętości hodowli (4-8 ml...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze startowe Illinois State University School of Biological Sciences, Illinois State University New Faculty Initiative Grant oraz grant NIAID R15AI164585 (dla J.-U. D.). G.M.A. był wspierany przez Illinois State University Undergraduate Research Support Program (dla G.M.A.). K. P. H. był wspierany przez stypendium RISE zapewnione przez Niemiecką Centralę Wymiany Akademickiej (DAAD). Autorzy dziękują dr Uwe Landau i dr Carstenowi Meyerowi z Largentech Vertriebs GmbH za dostarczenie proszku AGXX. Rysunki 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4 i Rysunek 5 zostały wygenerowane za pomocą Biorender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemikalia/odczynniki
AcetonFisher Scientific67-64-1
30% roztwór akrylamidu/bisakryloamidu 29:1Bio-Rad1610156
Nadsiarczan amonuMillipore SigmaA3678-100G
Nukleaza benzonazowaSigmaE1014-5KU
Bluestain 2 Drabinka białkowa, 5-245 kDaGoldBioP008-500
β-merkaptoetanolMillipore SigmaM6250-100ML
Bromofenol niebieskiGoldBioB-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250MP Biomedicals LLC821616
D-GlucoseMillipore SigmaG8270-1KG
D-SacharozaAcros Organics57-50-1
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichSLBT9686
Lodowaty kwas octowyMillipore SigmaARK2183-1L
Glicerol, 99%Sigma-AldrichG5516-1L
GlycineGoldBioG-630-1
Kwas solny, odczynnik ACSSigma-Aldrich320331-2.5L
Izopropanol (2-Propanol)Sigma402893-2.5L
LB bulion (Miller)Millipore SigmaL3522-1KG
LB bulion z agarem (Miller)Millipore SigmaL2897-1KG
LizozymGoldBioL-040-25
10x Bufor MOPSTeknovaM2101
Nonidet P-40Thomas Scientific9036-19-5
Fosforan potasu, dwuzasadowySigma-AldrichP3786-1KG
Fosforan potasu, jednozasadowyAcros Organics7778-77-0
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma-AldrichL3771-500G
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Millipore SigmaT9281-50ML
TiaminaSigma-AldrichT4625-100G 100%
Kwas trichlorooctowyMillipore SigmaT6399-100G
Tris baseGoldBioT-400-1
Materiał/Wyposażenie
probówki wirówkowe (15 ml)Alkali ScientificJABG-1019
Kolba Erlenmeyera (125 ml)Carolina726686
Kolba Erlenmeyera (500 ml)Carolina726694
Zamrażarka: -80 ° CFisher Scientific
Koraliki szklane (0,5 mm)BioSpec Products1107-9105
MikrowirówkaHermleZ216MK
Probówki do mikrowirówek (1,7 ml)VWR International87003-294
Probówki do mikrowirówek (2,0 ml)Axygen Maxiclear MicrotubesMCT-200-C
Kuwety plastikoweFischer Scientific14-377-012
ZasilaczThermoFisher ScientificEC105
RockerAlkali ScientificRS7235
Inkubator z wytrząsaniem (37 ° C)Benchmark Scientific
Mała szklana płytkaBio-Rad1653311
Płytki dystansowe (1 mm)Bio-Rad1653308
SpektrofotometrThermoscientific3339053
Wirówka stołowa do probówek wirówkowych 15 mlBeckman-Coulter
Pionowa komora do elektroforezy żelowejBio-Rad
VortexerFisher Vortex Genie 212-812
ThermomixerBenchmark ScientificH5000-HC
10-studzienkowy grzebieńBio-Rad1653359
1658004

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dahl, J. -U., et al. HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).
  2. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).
  3. Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -U. Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid. Infection and Immunity. 88 (7), 00964(2020).
  4. Dahl, J. -U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  5. Groitl, B., Dahl, J. -U., Schroeder, J. W., Jakob, U. Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants. Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).
  6. Casadevall, A. Thermal restriction as an antimicrobial function of fever. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577(2016).
  7. Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
  8. Van Loi, V., Busche, T., Preuß, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. The AGXX ® antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus. Frontiers in Microbiology. 9, 3037(2018).
  9. Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. Experimental and theoretical aspects of protein folding. Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).
  10. Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. Protein aggregation in bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).
  11. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).
  12. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  13. Weids, A. J., Ibstedt, S., Tamás, M. J., Grant, C. M. Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties. Scientific Reports. 6, 24554(2016).
  14. Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).
  15. Fay, A., Glickman, M. S. An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding. PLoS Genetics. 10 (7), 1004516(2014).
  16. Schramm, F. D., Heinrich, K., Thüring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus. PLoS Genetics. 13 (12), 1007148(2017).
  17. Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells. Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).
  18. Heiss, A., Freisinger, B., Held-Föhn, E. Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles. Biointerphases. 12 (5), (2017).
  19. Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast. Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).
  20. Chuang, S. E., Blattner, F. R. Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).
  21. Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
  22. Mühlhofer, M., et al. The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins. Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).
  23. Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. Metal homeostasis and resistance in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).
  24. Stevens, M., et al. HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).
  25. Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus. Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protein AggregationEscherichia ColiProteotoxic StressProtein Aggregate ExtractionSDS PAGECoomassie StainingSoluble ProteinsCentrifugation SeparationAntimicrobial TreatmentBacterial Stress Response

Powiązane artykuły