Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcja ludzkiego siatkówczaka in vitro

DOI:

10.3791/62629

⸱

11 października 2022

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę generowania ludzkiego siatkówczaka (RB) poprzez wprowadzanie biallelicznych mutacji RB1 w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC). Linie komórkowe RB mogą być również z powodzeniem hodowane przy użyciu wyizolowanego RB w naczyniu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki RB to rak dziecięcy, który jest śmiertelny, jeśli nie stosuje się leczenia. Ponieważ RB wywodzi się z prekursorów czopków, co jest stosunkowo rzadkie w modelach gryzoni, tymczasem jeśli chodzi o różnice międzygatunkowe między ludźmi a gryzoniami, model choroby pochodzący od ludzi jest bardziej korzystny dla odkrycia mechanizmów ludzkiego RB i poszukiwania celów terapii. W niniejszym dokumencie protokół opisuje generowanie dwóch linii hESC z edytowanymi genami z bialleliczną mutacją punktową RB1 (RB1Mut/Mut) i mutacją nokautującą RB1 (RB1-/-). Podczas procesu rozwoju siatkówki obserwuje się powstawanie RB. Linie komórkowe RB są również ustanawiane przez segregację od organoidów RB. W sumie, różnicując edytowane genowo linie hESC w organoidy siatkówki przy użyciu połączonego protokołu różnicowania 2D i 3D, udało nam się zrekonstruować ludzki RB w naczyniu i zidentyfikować jego pochodzenie jako prekursora stożka. Stanowiłoby to pomocny model choroby do obserwacji genezy, proliferacji i wzrostu siatkówczaka, a także do dalszego opracowywania nowych środków terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki siatkówczak (RB) jest rzadkim, śmiertelnym nowotworem wywodzącym się z prekursorów stożków siatkówki1,2,3, jest najczęstszym typem nowotworu wewnątrzgałkowego w dzieciństwie4. Homozygotyczna inaktywacja genu RB1 jest inicjującą zmianą genetyczną w RB5. Jednak myszy z mutacjami RB1 nie tworzą guza siatkówki2. Chociaż guzy myszy mogą być generowane przez kombinację mutacji Rb1 i innych modyfikacji genetycznych, nadal brakuje im cech ludzkiego RB6. Dzięki rozwojowi różnicowania organoidów siatkówki udało się uzyskać RB pochodzącego z hESC, wyświetlającego cechy ludzkiego RB1.

W ciągu ostatniej dekady ustanowiono liczne protokoły różnicowania organoidów siatkówki, w tym 2D7, 3D8, oraz kombinację 2D i 3D9. Metoda użyta tutaj do wygenerowania ludzkiego RB to konsolidacja kultury przylegającej i kultury pływającej9. Poprzez różnicowanie hESC z mutacją RB1 w organoidy siatkówki, tworzenie RB jest wykrywane około 45 dnia, a następnie szybko się namnaża około 60 dnia. W 90 dniu możliwa jest izolacja RB i wytworzenie linii komórkowej RB; ponadto RB otacza prawie wszystkie organoidy siatkówki w 120 dniu.

hESC RB jest innowacyjnym modelem do badania pochodzenia, nowotworzenia i leczenia RB. W tym protokole szczegółowo opisano wytwarzanie hESC z edycją genów, różnicowanie RB i charakterystykę RB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną Komisję Etyki Szpitala Tongren w Pekinie, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. ESC H9 są pozyskiwane z Instytutu Badawczego WiCell.

1. Generacja zmutowanego RB1 hESC

  1. Wektor celowania CRISPR/Cas9 dla nokautu (KO) RB1.
    1. Zaprojektuj parę sgRNA. W celu ablacji RB1 należy celować w pierwszy ekson tego genu. Sekwencja startera do przodu to CACCGCGGTGGGGGGGTTTTTCGG, a odwrotna sekwencja startera to AAACCCGAAAACGGGCCCCACCGC.
      UWAGA: W przypadku konkretnej mutacji RB1 wymagany jest również naprawiony szablon. W tym protokole jako przykład użyto linii komórkowej RB1-KO.
    2. Trawić 1 μg pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro z enzymami restrykcyjnymi BbsI (patrz tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Oczyść strawione plazmidy za pomocą zestawu do oczyszczania zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Reakcje enzymatyczne można bezpośrednio oczyścić bez żelu agarozowego za pomocą zestawu do oczyszczania (patrz Tabela materiałów).
    4. Fosforylować i wyżarzać każdą parę oligonukleotydów za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 (PNK) (tabela materiałów) z reakcją obejmującą 1 μl oligo1 (100 μM), 1 μl oligo2 (100 μM), 1 μl 10x buforu ligacyjnego T4, 6,5 μl ddH2O i 0,5 μl T4 PNK.
      UWAGA: Startery do przodu i do tyłu w kroku 1.1.1 to para oligonukleotydów. Fosforylować i wyżarzać oligonukleotydy w termocyklerze, stosując następujące parametry: 37 °C przez 30 min; 95 °C przez 5 min; obniżyć do 25 °C przy 5 °C na minutę.
    5. Rozcieńczyć ufosforylowane i wyżarzane oligonukleotydy 200 razy, dodając 1 μl odczynnika oligokrygonukleostatycznego do 199 μl wody wolnej od nukleaz w temperaturze pokojowej (RT).
    6. Ustawić reakcję ligacji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, mieszając następujące elementy: 50 ng plazmidu strawionego przez Bbs1 z etapu 1.1.3, 1 μl oligoduplexu z kroku 1.1.5, 5 μl buforu ligacyjnego 2x, 1 μl ligazy i uzupełnić do 10 μl wodą bez nukleaz.
    7. Przekształć mieszaninę ligacyjną i zsekwencjonuj dodatnie kolonie do następnego kroku.
      UWAGA: Do sekwencjonowania użyj startera U6 do przodu lub do tyłu.
      1. Rozmrozić właściwe komórki na lodzie.
      2. Pobrać 50 μl właściwych komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      3. Dodać 1 μl mieszaniny ligacyjnej z kroku 1.1.6 do właściwych komórek.
      4. Delikatnie wymieszać, trzykrotnie pipetując rurkę w górę i w dół.
        UWAGA: Nie wirować.
      5. Umieść mieszaninę na lodzie na 30 minut.
      6. Szok cieplny mieszaniny w temperaturze 42 °C przez 90 s.
      7. Do probówki dodać 950 μl bulionu Luria-Bertani (LB) o temperaturze pokojowej bez antybiotyku.
      8. Umieścić probówkę w wytrząsarce przy 300 obr./min w temperaturze 37 °C na 60 min.
      9. Uprzednio ogrzać płytki LB (pepton, pepton z kazeiny, chlorek sodu, agar-agar i ampicylina) do temperatury 37 °C.
      10. Rozprowadzić 50-100 μl komórek i mieszaniny ligacji na płytkach w temperaturze pokojowej.
      11. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
      12. Zbierz 12 kolonii z płytki i przenieś je na pożywkę LB z ampicyliną. Umieść pożywkę na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min na 60 minut.
      13. Użyj 1 μl roztworu bakterii (z kroku 1.1.7.12) jako matrycy do PCR i wybierz dodatnie kolonie.
      14. Zsekwencjonuj dodatnie kolonie za pomocą starterów U6, w następnym kroku użyj kolonii z zaprojektowanymi sekwencjami sgRNA.
    8. Wyodrębnij plazmid za pomocą zestawu midi (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Jakość i ilość plazmidu przy użyciu mini zestawu nie są wystarczające do przeprowadzenia kolejnego eksperymentu z nukleofekcją. Zestaw midi lub maxi jest bardziej odpowiedni niż zestaw mini.
  2. Hodowla HESC i nukleofekcja.
    UWAGA: Podgrzej wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej.
    1. Rozmrozić 1 x 106 komórek H9 na wstępnie powlekanej płytce 6-dołkowej z 10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK) i 2 ml świeżej pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC.
      UWAGA: Przed użyciem pokryć 6-dołkową płytkę matrycą membrany podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu o 1% przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Następnego dnia usuń supernatant, przepłucz komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS), a następnie dodaj 2 ml świeżej pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC.
    3. Zmieniaj pożywkę codziennie z 2 ml świeżej pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC w ciągu następnych 3-5 dni, aż komórki osiągną około 80% zbieżności.
    4. Przejście raz lub dwa razy, aby dostosować stan hESC.
      UWAGA: Najprostszym sposobem identyfikacji stanu hESC jest morfologia.
    5. Hoduj niezróżnicowane komórki H9 na 6-dołkowej płytce, aż osiągną 80% zgrywu.
    6. Zmienić pożywkę na 2 godziny przed nukleofekcją za pomocą 2 ml świeżej pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC zmieszanej z 10 μM Y-27632 i wstępnie pokryć jedną studzienkę 12-dołkowej płytki przy użyciu 1% matrycy błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu.
    7. Odessać pożywkę i spłukać 1 ml podgrzanego DPBS.
    8. Wyjąć DPBS i inkubować z 1 ml enzymu dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) przez 3,5 minuty w temperaturze 37 °C.
    9. Dodać 1 ml świeżej pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC do komórek i dwukrotnie pipetować, aby komórki H9 stały się zawiesiną pojedynczej komórki.
    10. Wyjąć 100 μl mieszaniny do zliczania komórek i przenieść pozostałą część do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej kolejne 2 ml pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC.
    11. Wirować przy 200 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić około 2 x 106 komórek w objętości reakcyjnej 100 μl. Zgodnie z protokołem producenta zoptymalizuj objętość komórek, plazmidów, nukleofektora i warunków reakcji. Patrz tabela materiałów dla systemu nukleofekcji używanego w tym protokole.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, pęcherzyki nie są dozwolone podczas nukleofekcji.
    12. Po transfekcji przenieść komórki na wstępnie powlekaną płytkę 12-dołkową, uzupełnić 1,5 ml pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC i 10 μM Y-27632, a następnie hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    13. Zmieniaj medium codziennie. Po 48 godzinach dodać 2 μg/ml puromycyny do selekcji komórek około tygodnia.
      UWAGA: Wiele komórek umiera w ciągu pierwszych 3 dni. Pozostałe komórki mogą się namnażać i przekształcać w kolonie w następnym tygodniu po selekcji puromycyny. W tygodniu selekcji upewnij się, że podłoże zawsze zawiera 2 μg/ml puromycyny.
    14. Wybierz kolonie ręcznie pod mikroskopem.
      UWAGA: Morfologia kolonii jest taka sama jak kolonii hES. Pokrój kolonie na kawałki (2-6 sztuk na kolonię) za pomocą 10 μl białej/normalnej końcówki pipety w pożywce i przenieś jedną kolonię do jednego wstępnie powlekanego dołka na 12-dołkowej płytce.
    15. Najpierw zidentyfikuj mutacje RB1 i sytuacje poza celem (Tabela 1), a następnie pluripotencję, aby scharakteryzować linię komórkową H9 z nokautem RB1.
      UWAGA: Wykryj mutacje RB1 i sytuacje poza celem za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera. Zidentyfikuj markery pluripotencji za pomocą RT-PCR i immunofluorescencji.

2. Generacja ludzkiego siatkówczaka

  1. Utrzymanie RB1-KO hESC.
    1. Hoduj komórki H9 z edytowanym genem na 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostu z 2 ml pożywki hodowlanej ncEpic-hiPSC/hESC i zmieniaj pożywkę codziennie.
    2. Pasaż z użyciem buforu EDTA przez 3,5 min w temperaturze 37 °C lub 5 min w temperaturze RT.
      UWAGA: Bufor EDTA jest mieszaniną 1x DPBS, 5 mM EDTA i 0,9 mg/ml NaCl.
  2. Różnicowanie komórek siatkówki.
    UWAGA: Przygotować pożywkę I przed różnicowaniem. Aby przygotować pożywkę I, wymieszaj 24,5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle Medium (DMEM)/mieszanki składników odżywczych F-12(F12)-Glutaminy (1x), 24,5 ml pożywki Neuronal basenal, 250 μl 100x suplementu A, 500 μL 50x suplementu B, 0,1 mM ß-merkaptoetanolu i 250 μl 100x L-glutaminy. Przed użyciem podgrzej wszystkie mieszanki do RT.
    1. Wyhoduj RB1-KO hESC do 80% konfluencji w jednym dołku na 6-dołkowej płytce.
    2. Usuń pożywkę i przepłucz komórki 1 ml 1x DPBS.
    3. Podnieść kolonie komórkowe za pomocą 1 ml buforu dyspazy (patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Sprawdź kolonie komórkowe pod mikroskopem. Zwykle rozwinięcie się krawędzi kolonii zajmuje 5 minut.
    4. Odessać bufor do depazy i delikatnie przepłukać komórki raz 1 ml 1x DPBS.
    5. Dodaj 1 ml pożywki I do dołka.
    6. Pokrój kolonie na kawałki (6-9 sztuk na kolonię) za pomocą 10 μl białej/normalnej końcówki pipety w podłożu.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, około 60%-70% komórek odłącza się od studni. Użyj skrobaka do komórek, aby zeskrobać pozostałe komórki w podłożu.
    7. Zbierz wszystkie komórki, odwirowując w probówce o pojemności 15 ml o pojemności 200 x g przez 5 minut.
    8. Pozostawić około 50 μl supernatantu do rozproszenia komórek w pożywce, a następnie wymieszać komórki z 250 μl matrycy błony podstawnej zredukowanej przez czynnik wzrostu przez delikatne mieszanie.
      UWAGA: Przed użyciem należy przechowywać matrycę membrany podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu w temperaturze 4 °C lub na lodzie. Jeżeli lek jest porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C, należy go umieścić w temperaturze 4 °C na noc lub co najmniej 1 godzinę przed użyciem.
    9. Probówkę o pojemności 15 ml z zawieszonymi komórkami należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 20 minut
      UWAGA: Upewnij się, że komórki i macierz błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu tworzą zestalony żel.
    10. Dodać 1 ml pożywki I do probówki o pojemności 15 ml, a następnie lekko odpipetować zestalony żel dwa do trzech razy, aby rozproszyć grudkę za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    11. Dodać 9 ml pożywki I i przenieść zawiesinę komórek do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych.
    12. Przenieś naczynie do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO2 i ustaw dzień jako dzień 0.
    13. Zbadaj komórki pod mikroskopem w dniu 1.
      UWAGA: W naczyniu można było zaobserwować tysiące pustych torbieli. Średnio w jednym kawałku żelu obserwuje się od 3 do 4 torbieli.
    14. Zmień podłoże w 5 dniu. Zebrać supernatant do probówki o pojemności 15 ml, poczekać, aż torbiele osiądą na dnie, a następnie usunąć pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką I.
      UWAGA: Jeśli pożywka zmieni kolor na żółty w 4 dniu, zmień pożywkę w 4 dniu, w przeciwnym razie w 5 dniu. Dodaj 10 ml świeżego podłoża I do oryginalnego naczynia. Setki torbieli przyczepiły się już do powierzchni hodowli; Trzymaj je tam.
    15. Rozprowadź torbiele w probówce w dwóch 10-centymetrowych szalkach.
      UWAGA: Upewnij się, że w naczyniu znajduje się co najmniej 300 torbieli. Jeśli torbiele nie zlewają się, nie rozdzielaj torbieli na inne naczynia; Włóż je z powrotem do oryginalnego naczynia o średnicy 10 cm.
    16. W 7 dniu większość torbieli (powyżej 95%) przyczepia się do naczynia, rozprzestrzenia się i tworzy przylegające kolonie.
      UWAGA: Już w 3 dniu można zaobserwować przylegające kolonie.
    17. W 10 dniu zmień pożywkę na świeżą pożywkę I. Upewnij się, że wszystkie torbiele są przyczepione do naczynia.
    18. Przygotuj pożywkę II przed następnym krokiem, mieszając następujące elementy: 36 ml DMEM, 12 ml F12, 2% suplementu B (v/v), 0,1 mM roztworu aminokwasów endogennych MEM (NEAA).
    19. Upewnij się, że komórki są rozłożone do 13-17 dnia. Następny krok wykonaj w 15 dniu, kiedy komórki są rozproszone, ale nie wchodzą w interakcję z sąsiednimi koloniami.
    20. Przepłukać komórki raz 1 ml DPBS i dodać 1 ml roztworu do dyspazy przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: W ciągu 5 minut krawędź komórek podnosi się.
    21. Usunąć bufor do dypazy i delikatnie przepłukać kultury 1 ml 1x DPBS.
    22. Dodać 10 ml pożywki II do każdego 10 cm naczynia i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    23. Przylegające kultury samoistnie odrywają się po 24 godzinach i łączą się w organoidy siatkówki.
      UWAGA: Wiele komórek, które nie tworzą organoidów, umrze w ciągu następnych 2 dni.
    24. Trzy dni po odłączeniu należy pobrać komórki z naczynia do hodowli komórkowych i pozwolić organoidom osiąść w probówce o pojemności 15 ml.
    25. Usunąć supernatant z probówki i przenieść organoidy do nowej, nieprzylegającej szalki (szalki Petriego) z 10 ml pożywki II na następne cztery dni.
    26. Przygotuj pożywkę III, mieszając DMEM: F12 w stosunku 3:1 (v/v), 2% suplement B (v/v), 0,1 mM roztworu aminokwasów endogennych MEM (NEAA), 8% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (v/v), 100 μM tauryny i 2 mM glutaminy.
    27. Tydzień po odłączeniu zmień pożywkę na Średnią III.
    28. Od tego dnia hoduj organoidy w pożywce III i odświeżaj podłoże dwa razy w tygodniu.
  3. Ustanowienie linii komórkowej RB.
    UWAGA: Wszystkie odczynniki są wstępnie podgrzewane w temperaturze pokojowej.
    1. W 90 dniu RB (80%-90%) obejmują organoidy siatkówki. Dlatego wybierz 90-dniowe organoidy RB do wytworzenia linii komórek RB.
    2. Przygotuj pożywkę 1640, mieszając pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 z 10% FBS.
    3. Pokrój RB na kawałki (20-25 sztuk na RB) za pomocą noża mikrochirurgicznego pod mikroskopem w pożywce RPMI-1640.
    4. Usuń pożywkę RPMI-1640 i potraktuj kawałki 0,25% trypsyną/EDTA przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    5. Dodaj pożywkę RPMI-1640, aby zakończyć reakcję i odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce 1640 w naczyniu nieprzylegającym.
    7. Linia komórkowa RB to pływająca kultura. Zmieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu i przechodź komórki RB w ciągu 2 tygodni.
      UWAGA: Tempo proliferacji pierwotnych komórek RB jest dość powolne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedura generowania RB jest wyjaśniona w Rysunek 1, który łączy kulturę przylegającą i pływającą. Udało się zebrać ludzki RB z RB1-KO hESC i uzyskać linię komórkową RB poprzez wyizolowanie organoidów RB.

Tutaj protokół dostarcza szczegółów różnicowania w różnych etapach (Rysunek 2). W ciągu pierwszych 3 dni tworzą się puste kule, które przyczepiają się do powierzchni hodowli, a następnie rozszerzają się (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki siatkówczak (RB) jest spowodowany inaktywacją RB1 i dysfunkcją białka Rb. W tym protokole hESC RB1-KO jest kluczowym krokiem w wytwarzaniu RB w naczyniu. Chociaż nawet w przypadku RB1-/- hESC możliwe jest, że nie dochodzi do tworzenia RB ze względu na metody różnicowania organoidów siatkówki10. W tym protokole przejście od kultury przylegającej do kultury pływającej jest niezbędne w procesie różnicowania. Gęstość torbieli, rodzaje pluripotencjalnych kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie są świadomi żadnych powiązań, członkostwa, finansowania lub udziałów finansowych, które mogłyby wpłynąć na obiektywność tego badania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy zespołowi 502 za wszelką pomoc. Prace te są częściowo wspierane przez Miejską Fundację Nauk Przyrodniczych w Pekinie (Z200014) oraz Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFA0105300).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolLife Technologies21985-023
Przeciwciałoanty-ARR3SigmaHPA063129
Przeciwciało anty-CRX (M02)AbnoveABN-H00001406-M02Przeciwciało
anty-Ki67Abcam  ab15580Przeciwciało
anty-Syk (D3Z1E)Technologia sygnalizacji komórkowej13198Przeciwciało
BbsINEBR3539SEnzymy restrykcyjne
Dyspaza (1U / mL)Technologie komórek macierzystych7923
DMEM basicGibco10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAXGibco10565-042
DMSOSigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo 15575020
Płodowa surowica bydlęca (FBS), zakwalifikowana do ludzkich embrionalnych komórek macierzystychPrzemysł biologiczny04-002-1A
GlutaminaGibco35050-061
Mieszanka odżywcza szynki F-12 (szynki F12)Gibco11765-054
MEM Nieistotny roztwór aminokwasów (100X)SigmaM7145
Podłoże neurobazalneGibco21103-049
P3 Zestaw 4D-Nucleofector X Primary Cell SLonzaV4XP-3032Zestaw do nukleofekcji
Pen StrepGibco15140-122
Operacja genuPuromycynyISY1130-0025MG
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQIAGEN28104
pożywka hodowlana ncEpic-hiPSC/hESCNuwacellRP01001ncEpic-hiPSC/hESC w 1.2.1
Macierz błony podstawnej o obniżonym czynniku wzrostuBD356231Matrigel w 1.2.1
Enzym dysocjacji komórekGibco12563-011TrypLE Express w 1.2.8
ZestawRNeasy MidiQIAGEN75144
RNeasy Mini KitQIAGEN74104
Suplement ALife Technologies17502-048Suplement N-2 (100X), płyn, suplement w medum I
Suplement BLife Technologies17105-041B-27 Suplement (50X), płyn, suplement w medum I,II,III
T4 Kinaza polinukleotydowaTechnologiesEK0032
TaurynaSigmaT-8691-25G
Y-27632 2HClSelleckS1049
pX330-U6- Chimeryczny BB-CBh-hSpCas9-2A-PuroAddgene42230
Nucleofector 4DLonza
RPMISigmaR0883-500ML
Pożywka hodowlana Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  2. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
  3. Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
  4. Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. The biology of retinoblastoma. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).
  5. Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
  6. Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
  7. Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
  8. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  9. Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
  10. Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
  11. Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
  12. Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
  13. Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy siatk wkinokaut RB1kom rki prekursorowe czopk wmodel nowotworu in vitroludzkie embrionalne kom rki macierzystegeneza retinoblastomy3D r nicowanie kom rekmarker proliferacji Ki67architektura p cherzyka optycznego

Powiązane artykuły