Artykuł metodologiczny

Jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej

DOI:

10.3791/62632

⸱

18 maja 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 3Black Family Stem Cell Institute, Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 4Sema4, a Mount Sinai venture

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół, w którym pojedyncze komórki są monitorowane pod kątem ostrych zdarzeń i produktywnego zakażenia HIV-1 na urządzeniu nanofluidycznym. Dane obrazowe definiują interakcje wirus-receptor gospodarza i dynamikę szlaku sygnałowego. Jest to pierwsza metoda nanofluidycznej, wysokoprzepustowej, podłużnej hodowli pojedynczej komórki i obrazowania w celu zbadania kinetyki sygnalizacji i interakcji molekularnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewlekły stan zapalny jest główną przyczyną wczesnych chorób i śmiertelności związanych z HIV1,2,3. Istnieje wiele mechanizmów, dzięki którym HIV może aktywować sygnalizację zapalną, a ostatnie dowody sugerują rolę receptorów P2X we wjeździe wirusa HIV, którymi są receptory adenozynotrifosforanu (ATP) bramkujące wapń3,4,5,6,7,8,9,10. Podtyp receptorów purynergicznych P2X (P2XR) może być ważnym czynnikiem ułatwiającym ten stan zapalny. Jednak mechanizmy molekularne interakcji HIV-P2XR są w dużej mierze nieznane i mogą wpływać na wczesne i późne etapy cyklu życiowego wirusa HIV-1. Zdefiniowanie szlaków i kinetyki napędzających przewlekły stan zapalny związany z HIV ma kluczowe znaczenie dla rozwoju możliwości leczenia osób z HIV.

Aby ocenić, czy HIV-1 bezpośrednio niszczy receptory P2X, aktywacja P2XR i zakażenie HIV-1 muszą być mierzone równolegle. Testy aktywności P2XR i zakażenia HIV-1 zostały ustalone niezależnie: Napływ wapnia do komórek jest wskaźnikiem aktywacji P2XR, a infekcję produktywną HIV-1 można określić ilościowo za pomocą obfitości RNA. Fluorescencyjne wykrywanie napływu wapnia jest możliwe za pomocą barwnika wrażliwego na wapń Fluo-4, a zakażenie HIV-1 można uwidocznić za pomocą fluorescencyjnego wirusa reporterowego mCherry HIV-NLCI11,12,13,14,15.

Ponieważ te wskaźniki aktywacji P2X (ostry napływ wapnia do komórek) i zakażenia HIV-1 (synteza RNA HIV-1) występują w różnych skalach czasowych (minuty kontra dni), brakuje metody o wysokiej przepustowości, która pozwalałaby na analizę aktywacji P2XR i infekcji HIV-1. Standardowe wysokoprzepustowe techniki eksperymentalne, takie jak cytometria przepływowa, pozwalają na analizę populacji, ale nie mogą ocenić związku między ostrymi i podłużnymi zdarzeniami w pojedynczych komórkach. Alternatywnie, obrazowanie pojedynczych komórek za pomocą standardowej mikroskopii fluorescencyjnej jest niskoprzepustowe. Te eksperymentalne ograniczenia stwarzają potrzebę nowatorskich, wysokoprzepustowych technik bezpośredniego pomiaru powiązań między ostrymi i podłużnymi zdarzeniami komórkowymi.

Opisany system optofluidyczny to nowatorska platforma zdolna do sortowania i izolowania pojedynczych komórek, hodowli, obrazowania i automatyzacji oprogramowania16,17,18,19. System ten stanowi zintegrowaną, wysokowydajną alternatywę dla ograniczeń tradycyjnych metod obrazowania. Platforma Beacon składa się z inkubatora z dwutlenkiem węgla (CO2 ) i kontrolowaną temperaturą, który podtrzymuje komórki zawarte na chipie. Chip posiada światłoczułe tranzystory, które generują gradient elektryczny w odpowiedzi na docelowe światło. Ta powstała siła dielektroforetyczna jest wykorzystywana do przesuwania pojedynczych komórek przez chip nanofluidyczny do pożądanych regionów. Komórki są sortowane w długopisy na chipie, które stanowią barierę do fizycznej izolacji poszczególnych komórek. Ciągły laminarny przepływ pożywki wzrostowej przez chip zapobiega migracji komórek z wstrzykiwaczy, umożliwiając jednocześnie dyfuzję składników odżywczych i odczynników specyficznych dla eksperymentu na małe cząsteczki. Mikroskop fluorescencyjny znajduje się nad chipem. Automatyzacja oprogramowania służy do przechwytywania obrazów chipa w określonym przez użytkownika punkcie czasowym.

Cała charakterystyka komórek została przeprowadzona przy użyciu systemu optofluidycznego do selekcji i manipulacji pojedynczych komórek. System ten składa się ze zintegrowanych komponentów mechanicznych, mikroprzepływowych i optycznych, które umożliwiają manipulację pojedynczymi komórkami, testy, hodowle i obrazowanie. Komórki są ładowane i hodowane na jednorazowym urządzeniu nanofluidycznym składającym się z 3500 indywidualnych komór (długopisów), z których każda jest w stanie pomieścić objętość poniżej nanolitra. Komórki można umieszczać w kojcach za pomocą indukowanych światłem "klatek" dielektroforetycznych i hodować w warunkach kontrolowanych przez temperaturę i CO2 . Mikrofluidyka umożliwia perfuzję pożywek lub na chipie w celu hodowli komórkowej lub leczenia farmakologicznego. Uruchamiana igła pozwala na import i eksport komórek z inkubowanych i zamkniętych płytek studzienkowych. Obszar chipa może być obrazowany przy 4-krotnym lub 10-krotnym powiększeniu w kanałach jasnego pola i fluorescencyjnych (w tym DAPI, FITC, TRed lub Cy5) w celu scharakteryzowania fenotypów komórkowych lub analizy funkcjonalnej. Cały system jest zautomatyzowany za pomocą oprogramowania, które można wykorzystać do wstępnie zaprojektowanych przepływów pracy lub niestandardowych eksperymentów.

Związki między zakażeniem HIV-1 a P2XR zostały zbadane, ale nie zgłoszono procedury o wysokiej przepustowości, która bezpośrednio charakteryzowałaby te interakcje równolegle. W tym miejscu autorzy opisują metodologię badania interakcji HIV-P2XR poprzez śledzenie ostrego napływu wapnia i późniejszej infekcji produktywnej HIV-1 na poziomie pojedynczej komórki. Warto zauważyć, że w ten sposób powstało nowatorskie narzędzie, które pozwala na bezpośredni, wysokoprzepustowy, podłużny pomiar wielu celów w pojedynczych komórkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek do obrazowania

  1. Przygotuj świeży roztwór ładujący Fluo-4 AM: Dodaj 25 μl 100x stężonego rozpuszczalnika detergentowego, a następnie dodaj 2,5 μl Fluo-4 AM 1000x do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować do mieszania.
  2. Odpipetować pipetą 2,5 ml pożywki hodowlanej do roztworu ładującego i odwrócić do wymieszania. Chronić przed światłem.
  3. Odwirować 2 x 106 komórek MT-4 przy 500 x g przez 3 min.
  4. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić osad w 2 ml przygotowanego roztworu ładującego Fluo-4 AM. Chronić przed światłem.
  5. Pipetą zawiesić komórki na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15-30 minut, a następnie inkubować przez dodatkowe 15-30 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej. Odwirować komórki o sile 500 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant składający się z roztworu ładującego.
  7. Zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie w 1 ml pożywki hodowlanej i odwirować przy 500 x g przez 3 minuty w celu przemycia.
  8. Zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie w pożywce hodowlanej o stężeniu 2 x 106 komórek/ml (minimum 50 μl). Chronić przed światłem.

2. Przygotowanie systemu optofluidycznego, ładowanie komórek i zapisywanie komórek

  1. Przygotuj chip z roztworem zwilżającym, który ułatwia zagrodowanie komórek.
    1. Aby to zrobić, załaduj probówki wirówkowe zawierające 2 ml roztworu zwilżającego i 50 ml wody DI na instrument z nowym chipem optofluidycznym i uruchom funkcję Wet Chip. Ta funkcja automatycznie zaleje chip roztworem zwilżającym przez płyny systemu, inkubuje chip w temperaturze 50 °C i przepłukuje chip wodą 3 razy.
    2. Po zakończeniu płukania wodą przepłucz chip 3 cyklami po 250 μl pożywki hodowlanej.
  2. Uzupełnij zawiesinę komórek z kroku 1.8 substancją rozpuszczoną detergentu F-127 w stosunku 1:100 przed załadowaniem, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo przywierania komórek do kanałów chipowych.
  3. Użyj igły do eksportu instrumentu, aby zaimportować komórki z probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą operacji Load i Import małej objętości dla objętości opakowania komórek o objętości 5 μl.
  4. Ogniwa pióra wykorzystujące zoptymalizowane napięcie pozycjonowania optoelektronicznego (OEP) 4,3 V i prędkość klatki 5 μm/s. Pisanie odbywa się przy użyciu OEP. Zakończ pisanie za pomocą funkcji Autopen, która automatycznie wykryje pojedyncze komórki, otoczy je klatką OEP i przeniesie je do pobliskiego pióra. Jeśli interesujące komórki pozostają po automatycznym zapisywaniu, użyj funkcji Pióro ręczne, aby zaznaczyć komórki docelowe (za pomocą kliknięcia myszą) i pióro docelowe (po kolejnym kliknięciu myszą).
  5. Po zakończeniu wstrzykiwania (albo po zakończeniu funkcji automatycznego wstrzykiwania, albo po osiągnięciu żądanej liczby wstrzykiwanych komórek), przepłucz chip 3 cyklami po 250 μl pożywki hodowlanej, aby usunąć z chipa wszelkie pozostałe niezapisane komórki.

3. Zakażenie pojedynczymi komórkami i obrazowanie funkcjonalne

  1. Po napisaniu komórek uzyskaj obrazy fluorescencyjne komórek w kanałach FITC, Texas Red i DAPI, aby zmierzyć podstawowe Fluo-4, mCherry i autofluorescencję.
  2. Wlać HIV-1 do mikroczipa w stężeniu 13 ng HIV-1 NL-CI na 2 x 106 komórek, powoli pipetując zawiesinę do chipa przez igłę eksportową.
  3. Natychmiast po dodaniu wirusa HIV-1 należy wielokrotnie uzyskiwać obrazy w kanałach FITC i DAPI w ciągu 10 minut.
  4. Uzyskaj obrazy w kanałach Texas Red i DAPI po 1, 2, 3 i 4 dniach po infekcji (DPI).

4. Analiza danych obrazowania funkcjonalnego pojedynczej komórki za pomocą oprogramowania FIJI

  1. W każdym punkcie czasowym w każdym kanale obrazowania będącym przedmiotem zainteresowania użyj narzędzia FIJI Point Selection i funkcji Measure, aby zmierzyć sygnały Fluo-4, mCherry i autofluorescencji każdej komórki. Jednocześnie zmierz fluorescencję tła, obliczając średnią intensywność fluorescencji (MFI) pióra i chipa zawierających każdą komórkę.
  2. Kontroluj fluorescencję tła i autofluorescencję za pomocą funkcji Measure w celu znalezienia MFI w wyborze regionu i odjęcia tej wartości od wartości fluorescencji komórki.
  3. Znormalizuj fluorescencję tła każdego obrazu chipa: Zmierz MFI chipa w każdym polu. Następnie odejmij MFI chipa o najmniejszej fluorescencji tła od wszystkich innych pomiarów MIF chipa.
  4. Znormalizuj fluorescencję tła każdego pióra zawierającego komórkę: zmierz MFI pisaka każdej komórki w każdym polu widzenia. Następnie odejmij tę wartość od nieprzetworzonego MFI komórki dla każdego pola.
  5. Kontrola autofluorescencji komórek: Odejmij MIF dnia 0 i dnia 4 DAPI każdej komórki od mF mF dnia 0 i dnia 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 ilustruje format chipa i surowe dane obrazowe uzyskane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Identyfikacja i grupowanie niezakażonych i zakażonych komórek za pomocą pomiaru mCherry pokazano na rysunku Rysunek 2. Klastry te są analizowane pod kątem kinetyki napływu wapnia w Rysunek 3, który pokazuje wczesny napływ wapnia do komórek zakażonych wirusem HIV. Rysunek 4 pokazuje znaczącą dodatnią korelację między nap...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana metodologia badania związku między napływem wapnia a produktywnym zakażeniem HIV-1 w pojedynczych komórkach może być dostosowana do badania wewnątrzkomórkowej kinetyki wapnia w odpowiedzi na innych agonistów lub antagonistów będących przedmiotem zainteresowania. Przygotowanie komórek do obrazowania jest proste, minimalnie czasochłonne, a odczynniki dostępne są w wygodnych zestawach od powszechnie stosowanych producentów. Pomiar wapnia na bazie fluo-4 jest dobrze opisany w literaturze, a HIV-1 można łatwo zastąpić...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.P.S. jest pracownikiem firmy Sema4. Pozostali autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za naukowe dyskusje z dr Benjaminem Chenem. Praca ta została sfinansowana przez K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS i KB) oraz R21AI152833 (THS i KB).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Beacon Optofluidic SystemBerkeley Lights
  Surowica bydlęca płoduGibco
  FIDŻIOprogramowanie Open-sourcePMID: 22743772, 22930834
  Zestaw do obrazowania wapnia Fluo-4Thermo Fisher  F10489
  HIV-1 NLCINL4-3Laboratorium Benjamina ChenaPMID: 28148796
  Hyclone Pennecillin Streptomycyna roztwórGE Healthcare Nauki przyrodnicze  SV30010
  Komórki MT-4Odczynnik  ARP-120
  Układ OptoSelect 3500Berkeley Lights
  Końcówki do pipetDenville Scientific  P3020-CPS&
nbsp; Prism 9.0.0GraphPad
  RPMI-1640 ŚredniSigma-Aldrich  R8758
Pipety serologicznemarki Fisher  13-678-11E Kaptur do hodowli
tkanekRóżne modele
kolb T75Corning3073
NIH AIDS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
  2. Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
  3. Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585(2015).
  4. Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
  5. Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
  6. Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
  7. Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186(2019).
  8. Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
  9. Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
  10. Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
  11. Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
  12. Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
  13. Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  14. He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
  15. Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425(2017).
  16. Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010(2018).
  17. Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247(2020).
  18. Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41(2018).
  19. Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
  20. Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692(2019).
  21. Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074(2018).
  22. Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza pojedynczych kom rekobrazowanie ywych kom rekmikroskopia fluorescencyjnaurz dzenie nanofluidycznekom rki MT 4wirus reporterowysygnalizacja kom rkowa

Powiązane artykuły