Pobieranie próbek ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej techniką mini liposukcji

Summary

Rękopis i związane z nim wideo demonstrują technikę biopsji przezskórnej w celu uzyskania próbek podskórnej tkanki tłuszczowej z obszarów otaczających pępek. Metoda ta jest mało ryzykownym i skutecznym sposobem badania szeregu parametrów (np. ekspresji genów lub białek, aktywności enzymów, zawartości lipidów) w tkance tłuszczowej.

Abstract

Badania nad tkanką tłuszczową są przydatne w zrozumieniu zaburzeń metabolicznych i innych. Dostępna jest ludzka podskórna tkanka tłuszczowa. Dzięki odpowiedniemu przeszkoleniu i ścisłemu przestrzeganiu techniki aseptycznej, podskórne próbki tkanki tłuszczowej mogą być bezpiecznie i skutecznie pozyskiwane przez naukowców w warunkach nieklinicznych. Po podaniu znieczulenia miejscowego bocznie do pępka, przez skórę do tkanki podskórnej wprowadza się igłę o sile 14 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml. Pod wpływem zasysania strzykawka jest przesuwana ruchem posuwisto-zwrotnym, tnącym w celu wyizolowania fragmentów tkanki tłuszczowej. Wycofanie tłoka wystarczy, aby fragmenty tkanki tłuszczowej zostały zassane przez igłę do strzykawki. Z pojedynczej biopsji można pobrać około 200 mg tkanki. Ta technika biopsji jest bardzo bezpieczna zarówno dla uczestników, jak i personelu badawczego. Po biopsji uczestnicy mogą wznowić większość codziennych czynności, chociaż powinni unikać pływania i nadmiernie forsownych czynności przez 48 godzin, aby uniknąć nadmiernego krwawienia. Uczestnicy mogą bezpiecznie przejść 2 biopsje w ciągu jednego dnia, co oznacza, że technika ta może być stosowana w badaniach przed i po ostrej interwencji.

Introduction

Tkanka tłuszczowa może dostarczyć użytecznych informacji na temat funkcji metabolicznych człowieka. Ludzka podskórna tkanka tłuszczowa jest łatwo dostępna. Technika podskórnego usuwania tkanki tłuszczowej została po raz pierwszy opisana w połowie lat 80. XX wieku¹; Od tego czasu początkowy protokół został ulepszony w celu zwiększenia wydajności i poprawy tolerancji uczestników badania. Podskórną tkankę tłuszczową można pozyskać z wielu miejsc, najczęściej z glutei¹ oraz brzucha². Próbki z tych ostatnich mogą być bardziej pożądane, ponieważ dostarczają cenniejszych informacji w kontekstach związanych z chorobami metabolicznymi³.

Podskórna biopsja tkanki tłuszczowej przy użyciu metody mini-liposukcji może być bezpiecznie i efektywnie przeprowadzona w warunkach nieklinicznych. Po odpowiednim przeszkoleniu przez certyfikowanego lekarza i zastosowaniu ścisłej techniki aseptyki, badacze mogą rutynowo wykonywać te biopsje przy minimalnym ryzyku zarówno dla uczestnika, jak i badaczy. Zespół biopsyjny musi składać się z co najmniej 2 osób: osoby, która będzie wykonywać biopsję i asystenta.

Osoba odpowiedzialna za biopsję ma za zadanie potwierdzić tożsamość uczestnika, sprawdzić, czy uczestnik może bezpiecznie przejść procedurę (zobacz kroki protokołu 2.1-2.4 poniżej), upewnić się, że uczestnik czuje się komfortowo przez cały czas trwania procedury, zapewnić utrzymanie sterylności techniki przez cały czas trwania zabiegu, przeprowadzić procedurę oraz zapewnić uczestnikowi ustne i pisemne procedury po zabiegu. Rolą asystenta jest obsługa i szybkie przetwarzanie uzyskanej tkanki tłuszczowej do późniejszej analizy i/lub przechowywania. Asystent pomaga również, będąc "niesterylnymi rękami" i dbając o to, aby uczestnik czuł się swobodnie przez cały czas trwania zabiegu. Celem tego filmu i artykułu jest opisanie procedury biopsji krok po kroku w celu bezpiecznego pobrania podskórnej tkanki tłuszczowej z okolicy brzucha.

Protocol

UWAGA: Komitet ds. Badań Inwazyjnych lub Klinicznych Uniwersytetu w Stirling zatwierdził procedurę biopsji opisaną poniżej. Wszystkie badania naukowe z zastosowaniem tej procedury muszą zostać zatwierdzone przez odpowiednią niezależną komisję etyczną. Osoba wykonująca biopsję musi ukończyć formalne szkolenie w zakresie opisanej techniki zgodnie z wymaganiami swojej instytucji. Zazwyczaj wiąże się to z obserwacją demonstracji opisanej techniki biopsji tkanki tłuszczowej przez certyfikowanego lekarza, a następnie nadzorowaną praktyką. Gdy stażysta wykona 10 próbnych biopsji tkanki tłuszczowej na ochotnikach pod nadzorem, zostaną oni zbadani przez certyfikowanego lekarza, aby zapewnić dobrą wiedzę i praktykę procedury. Następnie certyfikowany lekarz przekazuje osobie podpisany formularz badania.

1. Przygotowanie pomieszczenia laboratoryjnego

1. Upewnij się, że laboratorium ma odpowiednio prywatne pomieszczenie z czystymi, nieporowatymi powierzchniami, które można wycierać, oraz czystym, wygodnym (najlepiej nieporowatym) łóżkiem, na którym uczestnik może leżeć na wznak. Oczyść wszystkie wymagane powierzchnie do procedury biopsji za pomocą sprayu 70% etanolu i czystych ręczników papierowych. W razie potrzeby zapewnij czyste poduszki lub poduszki, aby podeprzeć uczestnika.
2. Odpowiednie pojemniki na ostre przedmioty i worki na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne należy przechowywać w łatwo dostępnym miejscu miejsca, w którym wykonywana jest biopsja, oraz w łatwym zasięgu osoby wykonującej biopsję.
3. Przygotuj sprzęt wymagany do zabiegu i ustaw go na świeżo wyczyszczonym wózku medycznym przed przybyciem uczestnika do laboratorium (Rysunek 1). Pełna lista wymaganych materiałów eksploatacyjnych znajduje się w tabeli materiałów.

2. Przygotowanie uczestników

1. Należy dopilnować, aby wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed poddaniem się procedurze zgodnie z protokołami wymaganymi przez niezależną komisję etyczną instytucji. Dodatkowo poproś uczestników o wypełnienie pisemnego kwestionariusza, aby upewnić się, że nie są uczuleni na żadne materiały użyte podczas zabiegu (a mianowicie nikiel, chrom, środek znieczulający miejscowo, jod, skorupiaki i plastry).
2. Potwierdź tożsamość uczestnika. Upewnij się, że uczestnik rozumie procedurę, która ma zostać przeprowadzona, i potencjalne skutki uboczne, w tym siniaki, ból i infekcję (Tabela 1). Zbierz ustną zgodę oprócz wcześniej uzyskanej pisemnej świadomej zgody.
3. Opisz uczestnikowi, w jaki sposób zostanie przeprowadzona procedura, z naciskiem na to, jak będzie się czuło podanie środka znieczulającego i sama biopsja. Upewnij się, że uczestnik czuje się komfortowo z kontynuacją.
   UWAGA: Miejscowe znieczulenie podskórne spowoduje uczucie pieczenia, podobne do krótkotrwałego użądlenia pszczoły. Wielu uczestników zgłasza podanie środka znieczulającego jako najbardziej nieprzyjemną część techniki. Gdy znieczulenie zacznie działać, uczestnik powinien odczuwać nie więcej niż lekkie uczucie szarpania podczas biopsji.
4. Upewnij się, że uczestnik nie ma alergii na środek znieczulający miejscowo (szczególnie z rodzaju aminoamidu, jeśli używasz lidokainy lub podobnego), niektórych metali (niklu i chromu) i skorupiaków (jeśli używasz roztworów na bazie jodu). Dodatkowo upewnij się, że uczestnicy nie przyjmują żadnych leków przeciwzakrzepowych.
5. Zapewnij uczestnikowi możliwość opróżnienia pęcherza, jeśli jest to wymagane, aby upewnić się, że nie musi przerywać procedury ani odczuwać nadmiernego dyskomfortu w kroku 4.1.

3. Procedura biopsji - instrukcje dla osoby wykonującej biopsję

1. Gdy uczestnik leży w pozycji leżącej, zidentyfikuj miejsce biopsji około 5-10 cm z boku pępka.
   UWAGA: Jeśli uczestnik ma przejść wiele biopsji tego samego dnia, zidentyfikuj miejsca biopsji po przeciwnych stronach pępka dla każdej biopsji. Zapewni to maksymalną odległość między każdym miejscem biopsji.
2. Umyj ręce mydłem i ciepłą wodą zgodnie ze standardowymi wytycznymi medycznymi⁴.
3. Umieść sterylny arkusz na oczyszczonym wózku lub obszarze roboczym, uważając, aby dotykać tylko zewnętrznych krawędzi arkusza.
4. Załóż sterylne rękawice chirurgiczne, stosując odpowiednią technikę aseptyczną. Poproś asystenta, aby otworzył resztę sprzętu w taki sposób, aby upuścił go na przygotowany sterylny arkusz bez dotykania/zanieczyszczania sprzętu. Upewnij się, że asystent uważa, aby nie dotykać przedmiotów podczas wyjmowania narzędzi ze sterylnego opakowania.
5. Poinstruuj asystenta, aby dozował niewielką ilość roztworu na bazie jodu na sterylną gazę (bez nadmiernego nasycania gazy) na powierzchni roboczej.
6. Wysterylizuj około 5-10^cm2 wokół wybranego miejsca biopsji za pomocą sterylnej gazy i roztworu na bazie jodu. Upewnij się, że skóra jest oczyszczona ruchem spiralnym, przesuwając się na zewnątrz od proponowanego miejsca biopsji. Powtórz procedurę czyszczenia skóry dwukrotnie. Usuń nadmiar płynu (np. spływający ze sterylnego obszaru), wycierając świeżą sterylną gazą.
7. Wraz z asystentem potwierdź ustnie zawartość fiolki ze środkiem do znieczulenia miejscowego (2% lidokainy w tym protokole) i czy mieści się ona w upływie terminu ważności. Poinstruuj asystenta, aby trzymał otwartą fiolkę do góry dnem i nabrał 5 ml znieczulenia miejscowego do strzykawki za pomocą igły 21 G. Wyrzucić igłę do pojemnika na ostre przedmioty i upewnić się, że strzykawka jest wolna od pęcherzyków powietrza.
8. Przyłożyć igłę 26 G do strzykawki i usunąć pęcherzyki powietrza. Delikatnie uszczypnij skórę brzucha i tkankę tłuszczową, odsuwając ją od ściany brzucha. Następnie wprowadzić igłę poziomo do tkanki podskórnej pod kątem nie większym niż 10° w stosunku do powierzchni skóry.
   1. Pobrać tłok strzykawki o dodatkowe 0,5 ml (aby upewnić się, że igła nie znajduje się w naczyniu krwionośnym). Jeśli w strzykawce pojawi się krew, należy wyjąć igłę i ponownie wprowadzić ją pod innym kątem.
   2. Podnieś pęcherzyk o średnicy 2-4 mm, aby znieczulić obszar wprowadzania.
   3. Wsuń igłę do tkanki podskórnej i podaj ~1 ml lidokainy w kształcie wachlarza (Rysunek 2), uważając, aby wyjąć tłok za każdym razem przed wstrzyknięciem środka znieczulającego.
   4. Wyjmij i wyrzuć igłę 26 G, przyłóż igłę 21 G do strzykawki, usuń wszelkie pęcherzyki powietrza i podaj pozostałe ~4 ml lidokainy w kształcie wachlarza (Rysunek 2), uważając, aby wyjąć tłok za każdym razem przed wstrzyknięciem środka znieczulającego.
9. Odczekaj około 5 minut, aż zacznie działać znieczulenie miejscowe. Użyj sterylnego skalpela, aby delikatnie szturchnąć obszar biopsji, aby i) upewnić się, że znieczulenie miejscowe zadziałało i ii) zidentyfikować granice znieczulonego obszaru. W razie potrzeby odczekaj dodatkową minutę lub dwie i ponownie oceń.
10. Po upewnieniu się, że znieczulenie miejscowe działa, delikatnie uszczypnij skórę i tkankę tłuszczową (jak w kroku 3.8) i użyj sterylnego skalpela, aby wykonać małe 1-2 mm nakłucie w skórze.
    UWAGA: Musi być tylko wystarczająco duża, aby ułatwić wprowadzenie igły 14 G i musi być na tyle mała, aby nie był wymagany szew do jej zamknięcia. Od tego momentu często dochodzi do krwawienia, które można opanować za pomocą kawałka sterylnej gazy.
11. Najpierw przyłóż igłę 14 G do strzykawki o pojemności 5 lub 10 ml. Następnie, delikatnie ściskając skórę i tkankę tłuszczową, stopniowo wprowadzać igłę przez nakłucie w tkankę tłuszczową mniej więcej centralnie w obszarze znieczulanym i pod kątem nie większym niż 10° w stosunku do powierzchni skóry.
    UWAGA: We wszystkich przypadkach przesunięcia igły w kroku 3.11 należy zachować kąt strzykawki nie większy niż 10°.
    1. Zastosować ssanie, wycofując tłok do oznaczenia około 2,5 ml. Wykonaj biopsję, przesuwając igłę szybkim ruchem do tyłu i do przodu, aby przeciąć fragmenty tkanki tłuszczowej. Po około 30 sekundach przekręcić igłę i strzykawkę pod kątem 90° i powtórzyć tę procedurę, aby rozbić fragmenty tkanki tłuszczowej, które są następnie odsysane do strzykawki przez odsysanie.
       UWAGA: Można używać strzykawek o innych rozmiarach. Istotne jest, aby badacz wybrał rozmiar strzykawki, który pozwala zarówno na dobry chwyt strzykawki, jak i na wygodne utrzymanie chowania tłoka w celu utrzymania podciśnienia. Dostępne są strzykawki blokujące, które utrzymują podciśnienie, co może poprawić kontrolę igły i zmniejszyć odczuwalną trudność dla biopsysty ⁵.
    2. Po około 45-60 s kroku 3.11.1 wyjąć igłę i opróżnić zawartość strzykawki na warstwę gazy przykrywającą łódkę wagową. Upewnij się, że światło igły jest skierowane w dół, aby uniknąć potencjalnego rozpryskiwania krwi.
    3. Powtórz kroki 3.11.1 i 3.11.2 maksymalnie 3 razy. Sprawdź, czy uczestnik jest zadowolony z kontynuowania przed każdym powtórzeniem powyższej procedury.
    4. Wykonując czynności 3.11.1 i 3.11.2, poinstruuj asystenta, aby przetworzył i przygotował próbki do analizy/przechowywania (patrz sekcja 5).

4. Procedura po biopsji

1. Po uzyskaniu zadowalającej próbki (tj. ~200 mg) tkanki tłuszczowej, umieść 1-2 warstwy sterylnej gazy na ranie kłutej, a następnie umieść na nich okład z lodu i mocno uciskaj przez około 10 minut, aby wywołać hemostazę.
2. Po wystąpieniu hemostazy należy zetrzeć roztwór jodu/zaschniętą krew jałową gazą i przykleić do miejsca nałożenie adhezyjnego opatrunku z wkładką chłonną. Sprawdź, czy uczestnik czuje się dobrze i przekaż ustne i pisemne instrukcje dotyczące opieki nad pacjentem w miejscu biopsji.
   1. Podkreśl, że uczestnicy prawdopodobnie będą wykazywać siniaki przez kilka następnych dni. Poinformuj ich, że może to być znaczne, chociaż jest zminimalizowane przez okład lodowy w kroku 4.1 i ustąpi bez trwałych skutków.
   2. Zalecić, aby w przypadku odczuwania dyskomfortu/bólu po ustąpieniu znieczulenia, uczestnicy przyjmowali leki przeciwbólowe, takie jak paracetamol, postępując zgodnie z instrukcjami na opakowaniu, ale powstrzymali się od przyjmowania leków przeciwbólowych, które mają działanie przeciwzakrzepowe (np. ibuprofen lub aspiryna).
   3. Wyjaśnij, że obrzęk, zaczerwienienie lub wydzielina z miejsca biopsji wskazują na zakażenie. W mało prawdopodobnym przypadku wystąpienia tych oznak lub objawów, poinstruuj uczestnika, aby pilnie zasięgnął porady lekarza lub lokalnej jednostki pogotowia ratunkowego. Poinformuj uczestnika, że jeśli zwróci się o poradę lekarską, musi również powiadomić o tym zespół badawczy.
      UWAGA: Jako personel badawczy ani osoba wykonująca biopsję, ani asystent nie mogą udzielać porad medycznych ani leczenia; Ważne jest jednak, aby zespół badawczy był świadomy i rejestrował wszystkie przypadki powikłań wynikających z procedury biopsji.
   4. Zaleca, aby uczestnicy unikali pływania lub nadmiernie forsownej aktywności przez 48 godzin, aż do zamknięcia miejsca nacięcia.
3. Wszelkie zużyte ostre przedmioty i zanieczyszczone materiały należy usunąć do wyznaczonych pojemników na ostre przedmioty i/lub pojemniki na odpady kliniczne.
4. Oczyść wszystkie powierzchnie używane w procedurze biopsji za pomocą sprayu 70% etanolu i czystych ręczników papierowych. Jednorazowe i jednorazowe elementy pościeli należy umieścić odpowiednio w odpowiednich torbach klinicznych do utylizacji lub czyszczenia.

5. Przetwarzanie próbek - instrukcje dla asystenta

1. Użyj sterylnej pęsety i 0,9% soli fizjologicznej, aby spłukać próbkę tkanki tłuszczowej w celu usunięcia widocznych zanieczyszczeń (tj. krwi, naczyń krwionośnych). Następnie należy zważyć próbki tkanki tłuszczowej za pomocą wagi cyfrowej. Podziel tkankę na kawałki o odpowiedniej wielkości do dalszej analizy i umieść je w odpowiednich probówkach do przechowywania za pomocą sterylnej pęsety. Zanurzyć probówki zawierające biopsje tkanki tłuszczowej w ciekłym azocie w temperaturze -190 °C w celu błyskawicznego zamrożenia do momentu, gdy próbki będą przechowywane w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Asystent musi zakończyć przetwarzanie próbki tak szybko, jak to możliwe, zwykle w ciągu 3 minut od aspiracji próbki, aby zminimalizować potencjalną degradację próbki.

Results

Opisana procedura biopsji tkanki tłuszczowej jest skuteczną i mało ryzykowną techniką dla badaczy, aby uzyskać podskórne próbki tkanki tłuszczowej od ludzkich ochotników. Wykonano 39 biopsji podskórnej tkanki tłuszczowej opisaną procedurą u 11 zdrowych kobiet o prawidłowej masie ciała (wiek 27,4 ± 3,3 roku; wskaźnik masy ciała (BMI) 22,6 ± 1,5 kg/^m2). Wszyscy uczestnicy uczęszczali do laboratorium między 07:00 a 10:00 po 8-12 godzinnym okresie postu. Wydajność próbki przy użyciu tej procedury biopsji tkanki tł...

Discussion

Opisany protokół i towarzyszący mu film zawierają przegląd krok po kroku techniki mini-liposukcji w celu uzyskania podskórnych próbek tkanki tłuszczowej z okolicy brzucha. Ta grupa badawcza wykonała łącznie 124 biopsje w ciągu 19 miesięcy, bez żadnych działań niepożądanych u uczestników. Procedura jest bezpieczna i wiąże się z minimalnym ryzykiem dla uczestników lub zespołu biopsyjnego, pod warunkiem przestrzegania opisanych środków bezpieczeństwa. Technika aseptyczna (w tym otwieranie i wydawanie sterylnego sprzętu bez ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pozycja: Igła 14 G 14 G x 3 1/8" 210 mm x 80 mm	B Braun	4665473	Na biopsję: 1
Pozycja: Igła 21 G 21 G x 1 1/2" 0,8 mm x 38 mm	Terumo	AN*2138R1	Na biopsję: 2
Pozycja: 26 G  igła 26 G x 1/2" igła mikrolance 0,45 mm x 13 mm	BD	303800	Na biopsję: 2
Pozycja: 5 ml strzykawka 5 ml luer	DB plastipak	302187	Na biopsję: 2
Pozycja: Adhezyjny opatrunek na rany Opsite Opatrunek pooperacyjny 9,5 x 8,5	Smith & Siostrzeniec	6600709	Na biopsję: 1
Pozycja: Jednorazowy sterylny skalpel Jednorazowy sterylny skalpel Ostrze nr 10	Swann Morton	/0501	Na biopsję: 1
Pozycja: Icepack BlueDot Opakowanie wielokrotnego użytku na gorąco / na zimno 26,5 cm x 13,0 cm	NuCare	F711	Na biopsję: 1
Pozycja: Antyseptyczny środek antyseptyczny na bazie jodu Roztwór antyseptyczny Videne	Ecolab Videne	3030440	Per biopsja: q.s
Pozycja: Lidokaina 2% bez epinefryny Lidokaina 2% do wstrzyknięcia 5 ml	B Braun	3558553	Na biopsję: 5 ml
Pozycja: Rękawiczki niesterylne Wrażliwe bezpudrowe rękawice nitrylowe Starguard		SG-N-S	Na biopsję: para
Pozycja: Chlorek sodu 0,9% Chlride sodu 0,9% w/v wlew dożylny BP	BBraun	S8004-5384	Na biopsję: q.s.
Pozycja: Roztwór stabilizacyjny* Roztwór stabilizujący RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	Na biopsję: q.s
Pozycja: Sterylne kleszcze Sterylne kleszczyki	Rocialle	RML109-006	Na biopsję: 1
Pozycja: Sterylne waciki z gazy Waciki włókninowe sterylne 7,5 x 7,5 cm	Prestige	1860	Na biopsję: 5
Pozycja: Sterylne rękawice Prestiżowe sterylne bezpudrowe rękawice medyczne z miękkiego winylu	Prestige	S: P4301 M:P3302 L:P3301	Na biopsję: para
Pozycja: Sterylne probówki do mikrowirówek 1,5 ml sterylne probówki do mikrowirówek	StarLab	I1415-5510	Na biopsję: q.s
Pozycja: Sterylny arkusz Papier zwykły biały 90 x 90 cm	Rocialle	RML 126-216	Na biopsję: 1
Pozycja: Łódź do ważenia Łodzie do ważenia w kształcie rombu	Heathrow Scientific	HS1427C	Na biopsję: 1
* oznacza materiały