Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Yoshika Janapala; Katrina Woodward; Jiwon Lee; Melanie Rug; Thomas Preiss; Nikolay E. Shirokikh

doi:10.3791/62639

Artykuł metodologiczny

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

DOI:

10.3791/62639

⸱

25 grudnia 2021

Yoshika Janapala^*¹ , Katrina Woodward^*¹ , Jiwon Lee² , Melanie Rug² , Thomas Preiss¹^,³ , Nikolay E. Shirokikh¹

¹Division of Genome Sciences and Cancer, The John Curtin School of Medical Research, The Australian National University, ²Centre for Advanced Microscopy, The Australian National University, ³Victor Chang Cardiac Research Institute

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybkie reakcje obejmujące szybką redystrybucję informacyjnego(m)RNA i zmiany w translacji mRNA są związane z trwającymi dostosowaniami homeostazy komórek. Dostosowania te mają kluczowe znaczenie dla przeżywalności komórek eukariotycznych i "kontroli uszkodzeń" podczas wahań poziomu składników odżywczych i zasolenia, temperatury oraz różnych stresów chemicznych i radiacyjnych. Ze względu na wysoce dynamiczny charakter odpowiedzi na poziomie RNA oraz niestabilność wielu produktów pośrednich RNA:RNA i RNA:białka, uzyskanie znaczącego obrazu stanu cytoplazmatycznego RNA jest możliwe tylko przy użyciu ograniczonej liczby metod. Eksperymenty z profilowaniem rybosomów w całym transkryptomie i sekwencjonowaniu RNA są jednymi z najbardziej pouczających źródeł danych do kontroli translacji. Jednak brak jednolitej stabilizacji RNA i RNA:białko pośrednie może prowadzić do różnych odchyleń, szczególnie w szybko rozwijających się szlakach odpowiedzi komórkowej. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół szybkiego utrwalania mający zastosowanie do komórek eukariotycznych o różnej przepuszczalności, aby pomóc w stabilizacji RNA i RNA: białko pośrednie. Podajemy również przykłady izolacji stabilizowanych kompleksów RNA:białko w oparciu o ich kosedymentację frakcjami rybosomalnymi i poli(rybo)somalnymi. Oddzielony ustabilizowany materiał może być następnie wykorzystany w ramach eksperymentów typu profilowanie rybosomów, takich jak sekwencjonowanie profilu zespolonego translacji (TCP-seq) i jego pochodne. Wszechstronność metod w stylu TCP-seq została obecnie zademonstrowana przez zastosowanie w różnych organizmach i typach komórek. Ustabilizowane kompleksy mogą być również dodatkowo oczyszczane pod względem powinowactwa i obrazowane za pomocą mikroskopii elektronowej, rozdzielane na różne frakcje poli(rybo)somalne i poddawane sekwencjonowaniu RNA, ze względu na łatwość odwrócenia usieciowania. W związku z tym metody oparte na szybkim schładzaniu i utrwalaniu formaldehydu, a następnie wzbogacaniu w oparciu o sedymentację lub inny rodzaj wzbogacania kompleksu RNA: białko, mogą być szczególnie interesujące w badaniu drobniejszych szczegółów szybkiej dynamiki kompleksu RNA: białko w żywych komórkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywe organizmy podlegają dynamicznym zmianom wewnątrz- i zewnątrzkomórkowym przez całe swoje życie, które wymagają szybkich reakcji, aby utrzymać homeostazę i zapewnić przetrwanie. Aby umożliwić adaptację do środowiska, komórki eukariotyczne dostosowują swój metabolizm poprzez kontrolę ekspresji genów. Kontrola ekspresji genów może być wywierana podczas transkrypcji i/lub translacji; przy czym odpowiedzi translacyjne na ogół następują szybciej¹^,²^,³^,⁴. Na przykład zmiany translacyjne zwykle pojawiają się w ciągu 1-30 minut od wystąpienia stresu, podczas gdy zmiany na poziomie transkrypcji następują kilka godzin po ekspozycji na stres³^,⁴^,⁵. Zmiany w wyniku translacji są osiągane szybciej ze względu na stałą dostępność cząsteczek informacyjnego (m)RNA w cytoplazmie. I odwrotnie, na poziomie transkrypcji nowe cząsteczki mRNA muszą zostać zsyntetyzowane, a u eukariontów przetworzone i wyeksportowane z jądra, powodując znaczne opóźnienia w czasie odpowiedzi²^,⁴^,⁶^,⁷^,⁸.

Ostra reakcja translacyjna na stres charakteryzuje się ogólnym spadkiem wydajności translacji, z selektywną regulacją w górę białek niezbędnych do przeżycia komórki¹^,³^,⁴^,⁹. Uważa się, że zmniejszenie produkcji białka jest kluczowe ze względu na wysoki wydatek energetyczny procesu³^,⁷. Aby ułatwić selektywne hamowanie i regulację w górę, odpowiedzi translacyjne są obsługiwane przez szereg złożonych mechanizmów regulacyjnych. Regulacja może być stosowana we wszystkich fazach translacji: inicjacji, wydłużeniu, zakończeniu biosyntezy polipeptydów i recyklingu rybosomów¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³, ale jest najsilniej widoczna w fazie inicjacji5^,⁷^,⁹^,¹⁰^,¹³. Podczas inicjacji mała podjednostka rybosomalna (SSU), wspomagana przez eukariotyczne czynniki inicjacji (eIFs), wiąże się i skanuje nietranslowany region 5' mRNA mRNA, dopóki nie zostanie rozpoznany kodon start²^,5^,⁶^,⁸^,¹¹^,¹²^,¹³. Mechanizmy regulacyjne często są ukierunkowane na eIF, wpływając na przyłączanie, skanowanie i rozpoznawanie kodonów początkowych. Na przykład czynnik inicjacji eIF2, niezbędny czynnik translacyjny, który pomaga w rekrutacji inicjatora Met-tRNA_i^Met do SSU, jest często ukierunkowany na eukarionty w warunkach stresu⁴^,⁶^,¹¹. U drożdży fosforylacja tego czynnika może być indukowana pod wpływem niedoboru składników odżywczych i stresu osmotycznego¹^,⁴^,¹¹^,¹⁴^,¹⁵, a w komórkach ssaków głód aminokwasów, stres retikulum endoplazmatycznego (ER), stres UV, infekcja wirusowa i zmieniony poziom tlenu mogą wywołać tę reakcję⁸^,⁹^,¹¹. Szybka regulacja w górę specyficznej translacji mRNA jest widoczna w odpowiedzi komórek ssaków na niedotlenienie, która wykazuje globalne hamowanie szybkiej translacji i selektywną regulację w górę biosyntezy czynników indukowanych hipoksją (HIF). HIF są czynnikami transkrypcyjnymi, które następnie wywołują długoterminowe przeprogramowanie komórkowe na poziomie transkrypcji DNA⁸^,⁹^,¹⁶. Podobne reakcje zaobserwowano u drożdży pod wpływem stresu cieplnego, z szybką ekspresją translacyjną białek szoku cieplnego (HSP), po której następują opóźnione odpowiedzi na poziomie transkrypcji¹⁷^,¹⁸. Oprócz niedoboru składników odżywczych i szoku cieplnego, odpowiedzi translacyjne u drożdży badano pod różnymi poziomami tlenu⁸^,¹⁹, zasolenie⁵, fosforan, siarka²⁰^,²¹ i azot²²^,²³ poziomy. Badania te mają szerokie implikacje dla przemysłowych zastosowań drożdży, takich jak pieczenie i fermentacja²⁴^,²⁵. Odpowiedzi translacyjne mogą być również pomocne w pogłębianiu wiedzy na temat chorób, takich jak zaburzenia neurodegeneracyjne i choroby serca, które charakteryzują się stresami wewnątrzkomórkowymi, takimi jak stres oksydacyjny. Ogólnie rzecz biorąc, odpowiedzi translacyjne są integralną częścią kontroli ekspresji genów i ułatwiają szybką adaptację do szerokiego zakresu warunków stresowych w organizmach eukariotycznych.

Aby badać odpowiedzi tłumaczeniowe, potrzebne są metody, które dostarczają minimalnie zniekształconych migawek krajobrazu tłumaczeniowego. Profilowanie polisomów to klasyczne podejście stosowane w badaniu translacji przez mRNA, polegające na rozdzielaniu poli(rybo)somalnych frakcji mRNA poprzez ultrawirowanie przez gradienty sacharozy²⁶^,²⁷. Podejście to może być wykorzystane do zbadania poziomów translacji dla poszczególnych mRNA (za pomocą metod wykrywania, takich jak odwrotna transkrypcja i reakcja łańcuchowa polimerazy, RT-PCR²⁶) lub globalnie w połączeniu z technikami wysokoprzepustowymi (mikromacierz lub sekwencja RNA²⁸^,²⁹). Bardziej rozwiniętym podejściem jest profilowanie rybosomów, które umożliwia badanie pozycji wydłużających się rybosomów wzdłuż cząsteczki mRNA w skali całego genomu, a także wnioskowanie o wydajności translacji w transkryptomie i wykorzystaniu głównych i alternatywnych miejsc startowych³⁰^,³¹. Profilowanie rybosomów polega na izolacji i sekwencjonowaniu fragmentów mRNA chronionych przez rybosomalną obecność nad nimi. Profilowanie rybosomów dostarczyło istotnych informacji na temat dynamiki translacji w wielu warunkach, w tym w stresie hipoksyjnym, szoku cieplnym i stresie oksydacyjnym³¹^,³². Technika ta została dostosowana do wielu rodzajów materiałów źródłowych, w tym komórek drożdży i ssaków.

Podczas gdy profilowanie polisomów i rybosomów miało fundamentalne znaczenie dla rozszerzenia możliwości badań nad translacją, proces translacji obejmuje różne pośrednie produkty translacyjne i kompleksy, które są trudne do uchwycenia tymi metodami¹¹^,¹³. Dodatkowym ograniczeniem jest brak możliwości badania typów szybkiej reakcji, ponieważ kompleksy translacyjne są albo stabilizowane in vivo przez dodanie specyficznych inhibitorów translacji (antybiotyków), co prowadzi do pewnych artefaktów dystrybucji rybosomów, albo ex vivo po lizie komórek specyficznie (antybiotyki) lub niespecyficznie (wysoka zawartość soli lub jonów magnezu), co prowadzi do pozbawienia krótkotrwałych lub mniej stabilnych produktów pośrednich³³^,³⁴^,³⁵.

Formaldehyd jest powszechnie stosowany do sieciowania kwasów nukleinowych i białek, np. w badaniach immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i immunoprecypitacji sieciowania (CLIP). Jego niewielkie rozmiary i doskonała przepuszczalność komórek pozwalają na szybkie działanie in vivo³⁶. Opierając się na szybkim sieciowaniu formaldehydu, podejście do profilowania rybosomów zostało rozszerzone o sekwencjonowanie profilu złożonego translacji (TCP-seq)¹⁰^,³⁶^,³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰. TCP-seq, po raz pierwszy opracowany w drożdżach, umożliwia przechwytywanie wszystkich produktów pośrednich, w tym skanowania lub po terminacji kompleksów SSU i wielu konfiguracji rybosomalnych³⁷^,³⁸^,⁴¹^,⁴². Metoda ta została wykorzystana w kilku badaniach¹⁰^,³⁸^,³⁹^,⁴¹^,⁴², z których niektóre wykorzystują podejście kombinacyjne zarówno inhibitorów translacji, jak i sieciowania formaldehydu, aby ułatwić zatrzymanie translacji. Kolejna zmodyfikowana wersja techniki, selektywna TCP-seq³⁹, została niedawno zastosowana w celu uwzględnienia immunooczyszczania usieciowanych kompleksów, poszerzając zakres zastosowań TCP-seq. Szybka, wydajna i odwracalna natura sieciowania formaldehydu sprawia, że podejścia te są odpowiednie do badania przejściowych interakcji kompleksu mRNA:translacja, szczególnie w kontekście wysoce dynamicznych szlaków odpowiedzi na poziomie translacji.

Tutaj szczegółowo opisujemy procesy sieciowania formaldehydu in vivo w celu kompleksowej translacji, kompleksowej stabilizacji i izolacji. Udostępniamy osobne protokoły zniuansowane dla komórek drożdży i ssaków (Rysunek 1). Dalej przedstawiamy przykłady późniejszego zastosowania materiału stabilizowanego usieciowaniem (Rysunek 1), takie jak wykrywanie współoczyszczonych czynników białkowych za pomocą immunoblottingu (western-blotting), oczyszczania wspomaganego immunologicznie (lub 'immunoprecypitacji'; IP) oraz wzbogacanie kompleksów translacyjnych zawierających specyficzne czynniki będące przedmiotem zainteresowania, mikroskopia elektronowa i sekwencjonowanie RNA.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat przedstawiający przegląd typowego zestawu eksperymentalnego. Główne etapy stabilizacji kompleksów translacyjnych formaldehydem in vivo przedstawiono w postaci schematu blokowego, uzupełnionego informacjami o kluczowych niezbędnych instrumentach. Przedstawiono potencjalne dalsze zastosowania usieciowanego materiału, w tym przykłady, które zostały z powodzeniem zastosowane, ale nie zostały bezpośrednio omówione w tym protokole, takie jak oczyszczanie RNA z kulkami SPRI, sekwencjonowanie RNA i spektrometria mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protokół komórek drożdży

Hodowla i utrwalanie komórek drożdży
UWAGA: Utrwalanie i zbieranie komórek jest dostosowane z¹⁰^,³⁸ z modyfikacjami.
1. Ustawić 1 l hodowli komórek drożdży (jako przykład podano hodowlę komórek drożdży typu dzikiego (WT) BY4741) w wytrząsarce orbitalnej o początkowej gęstości optycznej nie większej niż 0,05 AU przy 600 nm (OD₆₀₀) w odpowiednich pożywkach (1% w/v ekstraktu drożdżowego, 2% w/v peptonu, 2% w/v dekstrozy (glukozy), 40 mg/L siarczanu adeniny (YPD) użytego jako przykład) w pożądanych warunkach (30 °C stosuje się w w tym eksperymencie).
2. Skonfiguruj wirówkę preparatywną z kompatybilnym rotorem i butelkami wirówkowymi do granulowania ciekłej kultury zawiesinowej komórek drożdży. W przypadku eksperymentów z głodem glukozy, po osiągnięciu gęstości optycznej 0,6-0,8 AU przy 600 nm (OD₆₀₀), należy zagnieździć komórki, stosując krótkie odwirowanie w temperaturze 30 °C, 5000 x g przez 1 min.
  UWAGA: Zapisuj OD rosnących komórek i pozwól komórkom rosnąć, aż OD₆₀₀ osiągnie 0,6-0,8 AU, jeśli interesująca jest faza wzrostu wykładniczego.
3. Natychmiast zawiesić osad w ciepłym (30 °C) pożywce YP zawierającej brak glukozy lub z niską dowartością (0,25% w/v) glukozy i inkubować kulturę przez kolejne 10 minut w temperaturze 30 °C w wytrząsarce orbitalnej-inkubatorze.
  UWAGA: Skład podłoża może mieć wpływ na późniejszą skuteczność sieciowania. Ten protokół został przetestowany tylko przy użyciu YPD. Podczas przeprowadzania eksperymentów z głodem kluczowe znaczenie ma przestrzeganie czasu i minimalizacja opóźnień między procedurami.
4. Gdy komórki będą gotowe, umieść pojemnik na lód w dygestorii ze zlewką zawierającą 250 g czystego, pokruszonego lodu wodnego. Upewnij się, że 25 ml pasiaków i świeżo zakupiony stabilizowany metanolem 37% w/v roztwór formaldehydu są dostępne wewnątrz kaptura. Wlać 1 l kultury do zlewki zawierającej 25% w/v kruszonego lodu wodnego.
  UWAGA: Utrzymuj komórki na lodzie przez wszystkie kolejne operacje, aż komórki zostaną zamrożone, chyba że wskazano inaczej.
5. Dodaj 75 ml 37% w/v roztworu formaldehydu do końcowego stężenia 2,2% w/v i intensywnie mieszaj mieszaninę, aż lód się rozpuści.
6. Gdy lód się rozpuści, ustaw minutnik na 10 min.
  UWAGA: Przestrzegaj zalecanych czasów i schematu temperatury, aby uzyskać powtarzalne wyniki utrwalania.
7. Po inkubacji przez 10 minut, przenieść kulturę do wstępnie schłodzonych butelek wirówkowych i granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 °C, 5 000 x g przez 5 minut. Gdy wirowanie jest włączone, schłodzić probówkę o pojemności 50 ml i przechowywać świeżo przygotowany bufor A (zawierający glicynę neutralizującą pozostały formaldehyd) na lodzie.
  UWAGA: Zapoznaj się z dostarczoną tabelą, aby uzyskać dokładny skład.
8. Po odwirowaniu umieść probówki wirówkowe na lodzie tak, aby strona z granulkami stykała się z lodem. Umieścić rurki pod wyciągiem i wyrzucić supernatant do pojemnika na odpady formaldehydu.
9. Zawiesić osad komórkowy ze wszystkich probówek w 20 ml buforu A za pomocą 25 ml paski i przenieść do probówki o pojemności 50 ml.
  UWAGA: To płukanie ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia niepowtarzalnego sieciowania, a dodanie buforu nie może przekroczyć 20 minut czasu od pobrania komórek.
10. Uzupełnić objętość do 40 ml buforem A i zebrać umyte komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 °C, 5 000 x g przez 5 minut.
11. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 ml buforu A1, który jest buforem A niezawierającym glicyny, w celu usunięcia zanieczyszczenia glicyną.
12. Ponownie granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 °C, 5 000 x g przez 5 min.
13. Powtórz pranie z buforem A1 jeszcze raz. Odrzucić supernatant i umieścić osad komórkowy na lodzie. Zważyć probówkę z osadem (masa mokrych komórek powinna wynosić ~1 g na 1 l hodowli komórkowej).
Rozbijanie komórek drożdży i zbieranie cytozolu
1. Napełnij pudełko z pianki polistyrenowej wyłożone folią aluminiową ciekłym azotem na głębokość około 3 cm. Umieść probówkę o pojemności 50 ml pionowo w pudełku.
2. Zawiesić osad (~1 g mokrej masy komórek) w 550 μl buforu A2 przez pipetowanie i wirowanie przez 10 s. Dodać 10 μL z 40 U/μL inhibitora RNazy i ponownie wirować przez 10 s.
  UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny, taki jak rękawice izolowane termicznie. Upewnij się, że pojemnik używany do przechowywania ciekłego azotu nie przecieka, a stojak na rurki w środku nie unosi się ani nie spada na bok. Pracuj w dobrze wentylowanym miejscu, aby uniknąć wyczerpania tlenu.
3. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml wlej zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml zawierającej ciekły azot.
  UWAGA: Kapanie należy wykonywać powoli i ostrożnie, aby uniknąć agregacji kropel. Upewnij się, że kropelki zamarzły przed wprowadzeniem nowych kropel.
4. Przenieść probówkę o pojemności 50 ml z kropelkami zawiesiny zamrożonych komórek do temperatury pokojowej i poczekać, aż ciekły azot całkowicie odparuje. Uszczelnij probówkę nakrętką i przechowuj granulki komórek w temperaturze -80 °C lub natychmiast przejdź dalej.
  UWAGA: Upewnij się, że ciekły azot został całkowicie odparowany przed uszczelnieniem rurki. Resztki ciekłego azotu w szczelnie zamkniętej rurze mogą spowodować niebezpieczny wzrost ciśnienia.
5. Aby przygotować się do następnego kroku, należy schłodzić na suchym lodzie probówki o pojemności 1,5 ml bez nukleazy i naczynia mielące ze stali nierdzewnej o pojemności 10 ml.
6. Przenieść kropelki zawiesiny zamrożonych komórek do słoików za pomocą czystej, sterylnej szpatułki.
  UWAGA: Upewnij się, że naczynia do mielenia są szczelnie zamknięte.
7. Zanurz naczynia mielące w ciekłym azocie na 1 minutę, upewniając się, że faza ciekła pozostaje poniżej złącza. Ustawić młyn kriomiksujący na 27 Hz do mieszania przez 1 min.
  UWAGA: Zawsze równoważ kanister do mielenia innym pojemnikiem tego samego modelu, nawet jeśli próbka wymaga tylko jednego kanistra do przetworzenia.
8. Mieszać szczelnie zamknięte naczynia mielące z częstotliwością 27 Hz przez 1 minutę w młynie miksującym.
9. Ponownie schłodzić naczynia do mielenia w ciekłym azocie jak poprzednio i wstrząsać z częstotliwością 27 Hz przez 1 minutę w młynie miksującym.
10. Przenieś słoiki do pojemnika na lód zawierającego suchy lód wraz z probówkami bez nukleazy o pojemności 1,5 ml. Za pomocą małej stalowej szpatułki przenieś otrzymaną sproszkowaną próbkę do probówek w porcjach ~100 mg i przechowuj probówki w temperaturze -80 °C.
  UWAGA: Zaleca się użycie ~ 600 mg próbki na eksperyment obejmujący analizę profilu sedymentacji polisomów, rozdzielenie cytozolu na frakcje translowane i nieuległe translacji oraz dalsze rozdzielenie translowanej frakcji na SSU, rybosom i frakcje disome po trawieniu RNazy.
Oddzielenie stałych kompleksów (poli)rybosomalnych od nieulegających translacji frakcji cytozolu
UWAGA: Procedura ustalona wcześniej¹⁰^,³⁸ jest zwykle stosowana w celu wzbogacenia translowanego RNA na podstawie jego kosedymentacji z (poli)rybosomami. Wprowadzono tutaj bardziej wyrafinowane podejście do oddzielania translowanych i nieulegających translacji frakcji cytozolu, eliminując potrzebę wytrącania, a następnie ponownego rozpuszczania materiału.
1. Przygotuj 2,5 ml liniowych gradientów sacharozy 10%-20% w/v z buforem B metodą zamrażania i rozmrażania⁴³ w cienkościennych ultrawirówkach (5 ml, 13 x 51 mm).
  UWAGA: Metoda zamrażania i rozmrażania polega na sekwencyjnym dodawaniu i zamrażaniu buforowanych warstw sacharozy o liniowo regresujących się stężeniach jedna na drugiej. Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli uzupełniającej 1.
2. Aby utworzyć nieciągłą poduszkę sacharozową o sile 50% w/v, po rozmrożeniu i ustabilizowaniu gradientów liniowych, powoli dozuj 0,5 ml 50% sacharozy w buforze B bezpośrednio na dno probówek za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml przymocowanej do igły 19 G x 1,5" lub szklanej kapilary o podobnych/odpowiednich wymiarach. Przed dozowaniem ostrożnie i powoli wbij końcówkę igły lub kapilary od góry do dołu wstępnie uformowanych gradientów sacharozy, unikając wszelkich zakłóceń, aż dotrze do dna probówki.
  UWAGA: Patrz Tabela Uzupełniająca 1 w celu uzyskania instrukcji dotyczących przygotowania buforu B.
3. Ostrożnie zrównoważyć gradienty, usuwając górne części lub nakładając więcej 10 w/v sacharozy w buforze B i utrzymując je w lodowatym chłodzie lub w temperaturze 4 °C.
  UWAGA: Nieciągły gradient z dolną 50% warstwą sacharozy jest potrzebny do zbierania materiału o większej szybkości sedymentacji bez wytrącania go na ściance rury.
4. Rozmrozić ~100 mg zamrożonej próbki w proszku w temperaturze pokojowej i natychmiast umieścić na lodzie. Wymieszać 150 μl buforu A2 przez pipetowanie, dodać inhibitor RNazy do 1 U/μl i mieszać przez wirowanie (unikać nadmiernego pienienia i mieszania z fazą gazową) przez 10 s.
  UWAGA: Kontynuuj wszystkie operacje, trzymając materiał na lodzie, chyba że wskazano inaczej.
5. Osadzać resztki komórek, odwirowując probówki w temperaturze 4 °C, 13 000 x g przez 5 minut i odzyskać oczyszczony supernatant (~150 μl) w nowej probówce o niskiej zawartości białka o pojemności 1,5 ml.
6. Załadować powstałą sklarowaną mieszaninę na nieciągłe rurki z gradientem sacharozy z kroku 1.3.3 i ostrożnie je zrównoważyć.
7. Ultraodwirować probówki w wirniku z kubełkiem obrotowym o średniej objętości w temperaturze 4 °C, ze średnią siłą g 287 980 x g (współczynnik k 49) przez 1 h 30 min.
  UWAGA: Warunki te zostały wstępnie zoptymalizowane (przy użyciu analizy śladowej absorbancji UV po ultrawirowaniu) w celu zachowania wolnych (nie(poli)rybosomalnych) SSU i LSU (duża podjednostka rybosomalna) w górnej (10%-20% sacharozy) części gradientu, jednocześnie koncentrując frakcję (poli)rybosomalną w dolnej (50%) poduszce sacharozy bez granulowania materiału.
8. Użyj nowej sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 19 G x 1,5 cala, aby zebrać translowaną frakcję cytozolu. Umieść gradient 5 ml na stabilnym stojaku, upewniając się, że spód probówki jest widoczny.
9. Od góry probówki wbij igłę prosto w dno gradientu (bez nakłuwania probówki) i delikatnie, nie tworząc żadnych pęcherzyków, pobierz dokładnie 0,5 ml dolnego roztworu zawierającego translowaną pulę RNA.
  UWAGA: Upewnij się, że ten krok jest wykonywany w zimnym pomieszczeniu, a rurka jest mocno trzymana. Zaleca się narysowanie całego 0,5 ml jednym ruchem w górę, aby uniknąć zakłóceń gradientu.
10. Potwierdzić obecność (poli)rybosomalną i zubożenie SSU, LSU i lżejszych frakcji w otrzymanej mieszaninie poprzez odczyt absorbancji gradientu sacharozy podczas ultrawirowania.
11. Zagęścić zebraną translację puli RNA z poprzedniego etapu do 100 μl za pomocą ultrafiltracji w urządzeniu do mikrokoncentracji z odciętą membraną z regenerowanej celulozy o napięciu 10 kDa.
  UWAGA: Wstępnie umyj membranę urządzenia do mikrozagęszczania 0,5 ml buforu 1 (patrz Rysunek 2a) i użyj warunków wirowania (g) zalecanych przez producenta.
12. Następnie rozcieńczyć materiał z poprzedniego etapu pięciokrotnie (dodać 400 μl) buforem 1 i zagęścić z powrotem do 200 μl, aby umożliwić zmniejszenie objętości, jak również częściowe usunięcie sacharozy.
  UWAGA: Zaleca się przechowywanie otrzymanych mieszanin w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy i wykorzystanie jako materiału wejściowego do budowy biblioteki sekwencyjnej RNA "całkowitego translowanego RNA" lub etapu trawienia RNazy w konstrukcji biblioteki TCP-seq. "Nietranslowana" frakcja cytozolu może być odzyskana z wierzchołka gradientu przy użyciu podobnej procedury i przechowywana w temperaturze -80 °C.
Trawienie RNazy stałych kompleksów (poli)rybosomalnych i rozdzielanie strawionego materiału na małe frakcje podjednostek rybosomalnych (SSU), monorybosomalnych (rybosomy, RS) i dirybosomalnych (disomy, DS)
UWAGA: Procedura jest zasadniczo zgodna z podejściem opisanym wcześniej¹⁰^,³⁸, ale zastosowano zmodyfikowany typ gradientu, czas separacji, przyspieszenie i warunki trawienia RNazy, aby osiągnąć najlepszą rozdzielczość dla wszystkich trzech izolowanych frakcji.
1. Przygotuj starannie zbilansowane 12,5 ml liniowe gradienty sacharozy 10%-40% w/v wykonane z bufora 1 na 13 ml cienkościennych probówek polipropylenowych o wymiarach 14 x 89 mm, stosując metodę zamrażania i rozmrażania⁴³, jak opisano w kroku 1.3.1 i zanotuj w nim.
2. Rozmrozić w temperaturze pokojowej i natychmiast przenieść próbki na lód lub pobrać skoncentrowaną i zubożoną w sacharozę translowaną frakcję cytozolu z kroku 1.3.12.
  UWAGA: Kontynuuj wszystkie procedury na lodzie, chyba że wskazano inaczej.
3. Roztrawić translowaną frakcję cytozolu przez zmieszanie w 4,5 j. RNazy I E. coli na 1 jednostkę OD₂₆₀ frakcji przez 30 minut w temperaturze 23 °C. Natychmiast dodać i wymieszać, pipetując inhibitor RNazy zdolny do inaktywacji RNazy I do 0,25 U/μl do mieszaniny, w celu inaktywacji RNazy I.
  UWAGA: Użyj inhibitora RNazy zdolnego do hamowania RNazy I. Uzyskaj AU₂₆₀ za pomocą AU₂₆₀ = (Absorbancja przy 260 nm znormalizowana do jednostek gęstości optycznej odpowiadających 1 cm ścieżce optycznej x objętość lizatu w μL) / 1,000.
4. Natychmiast przenieść próbki do ice.
  UWAGA: Bardzo ważne jest przestrzeganie zalecanych warunków trawienia i dokładne odmierzenie ilości dodanej RNazy I. Jednostka RNazy I, o której tutaj mowa, jest zdefiniowana jako ilość enzymu potrzebna do wytworzenia 1 μg rozpuszczalnego w kwasie materiału z RNA wątroby myszy w ciągu 30 minut w temperaturze 37 °C. Partie RNazy I mogą mieć nieudokumentowane różnice w aktywności i mogą wymagać eksperymentów w celu osiągnięcia optymalnych warunków trawienia. Jeśli podstawowy enzym jest zbyt skoncentrowany, zaleca się rozcieńczenie go buforem 1, aby uniknąć pipetowania bardzo małych objętości roztworu.
5. Załaduj mieszaniny reakcyjne na gradienty sacharozy 10%-40% w/v z kroku 1.4.1.
  UWAGA: Stosować końcowe objętości w zakresie 150-300 μL na gradient. Każde oczyszczanie wymaga co najmniej dwóch gradientów. Użyj różnych objętości wejściowych materiału (niższe AU₂₆₀, 10-11 AU₂₆₀ dla DS i stosunkowo wyższe AU₂₆₀, 13-14 AU₂₆₀ dla SSU lub RS), aby uzyskać optymalną separację.
6. Ultraodwirować probówki w wirniku kubełkowym o średniej objętości w temperaturze 4 °C ze średnią siłą g 178 305 x g (współczynnik k 143,9) przez 3 godziny 30 min.
  UWAGA: Jeśli potrzebne są zapasowe probówki równoważące, wyrównaj ich masę i rozkład masy z probówkami zawierającymi próbkę. Użyć zapasowych gradientów sacharozy pokrytych ilością buforu równoważną ilości buforu nałożonego na próbkę, a nie probówek o jednolitym stężeniu sacharozy.
7. Ustawić gradientowe urządzenie frakcjonujące co najmniej 30 minut przed zakończeniem wirowania ultrawirowania, w tym wlać 0,2 μm przefiltrowany roztwór ciężkiej bruzdy (np. 60% sacharozy w wodzie dejonizowanej, jak zastosowano tutaj) do pompy wyporowej.
  UWAGA: Zaleca się odkażenie przewodów i przewodów frakcjonatora za pomocą wody dejonizowanej, a następnie 1%-2% roztworu SDS w wodzie dejonizowanej, wodzie dejonizowanej i wreszcie 80% etanolu w roztworze wody dejonizowanej przed i po przebiegach.
8. Wyregulować linię bazową odczytu absorbancji, najpierw napełniając system wodą dejonizowaną i zerując optykę zgodnie z zaleceniami producenta, a następnie kompensując przesunięcie linii podstawowej za pomocą zapasowego, nieobciążonego gradientu sacharozy 14 x 89 mm wykonanego z buforem identycznym jak probówki z próbką (np. bufor 1).
  UWAGA: Do dokonania regulacji należy użyć tej samej prędkości przemieszczenia, co w przypadku odczytu próbki, np. 1.5 ml/min.
9. Zmierz objętość martwą układu przemieszczenia, dokładnie zliczając czas między pierwszym wejściem roztworu na ścieżkę optyczną detektora a pierwszym pojawieniem się na wyjściu kolektora frakcji.
  UWAGA: Przy zalecanej prędkości 1,5 ml/min frakcjonowanie można przeprowadzić w temperaturze pokojowej. Zaleca się natychmiastowe przeniesienie zebranych frakcji na lód.
10. Przeprowadzić frakcjonowanie, korzystając z odczytu absorpcji w czasie rzeczywistym przy 254 nm, prędkości przemieszczenia 1,5 ml/min i wykrywania frakcji w linii na podstawie oczekiwanej pozycji sedymentacji i profilu absorbancji próbek. Użyj przełączania rurki kolektora z opóźnieniem czasowym odpowiadającym objętości martwej, jak zmierzono wcześniej.
11. Wyizolować frakcje odpowiadające położeniu i ruchliwości kompleksów SSU, RS i DS i zebrać je do nowych probówek mikrowirówkowych o niskiej wiązalności białka 1,5 ml; natychmiast przenieść wyizolowane frakcje na lód i natychmiast zamrozić, jeśli nie są dalej przetwarzane.
  UWAGA: Zaleca się natychmiastowe błyskawiczne zamrożenie zebranych frakcji w suchym lodzie lub ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C lub niższej przez okres do 6 miesięcy.
Desieciowanie kompleksów rybosomalnych i izolacja RNA w celu budowy bibliotek sekwencyjnych RNA
1. Aby odblokować/odwrócić wiązania krzyżowe i odizolować RNA od powiązanych białek, przenieś około połowy całych frakcji gradientu sacharozy do nowych probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml z polipropylenu o niskiej zawartości kwasu nukleinowego (350 μl na probówkę) z urządzeniami zabezpieczającymi/blokującymi pokrywę.
2. Uzupełnić mieszaniny 40 μl 100% roztworu zatrzymanego (10% SDS w/v i 100 mM EDTA), 4 μl 1 M Tris-HCl pH 2 w temperaturze 25 °C (do 10 mM), 1,6 μl 2,5 M glicyny (do 10 mM) i wodą wolną od dejonizacji nukleaz, aby uzyskać końcową objętość 400 μL.
3. Wymieszać zawartość probówek przez pipetowanie i przenieść probówki w temperaturze pokojowej.
4. Dodać równą objętość kwaśnej mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy 125:24:1 (pH 4,0-5,0) do każdej probówki. Energicznie wstrząsaj mieszaninami przez 2 minuty za pomocą mieszadła wirowego ustawionego na maksymalną prędkość.
  UWAGA: Fenol i chloroform są i toksyczne. Unikaj fizycznego kontaktu z płynami i pracuj w dobrze wentylowanym pomieszczeniu lub pod wyciągiem. Podczas pracy z fenolem lub chloroformem należy zawsze używać rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych lub osłony twarzy.
5. Umieścić probówki w wytrząsarce termicznej i ciągle wstrząsać w temperaturze 65 °C, 1 400 obr./min przez 30 minut.
6. Ułatwić agregację faz poprzez odwirowanie mieszaniny przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
7. Zebrać górne fazy wodne i przenieść je do świeżych probówek o niskiej zawartości kwasu nukleinowego o pojemności 1,5 ml.
  UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, nie próbuj całkowicie odzyskać faz wodnych. Rozsądna objętość odzysku to 300-350 μL.
8. Uzupełnić zebrane fazy wodne 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH 5 w 25 °C), 20 μg glikogenu (stosując 5 μg/μl roztworu podstawowego) i 2,5 objętości absolutnego alkoholu etylowego. Ostrożnie wymieszaj roztwory, wirując probówki przez 1 minutę.
9. Wytrącić RNA przez inkubację próbek w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 godziny (zalecana noc).
10. Podgrzej probówki do temperatury pokojowej i wymieszaj przez wirowanie.
  UWAGA: Wstępne podgrzanie probówek, a następnie odwirowanie w temperaturze pokojowej (bez wymuszonego schładzania) pomaga zmniejszyć współwytrącanie soli i fenolu oraz przenoszenie. Warunki te nie powinny powodować strat materialnych ani nieefektywności pobierania RNA, jeśli są wykonywane zgodnie z opisem i przy użyciu wystarczająco czystego etanolu.
11. Wytrącić osad RNA, odwirowując probówki o sile 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
12. Odrzucić sklarowany osad i dwukrotnie przemyć osad etanolem o stężeniu 80% v/v, zbierając go za każdym razem przez odwirowanie przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
13. Wysuszyć granulki RNA, otwierając pokrywy probówek i umieszczając otwarte probówki w grzałce z suchym blokiem ustawionym na 45 °C na 10 minut. Powstały w ten sposób wysuszony osad rozpuścić w 20 μl 1x buforu HE.
14. Oszacuj wynikowe stężenie RNA za pomocą pomiaru widma absorbancji UV.
  UWAGA: Długość i całkowitą ilość fragmentu RNA można dalej ocenić za pomocą denaturującej elektroforezy żelowej, takiej jak zautomatyzowany aparat do elektroforezy kapilarnej w żelu opartym na fluorescencji.
Selektywne koimmunooczyszczanie SSU za pomocą oznakowanych eIF i analiza western blot selektywnego wzbogacania SSU
UWAGA: Użyj ~15 AU (260 nm) strawionej i posegregowanej sedymentacyjnie frakcji SSU z kroku 1.4.11, aby przeprowadzić oczyszczanie powinowactwa za pomocą magnetycznych kulek IgG. Zaoszczędź ~5% frakcji SSU jako sterowanie wejściowe (frakcja wejściowa, I). Z oznaczeniem eIF4A (TIF1-TAP; Zastosowano szczep drożdży Tandem Affinity Purification, który umożliwia również wykrycie eIF4A poprzez sondowanie w poszukiwaniu znacznika TAP za pomocą przeciwciała anty-TAP.
1. Przenieś 100 μl magnetycznej zawiesiny kulek IgG (1 mg kulek użyto na każde 15 AU (260 nm) lizatu lub frakcji) do nowej probówki o niskiej wiązalności białkowej 1,5 ml; zbierz kulki za pomocą stojaka magnetycznego i odessaj je.
2. Umyj kulki magnetyczne dwukrotnie 1 ml buforu 1, stosując sekwencyjne ponowne zawieszenie przez pipetowanie i zbieranie za pomocą stojaka magnetycznego.
3. Po umyciu zbierz i zdekantuj koraliki, trzymając je na stojaku magnetycznym.
4. Dodać frakcję SSU do przemytych kulek i inkubować mieszaninę przez 4 godziny z obrotami w temperaturze 4 °C w cyklomieszaczu ustawionym na ~20 obr./min.
5. Zebrać kulki za pomocą stojaka magnetycznego w temperaturze 4 °C i zachować supernatant (frakcja przepływowa, FT).
6. Umyć kulki dwukrotnie w temperaturze 4 °C z buforem 1 uzupełnionym o 4 mM DTT, za każdym razem obracając przez 10 minut w cyklomikserze i zbierając i dekantując kulki na stojaku magnetycznym. Zachowaj prania (frakcje W1 i W2).
7. W przypadku zastosowań analitycznych, takich jak western blotting, należy eluować związany materiał w warunkach denaturacji i redukcji, dodając bufor próbki do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) LDS (dodecylosiarczan) o pH 8,5 do 1x i DTT do 2 mM.
8. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 95 °C przez 5 minut w bloku termicznym, aby sfinalizować elucję.
9. Zbierz kulki za pomocą stojaka magnetycznego i odzyskaj zdenaturowany eluat (frakcja E) w świeżej probówce mikrowirówkowej o niskiej zawartości białka o niskiej zawartości białka
10. Użyj frakcji E z poprzedniego kroku, aby natychmiast uruchomić STRONĘ denaturującego dodecylosiarczanu sodu (SDS) lub zapisz frakcję E w temperaturze -20 °C.
  UWAGA: W celu uzyskania preparatywnego zbioru kompleksów translacyjnych wzbogaconych znacznikiem TAP do dowolnego kolejnego zastosowania, należy zastosować alternatywne podejście do elucji z wykorzystaniem proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV). Więcej informacji można znaleźć w tabeli uzupełniającej 1.
11. Aby zagęścić rozcieńczone frakcje FT, W1 i W2, wytrącić ich materiał, dodając 3 razy więcej lodowatego acetonu. Inkubować mieszaninę próbki i acetonu w temperaturze -20 °C przez 3 godziny.
12. osadzić przez odwirowanie probówek o sile 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
13. Odrzucić supernatant i wysuszyć osad na powietrzu w otwartych probówkach w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
14. Rozpuść osad w 7 μL 1x bufora ładującego LDS uzupełnionego 2 mM DTT. Podgrzewać próbki w bloku termicznym ustawionym na 95 °C przez 5 minut.
15. Załaduj wszystkie próbki I, FT, W1, W2 i E na 4% -12% w/v gradientu akrylamidu, żelu denaturującego poliakryloamid Bis-Tris. Uruchomić żel za pomocą 1x MES SDS (kwas 2- [N-mopholino]etanosulfonowy, dodecylosiarczan sodu) pod napięciem 80 V, aż marker białkowy (10-250 kDa) dobrze się rozpuści, a barwnik ołowiowy dotrze do dna żelu.
  UWAGA: Zaleca się ładowanie seryjnych rozcieńczeń WCL (lizatu pełnokomórkowego) (2-10 μg) na żel jako kontrolę. Może być konieczne kilka prób, aby uzyskać porównywalne obciążenie żelu w poprzek materiału frakcji.
16. Przenieść zawartość białka w żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) metodą mokrego transferu pod napięciem 100 V przez 1 godzinę w chłodni, zgodnie z zaleceniami producenta sprzętu do blottingu western.
17. Zablokować membranę za pomocą odpowiedniego buforu blokującego (na bazie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przy ciągłym wstrząsaniu.
18. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi rozcieńczania przeciwciała, należy zbadać błonę przeciwciałem anty-TAP w celu wykrycia oznakowanego białka eIF4A, przeciwciała anty-Pab1p lub przeciwciała anty-β-aktyny (lub innego pożądanego celu) przez nocną inkubację błony z przeciwciałem rozcieńczonym buforem blokującym (PBS) (rozcieńczenie 1:1,000) w cyklomiksatorze w chłodni.
  UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciał w stosunku 1:1,000 jest dobrym punktem wyjścia.
19. Przemyć membranę trzykrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, 0,2% v/v Tween 20 (PBST) przez 10 minut każdy.
20. Sondować membranę za pomocą znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych zgodnie z instrukcjami producenta, inkubując w cyklomikserze w temperaturze pokojowej przez 1 h.
  UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciał w stosunku 1:20 000 jest dobrym punktem wyjścia.
21. Umyj membranę trzykrotnie 1x PBST przez 10 minut każdy. Krótko przepłukać membranę wodą dejonizowaną, a następnie metanolem absolutnym. Wysuszyć i uwidocznić membranę w systemie obrazowania fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta.
  UWAGA: Barwienie innych białek można osiągnąć za pomocą przeciwciał drugorzędowych z barwnikami pasującymi do różnych kanałów fluorescencyjnych (takich jak w zastosowanej tutaj parze eIF4A-TAP vs. β-aktyna), poprzez sekwencyjne barwienie lub usuwanie i barwienie tej samej membrany lub wycinanie membrany z żelu załadowanego powtarzającym się wzorem frakcji i oddzielnie sondowanie każdego elementu odpowiednimi przeciwciałami (jak w przykładzie Pab1p użytym tutaj).

2. Protokół komórkowy ssaków

Hodowla i utrwalanie komórek ssaków
1. W 2 kolbach T-175 hoduj komórki HEK293 do 60%-70% konfluencji w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Medium i 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 °C i 5% v/v dwutlenku węgla.
  UWAGA: Kompletna pożywka jest wytwarzana przez dodanie 55 ml komercyjnego FBS do 500 ml zakupionego w handlu DMEM o wysokiej zawartości glukozy, zawierającego L-glutaminę, czerwień fenolową i wodorowęglan sodu, ale bez HEPES lub pirogronianu sodu. Liczba komórek w kolbie T-175 przy 70% konfluencji powinna mieścić się w zakresie 1,7-2,0 x 10⁷.
2. Co najmniej 3 godziny przed pożądanym czasem utrwalenia należy wymienić pożywkę z kolb T-175 na dokładnie 30 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki i umieścić kolby w inkubatorze komórkowym.
  UWAGA: Upewnij się, że świeże podłoże jest pipetowane na przeciwną stronę kolby niż monowarstwa komórek, aby uniknąć oderwania komórek. Staraj się przeprowadzić wymianę mediów tak szybko, jak to możliwe, wprowadzając minimalne zakłócenia równowagi gazowej i temperaturowej.
3. Po wymianie pożywki komórkowej przygotuj i chemikalia niezbędne do utrwalenia. Przygotuj buforowaną solą fizjologiczną (DPBS) firmy Dulbecco z 50 mM glicyny, dodając 10,2 ml bulionu 2,5 M glicyny do 500 ml butelki DPBS i mieszając.
4. Przygotować butelkę DMEM uzupełnioną 10% FBS, jak w kroku 2.1.1, do użycia w warunkach niesterylnych i 100 ml podwielokrotności 0,25% trypsyny-EDTA. Zaopatrz się w dodatkową butelkę komercyjnego DPBS wstępnie sformułowanego z chlorkiem wapnia (CaCl₂) i chlorkiem magnezu (MgCl₂).
  UWAGA: Roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
5. Przygotować pojemnik na lód po brzegi z pokruszonym lodem wodnym tak, aby kolba T-175 mogła zmieścić się równomiernie na wierzchu i przechowywać w dygestoriach wraz z przygotowanymi, również na lodzie.
  UWAGA: Ze względu na szybkie reakcje translacji na wszelkie zmiany środowiskowe, wszystkie czasy między wyjęciem kolb komórkowych z inkubatora a dodaniem roztworu formaldehydu muszą być zminimalizowane.
6. Aby schłodzić komórki, wyjmij kolbę T-175 z inkubatora i mocno dociśnij ją do lodu, zapewniając maksymalny kontakt powierzchniowy. Wewnątrz okapu oparowego przechylić kolbę na bok tak, aby pożywka zbierała się po stronie przeciwnej do komórek. Odpipetować 168 μl formaldehydu o zawartości 37% w/v bezpośrednio do zebranej pożywki (do końcowego stężenia 0,2% w/v). Natychmiast wymieszać, delikatnie kołysząc kolbą w przód i w tył, zamknąć i ponownie umieścić kolbę na lodzie, upewniając się, że jest pozioma, a komórki są równomiernie pokryte.
  UWAGA: Formaldehyd jest szkodliwą substancją o potencjalnych długotrwałych skutkach ubocznych, a także działa drażniąco zarówno na układ oddechowy, jak i na skórę. Należy z nim obchodzić się wyłącznie w odpowiednim dygestorium chemicznym. Pojemniki z formaldehydem muszą być zawsze szczelnie zamknięte, gdy znajdują się poza wyciągiem.
  UWAGA: Upewnij się, że formaldehyd jest dodawany bezpośrednio do pożywki komórkowej, a nie do ścianki kolby. Krok 2.1.6 powinien zająć mniej niż 1 minutę.
7. Inkubować kolby na lodzie przez kolejne 10 minut. Wylać pożywkę do odpowiedniego pojemnika na odpady przez stronę kolby przeciwną do komórek.
8. Za pomocą paski odpipetuj 30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco bez jonów wapnia i magnezu, a dodatkowo zawierającej 50 mM glicyny, delikatnie po stronie przeciwnej do komórek. Mieszać, kołysząc kolbą; Ustawić kolbę w pozycji poziomej i inkubować na lodzie jeszcze przez 10 minut.
9. Wylej roztwór przez stronę kolby przeciwległą do komórek i delikatnie dodaj 7 ml standardowego 0,25% w/v roztworu trypsyny-EDTA, aby odłączyć i ponownie zawiesić komórki. Inkubować kolbę w temperaturze pokojowej przez 5-10 min.
  UWAGA: Upewnij się, że roztwór trypsyny-EDTA równomiernie pokrywa wszystkie komórki. Stosuj okresowe, delikatne przechylanie i kołysanie, aby promować odwarstwienie komórek.
10. Przesunąć kolbę pionowo i za pomocą paski zebrać oderwane komórki, delikatnie myjąc pozostałe komórki ze ścianek kolby. Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml ustawionej na lodzie.
  UWAGA: Stałe komórki mogą stać się bardziej kruche; Nie pipetować intensywnie ani nie więcej niż jest to wymagane do odłączenia komórek od ścianki kolby.
11. Natychmiast uzupełnij zawiesinę pobranych komórek 20 ml kompletnej pożywki (niesterylnej, lodowatej pożywki z 10% FBS) i wymieszaj, delikatnie obracając probówkę.
  UWAGA: Dodaje się kompletną pożywkę do hodowli komórkowych (w tym 10% FBS) w celu zneutralizowania trypsyny, zapobiegając dalszym uszkodzeniom błon komórkowych i rozpadowi komórek.
12. Osadzać komórki, odwirowując probówkę o stężeniu 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Osad komórkowy musi być wyraźnie widoczny
13. Odlej pożywkę i delikatnie zawieś ponownie osad komórkowy w 10 ml lodowatego DPBS z Ca²⁺, Mg²⁺ i bez glicyny.
14. Powtórz krok 2.1.12.
15. Odlać bufor do przemywania i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 800 μl lodowatego DPBS z Ca²⁺, Mg²⁺, bez glicyny, na lodzie. Przenieś zawieszone komórki do nowej probówki mikrowirówkowej o niskim poziomie wiązania białek o pojemności 1,5 ml.
16. Odwirować probówkę o sile 100 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetora o pojemności 1 ml. Na tym etapie osad komórkowy można zamrozić w temperaturze -80 °C lub przejść do etapu lizy komórek.
  UWAGA: Zamrożone granulki komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C do 1 roku. Stwierdziliśmy, że zamrażanie granulek komórkowych ułatwia późniejszą lizę i zalecamy zamrażanie, nawet jeśli nie planuje się długoterminowego przechowywania.
Rozrywanie komórek ssaków i zbieranie cytozolu
1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 300 μl buforu do lizy na bazie niejonowego, niedenaturującego detergentu i 7 μl 40 μl inhibitora RNazy 40 U/μL. Dobrze wymieszać, pipetując za pomocą końcówki o pojemności 1 ml.
2. Ostrożnie przymocować igłę 25 G do strzykawki o pojemności 1-3 ml i energicznie pipetować mieszaninę, wykonując co najmniej siedem powolnych ruchów wlotu w górę i szybkich ruchów wydechu w dół.
3. Wyrzucić strzykawkę i igłę do pojemnika na ostre przedmioty i powtórzyć procedurę za pomocą strzykawki o pojemności 0,3 ml wyposażonej w igłę o pojemności 31 G.
4. Wyrzuć strzykawkę i igłę do pojemnika na ostre przedmioty. Odwirować probówki w temperaturze 4 °C, 12 000 x g przez 5 minut, aby osadzać resztki komórek.
5. Przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o niskiej zdolności wiązania białek o pojemności 1,5 ml. Przechowywać zarówno resztki komórek (do celów kontroli), jak i powstały w ten sposób oczyszczony lizat komórkowy w temperaturze -80 °C.
  UWAGA: Gęstość optyczna lizatu waha się między 25-30 AU₂₆₀, gdy dwie kolby T-175 są połączone i przestrzegane są zalecane objętości. Lizaty i resztki komórek mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do 1 roku.
Oddzielenie stałych kompleksów (poli)rybosomalnych od nieulegających translacji frakcji cytozolu
1. Przygotuj liniowe gradienty sacharozy 15%-45% w/v w cienkościennych probówkach polipropylenowych o pojemności 13 ml, 14 x 89 mm, stosując metodę zamrażania i rozmrażania, ogólnie opisaną w kroku 1.3.1 protokołu drożdżowego, ale przy użyciu buforu 2 (Rysunek 2a).
  UWAGA: Rozmrozić gradienty przez noc w chłodnym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C w noc poprzedzającą frakcjonowanie.
2. Załadować 150-250 (maksymalnie 300) μl lizatu komórkowego z poprzedniego kroku 2.2.5 na zrównoważone gradienty. Pozostały lizat przechowywać w temperaturze -80 °C i stosować do celów kontrolnych.
  UWAGA: Poniżej przedstawiono przykład segregacji opartej na sedymentacji na frakcje polisomalne, rybosomalne i "wolne" frakcje SSU. Zapoznaj się z podaną tabelą uzupełniającą 1 w celu zapoznania się z alternatywnym podejściem.
3. Ultraodwirować probówki w wirniku z kubełkiem obrotowym o średniej objętości w temperaturze 4 °C, średnia siła g 178 305 x g (współczynnik k 143,9) przez 1 h 45 min.
4. 30 minut przed zakończeniem wirowania należy ustawić i ustawić stopień wyjściowy frakcjonatora gradientowego, zgodnie z opisem w krokach 1.4.7-1.4.9 protokołu drożdżowego.
5. Frakcjonować gradienty ogólnie zgodnie z opisem w krokach protokołu drożdży 1.4.10-1.4.11.
  UWAGA: Ten krok pozwoli oddzielić frakcje polisomalne, rybosomalne i "wolne" frakcje SSU. Frakcje polisomalne mogą być wykorzystywane w eksperymentach z profilowaniem polisomów.
6. Zebrane frakcje należy natychmiast przenieść na lód i jeśli nie są dalej przetwarzane, przechowywać w temperaturze -80°C do 6 miesięcy.
  UWAGA: Jeśli wymiana rurki kolektora frakcji jest zsynchronizowana z identyfikacją i segregacją frakcji on-line, zalecamy użycie do 800 μL frakcji (czas zbierania 32 s na frakcję przy 1,5 ml/min). Jeżeli frakcjonowanie odbywa się bez użycia odczytu absorbancji in-line, zaleca się stosowanie frakcji 250-500 μL (10-20 s na frakcję przy 1,5 ml/min). Po rozdzieleniu frakcje mogą być od razu wykorzystane do immunooczyszczania, mikroskopii elektronowej, denaturacji PAGE i western blotting lub poddane odwróceniu usieciowania w celu późniejszych analiz RNA i/lub proteomiki.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kompleksy translacyjne są wrażliwe na skład jonowy, co jest szczególnie ważne podczas ultrawirowania, gdzie oceniane są właściwości sedymentacji. W związku z tym przetestowaliśmy kilka sedymentacyjnych przy użyciu klarowanego lizatu wyekstrahowanego ze zmielonego nieutrwalonego materiału drożdżowego, w celu wybrania warunków najlepiej nadających się do rozdzielenia kompleksów translacyjnych i oddzielnych podjednostek rybosomalnych (SSU, LSU), monosomów (RS) i polisomów w poprzek gradientu. Wszystkie oparto na składzie rdzenia zawierającym 25 mM HEPES-KOH o pH 7,6 i 2 mM naziemnej telewizji cyfrowej. Stężenia KCl, MgCl₂, CaCl₂ i EDTA zostały następnie zmodyfikowane w (Rysunek 2a), a składniki te dodano odpowiednio do lizatów przed obciążeniem gradientowym i do gradientu sacharozy przed odlewaniem gradientowym.

W 1 i 2 uzyskano dobrze rozdzielone kompleksy translacyjne. Bufor 1 spowodował nieco lepszą separację małych podjednostek rybosomalnych (SSU) (Rysunek 2a). Pominięcie MgCl₂ i dodanie EDTA (3,4) spowodowało utratę wysokich właściwości sedymentacyjnych dla większości polisomów i prawdopodobnie ich częściowy rozkład (Rysunek 2a). Podczas gdy dodanie 2,5 mM CaCl₂ spowodowało nieco bardziej jednorodne piki polissomalne, poprawa była marginalna, a ogólna ilość materiału polissomalnego zmniejszyła się w tym przypadku (Rysunek 2a) w porównaniu z 1 i 2. W związku z tym wybraliśmy bufor 1 jako bufor roboczy z wyboru.

figure-results-1
Rysunek 2: Warunki buforowe dla ekstrakcji kompleksu translacyjnego i ocena stabilizującego efektu utrwalenia. Przedstawiono profile absorbancji UV zebrane przy 260 nm dla całkowitego lizatu komórek drożdży oddzielonych w gradientach 10%-40% w/v sacharozy. a) Wpływ soli jedno- i dwuwartościowych oraz sekwestracji jonów magnezu na sedymentację materiału wyekstrahowanego z niezwiązanych komórek drożdży. Czerwone i szare linie reprezentują typową replikę. lit. b), c) Porównanie lizatów pochodzących z komórek drożdży utrwalonych formaldehydem (szara linia), 2,2% (linia) i 4,4% (linia przerywana) w/v komórek drożdży utrwalonych formaldehydem. (d) Stabilizacja polisomów przez zoptymalizowane 0,2% w/v wiązania formaldehydu (przerywana i kropkowana linia) komórek HEK 293T, w porównaniu z materiałem z tych samych komórek nieutrwalonych (szara linia). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Następnie sprawdziliśmy efekt stabilizacji polisomalnej poprzez utrwalenie różnymi stężeniami formaldehydu. Korzystając z tego samego materiału komórkowego,, obchodzenia się z komórkami i podejścia do czasu, porównaliśmy materiał wyekstrahowany z komórek nieutrwalonych i komórek utrwalonych 2,2% i 4% w/v formaldehydu (Rysunek 2b,c). Odkryliśmy, że 2,2% w/v formaldehydu lepiej nadawało się do utrwalania, ponieważ chociaż doskonale zachowywało polisomy, co można ocenić na podstawie stosunku polisomów do monosomów (Rysunek 2b), nie zmniejszyło to ogólnej wydajności materiału rybosomalnego w porównaniu z 4% w/v formaldehydu, który wykazywał wyraźne oznaki nadmiernego utrwalenia (Rysunek 2c).

Dla materiału pochodzącego z komórek ssaków, ze względu na większy stosunek objętości bufora do komórki wymagany przez ekstrakcję na bazie detergentu, użyto buforu 2 (Rysunek 2a). W ten sposób powstały dobrze rozdzielone kompleksy translacyjne po sedymentacji w gradientach sacharozy (Rysunek 2d). Warto zauważyć, że zastosowano znacznie niższe stężenie formaldehydu wynoszące 0,2% w/v, ponieważ wyższe stężenia powodowały znaczne straty materiału polissomalnego i rybosomalnego (brak danych). Podobnie jak wyniki uzyskane z komórkami drożdży, materiał stabilizowany usieciowaniem wykazał lepsze zachowanie polisomów i wyższy stosunek polisomów do monosomów (Rysunek 2d).

Następnie sprawdziliśmy, czy wybrane warunki wiązania formaldehydu są wystarczająco wydajne, aby ustabilizować aktywnie translowane mRNA we frakcjach polisomalnych w wyniku sieciowania, a poprawa wydajności polisomalnej nie jest tylko konsekwencją hamowania funkcji enzymu i progresji wydłużania translacji. Użyliśmy EDTA i soli wysokowartościowej (KCl) do destabilizacji polisomów i rybosomów. Odczynniki te dodano do sklarowanych lizatów komórek drożdży i włączono odpowiednio do wszystkich kolejnych i gradientów sacharozy na wierzchu kompozycji buforu 1.

Rzeczywiście, 15 mM EDTA wykazywało mniejszy efekt destabilizacji na frakcje polisomalne pochodzące z komórek stałych (Rysunek 3a), potwierdzając, że usieciowane kompleksy są bardziej wytrzymałe. Destabilizujące działanie EDTA można w pewnym stopniu przezwyciężyć poprzez zwiększenie stężenia formaldehydu, ponieważ materiał z 4% w/v komórek utrwalonych formaldehydem jest bardziej odporny na rozwijanie się (Rysunek 3a). Jednak zwiększenie stężenia EDTA do 50 mM spowodowało destabilizację większości kompleksów translacyjnych zarówno w warunkach stałych, jak i nieustalonych, co można wywnioskować z wolniejszej sedymentacji materiału i braku dobrze ukształtowanych pików (Figura 3b). Można to wytłumaczyć częściowym rozwinięciem struktur i ogólną utratą zwartości, a nie całkowitą dysocjacją składników polisomimalnych od mRNA. Nawet w tym przypadku usieciowany materiał wykazał szybszą sedymentację (Rysunek 3b).

figure-results-2
Rysunek 3: Wpływ wiązania formaldehydu drożdży in vivo na stabilność polisomów. Bufor 1 (patrz tekst i Rysunek 2a) był używany we wszystkich eksperymentach. Typ danych i wykres zgodnie z opisem w legendzie Rysunek 2. (a) Porównanie dodania 15 mM EDTA do lizatów komórkowych i kolejnych na stabilność polisomów pochodzących z nieustalonych (szara linia), 2,2% (linia) i 4% (linia przerywana) w/v komórek utrwalonych formaldehydem. b) takie same jak w lit. a), ale dla dodania 50 mM EDTA i z wyłączeniem 4% w/v komórek utrwalonych formaldehydem. c) takie same jak w lit. a), ale dla dodania 500 mM KCl i z wyłączeniem 2,2% w/v komórek utrwalonych formaldehydem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podobnie jak w przypadku efektów EDTA, przy 500 mM KCl, stwierdziliśmy znaczną poprawę stabilności przy 4% w/v wiązania formaldehydu (Rysunek 3c). Pozorną utratę zwartości w tym przypadku można również wytłumaczyć częściowym oderwaniem się składników kompleksów rybosomalnych, a nie ich całkowitym odłączeniem od RNA. Ogólnie rzecz biorąc, polisomy pochodzące z komórek utrwalonych formaldehydem wykazywały wyższą odporność na rozwijanie się i destabilizację strukturalną, co jest zgodne z tworzeniem dodatkowych wiązań kowalencyjnych w tych kompleksach.

Podczas stymulowania warunków wzrostu, mRNA mogą być szybko inicjowane, co powoduje akumulację wielu rybosomów na tych samych cząsteczkach mRNA, które tworzą struktury znane jako polirybosomy lub polisomy. Polisomy można rozdzielić przez ultrawirowanie w gradientach sacharozy, gdzie osadzają się na podstawie ich kolejności (liczba jednocześnie przyłączonych rybosomów na mRNA). Gdy translacja jest tłumiona, rybosomy nie są w stanie wystarczająco szybko zaangażować się w kolejną rundę translacji, co skutkuje (częściowym) "demontażem" polisomów, co objawia się jako przesunięcie modalne w kierunku polisosomów niższego rzędu i akumulacja monosomów4^,²⁶.

Model odpowiedzi translacyjnej, który może być wizualizowany na poziomie rozkładu rzędu polisomów, może być dostarczony przez głód glukozy. Wyczerpanie glukozy wywołuje jeden z najbardziej dramatycznych i szybkich efektów hamujących translację drożdży¹^,³^,⁴⁰. Wcześniejsze badania dowiodły, że w ciągu 1 minuty od wyczerpania glukozy może dojść do utraty polisomów, akumulacji monosomów i zahamowania inicjacji translacji⁴. W ciągu 5 minut od ponownego uzupełnienia glukozy translacja jest szybko przywracana z widocznym wzrostem polisomów³^,⁴. Zaobserwowano również, że translacja była zahamowana, gdy komórki były wystawione na działanie pożywki zawierającej glukozę 0,5% (w/v) lub niższą i nie zaobserwowano żadnego wpływu na poziom glukozy 0,6% (w/v) lub wyższy.

Chcieliśmy zatem ustalić, czy nasze warunki fiksacji są odpowiednie dla zachowania różnic translacyjnych w dynamice reakcji na stres glukozy, co można ocenić za pomocą stosunku polisomów do monosomów. Porównaliśmy materiał z komórek hodowanych w środkowej fazie wykładniczej na wysokim poziomie glukozy (2,00% w/v dodane) z tymi przenoszonymi przez 10 minut do pożywki bez lub z niską dowartością (odpowiednio 0,00% lub 0,25% w/v) glukozy. Utrwalanie przeprowadzono przy użyciu 2,2% w/v formaldehydu równolegle w próbie kontrolnej (bez głodówki; szybka wymiana pożywki na tę samą standardową pożywkę zawierającą 2% w/v dodatku glukozy, a następnie inkubacja przez 10 min i utrwalenie) i 10 min głodzone (szybka wymiana pożywki na tę samą pożywkę, ale o niskiej zawartości 0,25 W/v lub bez dodatku glukozy, następnie inkubacja przez 10 minut i utrwalenie) komórek.

Zgodnie z wcześniejszymi wynikami, zaobserwowaliśmy, że komórki drożdży silnie hamują translację w przypadku stresu głodu glukozy (Rysunek 4a). Zarówno brak dodanych, jak i warunki niskiego poziomu glukozy powodowały rozkład polisomów, z nieznacznie, ale wyraźnie więcej polisomów zatrzymywanych w przypadku niskiego dodatku glukozy. W związku z tym reakcja na usuwanie glukozy przez drożdże może nie być typu całkowitego lub całkowitego i jest stopniowo dostosowywana. Potwierdzając oczekiwania dotyczące stabilizującego działania sieciowania formaldehydu, materiał polissomalny z komórek utrwalonych wykazał większe rozróżnienie między komórkami zagłodzonymi i niegłodzonymi, prawdopodobnie zachowując wyższy zakres dynamiki odpowiedzi (Rysunek 4b). Co ciekawe, w przypadku materiału z komórek stałych, niskie stężenie glukozy z dodatkiem glukozy skutkowało specyficzną obfitością polisomalną, która znacznie lepiej odróżnia się od stanu braku dodatku glukozy, w porównaniu z komórkami nieustalonymi (Figura 4a). Jest to silna wskazówka wskazująca na przydatność podejścia do utrwalania formaldehydu w zachowywaniu i wychwytywaniu stosunkowo drobnych i przejściowych różnic w równowadze wysoce dynamicznych procesów, takich jak podczas reakcji translacyjnych.

figure-results-3
Rysunek 4: Uchwycenie szybkich zmian w translacji drożdży po głodzie glukozy. Bufor 1 (patrz tekst i Rysunek 2a) był używany we wszystkich eksperymentach. Typ danych i wykres zgodnie z opisem w legendzie Rysunek 2. (a) Lizaty komórkowe uzyskane z nieutrwalonych komórek drożdży bez głodu (szara linia), z ograniczonym niedoborem glukozy (0,25% w/v glukozy przez 10 minut; brązowa linia) i zubożonych w glukozę (bez dodatku glukozy przez 10 minut; czerwona linia). (b) takie same jak (a), ale dla 2,2% w/v komórek utrwalonych formaldehydem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Monitorowanie statusu translacji przez rybosomy związane z aktywną translacją mRNA za pomocą sedymentacji gradientu sacharozy ('profilowanie polisomów') jest szeroko stosowaną techniką²⁶^,²⁷^,²⁸. W połączeniu z ilościową analizą mikromacierzy, a ostatnio z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości²⁸^,⁴⁴, profilowanie polisomów dostarcza informacji o mRNA związanych z rybosomami w całym transkryptomie. Opierając się na kilku założeniach, w dziedzinie badań nad biosyntezą białek tradycyjnie argumentowano, że obecność polisomiczna wskazuje na aktywny udział w translacji odpowiednich mRNA. Często (ale nie zawsze) uzasadniony jest dalszy wniosek, że im więcej rybosomów jest obecnych na mRNA o danej długości (im wyższy rząd polisomów), tym aktywniej mRNA bierze udział w translacji. Tak więc oddzielenie frakcji polisomicznej od reszty materiału może być przydatne z punktu widzenia izolacji aktywnie ulegającego translacji RNA. W ramach podejść do profilowania śladu, a w szczególności TCP-seq¹⁰^,³⁸^,³⁹, które generuje oddzielną populację uwolnionych SSU pochodzących z kompleksów kodonów skanowania, uruchamiania i zatrzymywania, może być dodatkowo wnikliwe usunięcie podjednostek rybosomalnych, które nie osadzają się z pełnymi monosomami lub polisomami.

Dlatego zastosowaliśmy separację 'nietranslowanych' mRNP, takich jak wolne SSU (mRNA związane z pojedynczym SSU lub SSU bez dołączonego mRNA) od 'aktywnie translujących' puli mRNA. Aby to osiągnąć, założyliśmy, że mRNA biorące udział w interakcjach z jednym (mono-) lub kilkoma rybosomami (polisomami) mogą ulegać aktywnej translacji. Takie kompleksy można oddzielić od innych wyższym współczynnikiem sedymentacji. Zasugerowaliśmy również, aby oddzielić "aktywnie translowaną" pulę mRNA do poduszki sacharozowej (50% w/v sacharozy) zamiast bezpośredniego granulowania materiału na ściance probówki. Odwirowanie szybko sedymentujących kompleksów do poduszki pozwoliło nam monitorować separację za pomocą odczytu profilu absorbancji i osiągnąć wyższą wydajność materiału rozpuszczonego, niezagregowanego i niedenaturowanego, w porównaniu z granulowaniem i re-solubilizacją¹⁰^,³⁸.

Ogólnie, aby oczyścić poszczególne SSUs, rybosomy, disomy i potencjalnie zwarte polisomy wyższego rzędu, utrwalone klarowane lizaty poddano dwuetapowemu procesowi ultrawirowania (Rysunek 5). W pierwszym gradiencie sacharozy ultrawirowanie spowodowało oddzielenie wolnych SSU i LSU w górnej (10% -20% w/v sacharozy) części gradientu, podczas gdy usieciowana pula translacji, w tym polisomy i mRNA związane z jednym kompletnym rybosomem, była skoncentrowana na dole (50% w/v sacharozy) gradientu (Rysunek 5a). Dolne 50% w/v warstwy sacharozy zawierającej translowaną pulę mRNA zostało następnie zagęszczone, a jego RNA strawione za pomocą RNazy I, a następnie poddano je drugiemu ultrawirowaniu w gradifikacji sacharozy w celu uzyskania oddzielnych disomów odpornych na sachazy (DS) i niewielką frakcję polisomów odpornych na nukleazy wyższego rzędu (Rysunek 5b). Barwienie ujemne octanem uranylu i obrazowanie za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego potwierdziło tożsamość kompleksów wyizolowanych na każdym etapie sedymentacji (Ryc. 5).

figure-results-4
Rysunek 5: Izolacja całkowitej liczby translowanych frakcji RNA od nietranslowanego RNA. (a,c) Schemat (po lewej) i odpowiednie reprezentatywne wyniki (po prawej; typ danych i wykres zgodnie z opisem w Rysunek 2 legendy) (a) pierwsza nieciągła separacja gradientu sacharozy nieulegających translacji frakcji cytozolu, w tym wolnych SSU i translowanej puli mRNA, zidentyfikowanej przez współsedymentacja rybosomami i polisomami oraz (c) oddzielenie poszczególnych kompleksów rybosomalnych uwolnionych z puli translowanych mRNA przez kontrolowane trawienie RNazy I i ultrawirowanie przez drugi liniowy gradient sacharozy do frakcji SSU, LSU, rybosomalnych (RS) i odpornych na nukleazy (DS). Uwzględniono wysokie (15 AU₂₆₀) i niskie (8 AU₂₆₀) ilości niegłodowego strawionego materiału, aby wykazać możliwość zwiększenia ładunków ultrawirowania, gdy interesujące są drobne frakcje. Można również zidentyfikować polisomy odporne na nukleazy wyższego rzędu (np. trysomy w podanych przykładach). lit. b,d) Reprezentatywne obrazy TEM frakcji skontrastowanych octanem uranylu z (a,c), odpowiednio, jak oznaczono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby sprawdzić przydatność schematu utrwalania do zatrzymywania przejściowych białek związanych z rybosomami (szczególnie eIFs), przetestowaliśmy kosedymentację eIF4A, labilnego eIF dynamicznie związanego z rybosomem, w poprzek frakcji rybosomalnych. Wykorzystaliśmy szczep drożdży oznaczony eIF4A Tandem Affinity Purification (TAP) (TIF1-TAP) i zbadaliśmy obecność eIF4A w materiale pochodzącym z komórek stałych i nieutrwalonych przy użyciu przeciwciała anty-TAP, w porównaniu z obfitością Pab1p jako dodatkowej kontroli wiążącej RNA, przy użyciu SDS-PAGE, a następnie western blotting (Rysunek 6).

figure-results-5
Rysunek 6: Stabilizacja przejściowych białek w kompleksach translacyjnych po utrwaleniu formaldehydu in vivo. (a,b) (górne wykresy) Lizat całokomórkowy (WCL) komórek drożdży (a) nieutrwalonych i (b) 2,2% komórek drożdży eIF4A-TAP utrwalonych formaldehydem oddzielonych przez ultrawirowanie i wizualizowanych zgodnie z opisem w legendzie Rysunek 2. (dolne wykresy) Obrazowanie metodą western-blot odpowiednich frakcji gradientu sacharozy po oddzieleniu analizowanego materiału w odpowiednich gradientach (wykresy górne) i WCL jako kontrola. c) Średni stosunek obfitości eIF4A lub Pab1p we frakcjach materiału stałego i niestałego. Proporcje względne (znormalizowane do sygnału wszystkich 2-7 frakcji) eIF4A (czarne paski) i Pab1p (szare paski) obliczono dla 2,3 (SSU, LSU), 4,5 (RS, lekkie polisomy) i 6,7 (ciężkie polisomy) na podstawie danych (a,b) (dolne wykresy) i przyjęto ich stały stosunek do niestałego. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe współczynnika od średniej, przy czym ułamki zbiorcze (pola kropkowane) są traktowane jako kontrpróby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zgodnie z ich dużą obfitością w komórkach, zaobserwowaliśmy wysoką intensywność sygnału z obu białek w lizacie całej komórki (WCL), jak i wolniejszych frakcji sedymentacyjnych pochodzących z komórek nieustalonych (Rysunek 6a, dolny panel). Wykryliśmy również znaczne ilości tych białek w WCL pochodzących z komórek utrwalonych i zapewniających skuteczność ekstrakcji usieciowanego materiału i brak nieoczekiwanych strat (Rysunek 6b, dolny panel). Jednak w przeciwieństwie do komórek nieutrwalonych, materiał z komórek stałych wykazał podwyższoną względną obecność eIF4A w szybciej sedymentujących frakcjach rybosomalnych w porównaniu z Pab1p (Rysunek 6c). Wynik ten sugeruje, że eIF4A pozostaje silniej związany z polisomami w materiale usieciowanym formaldehydem.

Potwierdzając pozytywny i specyficzny efekt stabilizacji sieciowania na obecność eIF4A we frakcjach rybosomalnych, użyliśmy stałego materiału ze szczepu drożdży oznaczonego eIF4A (TIF1-TAP) do wychwytywania i wzbogacania kompleksów zawierających eIF4A poprzez oczyszczanie powinowactwa magnetycznymi kulkami IgG. Mamy wzbogacone w powinowactwo WCL, wolne SSU i frakcje polisomalne (translowana pula mRNA) po pierwszej sedymentacji przez gradient sacharozy (np. sekcja 1.3 protokołu drożdżowego), a także frakcje SSU, LSU i RS z drugiej sedymentacji po rozłożeniu translowanej puli na indywidualne kompleksy z RNazą I (np. sekcja 1.4 protokołu drożdżowego) (Rysunek 7). We wszystkich przypadkach, z wyjątkiem frakcji LSU, udało nam się zaobserwować selektywne wzbogacanie eIF4A we oczyszczone frakcje (eluat, E), w porównaniu z obecnością β-aktyny w materiale źródłowym (wejście, I) (Rysunek 7).

figure-results-6
Rysunek 7: Selektywne oczyszczanie immunologiczne kompleksów translacyjnych stabilizowanych formaldehydem in vivo przez przejściowo związany eIF4A.Schemat ilustruje źródło różnych kompleksów translacyjnych i epitopu eIF4A, w tym niefrakcjonowanego klarowanego WCL komórek drożdży eIF4A-TAP; wolne SSU i translowana pula RNA (polisomy) wydzielone w pierwszym ultrawirowaniu; Frakcje SSU, LSU i RS uwolnione z translowanego RNA przez trawienie RNazy I i posegregowane za pomocą drugiego ultrawirowania (patrz tekst). Obraz Western blot zapewnia wizualizację obfitości eIF4A we frakcjach w porównaniu z obfitością jednocześnie barwionej kontroli β-aktyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utrwalanie formaldehydu jest wygodną i popularną metodą szybkiego sieciowania biomolekuł in vivo 10,36,45,46,47,48. W porównaniu z innymi potencjalnymi celami biomolekuł, skuteczne wychwycenie kompleksów translacyjnych wymaga natychmiastowego utrwalenia podczas błyskawicznego schładzania komórek lub innego materiału. Bez nieopóźnionej stabilizacji istnieje możliwość kontynuowania różnych procesów związanych z translacją, przesuwając złożoną dystrybucję od niezakłóconego stanu in vivo ⁴⁹. W porównaniu z innymi metodami zatrzymania translacji i stabilizacji kompleksu rybosomalnego, szybkość działania formaldehydu przez błony komórkowe i bezkrytyczny charakter wiązań krzyżowych obiecują zachowanie maksymalnej różnorodności produktów pośrednich kompleksu translacyjnego bliżej ich natywnie rozmieszczonych stanów⁵⁰.

Przedstawione tutaj podejście zostało ustalone i zoptymalizowane zarówno w komórkach drożdży, jak i ssaków, a metody zostały teraz opracowane przez inne grupy do stosowania w bardziej zróżnicowanym materiale biologicznym, takim jak całe kręgowce (np. zarodki danio pręgowanego)10,38,39,49,51,52. Chociaż prace te łącznie potwierdzają wszechstronność i szerokie zastosowanie tego podejścia, szybkie sieciowanie kompleksów translacyjnych formaldehydem można uznać za nieco trudne do transpozycji do nowych typów materiału biologicznego ze względu na potrzebę optymalizacji i dostosowań.

Podstawowym warunkiem powodzenia metody jest ponowna optymalizacja stężenia formaldehydu oraz techniki zbierania i rozdzielania komórek. Mniej przepuszczalne, małe i okrągłe komórki drożdży wymagają znacznie wyższego (co najmniej 10-krotnego) stężenia formaldehydu i fizycznego rozerwania utrwalonych komórek. W przeciwieństwie do tego, duże i spłaszczone przylegające komórki ssaków w hodowli mogą być łatwo nadmiernie utrwalone i wymagać delikatnego obchodzenia się z nimi po utrwaleniu, podczas gdy ekstrakcja utrwalonych kompleksów może być przeprowadzona chemicznie z rozerwaniem błony przy użyciu detergentów. Niedostateczne usieciowanie może pozwolić mniej stabilnym lub bardziej krótkotrwałym produktom pośrednim na dysocjację lub wyciek do późniejszego stanu. Nadmierne sieciowanie może negatywnie wpływać na zdolność do izolowania i badania frakcji rybosomalnych i może powodować selektywne odchylenia, takie jak głębsze zubożenie ciężkich kompleksów. Z naszych obserwacji wynika, że nawet drobne zmiany, takie jak rodzaj użytych adherentnych komórek ludzkich, mogą wpływać na wydajność odzyskanych usieciowanych kompleksów i mogą wymagać ponownej optymalizacji schematu sieciowania. Możemy również przewidzieć, że komórki o zasadniczo różnych właściwościach przepuszczalności, takie jak komórki roślinne, będą wymagały dodatkowej szeroko zakrojonej optymalizacji warunków utrwalania⁵². Trudno jednak wyobrazić sobie rodzaj materiału biologicznego, który byłby całkowicie niezgodny z tym podejściem.

Jedną z kwestii związanych z protokołem utrwalania ssaków jest gęstość i ilość materiału komórkowego użytego jako wejście. Zaleca się, aby komórki rosły w sposób ciągły bez ponownego wysiewu lub innych zakłóceń przez co najmniej 2 dni, aby uniknąć zewnętrznych wpływów na dynamikę translacji komórkowej. Ma zastosowanie do większości typów komórek, ale dla większości przylegających komórek konsekwentnie osiągane poziomy konfluencji nie większe niż 70% zapewnią brak głównych efektów hamowania kontaktu, które mogą negatywnie i nieprzewidywalnie wpływać na szybkość translacji.

Inną interesującą i potencjalnie wyjątkowo wygodną cechą utrwalania formaldehydu, wynikającą z jego bezkrytycznej reaktywności, jest efekt stabilizacji kompleksów translacyjnych w układach o mieszanej taksonomii. Bakteryjne, a tym bardziej kompleksy translacyjne mitochondriów, chloroplastów i różnych pasożytów wewnątrzkomórkowych są niezwykle trudne do namierzenia za pomocą specyficznych inhibitorów translacji. W przeciwieństwie do tego, w danych TCP-seq, ślady stóp odwzorowujące mitotranskryptom są łatwo widoczne w danych 38,39,50. Interesującym późniejszym osiągnięciem może być zastosowanie tego podejścia do badania translacji w całych mikrospołecznościach, takich jak próbki gleby, wody lub jelit, gdzie niezawodne szybkie zatrzymanie translacji i złożona stabilizacja za pomocą jakichkolwiek innych środków byłyby problematyczne.

Należy również wspomnieć, że w przypadku najbardziej skomplikowanych materiałów (takich jak twarde i/lub nieporęczne tkanki) nic nie stoi na przeszkodzie, aby zastosować stabilizację formaldehydu natychmiast po rozerwaniu komórek i homogenizacji materiału. Podejście to jest już często stosowane w celu usunięcia opóźnienia wejścia do komórki podczas stabilizacji kompleksów translacyjnych za pomocą specyficznych inhibitorów drobnocząsteczkowych 33,53,54,55^. Biorąc pod uwagę, że utrwalanie formaldehydu było tradycyjnie stosowane z doskonałymi wynikami do stabilizacji próbek ex vivo/in vitro w zastosowaniach takich jak mikroskopia elektronowa 45,56,57,58, możemy spodziewać się jeszcze mniej negatywnych skutków w tym przypadku, szczególnie tych związanych ze słabą ekstrakcją kompleksów translacyjnych z dokładnie utrwalonych komórek.

Nasze odkrycia potwierdzają przydatność szybkiego wiązania formaldehydu do stabilizacji wysoce przejściowych kompleksów, takich jak te, które zawierają eIF4A. Warto zauważyć, że w przeciwieństwie do ssaków, drożdże eIF4A są znacznie słabiej związane z kompleksem wiążącym czapeczkę eIF4F, a co za tym idzie, ogólnie z kompleksami translacyjnymi. eIF4A jest zwykle tracony podczas intensywnego oczyszczania materiału rybosomalnego w drożdżach 29,59,60,61,62,63. Jednak w materiale drożdżowym utrwalonym in vivo możliwe jest osiągnięcie niezawodnego wzbogacenia eIF4A we wszystkie frakcje kompleksów translacyjnych, w których można by się spodziewać jego obecności. Wcześniej opublikowane dane Sel-TCP-seq wykazały wzbogacenie eIF2 i eIF3, które silniej wiążą się z rybosomami (ale także ujawniły przejściowo zachodzący kotranslacyjny kompleks białkowy)³⁹. W związku z tym metoda ta nadaje się do wykrywania zarówno silniejszych, jak i słabszych przyłączonych składników kompleksów translacyjnych.

Podsumowując, przedstawiliśmy podejście przydatne do uzyskania wglądu przede wszystkim w zmiany zachodzące w początkowej fazie translacji oraz gdy wymagany jest minimalnie zaburzony rozkład rybosomalny w mRNA. Co ważne, podejście to nadaje się do stabilizacji stosunkowo labilnych i dynamicznych składników kompleksów translacyjnych, takich jak eIF4A, i może być szeroko stosowane po poddanych niezbędnym optymalizacjom. Dostarczyliśmy również dowodów na przydatność utrwalania formaldehydu w scenariuszach szybkiej dynamicznej zmiany translacji, otwierając obszary badań, takie jak szybkie reakcje komórkowe na zmiany środowiskowe lub warunki stresowe.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant Australian Research Council Discovery Project (DP180100111 dla T.P. i N.E.S.), National Health and Medical Research Council Investigator Grant (GNT1175388 dla N.E.S.) oraz Research Fellowship (APP1135928 dla T.P.). Autorzy doceniają wyposażenie Microscopy Australia w Centrum Zaawansowanej Mikroskopii Australijskiego Uniwersytetu Narodowego, placówce finansowanej przez Uniwersytet i rząd federalny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ekstrakt drożdżowy	Merck, Sigma-Aldrich	70161
Pepton	Merck, Sigma-Aldrich	70178
D-glukoza (dekstroza)	Merck, Sigma-Aldrich	49139
Siarczan adeniny	Amresco	0607-50G
Roztwór formaldehydu	Merck Sigma-Aldrich	F11635-500ML	Odczynnik ACS, 37 % wag. w H₂O, zawiera 10-15% metanolu jako stabilizatora (zapobiegającego polimeryzacji)
RNazaOUT&handel; Rekombinowany inhibitor rybonukleazy	Invitrogen™ autorThermo Fischer Scientific	10777019
cOmplete™, Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA	COEDTAF-RO Roche firmy Merck	11873580001
Roztwór chlorku magnezu	(Merck/Sigma-Aldrich)	M1028
Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego	(Merck/Sigma-Aldrich)	E7889
Ambion™ RNaza I, sklonowana, 100 U/&mikro; L	Ambion	AM2294
SUPERase• W handlu i handlu; Inhibitor RNazy (20 U/μ L) < / em>	Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific	AM2694
Kwaśny fenol: chloroform: alkohol izoamylowy 125:24:1 (pH 4,0-5,0)	(Merck/Sigma-Aldrich)	P1944-100ML
Dynabeads™ Kozia IgG Przeciw Mysim	Invitrogen&handel; przez Thermo Fisher Scientific)	11033
Octan sodu (3 M), pH 5,5	Invitrogen&handel; przez Thermo Fisher Scientific)	AM9740
Glikogen (5 mg / ml)	Invitrogen&handel; przez Thermo Fisher Scientific)	AM9510
Alkohol etylowy, czysty	Merck; Sigma Aldrich	E7023
Amersham^™ Hybond^® P Western blotting membrany, PVDF	GE10600023		Membrana PVDF do western blotting
Bolt™ 4 do 12%, Bis-tris, 1,0 mm, Mini żel białkowy	Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific	NW04120BOX	Żel białkowy
4X Bolt™ Bufor do próbek LDS	Invitrogen™ firmy ThermoFischer Sientific	B0007	Bufor do ładowania próbek LDS
Precision Plus Protein™ Kalejdoskop i handel; Wstępnie barwione wzorce białkowe	BioRad	1610375	Drabinka białkowa
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer	ThermoFischer Scientific	B0002	PAGE runninjg buffer
Intercept® (PBS) Bufor blokujący	LI-COR	927-70001	Odyssey Bufor koksowy (PBS)
IRDye® 800CW Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG	LI-COR	92632210
IRDye® 800CW Koza anty-królicza IgG Przeciwciało wtórne	LI-COR	92632211
TAP Tag Przeciwciało poliklonalne	Invitrogen™ przez ThermoFischer Sientific	CAB1001
Przeciwciało anty-beta aktyny	Abcam	ab8227
Sacharoza	(Merck/Sigma-Aldrich)	84097	BioUltra, do biologii molekularnej, ≥ 99,5% (HPLC)
Roztwór DL-ditiotreitolu	(Merck/Sigma-Aldrich)	43816	BioUltra, do biologii molekularnej, ~1 M w H₂O
Strzykawka Terumo 1CC/mL	Strzykawka Terumo	878499
Chlorek potasu	(Merck/Sigma-Aldrich)	60128
HEPES(	Merck/Sigma-Aldrich)	H3375
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoka glukoza	Sigma Aldrich	D5796
Płodowa surowica bydlęca	Sigma Aldrich	12003C
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Gibco	25300062
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco z wapniem i magnezem	Sigma-Aldrich	D8662
Glicyna	Sigma-Aldrich	G7126
Chlorowodorek Tris	Merck/Sigma-Aldrich	10812846001
Dodecylosiarczan sodu	Merck/Sigma-Aldrich	436143
IGEPAL CA-630	Merck/Sigma-Aldrich	I3021
Inhibitor rybonukleazy rnazyny	Promega	N2111
Naczynie do mielenia ze stali nierdzewnej	Retsch	02.462.0059
Młyn mieszający MM400	Retsch	20.745.0001
Frakcjonownik gradientowy	Brandel	BRN-BR-188
Termomikser R	Eppendorf	Z605271
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
0,5 ml probówki wirówkowe z urządzeniami blokującymi	Eppendorf Safe-Lock	30121023
Mini zbiornik żelowy	(Thermo Fisher Scientific)	A25977	PAGE zbiornik do biegania
5 ml, otwarta cienkościenna ultraprzezroczysta tuba, 13 x 51 mm	Beckman-Coulter	344057
13,2 mL, certyfikowany bezpłatny cienkościenny polipropylen otwarty, 14 x 89 mm - 50 szt	Beckman-Coulter	331372
Urządzenia ultrafiltracyjne Amicon Ultra-0,5	Merck	UFC5030	Membrana z regenerowanej celulozy Ultracel-30, objętość próbki 0,5 ml
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Wirówka	Cambridge Scientific	15566
Beckman Coulter Optima L-90K	GMI	8043-30-1191
Nunc EasYFlask 175cm2	Thermofisher Scientific	159910
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml	Thermofisher Scientific	14-432-22
Pipeta serologiczna 25 ml	Sigma-Aldrich	SIAL1250
10 ml Pipeta serologiczna	Sigma-Aldrich	SIAL1100
probówki lobind DNA	Eppendorf	30108051
5810 R	Eppendorf	EP022628188	do probówek 50 ml
Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym	Ratek	OM11
Frezco 17 Mikrowirówka	Thermofisher Scientific 75002402
Eppendorf Probówki do usuwania wiązek DNA	Merck/Sigma-Aldrich	EP0030108051
Eppendorf® Rurki białkowe LoBind	Merck/Sigma-Aldrich	EP0030108116
SW 41 Ti Wahadłowy wirnik kubełkowy	Beckman-Coulter	331362
Heracell™ 150i Inkubator CO2, 150 L	Thermofisher Scientific	51026282
0,3 mL ultra-fine II krótka strzykawka insulinowa	BD Medical	328822
3 ml strzykawka z końcówką Luer Lok	BD Medical
Igła podskórna Terumo 25 G x 16 mm		TUAN2516R1

Spektrofotometr . Zimna wirówka 302113

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Janapala, Y., Preiss, T., Shirokikh, N. E. Control of translation at the initiation phase during glucose starvation in yeast. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4043(2019).
Masvidal, L., Hulea, L., Furic, L., Topisirovic, I., Larsson, O. mTOR-sensitive translation: Cleared fog reveals more trees. RNA Biology. 14 (10), 1299-1305 (2017).
Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Molecular Biology of the Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
Crawford, R. A., Pavitt, G. D. Translational regulation in response to stress in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 36 (1), 5-21 (2019).
Melamed, D., Pnueli, L., Arava, Y. Yeast translational response to high salinity: global analysis reveals regulation at multiple levels. RNA. 14 (7), 1337-1351 (2008).
Hershey, J. W., Sonenberg, N., Mathews, M. B. Principles of translational control: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 011528(2012).
Mata, J., Marguerat, S., Bähler, J. Post-transcriptional control of gene expression: a genome-wide perspective. Trends in Biochemical Sciences. 30 (9), 506-514 (2005).
Spriggs, K. A., Bushell, M., Willis, A. E. Translational regulation of gene expression during conditions of cell stress. Molecular Cell. 40 (2), 228-237 (2010).
Liu, B., Qian, S. B. Translational reprogramming in cellular stress response. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 5 (3), 301-315 (2014).
Archer, S. K., Shirokikh, N. E., Beilharz, T. H., Preiss, T. Dynamics of ribosome scanning and recycling revealed by translation complex profiling. Nature. 535 (7613), 570-574 (2016).
Hinnebusch, A. G., Ivanov, I. P., Sonenberg, N. Translational control by 5'-untranslated regions of eukaryotic mRNAs. Science. 352 (6292), 1413-1416 (2016).
Dever, T. E., Green, R. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (7), 013706(2012).
Shirokikh, N. E., Preiss, T. Translation initiation by cap-dependent ribosome recruitment: Recent insights and open questions. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 9 (4), 1473(2018).
Jiménez-Díaz, A., Remacha, M., Ballesta, J. P., Berlanga, J. J. Phosphorylation of initiation factor eIF2 in response to stress conditions is mediated by acidic ribosomal P1/P2 proteins in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 8 (12), 84219(2013).
Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
Majmundar, A. J., Wong, W. J., Simon, M. C. Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress. Molecular Cell. 40 (2), 294-309 (2010).
Barraza, C. E., et al. The role of PKA in the translational response to heat stress in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 12 (10), 0185416(2017).
Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: Life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
Jamar, N. H., Kritsiligkou, P., Grant, C. M. The non-stop decay mRNA surveillance pathway is required for oxidative stress tolerance. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6881-6893 (2017).
Chen, Z., et al. The complete pathway for thiosulfate utilization in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology. 84 (22), (2018).
Marzluf, G. A. Molecular genetics of sulfur assimilation in filamentous fungi and yeast. Annual Review of Microbiology. 51, 73-96 (1997).
Miller, D., Brandt, N., Gresham, D. Systematic identification of factors mediating accelerated mRNA degradation in response to changes in environmental nitrogen. PLoS Genetics. 14 (5), 1007406(2018).
Zhang, W., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Regulation of sensing, transportation, and catabolism of nitrogen sources in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 82 (1), (2018).
Tokpohozin, S. E., Fischer, S., Becker, T. Selection of a new Saccharomyces yeast to enhance relevant sorghum beer aroma components, higher alcohols, and esters. Food Microbiology. 83, 181-186 (2019).
Walker, G. M., Stewart, G. G. Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented beverages. Beverages. 2 (4), 30(2016).
Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15(2017).
Jin, H. Y., Xiao, C. An integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome. Methods in Molecular Biology. 1712, 1-18 (2018).
Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3889-3894 (2003).
Lackner, D. H., et al. A network of multiple regulatory layers shapes gene expression in fission yeast. Molecular Cell. 26 (1), 145-155 (2007).
Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-Wide Analysis in Vivo of Translation with Nucleotide Resolution Using Ribosome Profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. Ribosome Profiling: Global Views of Translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), (2019).
Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).
Hussmann, J. A., Patchett, S., Johnson, A., Sawyer, S., Press, W. H. Understanding biases in ribosome profiling experiments reveals signatures of translation dynamics in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences Genetics. 11 (12), 1005732(2015).
Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: A tool for the study of chromatin complexes. Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).
Kage, U., Powell, J. J., Gardiner, D. M., Kazan, K. Ribosome profiling in plants: What is not lost in translation. Journal of Experimental Botany. 71 (18), 5323-5332 (2020).
Shirokikh, N. E., Archer, S. K., Beilharz, T. H., Powell, D., Preiss, T. Translation complex profile sequencing to study the in vivo dynamics of mRNA-ribosome interactions during translation initiation, elongation and termination. Nature Protocols. 12 (4), 697-731 (2017).
Wagner, S., et al. Selective translation complex profiling reveals staged initiation and co-translational assembly of initiation factor complexes. Molecular Cell. 79 (4), 546-560 (2020).
Zlotorynski, E. Profiling ribosome dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (9), 535-535 (2016).
Sen, N. D., Gupta, N., S, K. A., Preiss, T., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Functional interplay between DEAD-box RNA helicases Ded1 and Dbp1 in preinitiation complex attachment and scanning on structured mRNAs in vivo. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8785-8806 (2019).
Zhao, J., Qin, B., Nikolay, R., Spahn, C. M. T., Zhang, G. Translatomics: The global view of translation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (1), 20010212(2019).
Luthe, D. S. A simple technique for the preparation and storage of sucrose gradients. Analytical Biochemistry. 135 (1), 230-232 (1983).
Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Review Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends in Biochemical Sciences. 25 (3), 99-104 (2000).
Schmiedeberg, L., Skene, P., Deaton, A., Bird, A. A Temporal Threshold for Formaldehyde Crosslinking and Fixation. PLoS One. 4 (2), 4636(2009).
Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: A probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping proteinDNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
Bohlen, J., Fenzl, K., Kramer, G., Bukau, B., Teleman, A. A. Selective 40S footprinting reveals cap-tethered ribosome scanning in human cells. Molecular Cell. 79 (4), 561-574 (2020).
Shirokikh, N. E. Translation complex stabilization on messenger RNA and footprint profiling to study the RNA responses and dynamics of protein biosynthesis in the cells. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. , (2021).
Giess, A., et al. Profiling of small ribosomal subunits reveals modes and regulation of translation initiation. Cell Reports. 31 (3), 107534(2020).
Firmino, A. A. P., et al. Separation and paired proteome profiling of plant chloroplast and cytoplasmic ribosomes. Plants (Basel). 9 (7), (2020).
Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Research. 42 (17), 134(2014).
Santos, D. A., Shi, L., Tu, B. P., Weissman, J. S. Cycloheximide can distort measurements of mRNA levels and translation efficiency. Nucleic Acids Research. 47 (10), 4974-4985 (2019).
Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6 (3), 209-217 (2010).
Plénat, F., et al. Formaldehyde fixation in the third millennium. Annales De Pathologie. 21 (1), 29-47 (2001).
Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
Wang, N. S., Minassian, H. The formaldehyde-fixed and paraffin-embedded tissues for diagnostic transmission electron microscopy: A retrospective and prospective study. Human Pathology. 18 (7), 715-727 (1987).
Grifo, J. A., et al. Characterization of eukaryotic initiation factor 4A, a protein involved in ATP-dependent binding of globin mRNA. Journal of Biological Chemistry. 257 (9), 5246-5252 (1982).
Li, Y. Commonly used tag combinations for tandem affinity purification. Biotechnology and Applied Biochemistry. 55 (2), 73-83 (2010).
Blum, S., et al. ATP hydrolysis by initiation factor 4A is required for translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (16), 7664-7668 (1992).
Merrick, W. C. eIF4F: A Retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
Rogers, G. W., Komar, A. A., Merrick, W. C. eIF4A: The godfather of the DEAD box helicases. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 72, 307-331 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kompleks w translacyjnych profilowanie rybosom w kompleksy RNA bia ko utrwalanie formaldehydem frakcjonowanie polisom w sekwencjonowanie RNA analiza sedymentacji mikroskopia elektronowa

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły