Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

3.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62642

⸱

4 maja 2021

 , 
1Cell Biology, University of Bern, 2Department of life sciences and medicine, University of Luxembourg

W tym artykule

Podsumowanie

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Streszczenie

Analiza progresji cyklu komórkowego in vivo jest rutynowo przeprowadzana w badaniach nad genami regulującymi mitozę i replikację DNA. 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) została wykorzystana do zbadania progresji replikacyjnej/fazy S, podczas gdy przeciwciała przeciwko fosfo-histonowi H3 zostały wykorzystane do oznaczania mitotycznych jąder i komórek. Połączenie obu znaczników umożliwiłoby klasyfikację faz G0/G1 (faza przerwy), S (replikatywna) i M (mitotyczna) i posłużyłaby jako ważne narzędzie do oceny wpływu knockdownów genów mitotycznych lub mutantów zerowych na progresję cyklu komórkowego. Jednak odczynniki używane do oznaczania komórek znakowanych EdU są niekompatybilne z kilkoma drugorzędowymi znacznikami fluorescencyjnymi przeciwciał. Komplikuje to barwienie immunologiczne, w którym pierwszorzędowe i znakowane przeciwciała drugorzędowe są używane do oznaczania komórek mitotycznych o pH3-dodatnim. W artykule opisano krok po kroku protokół podwójnego znakowania EdU i pH3 w larwalnych nerwowych komórkach macierzystych Drosophila, systemie szeroko wykorzystywanym do badania czynników mitotycznych. Dodatkowo dostępny jest protokół do analizy obrazu i kwantyfikacji w celu przydzielenia znakowanych komórek do 3 odrębnych kategorii: G0 / G1, S, S>G2 / M (progresja od S do G2 / M) i fazy M.

Wprowadzenie

Cykl podziału komórki składa się z fazy G1 (pierwsza faza przerwy), fazy replikacyjnej/S, G2 (druga faza przerwy) i fazy M (mitotyczna). Przechodząc przez te fazy, komórka przechodzi dramatyczne zmiany w transkrypcji komórkowej, translacji i reorganizacji maszynerii cytoszkieletu1,2. W odpowiedzi na sygnały rozwojowe i środowiskowe komórki mogą tymczasowo przestać się dzielić i przejść w stan spoczynku (G0) lub różnicować się i trwale przestać się dzielić3. Inne scenariusze, takie jak uszkodzenie DNA, mogą powodować przedwczesne różnicowanie lub apoptozę3,4. Reakcja na takie sygnały jest pośredniczona przez punkty kontrolne cyklu komórkowego, które działają jak system nadzoru, aby zapewnić integralność podstawowych procesów komórkowych, zanim komórka przejdzie do następnej fazy cyklu podziału5. Dlatego badania nad genami regulującymi replikację DNA, punktami kontrolnymi i maszynerią mitotyczną muszą analizować możliwe defekty progresji cyklu komórkowego, które mogą wystąpić w zmutowanych komórkach lub po knocku siRNA tych genów. Ponadto takie analizy mogą być wykorzystane do zbadania ogólnego stanu zdrowia komórek, a także odpowiedzi komórek na leczenie farmakologiczne.

5-bromo-2'-deoksyurydyna (BrdU) to analog tymidyny, który jest wprowadzany do DNA podczas replikacji6. Metoda ta była szeroko stosowana do identyfikacji komórek w fazie S. Jednak komórki są następnie poddawane surowym procedurom denaturacji DNA, aby umożliwić wykrycie BrdU poprzez użycie przeciwciał anty-BrdU6. To ostre traktowanie może uszkodzić epitopy komórkowe i uniemożliwić dalszą charakterystykę próbki poprzez barwienie immunologiczne. Włączenie EdU, a następnie wykrycie przez katalizowaną miedzią "reakcję klikania" z małymi, przepuszczalnymi dla komórek, fluorescencyjnie znakowanymi barwnikami azydkowymi eliminuje potrzebę stosowania surowych procedur denaturacji7. Metoda ta okazała się zatem bardziej praktyczną alternatywą dla inkorporacji BrdU.

Ponadto, pH3 zostało opisane jako niezawodny marker dla komórek mitotycznej/fazy M8. Histone H3 jest rdzeniowym białkiem histonowym związanym z DNA, które ulega fosforylacji mniej więcej w późnej fazie G2 do wczesnej fazy M i ulega defosforylacji pod koniec anaphase8. Kilka komercyjnych przeciwciał można wykorzystać do wykrywania pH3 przy użyciu standardowych protokołów barwienia immunologicznego. Podwójne barwienie EdU i pH3 umożliwiłoby zatem wykrywanie komórek zarówno w fazie S, jak i M. Ponadto komórki w fazie G1 i wczesnej fazie G2 nie barwiłyby się dodatnio dla żadnego z markerów.

Neuronalne komórki macierzyste lub neuroblasty (NB) Drosophila oferują dobrze scharakteryzowany model komórek macierzystych, w którym komórki dzielą się asymetrycznie, tworząc jedną identyczną samoodnawiającą się NB i komórkę macierzystą zwoju (GMC), która jest przeznaczona do różnicowania9. Ponadto kilka narzędzi genetycznych i przeciwciała specyficzne dla NB sprawiają, że system ten nadaje się do manipulacji genetycznych i obrazowania żywych komórek. W związku z tym w kilku badaniach wykorzystano NB do badania genów regulujących asymetryczne podziały i determinację losu komórki9. Odrębne populacje NB istnieją w centralnej części mózgu (CB) i płacie wzrokowym (OL) mózgu larwalnego9; W niniejszym badaniu wykorzystano CB NB. Te larwy CB NB w trzecim stadium rozwojowym są dużymi komórkami, które nadają się również do badania czynników regulujących składanie wrzecion mitotycznych. Protokół analizy defektów progresji cyklu komórkowego byłby kluczowym narzędziem w takich badaniach.

Opublikowane wcześniej protokoły wykorzystywały komercyjne zestawy, takie jak Click-iT EdU Alexa Fluor Proliferation Kit, które dostarczają kilka składników reakcji i barwników azydkowych oznaczonych różnymi barwnikami Alexa Fluor do włączania i wykrywania EdU10. Jednak odczynniki dostarczane z takimi zestawami nie są kompatybilne z niektórymi znacznikami fluorescencyjnymi, często stosowanymi z przeciwciałami drugorzędowymi. Ten zestaw do wykrywania EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit dostarczony z sprzężonym barwnikiem azydkowym Alexa Fluor 647) został przetestowany na NB larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym, a następnie próbowano współbarwienia przeciwciałami przeciwko pH3 i Miranda, markerowi NB. Co więcej, przeciwciała drugorzędowe znakowane Alexa Fluor 568 lub Cy3 zostały użyte do wykrywania znakowania Mirandy na błonie plazmatycznej NBs11. Jednak oczekiwana intensywność sygnału i wzór barwienia (wyniki niepublikowane) nie zostały zaobserwowane w przypadku tych przeciwciał drugorzędowych, gdy barwienie immunologiczne przeprowadzono po wykryciu EdU.

Do inkorporacji EdU, protokół opisany przez Daula i współpracowników wymagał karmienia larw pożywką Kankel-White zmieszaną z EdU i błękitem bromofenolowym (BPB)10. Larwy żywiły się pokarmem z dodatkiem EdU i BPB, który można było zobaczyć po jego niebieskim kolorze po spożyciu w jelicie larwalnym. Chociaż metoda ta została użyta do włączenia EdU do larw Mms19 z utratą funkcji (Mms19P) w trzecim stadium rozwojowym, larwy Mms19P najwyraźniej nie żerowały, ponieważ w jelicie larwy prawie nie wykryto niebieskiego koloru (niepublikowane wyniki). Larwy Mms19P wykazują drastyczne deformacje rozwojowe i ostatecznie zatrzymują się w trzecim stadium rozwojowym. Może to w jakiś sposób wpłynąć na zachowanie żywieniowe larw trzeciego stadium rozwojowego i sprawić, że protokół żywienia EdU nie będzie odpowiedni w takich przypadkach.

Po przestudiowaniu dostępnej literatury i intensywnej pracy nad standaryzacją podstawowych kroków, zaproponowano alternatywne podejście do podwójnego znakowania EdU/pH3 u Drosophila NBs, które nie wymaga karmienia larw EdU. W poprzednim badaniu zastosowano podwójne barwienie EdU/pH3 do analizy cyklu komórkowego w NBs, ale nie przedstawiono szczegółowego protokołu4. Stanowi to niepotrzebną przeszkodę dla laboratoriów próbujących wdrożyć tę metodę. Ponadto ocena kompatybilności różnych odczynników z zestawem EdU i przeprowadzanie dalszej optymalizacji może być czasochłonnym procesem. W artykule przedstawiono krok po kroku protokół, który obejmuje inkorporację EdU w wypreparowanych mózgach larw i barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-pH3, a następnie mikroskopię konfokalną i analizę obrazu w celu przypisania NB do czterech odrębnych kategorii: faza G0 / G1, faza S, S>G2 / M (progresja od S do G2 / M) i faza M. Przedstawiono kroki, które wymagają optymalizacji, oraz podano wskazówki dotyczące analizy obrazów dużych zestawów danych. Dodatkowo odczyt EdU/pH3 w NB typu dzikiego jest analizowany i porównywany z NB Mms19P, które ostatnio wykazały opóźnienie cyklu komórkowego11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników i zapasów do testu Click-it EdU

UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów i Tabelą 1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zestawu i odczynników dostarczonych z zestawem.

  1. Doprowadzić fiolki do temperatury pokojowej przed przygotowaniem roztworów.
  2. Przygotować 10 mM roztworu podstawowego EdU (składnik A), dodając 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO, składnik C). Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotuj roztwór roboczy Alexa Fluor 647-azide (składnik B), dodając 70 μl DMSO (składnik C). Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Przygotować 1x roztwór buforu reakcyjnego Click-iT EdU (składnik D) mieszając 4 ml tego roztworu z 36 ml wody dejonizowanej. Pozostały roztwór przechowywać w temperaturze 2-6 °C.
  5. Przygotuj 10-krotny zapas (200 mg/ml) dodatku buforowego Click-iT EdU (składnik F), dodając 2 ml wody dejonizowanej. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Przechowywać Hoechst 33342 (składnik G) w temperaturze 2-6 °C. Przechowywać DMSO (składnik C) w eksykatorze w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Do obsługi DMSO i Hoechst należy używać rękawic.

2. Sekcja mózgów larwalnych trzeciego stadium rozwoju i inkorporacja EdU

UWAGA: Protokół sekcji mózgu został opisany wcześniej12. Przed rozpoczęciem sekcji należy upewnić się, że przygotowana i rozmrożona została wystarczająca ilość roztworów EdU i PFA, jak opisano w ppkt 2.6 i 3.1.

  1. Przygotuj 10x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), dodając 25,6 g Na2HPO 4,7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl i 2 g KH2PO4 do 1 l wody dejonizowanej. Dostosuj pH do 7,4, a następnie przygotuj 1x roztwór w wodzie dejonizowanej.
  2. Dodaj pożywkę preparacyjną Schneidera (SM) do dwóch kolejnych wgłębień szklanej (3 lub 9) szklanej płytki punktowej z wgłębieniem. Dodaj 1x PBS do następnego kolejnego wgłębienia.
  3. Za pomocą kleszczy wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego i umieść je na chusteczce zwilżonej PBS, aby usunąć resztki pokarmu dla much. Umieść larwę w zagłębieniu z PBS, a następnie w kolejnym zagłębieniu z SM.
  4. Za pomocą cienkich kleszczy usuń 3/4 dolnej części ciała larwy.
    1. Delikatnie chwyć haczyki do ust larw jedną parą kleszczy i przytrzymaj naskórek na drugim końcu drugą parą kleszczy.
    2. Odwróć głowę larwy na lewą stronę, wciskając do środka haczyki gębowe i jednocześnie odrywając tkankę na drugim końcu.
  5. Obserwuj mózg larwy z przyczepionymi wyimaginowanymi dyskami. Usuń inne tkanki przyczepione do mózgu i przenieś mózg do następnego kolejnego depresją z SM.
  6. Rozmrozić roztwór podstawowy 10 mM EdU. Przygotować roztwór o stężeniu 100 μM, rozcieńczając ten 10 mM zapas w SM.
  7. Dodać 100 μL tego 100 μM roztworu EdU+SM w innym wgłębieniu na płytce Pyrex. Inkubować ~ 5-10 wypreparowanych mózgów w 100 μL 100 μM roztworu EdU+SM przez 2 godziny w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: Ponieważ NB dzielą się raz na ~2 godziny, protokół ten ma na celu analizę jednego pełnego cyklu komórkowego. Do dalszych kroków używaj tylko nienaruszonych mózgów. Wyrzuć mózgi, które zostały uszkodzone podczas sekcji.

3. Utrwalenie i barwienie immunologiczne

  1. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) w dygestorium.
    1. Dodać 4 g proszku paraformaldehydu do 80 ml 1x PBS w zlewce umieszczonej na mieszadle magnetycznym i podgrzać do 60 °C. Aby rozpuścić PFA, dodaj kilka kropli 1 N NaOH. Sprawdź pH i w razie potrzeby dostosuj do 7,0 za pomocą kilku kropli 1 M HCl.
    2. Dostosuj objętość do 100 ml za pomocą 1x PBS. Podwielokrotnić roztwór PFA i przechowywać w temperaturze 2-6 °C przez okres do 1 miesiąca. Dodać 0,3% niejonowego detergentu (patrz tabela materiałów) do roztworu PFA, aby skutecznie utrwalić duże tkanki, takie jak mózg larwy.
  2. Po włączeniu EdU przenieś mózgi do probówek mikrowirówek o pojemności 0,6 ml zawierających 4% PFA. Inkubować w temperaturze pokojowej na nutatorze przez 15 minut. Postukaj w probówkę na stole laboratoryjnym, aby mózgi osiadły na dnie probówki.
  3. Usuń PFA i umyj 3 razy PBS + 0,3% detergentem niejonowym (PBST) w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że każde pranie trwa co najmniej 10 minut na nutatorze. Po ostatnim przemyciu usunąć PBST, dodać roztwór blokujący (PBST + 5% albuminy surowicy bydlęcej) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Rozcieńczyć przeciwciało anty-Miranda (1:250) i przeciwciało anty pH3 (1:200) w PBST (oba przeciwciała w tej samej probówce). Usuń bufor blokujący i dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała. Inkubować przez noc w temperaturze 2-6 °C na nutatorze.
    UWAGA: Miranda jest białkiem błonowym obecnym na CB NB. Służy do identyfikacji tych dużych okrągłych komórek w regionie CB 13.
  5. Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć 3 razy PBST. Upewnij się, że każde pranie trwa 10 minut na nutatorze w temperaturze pokojowej.
  6. Przygotuj drugorzędowy roztwór przeciwciała, dodając rozcieńczony w 1:500 anty-Rabbit Alexa Fluor 488 i anty-Rat Alexa Fluor 568 do PBST. Usuń PBST i dodaj drugorzędowy roztwór przeciwciała do wypreparowanych mózgów. Inkubować przez noc w temperaturze 2-6 °C w ciemności, na nutatorze i przemyć 3 razy PBST (krok 3.5).

4. Wykrywanie EdU, barwienie DNA i montaż

  1. Aby przygotować koktajl detekcyjny EdU, wymieszaj składniki (patrz Tabela 2) w probówce o pojemności 1,5 ml.
  2. Po ostatnim praniu (krok 3.6) usuń PBST i dodaj koktajl detekcyjny EdU do wypreparowanych mózgów. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut na nutatorze. Umyj 2 razy PBST przez 10 minut każdy, w ciemności.
  3. Do barwienia DNA rozcieńczyć Hoechst 33342 (składnik G) w stosunku 1:2 000 w PBST, aby przygotować roztwór o stężeniu 5 μg/ml.
  4. Po drugim przemyciu (krok 4.2) usunąć PBST i dodać 500 μl 5 μg/ml roztworu Hoechsta do wypreparowanych mózgów. Inkubować w ciemności przez 10 minut. Usunąć Hoechst i przemywać raz PBST przez 10 minut.
  5. Postukaj rurką o stół laboratoryjny i pozwól mózgom się uspokoić. Wyjmij PBST z probówki, ale zostaw tylko 50-100 μL.
  6. Odetnij końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 200 μl i ostrożnie przenieś mózg na czyste szklane szkiełko. Usunąć nadmiar PBST ze szkiełka poprzez osuszenie paskami bibuły filtracyjnej. Uważaj, aby bibuła filtracyjna nie dotknęła mózgu.
  7. Umieść kroplę rozpuszczalnego w wodzie, niefluorescencyjnego podłoża montażowego na mózg i ustaw mózg tak, aby brzuszny rdzeń nerwowy był skierowany w stronę szkiełka, a płaty skierowane do góry. Ułóż mózgi w jednym pliku, aby łatwiej było je obrazować szeregowo.
  8. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na mózgu. Umieść szkiełko w temperaturze 2-6 °C na noc.
    UWAGA: Podłoże montażowe twardnieje po nocnym przechowywaniu, dzięki czemu nie ma potrzeby uszczelniania szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.

5. Obrazowanie

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat laserowego mikroskopu skaningowego i obiektywu zanurzeniowego w oleju używanego w tym protokole.

  1. W oprogramowaniu Acquisition wybierz obiektyw 63x.
  2. Nałóż kroplę olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe tuż nad zamontowanymi mózgami, aby ułatwić zlokalizowanie tkanki przez okular.
  3. Korzystając z kanału DAPI/Hoechst 33342, znajdź mózg przez okular, a następnie przełącz się w tryb akwizycji w oprogramowaniu.
  4. Skonfiguruj 4 kanały do obrazowania Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) i Alexa Fluor 647 (EdU). Skorzystaj z narzędzia dye-assistant, które automatycznie konfiguruje lasery wzbudzające i filtry emisyjne dla wybranych barwników.
  5. Ustaw pole widzenia tak, aby obejmowało cały płat mózgu. Wyobraź sobie całą objętość płata mózgowego, uzyskując stosy z oddalone od siebie o 0,8 μm. Przechowuj wszystkie obrazy z sesji obrazowania w formacie biblioteki *.lif.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Poniższe kroki opisują analizę pozyskanych obrazów i sposób sortowania komórek na fazę G0/G1, fazę S, S>G2/M (progresja od S do G2/M) i fazę M za pomocą oprogramowania ImageJ.

  1. Pobierz Fidżi (Fidżi to ImageJ) z następującego adresu URL: https://fiji.sc/. Otwórz Fidżi, a następnie przeciągnij i upuść pliki .lif do Fiji.
    UWAGA: Fiji to wersja ImageJ, która jest fabrycznie zainstalowana z kilkoma wtyczkami14. Przeniesienie plików .lif na Fidżi otworzy wtyczkę Bio-formats, która jest potrzebna do przetworzenia plików .lif. Wtyczka Bio-formats jest również wymagana do otwierania plików obrazów wygenerowanych przez niektóre inne marki mikroskopów, np. plików nd2 wygenerowanych za pomocą mikroskopu Nikon. Ta wtyczka jest preinstalowana na Fidżi.
  2. Wybierz Przeglądarkę danych z zakładki przeglądania stosu i użyj wirtualnego stosu z zakładki zarządzania pamięcią w wtyczce bio-formats.
    UWAGA: Pliki Lif ze stosami z 8-10 mózgów mają często rozmiar 300-400 megabajtów. Na komputerach z małą ilością pamięci RAM otwarcie kilku takich plików może szybko wyczerpać dostępną pamięć RAM w ImageJ i uniemożliwić dalsze przetwarzanie obrazu. Wirtualny stos jest "tylko do odczytu", nie wymaga dużej ilości pamięci RAM do przetwarzania i jest idealną opcją do ładowania dużych zbiorów danych na Fidżi.
  3. Obserwuj wielokanałowy obraz wyświetlany w ImageJ. Zmień kolor kanałów na pasku menu za pomocą narzędzia Obraz | kolor | kanały. Obserwuj NB oznaczone przez Mirandę jako duże okrągłe komórki w obszarze CB.
  4. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia elipsy nad każdym NB, aby uniknąć dwukrotnego liczenia NB.
    1. Z paska menu ImageJ wybierz pozycję Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji. Zaznacz wszystkie NB w bieżącej sekcji Z i naciśnij t po zaznaczeniu każdej komórki.
  5. Po zaznaczeniu wszystkich NB w bieżącej sekcji Z, zmień kanały na pH3 i EdU i ręcznie policz liczbę NB EdU-dodatnich, NB dodatnich pH3, NB barwiących dodatnio zarówno dla EdU, jak i pH3 oraz NB niebarwiących dla obu markerów.
  6. Wyszukaj jednostki podziału na wartości w kolejnych sekcjach Z, usuń stare wskaźniki zwrotu z inwestycji i dodaj nowe wskaźniki zwrotu z inwestycji, aby policzyć jednostki NB w różnych stosach.
  7. Przygotuj arkusz kalkulacyjny z następującymi kolumnami: 1. EdU- pH3-: ta sekcja reprezentuje komórki podwójnie ujemne, które znajdują się w fazie G0/G1 cyklu komórkowego; 2. EdU+: komórki z tej kategorii mają włączone EdU i przechodzą replikację DNA (faza S); 3. EdU + pH3 +: te podwójnie dodatnie komórki zakończyły fazę S i przeszły do fazy G2 lub M; 4. pH3+: te NB przechodzą mitozę.
  8. Oblicz procentową zawartość NB obecnych we wszystkich powyższych 4 kategoriach dla każdego płata. Przygotuj wykres słupkowy za pomocą arkusza kalkulacyjnego przedstawiającego zbiorcze dane dla procentów jednostek notyfikowanych w każdej kategorii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dwupłatowy mózg larwy Drosophila w trzecim stadium rozwojowym jest wykorzystywany jako modelowy system do badania podstawowych procesów komórkowych i rozwojowych9. Celem niniejszego badania było przedstawienie protokołu analizy przebiegu cyklu komórkowego w neuroblastach (NB) regionu CB, znakowanych EdU i pH3 (Rycina 1). Neuroblasty CB dzielą się na typ I i typ II i wykazują charakterystyczny wzór podziału asymetrycznego9. Każdy podzia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Włączenie EdU i jego następcza reakcja "klik" z przepuszczalnym dla komórek azydkiem przedstawia praktyczne zalety tej techniki w porównaniu z metodą BrdU zastosowaną wcześniej7. Jednak reakcja ta jest katalizowana przez jony Cu(I), a kilka barwników może być niestabilnych w obecności tego katalizatora miedziowego, co jest wyraźnie zalecane przez producenta zestawu Click-it EdU. Gdy eksperymenty z barwieniem immunologicznym przeprowadzono po wykonaniu etapu detekcji EdU, oczekiwana intensywność sy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (grant na projekt 31003A_173188; www.snf.ch) i Uniwersytetu w Bernie (www.unibe.ch) dla BS. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)Bloomington stock center#15477Wstawienie elementu P w trzecim eksonie Mms19
 +; Mms19::eGFP, Mms19pGenerowane w domubiałko Mms19 oznaczone eGFP wyrażone w tle Mms19p
w1118Bloomington stock center#3605stado typu dzikiego (w;+;+)
PrzeciwciałaRozcieńczenie
Szczur anty-MirandaAbcamAb1977881/250
Królicza sygnalizacja komórkowa anty-pH397011/200
Przeciwciała drugorzędowe
Goat anty-Rat Cy3Jackson Immuno112-165-1671/150
Goat anti-Rat Alexa Fluor 568InvitrogenA110771/500
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA270341/500
Reagent/Kit
Medium montażowe Aqua Poly/MountPolysciences Inc18606-20
Zestaw montażowy Click-it EdU, Alexa Flour 647Thermo Fischer ScientificC10340
Schneider' s Drosophila mediumThermo Fischer Scientific21720-024
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) frakcja VMerck10735078001
Triton X-100Fischer Scientific9002-93-1niejonowy detergent
Software
Fiji (Imagej)https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)Oprogramowanie PRISM Graphpad firmy Leica microsystems
Wersja 5
Microsoft ExcelOffice2016
Equipment
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Leica TCS SP8 z 63-krotnym zanurzeniem w oleju, obiektyw
Materiały
Aqua Poly/Mount mediumrozpuszczalne w wodzie, niefluorescencyjne medium montażowe
Pyrex 3 lub 9 wgłębienie szklana płyta
bibuła
pierwszorzędowe Microsoft planapochromatyczny 1,4 NA montażowe punktowa filtracyjna Whatman

Bibliografia

  1. Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
  2. Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
  3. Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
  4. Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894(2015).
  5. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  6. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  7. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  8. Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
  9. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  10. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461(2010).
  11. Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913(2020).
  12. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
  13. Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
  16. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
  17. Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
  18. Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015(2012).
  19. Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
  20. Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
  21. Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
  22. Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
  23. Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
  24. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  25. Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
  26. Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517(2017).
  27. Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
  28. Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza cyklu kom rkowegoznakowanie EdUwyciszanie gen w mitotycznychprotok immunobarwieniaanaliza obrazu w programie Fijikwantyfikacja neuroblast wmarkery replikacji DNA
Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.