Artykuł metodologiczny

Ocena in vitro przeprogramowania serca poprzez pomiar specyficznego dla serca strumienia wapnia za pomocą reportera GCaMP3

DOI:

10.3791/62643

⸱

22 lutego 2022

 ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj, założenie i zastosowanie mysiej linii reporterowej Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (określanej poniżej jako αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) do oceny przeprogramowania serca. Noworodkowe fibroblasty serca (NCF) wyizolowane ze szczepu myszy są przekształcane w indukowane kardiomiocyty (iCM), co pozwala na wygodną i efektywną ocenę skuteczności przeprogramowania i funkcjonalnego dojrzewania iCM poprzez strumień wapnia (Ca2+).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprogramowanie serca stało się potencjalnie obiecującą terapią naprawy uszkodzonego serca. Poprzez wprowadzenie wielu czynników transkrypcyjnych, w tym Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblasty mogą zostać przeprogramowane w indukowane kardiomiocyty (iCM). Te iCM, gdy są generowane in situ w sercu z zawałem, integrują się elektrycznie i mechanicznie z otaczającym mięśniem sercowym, prowadząc do zmniejszenia rozmiaru blizny i poprawy funkcji serca. Ze względu na stosunkowo niską wydajność przeprogramowywania, czystość i jakość iCM, charakterystyka iCM pozostaje wyzwaniem. Obecnie stosowane metody w tej dziedzinie, w tym cytometria przepływowa, immunocytochemia i qPCR, koncentrują się głównie na ekspresji genów i białek specyficznych dla serca, ale nie na funkcjonalnym dojrzewaniu iCM. Wyzwalane potencjałami czynnościowymi otwarcie kanałów wapniowych bramkowanych napięciem w kardiomiocytach prowadzi do szybkiego napływu wapnia do komórki. Dlatego ilościowe określenie szybkości napływu wapnia jest obiecującą metodą oceny funkcji kardiomiocytów. W tym przypadku protokół wprowadza metodę oceny funkcji iCM za pomocą strumienia wapnia (Ca2+). Szczep myszy αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 został utworzony przez skrzyżowanie Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J (określanego poniżej jako Myh6-Cre) z Gt (ROSA)26Sor tm38 (CAG-GCaMP3) Hze / J (określanym jako Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 poniżej). Noworodkowe fibroblasty serca (NCF) od nowonarodzonych myszy P0-P2 wyizolowano i hodowano in vitro, a do NCF wprowadzono polistroniczną konstrukcję MGT, co doprowadziło do ich przeprogramowania do iCM. Ponieważ tylko pomyślnie przeprogramowane iCM będą wyrażać reporter GCaMP3, funkcjonalne dojrzewanie iCM można wizualnie ocenić za pomocą strumienia Ca2+ za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W porównaniu z nieprzeprogramowanymi NCF, NCF-iCM wykazywały znaczny przejściowy strumień wapnia i spontaniczne kurczenie się, podobnie jak CM. Protokół ten szczegółowo opisuje ustalenie szczepu myszy, izolację i selekcję nowonarodzonych serc myszy, izolację NCF, produkcję retrowirusa do przeprogramowania serca, indukcję iCM, ocenę strumienia iCM Ca2 + przy użyciu naszej linii reporterowej oraz powiązaną analizę statystyczną i prezentację danych. Oczekuje się, że opisane tutaj metody będą stanowić cenną platformę do oceny funkcjonalnej dojrzałości iCM na potrzeby badań nad przeprogramowaniem serca.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zawał mięśnia sercowego (MI) jest ciężką chorobą na całym świecie. Choroby układu krążenia (CVD) są główną przyczyną zgonów na całym świecie i odpowiadają za około 18,6 miliona zgonów w 2019 roku1,2. Całkowita śmiertelność z powodu chorób układu krążenia zmniejszyła się w ciągu ostatniego półwiecza. Jednak w niektórych krajach słabo rozwiniętych tendencja ta została spowolniona lub nawet odwrócona1, co wzywa do skuteczniejszego leczenia chorób układu krążenia. Jako jeden ze śmiertelnych objawów chorób układu krążenia, MI odpowiada za około połowę wszystkich zgonów przypisywanych chorobom układu krążenia w Stanach Zjednoczonych2. Podczas niedokrwienia, przy zablokowaniu tętnic wieńcowych i ograniczonym dopływie zarówno składników odżywczych, jak i tlenu, mięsień sercowy ulega poważnym zmianom metabolicznym, upośledza skurczową funkcję kardiomiocytów (CM) i prowadzi do śmierci CM3. Badano liczne podejścia w badaniach sercowo-naczyniowych w celu naprawy uszkodzenia serca i przywrócenia funkcji uszkodzonego serca4. Bezpośrednie przeprogramowanie serca okazało się jedną z obiecujących strategii naprawy uszkodzonego serca i przywrócenia jego funkcji5,6. Wprowadzając Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblasty mogą zostać przeprogramowane na iCM in vitro i in vivo, a te iCM mogą zmniejszyć obszar blizny i poprawić czynność serca7,8.

Chociaż przeprogramowanie serca jest obiecującą strategią leczenia zawału serca, nadal istnieje wiele wyzwań. Po pierwsze, wydajność, czystość i jakość przeprogramowywania nie zawsze są tak wysokie, jak oczekiwano. Indukcja MGT może osiągnąć tylko 8,4% (cTnT+) lub 24,7% (αMHC-GFP+) wszystkich CF, które mają zostać przeprogramowane na iCM in vitro7, lub do 35% in vivo8, co ogranicza jego zastosowanie. Nawet przy większej liczbie czynników indukowanych w systemie, takich jak Hand29 lub Akt1/PKB10, wydajność przeprogramowania jest nadal ledwo zadowalająca do zastosowania w warunkach klinicznych. W związku z tym potrzebne są dalsze badania skoncentrowane na poprawie wydajności przeprogramowywania w tej dziedzinie. Po drugie, integralność elektryczna i charakterystyka skurczu iCM są ważne dla skutecznej poprawy funkcji serca, jednak są one trudne do oceny. Obecnie szeroko stosowane metody oceny w tej dziedzinie, w tym cytometria przepływowa, immunocytochemia i qPCR ekspresji niektórych kluczowych genów CMs, koncentrują się na podobieństwie iCM i CMs, ale nie są bezpośrednio związane z funkcjonalnymi cechami iCMs. Co więcej, metody te mają stosunkowo skomplikowane procedury i są czasochłonne. Podczas gdy badania nad przeprogramowaniem zwykle obejmują badanie przesiewowe potencjalnych czynników przeprogramowujących, które sprzyjają dojrzewaniu iCMs11, przeprogramowanie serca wymaga szybkiej i wygodnej metody opartej na funkcji iCMs.

CMs otwierają bramkowane napięciem kanały jonów wapnia na cytomembranie podczas każdego cyklu kurczenia, co prowadzi do przejściowego napływu jonu wapnia (Ca2+) z płynu międzykomórkowego do cytoplazmy, aby uczestniczyć w skurczu miofilamentu. Taki cykl napływu i odpływuCa2+ jest podstawową cechą skurczu mięśnia sercowego i stanowi normalną funkcję CMs12. W związku z tym metoda wykrywająca napływ Ca2+ może być potencjalnym sposobem pomiaru funkcji CM i komórek podobnych do CM, w tym iCM. Co więcej, w przypadku iCM taka metoda zapewnia inny sposób oceny wydajności przeprogramowania.

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) zostały opracowane i szeroko stosowane do wskazywania aktywności komórek, zwłaszcza potencjałów czynnościowych. Ogólnie rzecz biorąc, GECI składają się z domeny wiążącej Ca2+, takiej jak kalmodulina, oraz domeny fluorescencyjnej, takiej jak GFP, a GCaMP3 to domena o wysokim powinowactwie i intensywności fluorescencji. Domena fluorescencyjna GCaMP3 zostanie aktywowana, gdy lokalne stężenie wapnia zostanie zmienione13. W tym artykule opisano szczep myszy, który specyficznie eksprymuje reporter GCaMP3 w komórkach Myh6+. Wprowadzając MGT do izolowanych NCF od noworodków tego szczepu, przeprogramowanie może być monitorowane za pomocą fluorescencji, którą pomyślnie przeprogramowane iCM będą wykazywać. Taki szczep myszy i metoda będą stanowić cenną platformę do badania przeprogramowania serca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymentalne procedury i praktyki z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Michigan. Wszystkie procedury eksperymentalne i praktyki związane z hodowlą komórkową muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego BSL2 w sterylnych warunkach. W przypadku procedur i praktyk związanych z wirusami przestrzegano wytycznych dotyczących prawidłowego usuwania transfekowanych komórek, końcówek pipet i probówek, aby uniknąć ryzyka zagrożeń dla środowiska i zdrowia.

1. Ustanowienie szczepu myszy Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (określanego jako Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) (Rysunek 1)

  1. Przygotuj odpowiednio szczep myszy Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (Jackson lab stock 009074, określany jako Myh6-Cre) i Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (Jackson lab stock 014538, określany jako Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3).
  2. Wyhoduj każdą odmianę w wieku do 8 tygodni, aby uzyskać odpowiednio dorosłe myszy Myh6-Cre i Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
  3. Krzyżuj dorosłe myszy Myh6-Cre i Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
    UWAGA: Skonfiguruj Myh6-Cre męski/żeński Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 lub odwrotnie. Nie ma znaczącej różnicy między ich potomkami. Zazwyczaj samice myszy rodzą 8-10 szczeniąt 19-21 dni po krzyżowaniu.

2. Izolacja i selekcja noworodków Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 serc myszy.

  1. Zdobądź szczenięta P0-P2. Upewnij się, że obecnych jest 8-10 szczeniąt, aby wyizolować 10 milionów NCF za pomocą tego protokołu.
  2. Głęboko znieczulił szczenięta przez hipotermię. Umieść szczenięta w rękawicy lateksowej i zanurz po szyję w kruszonym lodzie i wodzie (2°C - 3°C).
  3. Krótko zdezynfekuj szczenięta 75% etanolem.
  4. Skłoń szczenięta w ofierze przez ścięcie sterylnymi nożyczkami.
  5. Wykonaj poziome nacięcie w pobliżu serca, ściśnij serce, a następnie odizoluj je, oddzielając się u nasady aorty nożyczkami.
  6. Obserwuj bicie serca pod mikroskopem fluorescencyjnym. Upewnij się, że serca o genotypie Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 wykazują strumień Ca2+ wskazywany przez GCaMP3 z biciem serca. Pozostałe genotypy nie wykazują fluorescencji (Rysunek 2, Wideo 1 i Wideo 2).

3. Izolacja noworodków z fibroblastami serca (NCF)

UWAGA: W tej części protokół z Lab14 został przyjęty z niewielkimi optymalizacjami, jeśli ma to zastosowanie w tym badaniu.

  1. Po wyizolowaniu serc αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 pokrój je na cztery części, które są luźno połączone. Umyj je kilkakrotnie dokładnie w lodowatym DPBS na 6 cm talerzu, aby ograniczyć zanieczyszczenie komórek krwi w izolowanych komórkach.
  2. Przenieś serca do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Trawić serca za pomocą 8 ml ciepłej 0,25% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  4. Odrzuć supernatant trypsyny i dodaj 5 ml ciepłej kolagenazy typu II (0,5 mg/ml) do HBSS.
  5. Mieszaninę dokładnie zmieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  6. Po inkubacji dokładnie zwiruj i pozwól, aby niestrawiona tkanka osiadła grawitacyjnie.
  7. Zebrać supernatant w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z 5 ml pożywki z zimnego fibroblastu (FB) (IMDM z 20% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny).
  8. Powtórz kroki 3.4-3.7 dla niestrawionej tkanki 4-5 razy.
  9. Zebrać cały sklarowany osad i przefiltrować go za pomocą sitka o średnicy 40 μm.
  10. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  11. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml aktywowanego magnetycznie buforu do sortowania komórek (bufor MACS; 1x PBS z 2 mM EDTA i 0,5% BSA).
  12. Określ liczbę żywotnych komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
    1. Weź 10 μl komórek z 10 ml zawiesiny komórek w kroku 3.11.
    2. Wymieszać z 10 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Dodaj mieszaninę do hemocytometru i określ liczbę żywotnych komórek. Martwe komórki są barwione na niebiesko, podczas gdy żywe komórki są niebarwione.
  13. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  14. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 μl mikrogranulek Thy1,2 w 90 μl schłodzonego bufora MACS, aby uzyskać mniej niż 10 milionów żywotnych komórek. Dodaj proporcjonalnie więcej koralików, jeśli jest więcej niż 10 milionów żywotnych komórek. Dobrze odpipetować mieszaninę i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30-60 minut.
  15. Dodaj 10 ml buforu MACS i dobrze wymieszaj.
  16. Wirować przy 200 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant.
  17. Powtórz kroki 3.15-3.16 raz.
  18. Ponownie zawiesić komórki i kulki za pomocą 2 ml buforu MACS.
  19. Ustaw separator MACS w okapie. Włożyć kolumnę LS do separatora i zrównoważyć kolumnę z 3 ml buforu MACS.
  20. Gdy kolumna LS jest zrównoważona, przepuść komórki przez kolumnę.
  21. Przemyć kolumnę LS trzykrotnie 2 ml buforu MACS.
  22. Zdjąć kolumnę z separatora, wymyć ją trzykrotnie 2 ml buforu MACS, a następnie zebrać elucję do probówki o pojemności 50 ml.
  23. Wirować przy 200 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
  24. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml pożywki FB.
  25. Określ numer komórki za pomocą hemocytometru.
  26. Rozcieńczyć komórki pożywką FB i według uznania umieścić komórki na szalkach lub płytkach. Upewnij się, że gęstość wysiewu komórek wynosi około 2-2,5 x 104 komórek/cm2 (zoptymalizuj gęstość na podstawie indywidualnych eksperymentów). Upewnij się, że przyczepione fibroblasty mają kształt od owalnego do okrągłego na drugi dzień po wysiewie (Rysunek 3).

4. Produkcja retrowirusa kodującego policistroniczny wektor MGT do przeprogramowania serca

  1. Utrzymuj Plat-E z pożywką hodowlaną Plat-E (DMEM uzupełniony 10% FBS, 1 μg/ml puromycyny i 10 μg/ml blasticydyny) w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. W dniu 1 podziel Plat-E na 6-dołkową płytkę o gęstości około 4-5 x 105 komórek/studzienkę.
  3. W dniu 2 Plat-E zazwyczaj osiąga 80% konfluencji. Transfekuj komórki zgodnie z następującymi procedurami. Dostosuj objętość i ilość każdego pierwiastka obecnego tutaj w oparciu o każdą studzienkę w 6-dołkowej płytce.
    1. Rozcieńczyć 2 μg policistronicznego wektora plazmidowego ekspresji retrowirusa pMX-puro-MGT (Addgene 111809) do 500 ng/μL buforem TE.
    2. Przygotować mieszaninę transfekcji, mieszając 10 μl lipofetaminy ze 150 μl zredukowanej pożywki surowicy. Ostrożnie odpipetować do dobrego wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Należy uważać, aby podczas pipetowania nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza.
    3. W międzyczasie należy przygotować mieszaninę plazmidu, mieszając plazmid ze 150 μl zredukowanej pożywki surowicy. Ostrożnie odpipetować do dobrego wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Należy uważać, aby podczas pipetowania nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza.
    4. Ostrożnie wymieszaj obie mieszaniny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Roztwór może wydawać się mętny.
    5. Dodawać mieszaninę kropla po kropli do komórek, które mają być transfekowane.
    6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc.
  4. W dniu 3 zmień pożywkę na świeżą, kompletną pożywkę do hodowli komórkowej pozbawioną puromycyny i blasticydyny.
  5. W 4 dniu, 48 godzin po transfekcji, zebrać supernatant zawierający retrowirusa i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
  6. W 5 dniu, 72 godziny po transfekcji, zebrać supernatant zawierający retrowirusa.
  7. Przefiltrować zarówno 48 godzin, jak i 72 godzin supernatant za pomocą filtra 0,45 μm, wytrącić przez noc w temperaturze 4 °C, dodając 1/5 objętości 40% roztworu poli(glikolu etylenowego) (PEG), aby uzyskać końcowe stężenie 8% PEG.
  8. Wirować przy 4 000 x g przez 30 minut w celu wytrącenia wirusa.
    UWAGA: PEG8000-wirus tworzy małe białe opady.
  9. W razie potrzeby zawiesić wirusa za pomocą pożywki iCM zawierającej 8 μg/ml polibrenu. Retrowirusa należy natychmiast użyć.

5. Przeprogramowanie NCF na iCM z MGT kodującym infekcję retrowirusową

  1. Wzrost lub przejście NCF przed infekcją wirusową.
    UWAGA: Zazwyczaj NCF może być przepuszczony dwukrotnie.
  2. W dniu 0 wysiewać NCF do gęstości około 1-2 x 104 komórek/cm2 w pożywce FB.
  3. W dniu 1 należy zastąpić pożywkę hodowlaną pożywką zawierającą wirusa dla każdego dołka, zgodnie z życzeniem. Użyj wirusa z jednej studzienki Plat-E w płytce 6-dołkowej, aby zainfekować dwie studzienki w płytce 24-dołkowej. Miano wirusa w celu określenia optymalnego stężenia wirusa.
    UWAGA: Wirusy zawierające inne interesujące czynniki przeprogramowujące mogą zostać wprowadzone wraz z retrowirusem MGT.
  4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. W 2 dniu, 24 godziny po zakażeniu wirusem, należy wymienić pożywkę zawierającą wirusa na zwykłą pożywkę iCM.
  6. Aby monitorować ekspresję GCaMP3, umieść ją pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Poniżej 10x w kanale GFP obserwuj łagodną podstawową fluorescencję GCaMP3 części komórek już w 5 dniu.
  7. Wymieniaj medium co 2-3 dni podczas przeprogramowywania. W razie potrzeby przeprowadzić pozytywną selekcję komórek zakażonych retrowirusem MGT, dodając 2 μg/ml puromycyny do pożywki hodowlanej przez 3 dni i utrzymując ją na poziomie 1 μg/ml.
    UWAGA: Wprowadź interesujące nas substancje chemiczne (np. IGF-1, MM589, A83-01 i PTC-209, określane jako IMAP, jak wcześniej informowaliśmy15) wraz ze zmianą medium.
  8. Po 14 dniach od zakażenia należy zastąpić pożywkę pożywką B27, aby jeszcze bardziej wywołać dojrzewanie iCM.

6. Ocena efektywności funkcjonalnego dojrzewania i przeprogramowania iCM za pomocą strumienia Ca2+

UWAGA: Jeśli to konieczne, dodaj 1 μM izoproterenol do komórek do oceny przed oceną.

  1. Oceń strumieńCa2+ za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego w temperaturze pokojowej.
  2. W kanale GFP obserwuj komórki GCaMP3+ pod obiektywem 10x. Upewnij się, że pokazuje spontaniczne bicie komórek w kanale jasnego pola.
  3. Losowo wybierz trzy pola poniżej 20x i rejestruj strumień Ca2+ iCM przez 3 minuty dla każdego pola.
    UWAGA: W tym przypadku strumień Ca2+ był zsynchronizowany ze spontanicznym dudnieniem komórek (Rysunek 4, Rysunek 5, oraz Wideo 3, Wideo 4, Wideo 5, Wideo 6, Wideo 7, Wideo 8).
  4. Ręcznie określ ilościowo komórki za pomocą strumienia Ca2+.

7. Analiza statystyczna i prezentacja danych

  1. Przeanalizuj różnice między grupami jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) i wykonaj testy wielokrotnych porównań Studenta-Newmana-Keulsa.
    UWAGA: Wyniki są tak samo średnie ± S.E, gdzie p < 0,05 jest uważane za statystycznie istotne. Każdy eksperyment został przeprowadzony co najmniej trzy razy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalny proces generowania szczepu myszy Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 oraz struktura genów myszy transgenicznych jest pokazana w Rysunek 1. Podczas gdy szczep myszy został ustalony, serca szczeniąt zostały odizolowane i obserwowane pod mikroskopem odwrotnej fluorescencji, aby potwierdzić genotyp. Serca z prawidłowym genotypem wykazują strumień Ca2+ zsynchronizowany z biciem, wizualizowany jako fluorescencja GCaMP3, podczas gdy nie zaobserwowano fluorescencji w se...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena funkcji iCMs jest niezbędna w dziedzinie przeprogramowania serca. W tym manuskrypcie protokół opisuje Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J, który został ustalony, jak używać NCF wyizolowanych od noworodków myszy w tym szczepie do przeprogramowania na iCM oraz ocenę funkcji iCM przez strumień Ca2+ . Jest to metoda de novo służąca do oceny dojrzałości funkcjonalnej iCM.

Kilka krytycznych kroków jest ważnych dla pomyślnego przeprogramowania i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy wysiłki Leo Gnatovskiy'ego w redagowaniu angielskiego tekstu tego rękopisu. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com. Badanie to było wspierane przez National Institutes of Health (NIH) of the United States (1R01HL109054) grant dla dr Wanga.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stożkowe probówki wirówkowe 15 mlThermo Fisher Scientific14-959-70C
50 ml stożkowe probówki wirówkoweThermo Fisher Scientific14-959-49A 6-dołkowe
komórkowychAlkali ScientificTP9006
A83-01Stemgent04– 0014
Mikroskop fluorescencyjny All-in-OneKeyenceBZ-X800EOdwrócony mikroskop fluorescencyjny
B-27 Suplement (50X), bez surowicyThermo Fisher Scientific17504044
Blasticidin S HCl (10 mg / mL)Thermo Fisher ScientificA1113903
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Proszek wolny od DNaz i proteazThermo Fisher Scientific
CD90.2 MicroBeads, myszMiltenyi Biotec130-049-101Thy1.2 mikrogranulki
Kolagenaza, Typ 2Thermo Fisher ScientificNC9693955
Komora zliczającaThermo Fisher Scientific02-671-51BHemocytometr
DMEM, wysoki poziom glukozy, bez glutaminyThermo Fisher Scientific11960069
DPBS, wapń, magnezThermo Fisher Scientific14-040-133
Etanol, 200 proof (100%)Thermo Fisher Scientific04-355-451
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (certyfikowany ACS)Thermo Fisher ScientificE478-500
Płodowa surowica bydlęcaCorning35-010-CV
HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowejThermo Fisher Naukowe14025092
nośniki IMDMThermo Fisher Scientific12440053
IX73 Mikroskop odwróconyOlympusIX73P2FOdwrócony mikroskop fluorescencyjny
Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcjiThermo Fisher Scientific11-668-019
Kolumny LSMiltenyi Biotec130-042-401
Medium 199, Earle's SaltsThermo Fisher Scientific11150059
MidiMACS Separator i zestawy startoweMiltenyi Biotec130-042-302
Filtr strzykawkowy Millex-HV, 0.45  &mikro; m, PVDF, 33  mm, sterylizowany promieniami gammaMillipore SigmaSLHV033RB
MM589Uzyskany od dr Shaomeng Wang' s laboratorium na Uniwersytecie Michigan
Opti-MEM I Zredukowana surowicaMedium Thermo Fisher Scientific31-985-070
PBS, pH 7,4Thermo Fisher Scientific10-010-049
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Platinum-E (Plat-E) Retrowirusowe opakowanie Komórka komórkowa  BiolabsRV-101
pMx-puro-MGTAddgene111809
Poli(glikol etylenowy)Millipore SigmaP5413-1KGPEG8000
Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenuMillipore SigmaTR-1003-G
PTC-209SigmaSML1143– 5MG
Dichlorowodorek PuromycynyThermo Fisher ScientificA1113803
Rekombinowany ludzki IGF-IPeprotech100-11
RPMI 1640 ŚredniThermo Fisher Scientific 11875093
Seria wirówek ST 16Thermo Fisher Scientific75-004-381
Sterylne sitka komórkoweThermo Fisher Scientific22-363-54740 & mikro; m sitko
Naczynia do kultur tkankowych poddanych obróbce powierzchniowejThermo Fisher ScientificFB012921
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015
Roztwór błękitu trypanowegoMillipore SigmaT8154
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25300054
Mieszalnik wirowyThermo Fisher Scientific
płytki do hodowli BP970610002215365

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
  2. Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
  3. Frangogiannis, N. G. Pathophysiology of myocardial infarction. Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).
  4. Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
  5. Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
  6. Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
  7. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  8. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  11. Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036(2016).
  12. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  13. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  14. Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426(2015).
  15. Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
  16. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  17. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  18. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  19. Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505(2011).
  20. Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

indukowane kardiomiocytyneonatalne fibroblasty sercadojrzewanie funkcjonalnemikroskopia fluorescencyjnar nicowanie kardiologicznetransdukcja retrowirusowaizolacja serca

Powiązane artykuły