Method Article

Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

DOI:

10.3791/62650

⸱

March 31st, 2022

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje nowatorski test przejściowy oparty na rAAV z funkcją wzmacniania i opisywania. Ten test może być wykorzystany do wywołania ekspresji in vivo w mózgu myszy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzmacniacze są platformami wiążącymi dla różnorodnego wachlarza czynników transkrypcyjnych, które napędzają określone wzorce ekspresji genów specyficznych dla typów tkanek i komórek. Wiele sposobów oceny niekodującego DNA i różnych stanów chromatyny okazało się przydatne w przewidywaniu obecności sekwencji wzmacniających w genomie, ale walidacja aktywności tych sekwencji i znalezienie narządów i etapów rozwoju, w których są aktywne, jest pracochłonnym procesem. Niedawne postępy w dziedzinie wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) umożliwiły powszechne dostarczanie transgenów do tkanek myszy, umożliwiając testowanie wzmacniaczy in vivo bez konieczności stosowania transgenicznego zwierzęcia. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób konstrukt reporterowy, który wyraża EGFP pod kontrolą minimalnego promotora, który sam w sobie nie napędza znaczącej ekspresji, może być wykorzystany do badania wzorców aktywności potencjalnych sekwencji wzmacniacza w mózgu myszy. Konstrukt reporterowy w opakowaniu AAV jest dostarczany do mózgu myszy i inkubowany przez 1-4 tygodnie, po czym zwierzę jest uśmiercane, a skrawki mózgu są obserwowane pod mikroskopem. EGFP pojawia się w komórkach, w których testowany wzmacniacz jest wystarczający do zainicjowania ekspresji genów, wskazując lokalizację i etap rozwoju, w którym wzmacniacz jest aktywny w mózgu. Standardowe metody klonowania, tanie pakowanie AAV i rozszerzanie serotypów AAV oraz metody dostarczania in vivo i standardowego odczytu obrazowania sprawiają, że jest to przystępne podejście do badania, w jaki sposób ekspresja genów jest regulowana w mózgu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzmacniacze to genomowe elementy cis-regulatorowe, które służą jako miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych i mogą sterować ekspresją docelowego genu w sposób specyficzny czasowo1,2. Są one różnie aktywne w różnych typach komórek, tkankach i stadiach rozwoju i mogą być substratami zmienności genomowej związanej z ryzykiem choroby3,4. W związku z tym potrzeba zrozumienia dynamiki funkcji wzmacniacza ma kluczowe znaczenie dla postępu zarówno w zastosowaniach translacyjnych, jak i podstawowych w genomice. Przewidywania in silico aktywności wz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt UC Davis (Protokół #22339) oraz Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego UC Davis (BUA-R1903). Protokół ten został przetestowany na myszach C57BL/6J obu płci w dniu poporodowym 0-1.

1. Sklonuj sekwencję kandydata na wzmacniacz do plazmidu wektorowego AAV.

UWAGA: Podano reprezentatywne protokoły, ale strategia klonowania charakteryzuje się wysokim stopniem elastyczności.

  1. Wybierz lub zaprojektuj konstrukcję reportera. W tym przypadku kandydat na wzmacniacz jest wprowadzany do regionu 3' bez ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tych metod, sekwencja 915 pz w trzecim intronie genu związanym z ryzykiem psychiatrycznym CACNA1C19,49,50 została przetestowana pod kątem aktywności wzmacniającej w mózgu myszy po urodzeniu. Sekwencja ta została odkryta w MPRA składającej się z 345 kandydujących sekwencji wzmacniających skoncentrowanych na ryzyku psychiatrycznym i neurologicznym SNPs12, a eksperymenty charakteryzacy.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje opartą na rAAV metodę wdrażania transgenów napędzanych wzmacniaczem w mózgu myszy po urodzeniu. W tym uogólnionym protokole kandydat na wzmacniacz, minimalny promotor, gen reporterowy i opcjonalna sekwencja kodu kreskowego są klonowane do szkieletu plazmidu AAV. Eksperymenty te można przeprowadzić z pojedynczą sekwencją wzmacniacza kandydującego lub z wieloma sekwencjami równolegle. Plazmid jest pakowany w rAAV i dostarczany do mózgu myszy po urodzeniu. Po pewnym czasie, aby umożliwić transdukcję wir.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie zostało przeprowadzone w UC Davis DNA Technologies Core. Dziękujemy laboratorium Lin Tian na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis za szkolenie w zakresie pakowania rAAV i hojne podarowanie nam plazmidów pomocniczych AAV i rep/cap. Prace te były wspierane przez NIH/NIGMS R35GM119831.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Bufor cytrynianowySigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A: Specjalnie zaprojektowanystarter Forward do weryfikacji klonów po transformacji. Te startery są specyficzne dla użytego wektora i zostały zaprojektowane dla konkretnego wektora użytego w naszych eksperymentach.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A: Specjalnie zaprojektowanyodwrócony starter do weryfikacji klonów po transformacji. Te startery są specyficzne dla użytego wektora i zostały zaprojektowane dla konkretnego wektora użytego w naszych eksperymentach.
AgarozaVWRVWRVN605-500G
Zespoły rurek aspiratoraSigma-AldrichA5177-5EAdo doustnego dostarczania rAAV
Bakteriologiczne szalki PetriegoThermo Fisher Scientific08-757-100D
KarbenicylinaSigma-AldrichC1389-5G
Kurczak IgY anty-GFPThermo Fisher ScientificA10262
Mikroskop konfokalnyZeissLSM900Zdjęcia zostały wykonane modelem LSM800, ale Zeiss wprowadził na rynek model LSM900 w ostatnich latach, aby zastąpić LSM800.
Stożkowe probówki wirówkowe 15 mlThermo Fisher Scientific12-565-269
CryomoldsThermo Fisher ScientificNC9806558Te formy są odpowiednie dla mózgu myszy P28. Inne rozmiary mogą być bardziej odpowiednie dla większych lub mniejszych tkanek.
DAPISigma-AldrichD9542-10MG
Nożyczki preparacyjne, 4,5"VWR82027-578
Oślica przeciw kurczakom AlexaFlour-488Jackson ImmunoResearch703-545-155
Dulbecco's PBS 1xThermo Fisher ScientificMT21031CV
Probówki do mikrowirówek Eppendorf 2,0 mlThermo Fisher Scientific
Falcon probówki okrągłodenne 14 mlThermo Fisher Scientific352059
Fast Green dyeGraingerF0099-1G
Zestaw pędzli do drobnych detaliArtbrush TowerB014GWCLFO
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S Szklane
rurki kapilarneDrummond Scientific Company5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi KitQIAGEN12663Komercyjny zestaw do przygotowania plazmidu maxi
HyClone HyPure Molecular Biology Grade WaterVWRSH30538.03
IV zestaw do infuzji motyli z rurką 12" i igłą 25GThermo Fisher Scientific26708
KimwipesKimberly Clark34155Niestrzępiąca się chusteczka
LB AgarThermo Fisher ScientificBP1425-500LB premiks agarowy do pożywek selektywnych
Nożyczki do irysu McPherson VannasIntegra LifeSciences360-215
Olej mineralnySigma Life Science69794-500ML
NEB Stabilny kompetentny E. coliNEBC3040I
NucleoSpin Żel i PCR Clean-UpTakara740609.5Zestaw do reakcji enzymatycznej oczyszczanie i ekstrakcja żelu
Pożywka OCTVWR25608-930
Wytrząsarka orbitalnaCole Parmer60-100
Probówki paraformaldehydoweSigma-Aldrich158127-500G
do PCR 0,2 mlVWR490003-692
Pompa perystaltycznaGilsonF155005
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10xThermo Fisher Scientific70011044
Phusion Hot Start II Polimeraza DNA o wysokiej wiernościThermo Fisher ScientificF549L
Mleko w proszkuSunny Select
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
QIAquick Zestaw do oczyszczania PCRQIAGEN28106
rCutSmart BuforNEBB6004SBufor do trawienia restrykcyjnego z PacI, AscI i XmaI
Enzym restrykcyjny: AscINEBR0558L
Enzym restrykcyjny: PacINEBR0547L
Enzym restrykcyjny: XmaINEBR0180L
SOC pożywka przeciwwzrostowaNEBB0920SPożywka regeneracyjna po przemianie
Sacharoza ( Bez RNaz / DNaz)Millipore Sigma033522.5KG
Bufor TAEApex20-194
Rurka transferowaGilsonF1179941Do pompy perystaltycznej
Triton X100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps System oczyszczania DNAThermo Fisher ScientificA1460Mini zestaw przygotowawczy do plazmidu
22431048

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AAV DeliveryEnhancer TestingMouse BrainReporter ConstructEGFP ExpressionIn Vivo ExpressionGibson CloningBrain InjectionFluorescence ImagingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles