Method Article

Wdrożenie AAV konstruktów ekspresyjnych opartych na wzmacniaczu in vivo w mózgu myszy

DOI:

10.3791/62650

⸱

March 31st, 2022

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje nowatorski test przejściowy oparty na rAAV z funkcją wzmacniania i opisywania. Ten test może być wykorzystany do wywołania ekspresji in vivo w mózgu myszy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzmacniacze są platformami wiążącymi dla różnorodnego wachlarza czynników transkrypcyjnych, które napędzają określone wzorce ekspresji genów specyficznych dla typów tkanek i komórek. Wiele sposobów oceny niekodującego DNA i różnych stanów chromatyny okazało się przydatne w przewidywaniu obecności sekwencji wzmacniających w genomie, ale walidacja aktywności tych sekwencji i znalezienie narządów i etapów rozwoju, w których są aktywne, jest pracochłonnym procesem. Niedawne postępy w dziedzinie wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) umożliwiły powszechne dostarczanie transgenów do tkanek myszy, umożliwiając testowanie wzmacniaczy in vivo bez konieczności stosowania transgenicznego zwierzęcia. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób konstrukt reporterowy, który wyraża EGFP pod kontrolą minimalnego promotora, który sam w sobie nie napędza znaczącej ekspresji, może być wykorzystany do badania wzorców aktywności potencjalnych sekwencji wzmacniacza w mózgu myszy. Konstrukt reporterowy w opakowaniu AAV jest dostarczany do mózgu myszy i inkubowany przez 1-4 tygodnie, po czym zwierzę jest uśmiercane, a skrawki mózgu są obserwowane pod mikroskopem. EGFP pojawia się w komórkach, w których testowany wzmacniacz jest wystarczający do zainicjowania ekspresji genów, wskazując lokalizację i etap rozwoju, w którym wzmacniacz jest aktywny w mózgu. Standardowe metody klonowania, tanie pakowanie AAV i rozszerzanie serotypów AAV oraz metody dostarczania in vivo i standardowego odczytu obrazowania sprawiają, że jest to przystępne podejście do badania, w jaki sposób ekspresja genów jest regulowana w mózgu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzmacniacze to genomowe elementy cis-regulatorowe, które służą jako miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych i mogą sterować ekspresją docelowego genu w sposób specyficzny czasowo1,2. Są one różnie aktywne w różnych typach komórek, tkankach i stadiach rozwoju i mogą być substratami zmienności genomowej związanej z ryzykiem choroby3,4. W związku z tym potrzeba zrozumienia dynamiki funkcji wzmacniacza ma kluczowe znaczenie dla postępu zarówno w zastosowaniach translacyjnych, jak i podstawowych w genomice. Przewidywania in silico aktywności wzmacniacza mogą służyć jako doskonałe zasoby do generowania hipotez dotyczących zdolności wzmacniacza5,6. Taka przewidywana aktywność wzmacniacza może wymagać dodatkowej walidacji i przesłuchania w celu pełnego zrozumienia aktywności funkcjonalnej. Testy reporterowe Enhancer okazały się cenne w tym celu w różnych systemach, od komórek po zwierzęta7,8,9. W celu rozszerzenia tych badań na elastyczny i opłacalny kontekst przejściowy in vivo, protokół ten opisuje zastosowanie metod opartych na AAV in vivo do testowania przypuszczalnych sekwencji wzmacniających pod kątem ich zdolności do kierowania ekspresją ektopowego genu reporterowego w mózgu myszy po urodzeniu. Ta rodzina metod jest przydatna do badania pojedynczych sekwencji kandydujących lub równoległego przesiewu bibliotek i jest istotna dla badań podstawowych i translacyjnych.

Ta metoda łączy w pojedynczym plazmidzie przypuszczalną sekwencję DNA kandydata na wzmacniacz z genem reporterowym (tutaj EGFP), pod kontrolą minimalnego promotora, który sam w sobie nie napędza znaczącej ekspresji. Plazmid jest pakowany w rekombinowany AAV (rAAV) i wstrzykiwany do modelu zwierzęcego. Chociaż zastosowanie dotyczy to mózgu, różne serotypy rAAV umożliwiają infekcję w różnych typach tkanek, dzięki czemu podejście to można rozszerzyć na inne systemy10. Po pewnym czasie mózg może zostać pobrany i przetestowany pod kątem ekspresji genu reporterowego. Silna ekspresja w porównaniu z grupą kontrolną wskazuje, że testowana sekwencja kandydująca była w stanie "zwiększyć" ekspresję genu (Rysunek 1). Ta prosta konstrukcja oferuje łatwe i przejrzyste podejście do testowania sekwencji pod kątem aktywności wzmacniacza in vivo w mózgu.

Oprócz testowania zdolności wzmacniania sekwencji, ta metoda może być połączona z technikami określania aktywności wzmacniacza typu komórkowego. W podejściach opartych na sekwencjach do określania zróżnicowanej aktywności wzmacniacza, sortowanie komórek według markerów specyficznych dla typu komórki przed sekwencjonowaniem DNA i RNA może pozwolić badaczom określić, czy różne typy komórek wykazują różnicową aktywność wzmacniającą, jak opisano w Gisselbrecht i wsp.11. W podejściach opartych na obrazowaniu, wspólne znakowanie obrazów markerami specyficznymi dla typu komórki pozwala na zbadanie, czy komórki wykazujące fluorescencję sterowaną wzmacniaczem wyświetlają również interesujące markery typu komórki12,13,14,15,16. Testy reporterowe wzmacniacza umożliwiają bezpośrednie testowanie związanych z ryzykiem zmienności alleli w wzmacniaczach pod kątem wpływu na zdolność wzmacniacza. Zdecydowana większość loci ryzyka zidentyfikowanych w badaniach asocjacyjnych całego genomu (GWAS) leży w niekodujących regionach genome17. Badania adnotacji funkcjonalnych tych loci ryzyka wskazują, że duża część z nich prawdopodobnie działa jako wzmacniacze18,19,20. Wdrożenie MPRA in vivo może umożliwić testowanie tych wariantów związanych z ryzykiem pod kątem aktywności wzmacniacza w brain12,21. Wreszcie, dostawa i odbiór w różnych punktach czasowych może zapewnić wgląd w etapy rozwoju, podczas których wzmacniacz jest aktywny.

Projekty plazmidów wzmacniająco-reporterowych są różnorodne i mogą być dostosowane do celów eksperymentalnych. Istnieje kilka opcji minimalnych promotorów, które zostały wykorzystane w badaniach nad wzmacniaczami, takich jak ludzki β-globinowy minimalny promotor22 i mysi Hsp68 minimalny promotor23. Wiadomo, że te promotory napędzają niski poziom ekspresji, chyba że w połączeniu z elementem wzmacniającym, który je aktywuje. W przeciwieństwie do tego, konstytutywne elementy promotorowe napędzają silną ekspresję transgenu, przydatną do kontroli pozytywnej lub do testowania funkcji wzmacniacza na tle silnej ekspresji. Typowe wybory dla konstytutywnych promotorów obejmują CAG, hybrydowy promotor pochodzący z promotora β-aktyny kurczaka i wirusa cytomegalii natychmiast-wczesnego wzmacniacza24, lub ludzki EF1α25. Ponieważ wiadomo, że wzmacniacze działają dwukierunkowo26, orientacja i położenie wzmacniacza względem minimalnego promotora są elastyczne (Rysunek 2A). Tradycyjne testy enhancer-reporter umieszczają wzmacniacz przed promotorem, a w przypadku dostaw bibliotecznych zawierają sekwencję kodu kreskowego za genem reporterowym, aby skojarzyć odczyty sekwencjonowania z testowanym enhancer27. Jednak wzmacniacze mogą być również umieszczane w otwartej ramce odczytu genu reporterowego i służyć jako własna sekwencja kodu kreskowego, tak jak ma to miejsce w STARR-seq28. Opisany tutaj protokół wykorzystuje projekt testu STARR-seq, umieszczając kandydującą sekwencję wzmacniacza w 3' UTR genu reporterowego. Chociaż orientacja STARR-seq oferuje korzyści w postaci bardziej usprawnionego klonowania, jest ona mniej dobrze poznana niż podejście konwencjonalne i może indukować zmienną stabilność RNA między konstruktami. Opisane metody można łatwo dostosować zarówno do orientacji STARR-seq, jak i konwencjonalnej, z niewielkimi zmianami w procesie klonowania, które zostały opisane gdzie indziej27,29.

Różne metody dostarczania AAV mogą być stosowane w celu dalszego dostosowania tej techniki do celów eksperymentalnych (Rysunek 2B). Bezpośrednie wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe, opisane w dalszej części tego protokołu, dostarczają wysokie stężenie wirusa bezpośrednio do mózgu30. Daje to wysoką wydajność transdukcji wyśrodkowaną w miejscu wstrzyknięcia, co czyni ją doskonałą techniką do eksperymentów mających na celu maksymalizację gęstości transdukowanych komórek na obszarze tkanki. Wstrzyknięcie stereotaktyczne może pomóc w standaryzacji miejsca wstrzyknięcia u zwierząt w celu uzyskania powtarzalnej transdukcji miejscowej. Wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe są najprostsze u zwierząt we wczesnym okresie pourodzeniowym. Jako alternatywna technika, zastrzyki ogólnoustrojowe mogą dostarczać transgeny za pomocą AAV z serotypami zdolnymi do przekraczania bariery krew-mózg31. Wstrzyknięcia do żyły ogonowej pozwalają wirusowi krążyć po całym ciele, umożliwiając uogólnione dostarczanie do wielu tkanek10. Zastrzyki zaoczodołowe to kolejna technika iniekcji ogólnoustrojowych, która dostarcza wirusa za oko do zatoki zaoczodołowej32. Oferuje to bardziej bezpośrednią drogę dla AAV z układu żylnego do mózgu, co skutkuje wyższym stężeniem transdukowanych komórek w mózgu niż wstrzyknięcia do bardziej obwodowych naczyń krwionośnych33.

Innym elastycznym aspektem tej techniki jest metoda odczytu. Ogólnie rzecz biorąc, opcje można opisać jako oparte na raportowaniu lub sekwencjonowaniu (Rysunek 2C). Włączenie fluorescencyjnego reportera, takiego jak GFP, do otwartej ramy odczytu konstruktu, powoduje ekspresję białka fluorescencyjnego we wszystkich transdukowanych komórkach, w których kandydat na wzmacniacz sterował ekspresją. Techniki znakowania i obrazowania, takie jak immunohistochemia, umożliwiają wzmocnienie sygnału. Techniki odczytu oparte na sekwencjonowaniu polegają na identyfikacji sekwencji z dostarczonego konstruktu w RNA pobranym z tkanki. Określając ilościowo ilość wirusowego DNA, które zostało początkowo dostarczone, porównanie ekspresji RNA z dostarczonym DNA można wykorzystać do określenia stopnia, w jakim testowana sekwencja wzmacniacza była w stanie napędzać zwiększoną ekspresję transgenu, na przykład w kontekście masowo równoległego testu reporterowego (MPRA). MPRA oferują potężne rozszerzenie tych technik w celu jednoczesnego testowania do tysięcy potencjalnych wzmacniaczy aktywności i zostały obszernie opisane w badaniach genomicznych12,27,34,35,36. Wyższą przepustowość badań przesiewowych uzyskuje się poprzez wykonywanie etapów klonowania, pakowania, dostarczania i sekwencjonowania dla potencjalnych wzmacniaczy w partii, a nie pojedynczo.

Wybór kandydata na wzmacniacz daje kolejną możliwość elastyczności (Rysunek 2D). Na przykład test ten może być wykorzystany do identyfikacji wzmacniaczy określonego genu, do ustalenia funkcji niekodujących regionów DNA będących przedmiotem zainteresowania lub do określenia określonych typów komórek lub etapów rozwoju, podczas których wzmacniacz jest aktywny - wszystkie te cele służą celom zarówno w naukach podstawowych, jak i w badaniach nad chorobami. Ogólnie rzecz biorąc, wybór kandydata na wzmacniacz jest napędzany przez przewidywania in silico dotyczące aktywności wzmacniacza. Zazwyczaj przewidywania in silico obejmują ChIP-seq dla modyfikacji histonów, które wskazują na prawdopodobne wzmacniacze, takie jak H3K27ac37 i mapowanie dostępności chromatyny38. Wreszcie, rosnącym obszarem badań jest oparty na funkcjach przesiewowy syntetycznie zaprojektowanych elementów wzmacniających, umożliwiający badanie, w jaki sposób sekwencja wzmacniacza kieruje funkcją39 oraz projektowanie wzmacniaczy o określonych właściwościach40.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt UC Davis (Protokół #22339) oraz Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego UC Davis (BUA-R1903). Protokół ten został przetestowany na myszach C57BL/6J obu płci w dniu poporodowym 0-1.

1. Sklonuj sekwencję kandydata na wzmacniacz do plazmidu wektorowego AAV.

UWAGA: Podano reprezentatywne protokoły, ale strategia klonowania charakteryzuje się wysokim stopniem elastyczności.

  1. Wybierz lub zaprojektuj konstrukcję reportera. W tym przypadku kandydat na wzmacniacz jest wprowadzany do regionu 3' bez translacji (UTR) genu reporterowego EGFP, który ulega ekspresji pod kontrolą minimalnego promotora Hsp68.
    UWAGA: Wiele konstruktów plazmidowych MPRA odpowiednich dla tego testu zostało zdeponowanych w Addgene41 i jest dostępnych do użytku badawczego.
  2. Zaprojektuj startery PCR, aby wzmocnić sekwencję zainteresowania. Dodaj do końca 5' starterów odpowiednie ramię homologii do klonowania Gibsona (~35 pz odpowiadające sekwencji 5' przed miejscem insercji, górne pasmo dla startera do przodu i dolne pasmo dla startera odwrotnego).
    UWAGA: Upewnij się, że podstawowa sekwencja startera ma długość ~18-24 pz i zawartość ~50%-60% GC przy temperaturze topnienia około 57-59 °C.
  3. Wykonaj PCR z próbki DNA przy użyciu zaprojektowanych starterów.
    1. Zebrać mieszaninę reakcyjną PCR w probówkach PCR o pojemności 0,2 ml zgodnie z opisem w Tabeli 1.
    2. Umieścić mieszaninę(-y) reakcyjną(-e) PCR na termocyklerze i cyklować zgodnie z programem wymienionym w tabeli 1.
    3. Potwierdź powodzenie PCR, uruchamiając 5 μl produktu PCR na 0,7%-1% żelu agarozowym przy 100 V przez 30-60 min. Sprawdź, czy znajduje się fragment o przewidywanej długości.
    4. Oczyść produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu kolumny do czyszczenia reakcji enzymatycznej. Ostatnim eluatem jest wkładka do klonowania.
  4. Wykonaj trawienie restrykcyjne, aby zlinearyzować wektor AAV w unikalnym miejscu klonowania, aby wprowadzić wzmacniacz do wektora.
    1. Miejsce klonowania w 3' UTR użytego tutaj konstruktu reportera wzmacniacza jest ograniczone unikalnymi miejscami ograniczeń PacI i AscI. Wykonaj trawienie, aby zlinearyzować plazmid w tym miejscu zgodnie z następującymi parametrami (kroki 1.4.2-1.4.4).
    2. Trawić 1-10 μg wektorowego DNA za pomocą PacI i AscI, w zależności od tego, ile reakcji klonowania będzie potrzebnych. Przygotować reakcje za pomocą dołączonego buforu zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny w celu strawienia DNA wektora. (W przypadku trawienia więcej niż 5 μg w reakcji 50 μl może być konieczna dłuższa inkubacja.)
    4. Po 1-2 godzinach inkubacji dezaktywować enzym przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 20 minut.
    5. Oddzielić fragmenty trawienia restrykcyjnego za pomocą elektroforezy żelowej przy użyciu 0,7%-1% żelu agarozowego, uruchamiać pod napięciem 100 V przez 30-60 minut.
    6. Wytnij pasmo dla wektora linearyzowanego i oczyść za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu.
  5. Wykonywanie reakcji klonowania i transformacji Gibsona
    1. Oznaczyć stężenie oczyszczonego wektora i wkładki klonującej za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: DNA pochłania światło o długości fali 260 nm, podczas gdy zanieczyszczenia pochłaniają światło o długości fali 230 nm i 280 nm. Wysokie proporcje (>1,8) 260/230 i 260/280 wskazują na wysoce oczyszczone DNA.
    2. Złóż reakcje klonowania Gibsona w probówkach PCR o pojemności 0,2 ml: 5 μl 2x głównej mieszanki Gibsona, 0,02-0,5 pmol fragmenty DNA w stosunku 3:1 wstawka do wektora (optymalne stężenie DNA dla reakcji należy określić empirycznie) i woda wolna od nukleaz (zwiększyć objętość do 10 μl).
    3. Inkubować reakcje Gibsona w temperaturze 50 °C przez 20 minut w termocyklerze.
  6. Transformacja z niedoborem rekombinacji (recA-) kompetentna Escherichia coli (E. coli).
    1. Nastaw łaźnię wodną na temperaturę 42 °C i rozmroź dostępne w handlu kompetentne komórki na lodzie.
      UWAGA: Ten krok można wykonać przed krokiem 1.4, a komórki mogą się rozmrozić podczas przygotowywania i inkubacji reakcji Gibsona.
    2. Podwielokrotność 30-50 μl komórek do probówek mikrowirówek o pojemności 2,0 ml. Dodać 2 μl reakcji Gibsona do podwielokrotności i oznaczyć probówkę tożsamością Gibsona. Inkubować komórki na lodzie przez 30 min.
      UWAGA: Użyj 5-10 ng niestrawionego pustego wektora jako kontroli pozytywnej i wody jako kontroli ujemnej.
    3. Szok termiczny komórek w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 30-45 s, natychmiast załóż probówki do lodu i pozwól im dojść do siebie przez 5 minut.
    4. Będąc na lodzie, dodaj 400-950 μl dostępnych na rynku pożywek regeneracyjnych.
      UWAGA: Pożywka regeneracyjna użyta w tych eksperymentach zawiera 2% peptonu roślinnego, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mMMgSO4 i 20 mM glukozy.
    5. Po odzyskaniu na lodzie w pełni zregeneruj komórki, inkubując w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem 250 obr./min przez 30-60 min.
    6. Osadzać komórki przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 5 minut i usunąć 400 μl supernatantu, pozostawiając ~50 μl bakterii na płytce.
    7. Płytkę na pożywkach selektywnych i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Selektywne podłoża użyte w tych eksperymentach zawierają 1,0% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 1,0% chlorku sodu, 1-2% agaru, 96-97% wody i karbenicyliny w stężeniu 100 μg/ml. Do klonowania plazmidów wirusowych należy zawsze używać szczepów bakterii z niedoborem rekombinacji, ponieważ wirusowe powtórzenia odwróconego końca (ITR) mają pasujące sekwencje i mogą ulegać rekombinacji homologicznej. Jednak szczepy bakterii recA- nadal ulegają niskiemu poziomowi rekombinacji. Zastosowany tutaj plazmid reporterowy to samokomplementarny AAV, w którym sekwencja jednego z ITR została zmieniona i nie pasuje już idealnie do drugiego ITR. Hodowla bakterii w temperaturze 30 °C jest również zalecana w celu dalszego spowolnienia tempa rekombinacji homologicznej.
  7. Weryfikuj klony i odzyskuj plazmidy.
    1. Przygotuj główną mieszankę PCR, używając starterów do przodu i do tyłu (tabela materiałów), które wyżarzają się do wektora, otaczając miejsce wstawiania. Podwielokrotność 10 μl rozmieścić w 0,2 ml probówkach z paskiem PCR.
    2. W probówkach okrągłodennych o pojemności 14 ml przygotuj 5 ml porcji selektywnego bulionu LB selektywnego dla antybiotyków, po jednym dla każdej rodziny badanej za pomocą PCR i kontroli ujemnej.
    3. Użyj sterylnej wykałaczki lub końcówki pipety, aby wybrać pojedynczą kolonię i z grubsza zeskrobać kolonię na dno jednej probówki do PCR.
    4. Gdy kolonia zdysocjuje się w głównej mieszance PCR, wrzuć wykałaczkę lub końcówkę do jednej z podwielokrotności LB i oznacz probówkę 14 ml reakcją Gibsona i numerem probówki PCR.
    5. Umieść reakcje PCR kolonii na termocyklerze i cykl z programem opisanym w tabeli 2.
    6. Inkubować 5 ml płynnych kultur zaszczepionych wykałaczkami lub końcówkami pipet w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 37 °C i 180 obr./min.
    7. Przeprowadź reakcje PCR kolonii na żelu agarozowym 0,7%-1% przy napięciu 100 V przez 30-60 minut i uwidocznij prążki w systemie obrazowania doc w żelu.
    8. Odrzuć 5 ml kultur, które nie wykazują przewidywanego pasma PCR.
    9. Dla każdego pomyślnie zintegrowanego klonu pozwól kulturom o pojemności 5 ml rosnąć przez noc, a następnie wykonaj mini przygotowanie plazmidu z 4,5 ml za pomocą komercyjnego zestawu. Zachować 0,5 ml płynnej kultury i zachować w temperaturze -80 °C jako zapas gliceryny.
    10. Potwierdź, że transgeny zawarte w plazmidach są wolne od niepożądanych mutacji, korzystając z sekwencjonowania Sangera42.
    11. Po potwierdzeniu, że konstrukt reporterowy został pomyślnie sklonowany, użyj zaoszczędzonego zapasu glicerolu do zaszczepienia 5 ml kultury starterowej i hoduj przez 8-16 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C i 180 obr./min.
    12. Gdy bulion stanie się mętny, rozcieńczyć kulturę starterową 1000 razy w 250-300 ml świeżego selektywnego bulionu LB i inkubować co najmniej przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C i 180 obr./min. Następnie oczyść plazmid za pomocą komercyjnego zestawu maxi plasmid.
      UWAGA: Bakterie będą rosły wolniej w temperaturze 30 °C w porównaniu do 37 °C, ale jest to najlepsza temperatura do spowolnienia tempa spontanicznej rekombinacji podczas uprawy dużych kultur.
    13. Wykonaj skrót XmaI, aby przetestować rekombinację ITR, wykonując kroki 1.4.2-1.4.5, podstawiając XmaI zamiast PacI i AscI. Wizualizacja pasm w systemie obrazowania żelowego doc.
      UWAGA: Plazmid rAAV z obecnymi obydwoma ITR da dwa prążki na żelu po tym trawieniu: jedno długość genomu rAAV, a drugie długość reszty szkieletu plazmidu. Jeśli jest tylko jedno pasmo, to ITR uległy rekombinacji homologicznej, a plazmid rAAV nie będzie zdolny do pakowania cząstek wirusa. Opisany tutaj szkielet plazmidu rAAV został zaprojektowany tak, aby miejsca XmaI występowały tylko w ITR. Jeśli wstawka kandydacyjna wzmacniacza zawiera również jakiekolwiek miejsca XmaI, należy odpowiednio zaktualizować przewidywane wyniki pasma i analizę.

2. Zdobądź pakiet rAAV.

  1. Użyj pakietu rAAV (profesjonalnie lub wewnętrznie) do eksperymentów w tym badaniu.
    UWAGA: Istnieje wiele opcji pakowania rAAV. RAAV może być profesjonalnie zapakowany w firmie lub na uniwersytecie. rAAV może być również pakowany we własnym zakresie przy użyciu różnych technik, które różnią się złożonością i wymagają specjalistycznego sprzętu43,44. Podstawowym problemem jest uzyskanie wektora, który jest wysokiej jakości, a miano zakaźne zostało określone z dużą dozą pewności. Zarówno profesjonalnie zapakowane, jak i wewnętrznie zapakowane rAAV zostały wykorzystane w różnych eksperymentach opisanych w tym badaniu.

3. Wstrzyknąć doczaszkowo plazmid z rAAV noworodkom myszy.

  1. Przygotuj mieszaninę rAAV do podawania.
    1. Jeśli celem jest porównanie wzorców ekspresji między różnymi wirusami reporterowymi wzmacniacza, wyrównaj miana wszystkich wirusów, które mają być porównane, rozcieńczając wszystko, aby pasowały do najmniej skoncentrowanego wirusa.
    2. Wymieszać ze sobą proporcje 2:1 lub 3:1 wirusa reporterowego wzmacniacza i konstytutywnie wyrażonego wirusa reporterowego kontrolnego i dodać niewielką ilość (0,06% stężenia końcowego) barwnika Fast Green.
      UWAGA: Fast Green to barwnik, który jest szeroko stosowany w iniekcjach zwierząt doświadczalnych, w tym z AAV, do wizualizacji miejsca wstrzyknięcia podczas i bezpośrednio po zabiegu45,46,47,48. Chociaż jest to ważny krok w celu zapewnienia jakości, możliwe jest, że dodanie barwnika może zakłócić transdukcję. Ponowne rozważenie zastosowania barwnika iniekcyjnego może być w niektórych przypadkach ważne dla optymalizacji protokołu. Konstytutywnie napędzany wirus kontrolny jest absolutnie krytyczny dla porównania niezależnych wstrzyknięć. Wstrzyknięcia wirusa będą się różnić pod względem lokalizacji i zakresu transdukcji ze zwierzęcia na zwierzę. Kontrola konstytutywna umożliwi wykluczenie z analizy nieudanych iniekcji i zapewni standard normalizacji zmienności w dostarczaniu wirusa.
    3. Rozbij końcówkę sterylnej, ciągnionej szklanej pipety wykonanej z rurki kapilarnej z podziałką μl, delikatnie przekłuwając ją przez delikatną chusteczkę, wysterylizowaną przez namoczenie w 70% etanolu i pozostawioną do całkowitego wyschnięcia. Następnie włóż wyciągniętą szklaną pipetę do zespołu aspiratora składającego się z urządzenia do wywierania ciśnienia podłączonego do gumowej rurki o długości 15 cali zakończonej gumową uszczelką do przytrzymywania pipety mikrokapilarnej.
      UWAGA: "Urządzeniem do wywierania nacisku" może być strzykawka lub ustnik. Jeśli ma być użyta strzykawka, druga osoba będzie musiała wywierać nacisk przez strzykawkę, podczas gdy eksperymentator manipuluje pipetą w jednej ręce, a zwierzęciem w drugiej. W przypadku korzystania z ustnika, umożliwiającego eksperymentatorowi precyzyjną kontrolę zarówno nad pozycjami zwierzęcia i pipety, jak i naciskiem wywieranym na strzykawkę, wymagana jest szczególna ostrożność, aby uniknąć zakażenia wirusem.
    4. Zastosuj podciśnienie przez zespół aspiratora, aby pobrać niewielką objętość (~0,2-0,5 μl) oleju mineralnego do szklanej pipety.
      UWAGA: Ten krok jest bardzo ważny, aby zapewnić barierę zapobiegającą zanieczyszczeniu zespołu aspiratora przez cząsteczki wirusa w aerozolu.
    5. Przygotowany zespół aspiratora należy odłożyć na bok i trzymać wirusa na lodzie do momentu, gdy będzie gotowy do wstrzyknięcia.
  2. Krioznieczulenie myszy u noworodków w suchym plastikowym naczyniu częściowo zanurzonym w lodzie do momentu ustania odruchu wycofania pedału (~5 min). Upewnij się, że myszy nie mają bezpośredniego kontaktu z lodem.
  3. Użyć podciśnienia przez zespół aspiratora, aby wciągnąć mieszaninę wirusa do wyciągniętej szklanej pipety, aż menisk przekroczy znacznik 2 μl.
  4. Wyjmij mysz z zimnej komory i umieść ją na blacie. Zlokalizuj obustronne miejsca wstrzyknięć w połowie odległości między lambdą a bregmą i w połowie drogi między szwem strzałkowym a każdym okiem. Zdezynfekuj oba obszary chusteczką nasączoną alkoholem.
  5. Użyj wyciągniętej szklanej pipety, aby przekłuć czaszkę nowonarodzonych myszy i delikatnie wywieraj nadciśnienie przez zespół aspiratora, gdy igła wchodzi do mózgu. Obserwuj łąkotkę mieszaniny wirusów. Opór wywieranego nacisku zmniejszy się, gdy końcówka pipety dotrze do komory bocznej. Dozować 1 μl wirusa, wyjąć pipetę i powtórzyć dla drugiej komory bocznej.
  6. Umieść mysz na poduszce grzewczej lub komorze grzewczej, aby odzyskać sprawność. Po przebudzeniu i aktywności zwierzę wróć do jego domowej klatki.

4. Zbierz tkankę i przeprowadź immunohistochemię.

  1. Po upływie odpowiedniego czasu od transdukcji wirusa znieczulić myszy i złożyć je w ofierze przez perfuzję przezsercową.
    UWAGA: Wiele eksperymentów, w tym reprezentatywne wyniki pokazane tutaj, dopuszcza okres 4 tygodni lub dłużej na transdukcję wirusa. Jednak samouzupełniające się AAV mogą wykazywać silną ekspresję już po 7 dniach12. Pożądany okres inkubacji może wymagać optymalizacji w zależności od konkretnych technik i celów eksperymentalnych.
    1. Przygotować pompę perystaltyczną z rurką do infuzji dożylnej i igłą 25 G.
    2. Przygotuj 1x PBS i 4% paraformaldehydu (PFA) i umieść je na lodzie.
    3. Umieść końcówkę wlotową rurki w lodowatym 1x PBS. Ustaw natężenie przepływu (2.5 ml/min dla myszy P7, 3.5 mL/min dla myszy P28) i uruchom pompę, aż bufor zostanie wciągnięty przez rurkę i oczyszczony z pęcherzyków. Odłóż igłę na bok, aż będzie gotowa do perfuzji.
    4. Wewnątrz dygestorium odpipetuj niewielką objętość izofluranu na ręcznik papierowy na dnie komory słoika z kroplami. Umieść wcześniej wstrzykniętą mysz na ruszcie nad ręcznikiem papierowym, upewniając się, że nie ma ona bezpośredniego kontaktu z izofluranem. Uszczelnij komorę, aby znieczulić mysz. Odczekaj ~5 min, a następnie otwórz komorę i sprawdź, czy nie ma odruchu wycofania pedału. Kontynuuj, gdy zwierzę jest nieprzytomne.
      UWAGA: Przez cały czas trwania perfuzji mysz powinna być utrzymywana na izofluranie ze stożkiem nosowym, aby zapobiec odzyskaniu przytomności.
    5. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć brzuch i klatkę piersiową myszy, usuń klatkę piersiową i odsłoń serce.
    6. Użyj pary mikronożyczek do tęczówki, aby wykonać małe nacięcie w prawym przedsionku myszy, włóż igłę dożylną do lewej komory i aktywuj pompę perystaltyczną.
    7. Przelej zwierzę lodowatym środkiem 1x PBS, aż krew wypłukiwana z nacięcia w prawym przedsionku będzie czysta. Oczyszczenie tkanki z krwi jest bardzo ważne, ponieważ czerwone krwinki mają autofluorescencję, a naczynia krwionośne mogą upośledzać zdolność obrazowania komórek wykazujących ekspresję reporterową.
    8. Wstrzymaj pompę perystaltyczną i przenieś rurkę dolotową z PBS do 4% PFA. Ponownie aktywuj pompę i wykonaj 1 ml/g masy ciała, ~25 ml dla dorosłej myszy.
      UWAGA: Drżenie fiksacji powinno być zauważalne, a ciało myszy powinno usztywnieć.
  2. Przeprowadź sekcję i post-fix mózg.
    1. Usuń głowę myszy nożyczkami chirurgicznymi.
    2. Używając małych nożyczek chirurgicznych, zacznij od podstawy czaszki i wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej głowy i odciągnij skórę i tkankę pod spodem, aby odsłonić czaszkę.
    3. Za pomocą nożyczek do tęczówki ostrożnie odetnij tył czaszki, zaczynając od otworu wielkiego i kontynuując w górę w kierunku i wzdłuż szwu strzałkowego, aż opuszki węchowe zostaną przepuszczone.
    4. Włóż nożyczki do czaszki nad opuszkami węchowymi i wykonaj dwa poziome nacięcia w czaszce. Wykonaj podobną parę poziomych nacięć w kości potylicznej. Poziome i środkowe nacięcia tworzą parę przypominających drzwi klap w górnej części czaszki.
    5. Oderwij płaty czaszki, aby całkowicie odsłonić mózg. Użyj pęsety, aby odciąć opuszki węchowe od czaszki i przeciąć nerwy czaszkowe, uwalniając mózg od czaszki.
    6. Wrzuć mózg do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 3-5 ml 4% PFA w PBS. Po ustaleniu 6 godzin do nocy. Nie utrwalaj nadmiernie tkanki.
  3. Przygotuj mózgi do kriosekcji.
    1. Przenieś nieruchomy mózg do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 ml z 12-14 ml 30% sacharozy w PBS w celu odwodnienia. Inkubować w temperaturze 4 °C, aż mózg opadnie na dno probówki (2-3 dni).
    2. Zanurz unieruchomiony i odwodniony mózg w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w krioformie o wymiarach 15 mm x 15 mm x 5 mm. Dodawaj OCT, aż mózg zostanie całkowicie pokryty.
    3. Umieścić kriomold na bloku suchego lodu i zamrozić próbkę w stałym bloku OCT (~ 5 min).
      UWAGA: Bloki OCT mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez miesiące lub lata.
    4. Oznacz kriomold nazwą próbki i orientacją mózgu.
  4. Uzyskać przekroje koronalne za pomocą mikrotomu kriostatu.
    1. Zaznacz ołówkiem orientację mózgu na bloku OCT i wyjmij blok z kriofordu wewnątrz kriostatu.
    2. Ustaw blok OCT tak, aby mózg był zorientowany tak, aby opuszki węchowe były skierowane w stronę ostrza kriostatu i przyklej blok do uchwytu przedmiotu kriostatu za pomocą świeżego OCT.
    3. Po zamrożeniu na miejscu rozpocznij przecinanie bloku na odcinkach 50 μm, wykonując czynności 4.4.4-4.4.6.
    4. Nie używaj płytki stabilizującej. Podczas cięcia sekcje zwijają się w ciasne rolki i zbierają się albo na górze bloku, albo wpadają poniżej do tacy zbiorczej.
    5. Obserwuj kształt bloku w pierwszych kilku wykonanych cięciach. Wykonuj pionowe cięcia w bloku, tworząc równą powierzchnię na początku cięcia. W razie potrzeby wyreguluj kąt za pomocą ramienia regulacyjnego próbki.
    6. Kiedy opuszki węchowe są widoczne, zwróć szczególną uwagę na kształt sekcji. Jeśli jeden wydaje się większy od drugiego, nacięcia są pod kątem w stosunku do mózgu i konieczne jest wyprostowanie orientacji mózgu względem ostrza za pomocą ramion do regulacji próbki.
      UWAGA: Jeśli tniesz prosto, kora powinna zacząć pojawiać się nad każdą opuszką węchową w tym samym czasie.
    7. Po przecięciu opuszki węchowej i wyświetleniu rostralnej tkanki mózgowej zmniejsz grubość cięcia do 30-35 μm i zacznij zbierać pływające sekcje. Wykonaj kroki 4.4.8-4.4.13, aby podzielić mózg na sekcje.
    8. Zetrzyj wszystkie poprzednie sekcje z bloku i uchwytu na przedmioty, aby wpadły do tacki zbiorczej. Zetrzyj je na jedną stronę tacki i trzymaj je oddzielnie. Jeśli stos jest zbyt duży, opróżnij tacę.
    9. Dozować 1 ml PBS do każdego dołka na płytce 24-dołkowej. Oznacz 1 wiersz dla każdego mózgu.
    10. Wytnij 6 sekcji koronalnych. Wyjmij skrawki za pomocą zimnej pęsety i ułóż je na etapie kriostatu. Powtórz ten krok 2 lub 3 razy, oddzielając grupy po 6 sekcji.
    11. Zwilż pędzel w rozmiarze 000 PBS i zetrzyj nadmiar płynu na niestrzępiącą się chusteczkę lub ręcznik papierowy. Użyj pędzla, aby delikatnie podnieść każdą sekcję, pojedynczo, i umieść ją w odpowiednich dołkach 24-dołkowej płytki.
    12. Umieść jedną z 6 sekcji z grupy plastrów w każdym z 6 dołków w rzędzie płytki 24-dołkowej. Gwarantuje to, że każda studzienka zawiera reprezentatywne sekcje, które obejmują podzielony obszar mózgu.
    13. Kontynuuj sekcje w grupach po 6, aż ogonowy koniec kory mózgowej zostanie podzielony na sekcje.
    14. Na czas przechowywania należy zamknąć płytkę 24-dołkową parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Sekcje są stabilne przez 1-2 miesiące w temperaturze 4 °C. Roztwór PBS z 0,1% azydkiem sodu może być stosowany w celu zahamowania rozwoju bakterii i przedłużenia okresu trwałości skrawków. Jeśli jednak skrawki mają być przechowywane dłużej niż 2 miesiące, należy je umieścić w roztworze krioprotektantu i zamrozić w temperaturze -20 °C w celu uzyskania najlepszych wyników.
  5. Wykonaj immunohistochemię w celu amplifikacji sygnału genu reporterowego.
    UWAGA: Wszystkie kroki, z wyjątkiem pobierania antygenu, powinny być wykonywane przy użyciu delikatnego lub umiarkowanego mieszania (~100 obr./min) na wytrząsarce orbitalnej. Aby zachować natywną fluorescencję reportera kontrolnego (mRuby3), wszystkie stopnie powinny być w jak największym stopniu chronione przed światłem.
    1. Przygotować niezbędne zgodnie z opisem w tabeli 3.
    2. Przygotuj nową 24-dołkową płytkę z jednym rzędem dla każdego barwionego mózgu. W pierwszej kolumnie studzienek dodaj 1 ml PBS do każdej studzienki.
    3. Za pomocą pędzla o rozmiarze 000 delikatnie przenieś 1 dołek z sekcji z oryginalnej kolekcji do świeżego PBS na nowej 24-dołkowej płytce w celu szybkiego spłukania w celu usunięcia resztek związku OCT.
    4. Dodaj 1 ml ARB do następnego dołka w płytce 24-dołkowej i przenieś sekcje do tego dołka. Inkubować w piecu w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę.
    5. Pozostaw płytkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.
    6. Dodaj 1 ml PB do następnego dołka i przenieś skrawki do tego dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    7. Dodaj 500 μl BB do następnego dołka i przenieś skrawki do tego dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    8. Dodać 2 ml WB do kulki, a następnie odpipetować ~ 2 ml roztworu i wyrzucić, pozostawiając rozcieńczony roztwór BB w studzience. Powtarzaj, aż sekcje będą wyraźnie widoczne.
    9. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (Chicken IgY anty-GFP, 1:1000) w BB. Dodaj 350-500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do następnego dołka i przenieś skrawki do tego dołka. Uszczelnić płytkę parafilmem i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    10. Rozcieńczyć BB z WB, tak jak poprzednio, aż sekcje będą wyraźnie widoczne.
    11. Dodaj 1 ml WB do następnego dołka i przenieś skrawki do tego dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    12. Usuń ~800-900 μl buforu i wyrzuć. Dodaj 1 ml świeżego WB i inkubuj 20 min. Wymień 1 ml WB jeszcze 4 razy, co daje w sumie 5 prań po 20 minut każde.
    13. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 sprzężone, 1:500) w BB. Dodać 350-500 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do nowego dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut do 1 godz.
      UWAGA: To jest siódmy dołek, więc w przypadku barwienia skrawków z więcej niż 2 mózgów, w tym momencie potrzebna będzie nowa płytka.
    14. Rozcieńczyć BB WB jak poprzednio i przenieść skrawki do nowej studzienki wypełnionej 1 ml WB. Umyj sekcje tak, jak poprzednio, przez 20 minut 3 razy.
    15. Przygotować roztwór roboczy DAPI w PBS (stężenie końcowe 0,04-0,8 μg/ml). Chronić roztwór przed światłem.
    16. Dodaj 1 ml roztworu DAPI do następnego dołka i przenieś skrawki do tego dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez ~5 min.
    17. Przenieś skrawki z powrotem do balansu bieli i delikatnie zamontuj na szkiełkach mikroskopowych za pomocą pędzla w rozmiarze 000. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.
    18. Szkiełka nakrywkowe należy nakładać z odpowiednim nośnikiem montażowym. Pozwól szkiełkom utwardzić się w temperaturze pokojowej w ciemności przez noc.

5. Obrazuj i analizuj skrawki tkanki mózgowej pod kątem aktywności wzmacniającej.

  1. Użyj soczewki obiektywowej o małym powiększeniu (5x), aby rejestrować obrazy fluorescencyjne obejmujące część mózgu.
  2. Zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia i oceń zakres transdukcji wirusa na podstawie gęstości i intensywności czerwonych komórek fluorescencyjnych. Zadbaj o to, aby porównać zwierzęta, które zostały przetransdukowane w podobny sposób.
  3. W razie potrzeby rejestruj szczegółowe obrazy fluorescencyjne za pomocą soczewki obiektywowej o większym powiększeniu (≥25x).
    UWAGA: Zawsze upewnij się, że używasz tych samych ustawień dla parametrów akwizycji, takich jak natężenie światła wzbudzenia, filtry i czas ekspozycji między próbkami, które mają być porównywane.
  4. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
    UWAGA: Przetwarzanie może odbywać się w dowolnym pakiecie oprogramowania do analizy obrazu. Poniższe kroki są sugestiami dotyczącymi określania, czy sekwencja działa jako wzmacniacz w kontekście konstrukcji reportera (pytanie tak lub nie) przy użyciu dystrybucji FIJI typu open source ImageJ. Bardziej dogłębna fotometria może być odpowiednia przy porównywaniu stopni aktywności między wariantami wzmacniacza. Obrazy z różnych próbek powinny być zawsze przetwarzane w sposób spójny, aby można je było porównać.
    1. Zastosuj filtry, aby zredukować szum. Na Fidżi wybierz opcję Usuń plamki w menu Process > Noise.
      UWAGA: Jest to filtr mediany 3 x 3.
    2. Odejmij fluorescencję tła, wykonując kroki 5.4.3-5.4.6.
    3. Oddziel kanały obrazu wielokanałowego. Na Fidżi wybierz opcję Podziel kanały w menu Obraz > Kolor.
    4. Użyj narzędzia do zaznaczania prostokąta lub okręgu, aby narysować mały kształt w obszarze obrazu, w którym nie ma żadnych komórek fluorescencyjnych, i zmierz średnią intensywność pikseli tła za pomocą funkcji Analizuj > Mierz. Powtórz tę czynność, aby pobrać próbki z wielu obszarów.
      UWAGA: Upewnij się, że w menu Analizuj > ustaw pomiary wybrano opcję Średnia wartość szarości.
    5. Uśrednij średnią wartość szarości z 5-8 obszarów tła i upuść przecinek dziesiętny. Odejmij tę wartość od każdego piksela na obrazie za pomocą opcji Process > Math > Subtract.
      UWAGA: Zaokrąglenie do najbliższej liczby całkowitej może spowodować zawyżenie tła do odjęcia. Bardziej konserwatywne jest po prostu upuszczenie kropki dziesiętnej. Na przykład liczba 6,4 zostanie zaokrąglona w dół do 6, ale liczba 6,5 powinna być również zaokrąglona w dół do 6, aby uniknąć ryzyka odjęcia 0,5 jednostki rzeczywistego sygnału od każdego piksela.
    6. W razie potrzeby scal kanały z powrotem w obraz wielokanałowy. Na Fidżi użyj opcji Obraz > Kolor > Scal kanały.
    7. Zszyj ze sobą wszystkie nakładające się obrazy. Na Fidżi użyj wtyczek > zszywania > zszywania siatki/kolekcji.
    8. Dostosuj jasność i kontrast. Na Fidżi użyj opcji Image > Dostosuj > Jasność/Kontrast.
      UWAGA: Zawsze używaj tych samych wartości minimalnych i maksymalnych dla każdego obrazu, który ma być porównywany.
    9. Policz liczbę zielonych komórek fluorescencyjnych, wykonując czynności opisane w sekcjach 5.4.10-5.4.12. Są to komórki, w których kandydująca sekwencja wzmacniacza była w stanie napędzać ekspresję reporterową.
    10. Zacznij od ukrycia zielonego kanału i użyj narzędzia do zaznaczania dowolnego, aby narysować kształt wokół obszaru mózgu, który wyraża czerwoną fluorescencję. Korzystając z funkcji Measure na Fidżi, zmierz obszar, gęstość całkowaną i średnią wartość szarości kanału czerwonego w tej strefie.
    11. Za pomocą narzędzia do zaznaczania wielopunktowego policz liczbę zielonych komórek w tej strefie.
    12. Znormalizuj liczbę zielonych komórek przez zintegrowaną gęstość kanału czerwonego. Lokalna jasność kanału czerwonego jest miarą zastępczą dla wielkości ekspozycji na wirusa, umożliwiając porównanie aktywności wzmacniacza między różnymi transdukowanymi zwierzętami.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tych metod, sekwencja 915 pz w trzecim intronie genu związanym z ryzykiem psychiatrycznym CACNA1C19,49,50 została przetestowana pod kątem aktywności wzmacniającej w mózgu myszy po urodzeniu. Sekwencja ta została odkryta w MPRA składającej się z 345 kandydujących sekwencji wzmacniających skoncentrowanych na ryzyku psychiatrycznym i neurologicznym SNPs12, a eksperymenty charakteryzacy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje opartą na rAAV metodę wdrażania transgenów napędzanych wzmacniaczem w mózgu myszy po urodzeniu. W tym uogólnionym protokole kandydat na wzmacniacz, minimalny promotor, gen reporterowy i opcjonalna sekwencja kodu kreskowego są klonowane do szkieletu plazmidu AAV. Eksperymenty te można przeprowadzić z pojedynczą sekwencją wzmacniacza kandydującego lub z wieloma sekwencjami równolegle. Plazmid jest pakowany w rAAV i dostarczany do mózgu myszy po urodzeniu. Po pewnym czasie, aby umożliwić transdukcję wir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie zostało przeprowadzone w UC Davis DNA Technologies Core. Dziękujemy laboratorium Lin Tian na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis za szkolenie w zakresie pakowania rAAV i hojne podarowanie nam plazmidów pomocniczych AAV i rep/cap. Prace te były wspierane przez NIH/NIGMS R35GM119831.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Bufor cytrynianowySigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A: Specjalnie zaprojektowanystarter Forward do weryfikacji klonów po transformacji. Te startery są specyficzne dla użytego wektora i zostały zaprojektowane dla konkretnego wektora użytego w naszych eksperymentach.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A: Specjalnie zaprojektowanyodwrócony starter do weryfikacji klonów po transformacji. Te startery są specyficzne dla użytego wektora i zostały zaprojektowane dla konkretnego wektora użytego w naszych eksperymentach.
AgarozaVWRVWRVN605-500G
Zespoły rurek aspiratoraSigma-AldrichA5177-5EAdo doustnego dostarczania rAAV
Bakteriologiczne szalki PetriegoThermo Fisher Scientific08-757-100D
KarbenicylinaSigma-AldrichC1389-5G
Kurczak IgY anty-GFPThermo Fisher ScientificA10262
Mikroskop konfokalnyZeissLSM900Zdjęcia zostały wykonane modelem LSM800, ale Zeiss wprowadził na rynek model LSM900 w ostatnich latach, aby zastąpić LSM800.
Stożkowe probówki wirówkowe 15 mlThermo Fisher Scientific12-565-269
CryomoldsThermo Fisher ScientificNC9806558Te formy są odpowiednie dla mózgu myszy P28. Inne rozmiary mogą być bardziej odpowiednie dla większych lub mniejszych tkanek.
DAPISigma-AldrichD9542-10MG
Nożyczki preparacyjne, 4,5"VWR82027-578
Oślica przeciw kurczakom AlexaFlour-488Jackson ImmunoResearch703-545-155
Dulbecco's PBS 1xThermo Fisher ScientificMT21031CV
Probówki do mikrowirówek Eppendorf 2,0 mlThermo Fisher Scientific
Falcon probówki okrągłodenne 14 mlThermo Fisher Scientific352059
Fast Green dyeGraingerF0099-1G
Zestaw pędzli do drobnych detaliArtbrush TowerB014GWCLFO
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S Szklane
rurki kapilarneDrummond Scientific Company5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi KitQIAGEN12663Komercyjny zestaw do przygotowania plazmidu maxi
HyClone HyPure Molecular Biology Grade WaterVWRSH30538.03
IV zestaw do infuzji motyli z rurką 12" i igłą 25GThermo Fisher Scientific26708
KimwipesKimberly Clark34155Niestrzępiąca się chusteczka
LB AgarThermo Fisher ScientificBP1425-500LB premiks agarowy do pożywek selektywnych
Nożyczki do irysu McPherson VannasIntegra LifeSciences360-215
Olej mineralnySigma Life Science69794-500ML
NEB Stabilny kompetentny E. coliNEBC3040I
NucleoSpin Żel i PCR Clean-UpTakara740609.5Zestaw do reakcji enzymatycznej oczyszczanie i ekstrakcja żelu
Pożywka OCTVWR25608-930
Wytrząsarka orbitalnaCole Parmer60-100
Probówki paraformaldehydoweSigma-Aldrich158127-500G
do PCR 0,2 mlVWR490003-692
Pompa perystaltycznaGilsonF155005
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 10xThermo Fisher Scientific70011044
Phusion Hot Start II Polimeraza DNA o wysokiej wiernościThermo Fisher ScientificF549L
Mleko w proszkuSunny Select
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
QIAquick Zestaw do oczyszczania PCRQIAGEN28106
rCutSmart BuforNEBB6004SBufor do trawienia restrykcyjnego z PacI, AscI i XmaI
Enzym restrykcyjny: AscINEBR0558L
Enzym restrykcyjny: PacINEBR0547L
Enzym restrykcyjny: XmaINEBR0180L
SOC pożywka przeciwwzrostowaNEBB0920SPożywka regeneracyjna po przemianie
Sacharoza ( Bez RNaz / DNaz)Millipore Sigma033522.5KG
Bufor TAEApex20-194
Rurka transferowaGilsonF1179941Do pompy perystaltycznej
Triton X100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps System oczyszczania DNAThermo Fisher ScientificA1460Mini zestaw przygotowawczy do plazmidu
22431048

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020(2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479(2021).
  13. Chen, Y. -J. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956(2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014(2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863(2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384(2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279(2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877(2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Parrot, S., Denoroy, L. 130, Springer. New York. 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56(2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56(2018).
  46. Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270(2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628(2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93(2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298(2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061(2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380(2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243(2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888(2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AAV DeliveryEnhancer TestingMouse BrainReporter ConstructEGFP ExpressionIn Vivo ExpressionGibson CloningBrain InjectionFluorescence ImagingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles