Różnicowanie i polaryzacja makrofagów do fenotypu podobnego do M2 przy użyciu ludzkiej linii komórkowej białaczki THP-1 podobnej do monocytów

Podsumowanie

Makrofagi podobne do M2 związane z nowotworami (TAM) są związane z progresją guza i złym rokowaniem w raku. Protokół ten służy jako szczegółowy przewodnik do powtarzalnego różnicowania i polaryzacji komórek podobnych do monocytów THP-1 w makrofagi podobne do M2 w ciągu 14 dni. Model ten jest podstawą do badania przeciwzapalnego działania TAM w mikrośrodowisku guza.

Streszczenie

Makrofagi związane z nowotworem (TAM) mogą zmieniać swoją ekspresję i profil cytokin w zależności od bodźców zewnętrznych. Ta niezwykła plastyczność umożliwia TAM przystosowanie się do zachodzących zmian w mikrośrodowisku guza. Makrofagi mogą mieć przede wszystkim właściwości prozapalne (podobne do M1) lub przeciwzapalne (podobne do M2) i mogą stale przełączać się między tymi dwoma głównymi stanami. Makrofagi podobne do M2 w środowisku guza są związane z progresją raka i złym rokowaniem w kilku typach raka. Wiele różnych metod indukowania różnicowania i polaryzacji komórek THP-1 jest wykorzystywanych do badania mechanizmów komórkowych i międzykomórkowych oraz wpływu TAM w mikrośrodowisku nowotworów. Obecnie nie ma ustalonego modelu polaryzacji makrofagów podobnych do M2 przy użyciu linii komórkowej THP-1, a wyniki ekspresji i profili cytokin makrofagów spowodowanych pewnymi bodźcami in vitro różnią się w zależności od badania. Protokół ten służy jako szczegółowe wytyczne do różnicowania komórek podobnych do monocytów THP-1 w makrofagi M0 i dalszej polaryzacji komórek do fenotypu podobnego do M2 w ciągu 14 dni. Pokazujemy zmiany morfologiczne komórek podobnych do monocytów THP-1, zróżnicowanych makrofagów i spolaryzowanych makrofagów podobnych do M2 za pomocą mikroskopii świetlnej. Model ten jest podstawą dla modeli linii komórkowych badających przeciwzapalne działanie TAM i ich interakcje z innymi populacjami komórek mikrośrodowiska guza.

Wprowadzenie

Makrofagi związane z nowotworami (TAM) i ich rola w przewlekłym zapaleniu, początkach raka i rozwoju nowotworów są ważnymi celami w ostatnich badaniach^1,2. Monocyty krwi obwodowej, które są rekrutowane do mikrośrodowiska tkankowego rozwijającego się nowotworu, różnicują się w makrofagi i mogą być spolaryzowane na dwa główne podtypy makrofagów³. Klasycznie aktywowany makrofag reprezentuje przede wszystkim prozapalny fenotyp podobny do M1, a alternatywnie aktywowany podtyp podobny do M2 wykazuje głównie cechy przeciwzapalne⁴. Makrofagi mogą dynamicznie przełączać się między tymi dwoma głównymi fenotypami w zależności od ich metabolizmu komórkowego, przy czym podtypy pośrednie mają zarówno atrybuty zapalne, jak i przeciwzapalne⁵. TAM reprezentuje niejednorodną populację obu fenotypów. Funkcja sprzyjająca nowotworom i złe rokowanie w różnych typach nowotworów jest jednak szczególnie związane z makrofagami podobnymi do M2^6,7,8.

Profile funkcjonalne makrofagów i ich interakcja z innymi komórkami w mikrośrodowisku guza są skomplikowane i trudne do uchwycenia w ciągle zmieniającym się środowisku podczas trwającego rozwoju guza. Linie komórkowe mogą zapewnić jednorodną populację komórek o stabilnej żywotności w hodowli, co może ułatwić proces demonstracji zdefiniowanych mechanizmów komórkowych i międzykomórkowych. Monocytopodobna linia komórkowa THP-1 jest legalnym systemem modelowym dla pierwotnych ludzkich monocytów⁹. Ta spontanicznie unieśmiertelniona linia komórkowa została uzyskana z krwi obwodowej rocznego niemowlęcia z ostrą białaczką monocytową^9,10. Różnicowanie i polaryzacja komórek THP-1 zostały zgłoszone w kilku badaniach i zostały przeprowadzone na wiele różnych sposobów^11,12,13,14. Po aktywacji, a tym samym polaryzacji makrofagów do fenotypu podobnego do M1, następuje kompensacyjny przeciwzapalny mechanizm odbicia, promujący fenotyp podobny do M2 poprzez cytokiny wytwarzane przez makrofagi zapalne, takie jak interleukina 6 (IL-6) lub itakonian^15,16. Może to służyć jako mechanizm przerywający w celu osłabienia przestrzelonej reakcji zapalnej po aktywacji komórki¹⁷. Procesowi różnicowania i polaryzacji monocytów i komórek podobnych do monocytów THP-1 w przeciwzapalny fenotyp podobny do M2 towarzyszą również bodźce prozapalne, które należy pokonać. Odpowiedź cytokin zapalnych może być spowodowana stresem mechanicznym¹⁸, takim jak zmiana pożywki w celu ponownego odżywienia komórek lub dodanie związków chemicznych w celu różnicowania komórek THP-1, takich jak 12-mirystynian forbolu 13-octan (PMA) i indukowanie produkcji czynnika martwicy nowotworu α (TNFα), interleukiny 1β (IL-1β) lub IL-6¹⁹. Ten zmieniony profil ekspresji cytokin w odpowiedzi na PMA może wpływać i zapobiegać późniejszej polaryzacji makrofagów²⁰. Odpowiednie okresy spoczynku, jak zgłoszono przed leczeniem PMA, pozwalają tym reakcjom zapalnym zmniejszyć się i ułatwić polaryzację komórek do wyraźnego fenotypu podobnego do M2²¹.

Ten protokół demonstruje metodę różnicowania i polaryzacji komórek podobnych do monocytów THP-1 w fenotyp podobny do M2 makrofagów w ciągu 14 dni.

Protokół

UWAGA: Przegląd kroków opisanych w tym protokole jest pokazany w Rysunek 1. Zakupiono ludzką linię komórkową białaczki podobnej do monocytów THP-1. Przeprowadzono analizę krótkich powtórzeń tandemowych w celu uwierzytelnienia linii komórkowej THP-1. Wszystkie kroki wykonuj w sterylnych warunkach. Monocytowa linia komórkowa THP-1 rośnie w zawiesinie i nie przyczepia się do powierzchni hodowli komórkowych. Adherencja może być wywołana przez różnicowanie monocytów w komórki podobne do makrofagów, np. poprzez stres mechaniczny lub specyficzne leczenie PMA.

1. Hodowla i utrzymanie komórek monocytów THP-1

1. Ustaw minutnik na 150 s. Wyjmij zamrożoną fiolkę zawierającą linię komórkową THP-1 (tabela materiałów) z ciekłego azotu i natychmiast rozmrozić ją w łaźni czystej wody (37 °C). Uruchom stoper, gdy tylko fiolka zostanie umieszczona w łaźni wodnej. Poluzuj nakrętkę, aby uwolnić ciśnienie, które narasta w wyniku procesu rozmrażania, ale upewnij się, że otwór rurki nie styka się z wodą, aby uniknąć zanieczyszczenia. Optymalny okres rozmrażania komórek wynosi 120-150 s. Kontynuować rozmrażanie zawiesiny komórkowej do momentu, gdy w fiolce pozostanie odłamek lodu o wielkości około 4 mm; Następnie natychmiast przejdź do następnego kroku.
2. Przenieść fazę ciekłą zawiesiny komórek do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml ciepłej (37 °C) pożywki wzrostowej (tabela materiałów). Następnie przenieść 1 ml ciepłej zawiesiny średniokomórkowej do fiolki THP-1 i z powrotem do probówki o pojemności 15 ml, aby stopić pozostały wiór lodowy i przepłukać fiolkę, aby upewnić się, że nie pozostały żadne komórki.
3. Zawiesinę należy delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1000 μl. Pobrać małą próbkę (około 10 μl) w celu policzenia komórek pod kątem żywotności (przy użyciu błękitu trypanowego w celu wykluczenia) podczas ich wirowania. Odkręcać zawiesinę z ciepłymi komórkami o sile 200 x g przez 7 minut w temperaturze 37 °C.
4. Całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić z pewną objętością ciepłej pożywki wzrostowej, aby uzyskać gęstość komórek 5 x 10⁵/ml. Delikatnie wymieszać zawiesinę i przenieść 22 ml objętości do kolb do hodowli komórek T-75 (tabela materiałów). Kolby przechowywać w pozycji pionowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C o stężeniu 5% dwutlenku węgla (CO_{2 ).} Wymieniaj pożywki wzrostowe co 3-4 dni.

2. Wysiewanie komórek THP-1 i różnicowanie do makrofagów M0

1. Przygotować komórkę zawierającą pożywkę wzrostową o odpowiedniej gęstości komórek do wysiewu komórek o gęstości 3 x 10⁵/ml/studzienkę na 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych (tabela materiałów). Delikatnie wymieszać podłoże i przygotować porcje po 26 ml, z których każda powinna zostać przelana do probówki o pojemności 50 ml. Użyj każdej podwielokrotności 26 ml do wysiewu komórek na odpowiednią płytkę.
2. Przenieść 1 ml pożywki zawierającej komórki do każdego dołka 24-dołkowej płytki. Delikatnie wymieszać pożywkę, pipetując w górę i w dół między transferami.
3. Przygotować roztwór podstawowy PMA (rozpuścić 1 mg PMA w 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) = ~16 mM roztworu PMA w DMSO) i rozcieńczyć go zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia roboczego 10 ng / μL tuż przed leczeniem komórek (Tabela materiałów). Roztwór należy przechowywać na lodzie i natychmiast zużyć. Nie zamrażaj ponownie. Dodać 100 ng PMA na studzienkę. Pozostawić każdą płytkę komórkową w inkubatorze bez dalszego leczenia przez 72 godziny.
4. Po 72 godzinach usuń pożywkę wzrostową i zastąp ją 1 ml świeżej pożywki. Nie dotykaj dna studzienek końcówkami pipet. Pozostaw komórki na kolejne 96 godzin w inkubatorze.
5. Po 96 godzinach powtórz krok 2.4 (zmiana pożywki) i pozwól komórkom odpoczywać przez kolejne 24 godziny.
   UWAGA: Makrofagi M0 są teraz gotowe do użycia w eksperymentach (Rysunek 2). Bezpośrednio przed traktowaniem komórek w ramach dalszych eksperymentów, należy rozważyć zmianę pożywki tylko za pomocą RPMI (Tabela materiałów), ponieważ suplementy pożywek wzrostowych mogą powodować zakłócenia z odczynnikami, które są dodawane do leczenia komórek. W przypadku, gdy potrzebne są makrofagi podobne do M2, przejdź do sekcji 3.

3. Polaryzacja makrofagów M0 na makrofagi podobne do M2

1. Przygotować roztwór podstawowy IL-4 i IL-13 (rozpuścić 20 μg IL-4 lub IL-13 w 200 μl wody wolnej od nukleaz) i rozcieńczyć go do końcowego stężenia roboczego 2 ng/μl za pomocą PBS bezpośrednio przed poddawaniem działaniu komórek roztworu PBS. Roztwór należy przechowywać na lodzie i natychmiast zużyć. Nie zamrażaj ponownie.
2. Usuń pożywkę wzrostową i zastąp ją 1 ml świeżej pożywki. Dodać 20 ng interleukiny 4 (IL-4) i 20 ng interleukiny 13 (IL-13) do studzienki. Pozostaw komórki na 48 godzin w inkubatorze.
3. Po 48 godzinach powtórz krok 3.2. Pozostaw komórki na kolejne 48 godzin w inkubatorze.
4. Usuń pożywkę wzrostową i zastąp ją 1 ml świeżej pożywki. Pozostaw komórki na 48 godzin w inkubatorze.
   UWAGA: Makrofagi podobne do M2 są teraz gotowe do użycia w eksperymentach (Rysunek 2). Bezpośrednio przed traktowaniem komórek w ramach dalszych eksperymentów, należy rozważyć zmianę pożywki tylko za pomocą RPMI (Tabela materiałów), ponieważ suplementy pożywek wzrostowych mogą powodować zakłócenia.

4. Odłączanie i zbieranie makrofagów do cytometrii przepływowej

UWAGA: Użyj metody mechanicznej łączącej szokowanie na zimno i skrobanie komórek, aby odłączyć i zebrać spolaryzowane makrofagi z płytek do cytometrii przepływowej.

1. Usuń ciepłe podłoże komórkowe i zastąp je mieszaniną lodowatego PBS (bez wapnia i magnezu) i 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1 ml na studzienkę. Natychmiast po tym umieść płytkę komórkową na lodzie na 45 minut. Nie umieszczaj płytki komórkowej na lodzie przed usunięciem ciepłego podłoża komórkowego, ponieważ znacznie zmniejszy to żywotność komórek. Utrzymuj komórki na lodzie tylko po wywołaniu szoku zimnego lodowatą mieszaniną PBS/5% FBS.
2. Po 45 minutach na lodzie zeskrobać komórki za pomocą mini skrobaków do komórek (tabela materiałów). Delikatnie przenieś oderwane makrofagi w zimnym PBS/5% FBS do probówki o pojemności 15 ml. Trzymaj probówkę na lodzie przez cały czas, aż komórki zostaną poplamione.
   UWAGA: Połącz osiem dołków komórek, aby osiągnąć odpowiednią liczbę komórek do barwienia.

Wyniki

Makrofagi podobne do M2 zostały scharakteryzowane, a polaryzacja M2 została zweryfikowana za pomocą cytometrii przepływowej dla markerów Cluster of Differentiation (CD) CD14, CD11b, CD80 (marker podobny do M1) i CD206 (marker podobny do M2). Barwienie metodą cytometrii przepływowej wykonano zgodnie z zaleceniami producenta. Makrofagi przemyto PBS/5% FBS i inkubowano z blokiem receptora Fcγ, aby uniknąć niespecyficznego wiązania. Komórki następnie barwiono mysimi przeciwciałami anty-ludzkimi CD14 i CD80 sprzężonymi z FITC...

Dyskusja

Ten protokół różnicowania i polaryzacji komórek podobnych do monocytów THP-1 w ciągu 14 dni zapewnia metodę otrzymywania makrofagów o wyraźnym fenotypie podobnym do M2 dzięki długiej inkubacji komórek po leczeniu z odpowiednimi okresami spoczynku między etapami.

Niektóre kroki mają kluczowe znaczenie dla tego protokołu. Czas podwajania monocytów THP-1 wynosi około 26 godzin. Komórki można dzielić o gęstości komórek 9 x 10⁵ / ml i należy je wysiewać o gęstości 3 x 10⁵ / ml...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,4% błękit trypanowy	VWR, Radnor, Stany Zjednoczone	152-5061
Probówka mikrowirówkowa 1,5 ml	USA Scientific, Ocala, USA	1615-5510
Pipeta serologiczna 10 ml	VWR, Radnor, Stany Zjednoczone&	nbsp; 89130-898
1000 μ L Końcówki do pipet TipOne	USA Scientific, Ocala, USA	1111-2821
15 mL  Probówka wirówkowa	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 μ L Końcówki do pipet TipOne	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 μ L Końcówki do pipet TipOne	USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
Pipeta serologiczna 25 ml	VWR, Radnor, Stany Zjednoczone	89130-900
Pipeta serologiczna 5 ml	VWR, Radnor, Stany Zjednoczone&	nbsp; 89130-896
50 ml Probówka wirówkowa	VWR, Radnor, Stany Zjednoczone	89039-662
Roztwór Accutazy 500 ml	Sigma, St. Louis, USA	A6964
Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100x), stabilizowany	Sigma, St. Louis, USA	A5955-100 ml	z 10 000 jednostek penicyliny, 10 mg streptomycyny i 25 μ g amfoterycyny B na ml, sterylnie filtrowany, Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych
Inkubator CO2 Binder	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
Kolba CytoOne T-75cm z nasadką filtrującą	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	Należy stosować D8537-500 mL	PBS bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, ponieważ oba mogą zmieniać polaryzację makrofagów
Wirówka Eppendorf 5804 R (chłodzona)	Eppendorf, Enfield, USA-Alkohol
etylowy (70%)	-	-
FACSCalibur cytometr przepływowy	BD Biosciences, San Diego, USA-		Cytometr przepływowy współpracuje z oprogramowaniem CellQuest (BD Biosciences)
Falcon 24-dołkowa płytka	VWR, Radnor, USA	353504
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Cytometria przepływowa, marker komórek szpikowych (100 testów)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Cytometria przepływowa, marker M1 (100 testów)
FITC Mysz IgG1 κ Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555748	Cytometria przepływowa, kontrola izotypu dla CD80 (100 testów)
FITC Mouse IgG2a, κ Kontrola izotypu	BD Biosciences, San Diego, USA	553456	Cytometria przepływowa, kontrola izotypu dla CD14 (100 testów)
Ludzki blok BD Fc BD	Biosciences, San Diego, USA	564220	Cytometria przepływowa, blok Fc (0,25 mg)
Ludzka interleukina 13 (IL-13)	R& D, Minneapolis, USA	IL-771-10 μ g
Ludzka interleukina 4 (IL-4)	R& D, Minneapolis, Stany	Zjednoczone SRP3093-20 μ g
Szafa bezpieczeństwa biologicznego Labconco (seria Delta 36212/36213)	Labconco, Kansas City, USA-Roztwór
L-glutaminy, 200 mM	ATCC, Manassas, USA	30-2214
Lipopolisacharyd (LPS) z E. coli 0111:B4	Sigma, St. Louis, USA	L2630-100 mg
Mini skrobaki do komórek	Biotium, Fremont, USA	22003
Neubauer hemocytometr	Fisher Scientific, Waltham, USA	02-671-5
Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse TS100		Nikon, Melville, USA-Woda
wolna od nukleaz	Invitrogen, Carlsbad, USA	AM9937
Olympus Light Microscope RH-2	Mikroskop centralny, Feasterville, USA	40888
Zmienna pipeta P10 - Gilson	VWR, Radnor, USA	76180-014
Zmienna pipeta P1000-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
Zmienna pipeta P200- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Mysz anty-ludzka CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Cytometria przepływowa, marker komórek szpikowych (100 testów)
PE Mysz IgG1 i kappa; Kontrola izotypu	BD Biosciences, San Diego, USA	555749	Cytometria przepływowa, kontrola izotypu dla CD11b (100 testów)
PE-Cy 5 Mysz anty-ludzka CD206	BD Pharmingen, San Diego, USA	551136	Cytometria przepływowa, marker M2 (100 testów)
PE-Cy 5 Mysz IgG1 κ Kontrola izotypu	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Cytometria przepływowa, kontrola izotypu dla CD206 (100 testów)
12-mirystynian 13-octanu Phorbol (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Pipipeta Powerpette Plus	VWR, Radnor, USA	75856-448
Precyzyjna kąpiel wodna (model 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Medium	ATCC, Manassas, USA	30-2001
Linia komórkowa THP-1, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas, USA	TIB-202