Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

DOI:

10.3791/62655

⸱

30 maja 2021

 , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Używanie linijek spektroskopowych do śledzenia wielu konformacji pojedynczych biomolekuł i ich dynamiki zrewolucjonizowało zrozumienie dynamiki strukturalnej i jej wkład w biologię. Podczas gdy linijka oparta na fret informuje o odległościach między barwnikami w zakresie 3-10 nm, inne techniki spektroskopowe, takie jak wzmocnienie fluorescencji indukowane białkiem (PIFE), informują o bliskości między barwnikiem a powierzchnią białka w krótszym zakresie 0-3 nm. Niezależnie od wybranej metody, jej zastosowanie do pomiaru swobodnie dyfuzujących biomolekuł pojedynczo uzyskuje histogramy parametru eksperymentalnego, dając oddzielne, centralnie rozmieszczone subpopulacje biomolekuł, gdzie każda subpopulacja reprezentuje albo pojedynczą konformację, która pozostała niezmieniona w ciągu milisekund, albo wiele konformacji, które interkonwertują znacznie szybciej niż milisekundy, a zatem uśrednioną subpopulację. W jednocząsteczkowym FRET, gdzie parametrem zgłaszanym na histogramach jest wydajność FRET między barwnikami, wewnętrznie nieuporządkowane białko, takie jak monomer α-synukleiny w buforze, zostało wcześniej zgłoszone jako wykazujące pojedynczą uśrednioną subpopulację wielu konformacji szybko ulegających intertransformacji. Chociaż te wcześniejsze odkrycia zależą od zakresu 3-10 nm linijki opartej na FRET, staraliśmy się przetestować to białko za pomocą jednocząsteczkowego PIFE, w którym śledzimy czas trwania fluorescencji specyficznych dla miejsca białek α-synukleiny znakowanych sCy3 pojedynczo. Co ciekawe, przy użyciu tego spektroskopowego czujnika zbliżeniowego krótszego zasięgu, α-synukleina znakowana sCy3 wykazuje kilka subpopulacji o wyraźnie różnych średnich czasach życia, które przekształcają się w ciągu 10-100 ms. Wyniki te pokazują, że chociaż α-synukleina może być globalnie zaburzona, to jednak osiąga stabilne struktury lokalne. Podsumowując, w tej pracy podkreślamy zalety stosowania różnych spektroskopowych czujników zbliżeniowych, które śledzą lokalne lub globalne zmiany strukturalne po jednej biomolekułach na raz.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich dwóch dekad, metody oparte na fluorescencji pojedynczych cząsteczek stały się potężnym narzędziem do pomiaru biomolekuł1,2, badając, jak rozkładają się różne parametry biomolekularne, a także jak dynamicznie przekształcają się między różnymi subpopulacjami tych parametrów z rozdzielczością poniżej milisekundy3,4,5. Parametry w tych technikach obejmują efektywność transferu energii w pomiarach FRET 6,7, anizotropia fluorescencji8,9, wydajność kwantowa fluorescencji i czas życia10,11, jako funkcja innego wygaszania fluorescencji12 lub wzmocnienie13 mechanizmów. Jeden z tych mechanizmów, lepiej znany jako wzmocnienie fluorescencji indukowanej białkiem (PIFE)14 wprowadza zwiększenie wydajności kwantowej fluorescencji i czasu życia jako funkcję sterycznej niedrożności swobodnej izomeryzacji fluoroforu w stanie wzbudzonym, spowodowanej przez powierzchnie białek w pobliżu barwnika14,15,16,17,18,19. Zarówno FRET, jak i PIFE są uważane za linijki spektroskopowe lub czujniki zbliżeniowe, ponieważ ich mierzony parametr jest bezpośrednio związany z miarą przestrzenną w znakowanej biocząsteczce podlegającej pomiarom. Podczas gdy wydajność FRET jest związana z odległością między parą barwników w zakresie 3-10 nm20, PIFE śledzi wzrost wydajności kwantowej fluorescencji lub czasu życia związany z odległością między barwnikiem a powierzchnią pobliskiego białka w zakresie 0-3 nm19.

Jednocząsteczkowy FRET jest szeroko stosowany do dostarczania informacji strukturalnych o wielu różnych systemach białkowych, w tym o białkach wewnętrznie nieuporządkowanych (IDPs)21, takich jak α-synukleina (α-Syn)22. α-Syn może tworzyć uporządkowane struktury po związaniu z różnymi biomolekułami i w różnych warunkach23,24,25,26,27,28,29,30. Jednak po odwiązaniu monomer α-Syn charakteryzuje się wysoką niejednorodnością konformacyjną z szybko konwertującymi konformacjami31,32.

Konformacje α-Syn były wcześniej badane przy użyciu różnych technik, które pomagają w identyfikacji dynamiki konformacyjnej takich wysoce heterogenicznych i dynamicznych układów białkowych33,34,35,36,37,38,39. Co ciekawe, jednocząsteczkowe pomiary FRET (smFRET) α-Syn w buforze wykazały pojedynczą populację FRET39,40, co jest wynikiem uśredniania w czasie dynamicznych konformacji, które przekształcają się w czasie znacznie szybszym niż typowy czas dyfuzji α-Syn przez plamkę konfokalną (czasy tak szybkie, jak kilka mikrosekund, a nawet szybsze, w stosunku do typowych milisekundowych czasów dyfuzji)40,41. Jednak użycie linijki spektroskopowej FRET o czułości odległości 3-10 nm czasami informuje tylko o ogólnych zmianach strukturalnych w małym białku, takim jak α-Syn. Pomiary pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem spektroskopowych czujników zbliżeniowych o czułości mniejszej odległości mogą potencjalnie informować o dynamice struktur lokalnych. W tym celu przeprowadzamy pomiary pojedynczych cząsteczek PIFE α-Syn i identyfikujemy różne subpopulacje czasów życia fluorescencji, mapując je na różne struktury lokalne z przejściami między nimi tak wolnymi, jak 100 ms. Praca ta podsumowuje czasowo-rozdzielcze pomiary smPIFE swobodnie dyfuzyjnych cząsteczek α-Syn pojedynczo, w buforze i po związaniu z membranami opartymi na SDS jako spektroskopowy czujnik zbliżeniowy pojedynczej cząsteczki krótkiego zasięgu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transformacja plazmidu

  1. Przygotowanie 0,5 l pożywki SOC
    1. Odważyć 10 g tryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,25 g chlorku sodu (NaCl), 0,1 g chlorku potasu (KCl).
    2. Dodaj wodę podwójnie destylowaną (DDW) do uzyskania całkowitej objętości 0,5 l.
    3. Dostosuj do pH 7, dodając wodorotlenek sodu (NaOH).
    4. Przygotować porcje podstawowe po 100 ml i autoklaw.
    5. Przed użyciem dodaj 0,5 ml sterylnego chlorku magnezu (MgCl2) i 1,8 ml sterylnej glukozy do 100 ml SOC.
  2. Rozmrozić kompetentne komórki Escherichia coli BL21 (DE3) na lodzie.
  3. Delikatnie wymieszaj właściwe komórki.
  4. Przygotuj dwie probówki o pojemności 15 ml. Oznacz jedną jako rurkę reakcyjną transformacji, a drugą jako probówkę kontrolną.
  5. Podwielokrotność 100 μl kompetentnych komórek do probówek.
  6. Dodać 1 μl plazmidu o stężeniu 0,1 ng/μl do probówki z reakcją przemiany.
  7. Podgrzej pożywkę SOC w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C do użycia w kroku 1.8.
  8. Impuls termiczny obu probówek w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 sekund. (Krytyczny krok!)
  9. Do każdej probówki dodać 900 μl podgrzanej pożywki SOC.
  10. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 45 minut, wytrząsając z prędkością 225 obr./min.
  11. Rozprowadzić 200 μl komórek z przekształconym plazmidem na jednej płytce agarowej LB (Luria-Bertani) zawierającej 100 μg/ml ampicyliny, używając sterylnego rozsiewacza komórek.
  12. Rozprowadzić 200 μl komórek z przekształconym plazmidem na jednej płytce LB-agar bez ampicyliny, używając sterylnego rozsiewacza (kontrola pozytywna).
  13. Rozprowadzić 200 μl komórek kontrolnych (niezawierających plazmidu) na jednej płytce LB-agar zawierającej 100 μg/ml ampicyliny, używając sterylnego rozsiewacza (kontrola ujemna).
  14. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.

2. Preparat białkowy

  1. Rekombinowana ekspresja i oczyszczanie α-synukleiny
    1. Wybierz pojedynczą kolonię i hoduj w 100 ml autoklawowanego płynnego podłoża LB (Luria-Bertani) zawierającego 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C (starter).
    2. Przygotować cztery kolby Erlenmeyera o pojemności 2 l, z których każda zawiera 1 l autoklawowanej pożywki LB i 100 μg/ml ampicyliny (duża inokulacja).
    3. Zmierzyć gęstość optyczną (OD przy λ = 600 nm) roztworu ogniwa. Gdy gęstość komórek startera osiągnie ODλ=600nm 0,6-0,7, dodaj 10 ml roztworu starterowego na każdy 1 l pożywki LB przygotowanej w poprzednim kroku.
    4. Hodować pożywki bakteryjne w inkubatorze w temperaturze 37 °C i prędkości 200 obr./min.
    5. Gdy gęstość komórek osiągnie ODλ=600nm 0,6-0,8, indukuj ekspresję białka, dodając izopropylowy β-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) na każdy 1 l pożywki wzrostowej do końcowego stężenia 1 mM,
      UWAGA: Rozpuść 0,96 g IPTG w 4 ml DDW i dodaj 1 ml powstałego roztworu IPTG na każdy 1 l wzrostu bakterii.
    6. Hodować komórki przez 4 godziny i zbierać je przez odwirowanie w probówkach o pojemności 50 ml z prędkością 5,170 x g przez 8 minut><. UWAGA: W każdej rundzie wyrzuć supernatant, zachowaj osad i ponownie napełnij te same probówki wzrostem bakterii.
    7. Przechowuj osad bakteryjny w głębokim zamrażaniu (np. w temperaturze -80 °C) na następny dzień.
    8. Następnego dnia przygotuj 200 ml buforu do lizy: 40% (w/v) sacharozy i buforu A, który zawiera 30 mM Tris-HCl, 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 2 mM ditiotreitolu (DTT) o pH 8,0.
    9. Dodać 25 ml buforu do lizy do każdej probówki z osadem bakteryjnym.
    10. Ponownie zawiesić osad (użyć sterylnych plastikowych pipet Pasteura) w buforze do lizy (patrz 2.1.8).
    11. Przygotować sterylną kolbę Erlenmeyera o pojemności 250 ml z magnesem mieszającym na lodzie.
    12. Dodać 5 ml buforu do lizy, a następnie przenieść do niego jednorodne, ponownie zawieszone komórki.
    13. Mieszaj komórki przez 20 minut przy 200 obr./min w temperaturze pokojowej.
    14. Podzielić roztwór na probówki o pojemności 50 ml i odwirować w temperaturze 4 °C przez 30 minut z prędkością 17 400 x g.
    15. Odrzucić supernatant.
    16. Przygotować sterylną kolbę Erlenmeyera o pojemności 250 ml z magnesem mieszającym na lodzie.
    17. Dodać 15 ml buforu do rozpuszczania (90 ml schłodzonego buforu A i 37 μl MgCl2 rozpuszczonych poza granicę rozpuszczalności i przefiltrowanych) do każdej probówki. Użyj sterylnych plastikowych pipet Pasteura i rozpuść granulkę.
    18. Gdy część roztworu stanie się jednorodna, przenieść ją do wymieszanej kolby Erlenmeyera na lodzie.
    19. Określić objętość roztworu w Erlenmeyerze.
    20. Dodać 10 mg siarczanu streptomycyny na każdy 1 ml roztworu (przed dodaniem rozpuścić siarczan streptomycyny w 2 ml buforu A).
      UWAGA: Ten krok jest wykonywany w celu usunięcia DNA i rybosomów.
    21. Mieszaj roztwór przez 10-20 minut w temperaturze pokojowej.
    22. Podzielić roztwór na probówki o pojemności 50 ml i odwirować w temperaturze 4 °C i z prędkością 20 700 x g przez 30 minut.
    23. Zebrać sklarowany osad i wyrzucić osad.
    24. Przygotować sterylną kolbę Erlenmeyera o pojemności 250 ml na lodzie za pomocą mieszadła.
    25. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm do czystej kolby Erlenmeyera.
    26. Oznaczyć objętość roztworu i zważyć 0,3 g siarczanu amonu na każdy 1 ml roztworu.
    27. Stopniowo dodawać siarczan amonu do wymieszanego roztworu.
      UWAGA: Ten etap jest wykonywany w celu wytrącenia białek. Kiedy siarczan amonu wiąże białka, roztwór staje się niewyraźny i rozmyty, co objawia się białym kolorem.
    28. Mieszaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    29. Podzielić roztwór na probówki o pojemności 50 ml i odwirować w temperaturze 4 °C i z prędkością 20 700 g przez 30 minut.
    30. Ostrożnie wyrzucić supernatant i zachować osad.
    31. Rozpuścić osad w 20 ml buforu A.
    32. Zunifikuj wszystkie roztwory w jednej probówce, a następnie zmierz widmo absorpcji UV roztworu.
      UWAGA: Jeśli widmo wykazuje sygnaturę agregacji (absorpcja powyżej długości fali 300 nm), przejdź do następnego kroku. Jeśli nie, pomiń następny krok i przejdź do kroku 2.1.34.
      UWAGA: Wskaźnik agregacji (A.I.) obliczony na podstawie widm UV jako ODλ=350nm/ (ODλ=280nm - ODλ=350nm) ×100. 41
    33. Użyć odciętych probówek wirówkowych o natężeniu 100 kDa i odwirować z prędkością 3,590 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Zbierz płyn, który przeszedł przez filtr.
    34. Roztwór należy dializować w temperaturze 4 °C przez noc, w stosunku do buforu A, przy użyciu worków dializacyjnych z punktem odcięcia 3,5 kDa.
    35. Wykonać kolejną rundę dializy przez co najmniej 4 godziny.
    36. Załaduj dializowaną próbkę do kolumny do wymiany anionów MonoQ o pojemności 1 ml. Użyć 30 mM buforu chlorowodorku Tris (Tris-HCl) o pH 7,5 jako buforu płuczącego i 30 mM buforu Tris-HCl o pH 7,5 z 500 mM NaCl jako buforu elucyjnego.
    37. Wstrzyknąć próbkę do kolumny. Następnie przemyć 20 objętościami kolumny (CV) 0% buforu elucyjnego i 100% buforu płuczącego w celu usunięcia niezwiązanych białek.
    38. Przemyć 7 CV 30% buforu elucyjnego.
    39. Eluować próbkę białka α-Syn za pomocą gradientu, który zmienia się od 30% do 100% buforu elucji dla 30 CV, przy natężeniu przepływu 1,5 ml/min.
      UWAGA: α-Syn eluuje przy 46-66 CV przy przewodności 20-24 mS/cm, co odnosi się do 38-50% buforu elucyjnego.
    40. Zebrać frakcje głównego piku elucji. Sprawdź obecność α-Syn, przeprowadzając próbki w elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z 15% dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), po barwieniu roztworem barwiącym Coomassie Blue lub Fast SeeBand. Spodziewane jest pasmo na poziomie 15 kDa.
    41. Ujednolicić odpowiednie frakcje i dializować je przez noc w stosunku do buforu A, używając worków dializacyjnych z punktem odcięcia 3,5 kDa w temperaturze 4 °C.
    42. Przygotować podwielokrotności próbki białka i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
  2. Znakowana Cy3 α-synukleina
    1. Zredukować tiol reszty cysteiny w mutancie α-Syn A56C, dodając DTT do końcowego stężenia 2 mM przez okres 1 godziny w temperaturze pokojowej.
    2. Usuń naziemną telewizję cyfrową, wykonując dwie rundy dializy przy użyciu worków dializacyjnych o napięciu 3,5 kDa. W pierwszej rundzie dializa z 30 mM Tris-HCl pH 8,0 i 2 mM EDTA. W drugiej rundzie dializa z 50 mM HEPES pH 7,2 i 2 mM EDTA.
    3. Zredukować reszty cysteiny, dodając chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) do próbki białka, do końcowego stężenia 50 μM przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: TCEP jest niesulfhydrylowym środkiem redukującym, dlatego utrzymuje redukcję grup tiolowych bez reakcji z barwnikiem. Dodaliśmy 0,5 μl z roztworu podstawowego 1 M TCEP.
    4. Obliczyć ilość białka potrzebną do uzyskania końcowej objętości reakcyjnej wynoszącej 1 ml,
      UWAGA: Oto przykład użytych przez nas obliczeń:
      20 μM końcowe stężenie białka × 1 ml objętości końcowej = 56 μM początkowe stężenie białka × V białko do dodania
    5. Obliczyć ilość barwnika wymaganą do uzyskania końcowej objętości reakcji wynoszącej 1 ml. Znakowanie barwnikiem pojedynczej cysteiny powinno być wykonywane z nadmiarem barwnika, przy stosunku molowym barwnika do białka wynoszącym co najmniej 3:1,
      UWAGA: Przykład do obliczeń, których użyliśmy:
      60 μM końcowe stężenie barwnika × 1 ml objętości końcowej = 370 μM początkowe stężenie barwnika × V barwnika do dodania
    6. Obliczyć ilość buforu z dializatu potrzebną do dostosowania całkowitej objętości reakcji do 1 ml.
      UWAGA: Przykład obliczeń: 1 ml - (V obliczone od kroku 2.2.4 + V obliczone od kroku 2.2.5)
    7. Przygotować fiolkę reakcyjną z magnesem umieszczonym na mieszadle.
    8. Najpierw dodaj obliczoną ilość białka i buforu. Następnie dodać obliczoną ilość barwnika (maleimidu sulfo-Cy3).
    9. Utrzymuj reakcję w temperaturze pokojowej w ciemności przez 3-5 godzin.
    10. Zakończ reakcję, dodając 2 mM DTT i kontynuuj przez 1 godzinę.
    11. Wykonać trzy rundy dializy z buforem A, używając worków dializacyjnych z odcięciem 3,5 kDa w celu usunięcia nadmiaru wolnego barwnika z roztworu.
    12. Załaduj próbkę do kolumny wykluczającej rozmiar, aby jeszcze bardziej oddzielić oznaczony α-Syn od wolnego barwnika.
    13. Oznaczyć stężenie czystego znakowanego α-Syn, mierząc absorpcję barwnika (współczynnik absorpcji dla sulfo-Cy3 wynosi 162 000 M-1 cm-1przy λ=548 nm).
    14. W razie potrzeby stężyć czysty, oznakowany roztwór α-Syn za pomocą koncentratora próżniowego (np. SpeedVac). Następnie należy przeprowadzić jedną rundę dializy z użyciem buforu A, używając worków dializacyjnych z wartością odcięcia 3,5 kDa i ponownie określić stężenie znakowanego białka.
    15. Przygotować podwielokrotności znakowanej próbki białka i przechowywać je w temperaturze -20 °C.

3. Pomiary

  1. konfiguracja eksperymentalna smPIFE
    UWAGA: Użyj następującej konfiguracji opartej na konfokale lub podobnej.
    1. Użyj impulsowego źródła laserowego (w naszym przypadku λ= pikosekundowy laser impulsowy 532 nm o szerokości impulsu ~100 ps FWHM), działającego z odpowiednią częstotliwością powtarzania (w naszym przypadku 20 MHz) i skierowanego do SYNC karty zliczającej pojedyncze fotony skorelowanej w czasie (TCSPC), jako źródło wzbudzenia sulfo-Cy3 (sCy3).
    2. Użyj lustra dichroicznego o wysokim współczynniku odbicia przy 532 nm, aby oddzielić wzbudzenie i rozpraszanie od fluorescencji.
    3. Użyć otworu o średnicy 100 μm w ognisku emitowanego światła, po tym, jak skolimowana wiązka emisyjna została skupiona przez soczewkę, a przed ponowną kolimacją wiązki emisyjnej przez inną soczewkę.
    4. Użyj filtra pasmowo-przepustowego (w naszym przypadku 585/40 nm), aby dodatkowo odfiltrować fluorescencję sCy3 z innych źródeł światła.
    5. Wykryj fluorescencję za pomocą detektora (w naszym przypadku jednofotonowej diody lawinowej lub hybrydowego fotopowielacza) skierowanego (w naszym przypadku przez router 4 do 1) do modułu TCSPC (w naszym przypadku Becker & Hickl SPC-150).
      UWAGA: W naszym przypadku akwizycja danych odbywa się za pomocą oprogramowania VistaVision (ISSTM) w formacie pliku TTTR (time-tagged-time-resolved).
  2. Przygotowanie próbki smPIFE
    1. Przygotować 25 mM znakowany sCy3 α-Syn w buforze pomiarowym: 10 mM octanu sodu, 10 mM diwodorofosforanu sodu, 10 mM glicyny o pH 8,0, 20 mM NaCl, 10 mM cysteaminy i 1 mM kwasu 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowego (TROLOX), w probówce o niskiej zawartości białka.
      UWAGA: Jeśli α-Syn jest mierzony w obecności pęcherzyków SDS, dodaj również odpowiednią ilość SDS.
    2. Przepłukać 18-komorowe szkiełko nakrywkowe mikroskopem ze 100 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 1 mg/ml przez 1 minutę, a następnie usunąć BSA.
    3. Dodać 100 μl próbki α-Syn znakowanej sCy3 o ciśnieniu 25 pM do komory w szkiełku nakrywkowym.
    4. Wykonaj pomiar smPIFE próbki przy użyciu opisanej konfiguracji, w następujący sposób w następnych krokach.
  3. Akwizycja danych smPIFE
    1. Użyj soczewki obiektywowej zanurzonej w wodzie o dużej aperturze numerycznej (w naszym przypadku Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2) i dodaj kroplę ultraczystej wody na wierzch soczewki obiektywu.
    2. Zamocuj szkiełko nakrywkowe w komorze stage i zainstaluj je na stoliku mikroskopu.
    3. Przesuń soczewkę obiektywu do góry, aż kropla wody na wierzchu soczewki obiektywu rozmaże się na dole szkiełka nakrywkowego.
    4. Otwórz migawkę lasera i skieruj soczewkę obiektywu do góry, jednocześnie sprawdzając wzór w kamerze CMOS, zbierając światło rozproszone od próbki. Obserwuj wzór pierścieni Airy'ego: pierwszy z nich reprezentuje skupienie na granicy faz woda-szkło, a drugi reprezentuje skupienie na granicy między szkłem a roztworem próbki.
    5. Zwiększ wysokość soczewki obiektywu o dodatkowe 75 μm, wprowadzając ognisko lasera głęboko w roztwór, aby zminimalizować autofluorescencję ze szklanej powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    6. Dostosuj moc lasera na soczewce obiektywu na ~100 μW.
    7. Rozpocznij akwizycję wykrytych fotonów na określony czas (2 godziny, w naszych pomiarach).
      UWAGA: Większość sygnału akwizycji powinna mieć szybkość (mierzoną w liczbach na sekundę, cps) podobną do tej uzyskiwanej podczas pomiaru samego bufora; Dane z milisekundowymi grupami powinny pokazywać rzadką liczbę rozbłysków fotonów, przy czym większość z nich ma średnią częstotliwość porównywalną z typową szybkością tła detektora (w naszym przypadku <1000 cps).

4. analiza rozerwania smPIFE

  1. Konwersja danych surowych
    UWAGA: Dane są zwykle przechowywane w pliku binarnym o formacie, który został wstępnie zdefiniowany przez firmę produkującą kartę TCSPC (w naszym przypadku pliki .spc).
    1. Przekonwertuj plik z danymi surowymi na uniwersalny format pliku photon-HDF542, korzystając z pakietu oprogramowania phconvert (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). Wywołaj plik danych surowych jako dane wejściowe i przekonwertuj na plik danych surowych .hdf5 za pomocą odpowiedniego kodu w pakiecie phconvert (w naszym przypadku Konwertuj pliki ns-ALEX Becker-Hickl na Photon-HDF5.ipynb Jupyter notebook).
      UWAGA: Konwersja do pliku .hdf5 obejmuje: (1) określenie odpowiednich strumieni fotonów w surowych danych (tj. strumieni fotonów zarejestrowanych fotonów o odpowiednim identyfikatorze detektora); (2) odpowiednie nanoczasy fotonów (czasy wykrywania fotonów w stosunku do czasu wzbudzenia SYNC); oraz (3) dodano metadane.
  2. Wyszukiwanie i zaznaczanie serii za pomocą FRETbursts43
    UWAGA: Wszystkie pliki surowych danych photon-HDF5 z pomiarów smPIFE, a także kod podsumowujący analizę surowych danych, są przechowywane w Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). Wszystkie poniższe kroki są szczegółowo opisane i wyświetlane w notatnikach Jupyter, dostarczonych również w linku do repozytorium Zenode.
    1. Otwórz Jupyter Notebooks (w naszym przypadku w ramach platformy Anaconda).
    2. Otwórz notatnik smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (Final notebook).ipynb (można go znaleźć w linku Zenodo).
    3. Załaduj FRETbursts.
    4. Załaduj plik danych photon HDF5.
    5. Ocena szybkości BG: korzystając z histogramu czasów międzyfotonowych, oblicz współczynniki tła (BG) dla każdych 30 sekund akwizycji danych w pliku danych fotonu HDF5.
      UWAGA: Poniższe kroki opisują wyszukiwanie serii przy użyciu algorytmu okna przesuwanego44,45,46.
    6. Przesuń okno czasowe m=20 kolejnych fotonów, jeden foton na raz.
    7. Zbierz dane fotonowe tylko wtedy, gdy chwilowa szybkość fotonów (figure-protocol-1), jest co najmniej F=11 razy większa niż szybkość BG dla tego okresu pozyskiwania danych.
      UWAGA: Rozbłysk jest zbudowany ze wszystkich następujących po sobie fotonów, które zostały zebrane przez przesuwanie okna po jednym fotonie na raz (krok 4.2.6.) i zgadzanie się z kryterium szybkości fotonów (krok 4.2.7).
    8. Oblicz następujące charakterystyki rozerwania:
      Rozmiar serii: ilość fotonów w serii.
      Czas trwania impulsu: różnica czasu między czasem ostatniego i pierwszego wykrycia fotonu w serii.
      Jasność impulsu: największa wartość chwilowej szybkości fotonów w serii.
      Separacja serii: odstęp czasu między kolejnymi seriami.
      UWAGA: Poniższe punkty opisują dalszą procedurę selekcji serii.
    9. Wykreśl histogram wartości jasności rozbłysku (najwyższa chwilowa szybkość fotonów w rozbłysku) z osią zdarzeń w skali logarytmicznej.
    10. Zdefiniuj próg jasności serii jako minimalną wartość jasności serii, od której histogram wykazuje zanikający wzór.
    11. Wybierz serie o wartościach jasności większych niż próg jasności serii.
      UWAGA: Następne kroki opisują średnie czasy życia fluorescencji impulsów.
    12. Wykreśl histogram nanoczasów fotonów dla wszystkich fotonów we wszystkich wybranych rozbłyskach z osią zliczania fotonów w skali logarytmicznej.
    13. Zdefiniuj próg nanoczasowy jako minimalną wartość nanoczasu, od której histogram nanoczasów fotonów wykazuje wzór zaniku.
    14. Wybieraj tylko fotony, które są nanorazy większe niż próg nanoczasu.
    15. Oblicz średnią algebraiczną wszystkich wybranych nanoczasów fotonów.
    16. Odejmij próg nanoczasowy od średniej algebraicznej nanoczasu fotonów. Wynikiem jest średni nanoczas fotonu rozbłysku, który jest wprost proporcjonalny do średniego czasu życia fluorescencji.
    17. Wykreśl histogram wszystkich średnich czasów życia fluorescencji wybuchów. Mogą pojawić się subpopulacje o czasie trwania fluorescencji rozmieszczone centralnie. Subpopulacje o średnich wartościach reprezentują gatunki cząsteczek z sCy3, które nie były zablokowane sterycznie, podczas gdy subpopulacje o średnich wartościach reprezentują gatunki cząsteczek z sCy3, które były bardziej zatkane sterycznie.
      UWAGA: Następne kroki opisują powolną dynamikę między wybuchami w oparciu o analizę nawrotów serii47
    18. Wykreśl histogram czasów separacji serii z osią czasu separacji w skali logarytmicznej.
      UWAGA: Pojawią się dwie subpopulacje czasów separacji serii:
      Główna subpopulacja z czasami separacji wynoszącymi sekundy, reprezentująca następujące po sobie rozbłyski pochodzące z różnych, kolejno mierzonych cząsteczek.
      Niewielka subpopulacja z czasami separacji ~<100 ms, reprezentująca następujące po sobie wybuchy, oba pochodzące z tej samej cząsteczki, powtarzające się z powrotem przez objętość konfokalną.
    19. Wybierz tę opcję, aby zapisać wszystkie pary kolejnych impulsów, które są oddzielone od siebie mniej niż maksymalny czas separacji, który definiuje subpopulację tej samej cząsteczki (w naszym przypadku <100 ms).
    20. Wykreśl histogram lub wykres punktowy średniego czasu życia fluorescencji pierwszego i drugiego rozbłysku dla wszystkich par rozbłysków, które powtórzyły się poniżej pewnego progu czasu separacji

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako IDP, gdy nie jest związany z inną biomolekułą, α-Syn wykazuje dynamikę strukturalną między wieloma konformacjami, z przejściami w ciągu kilku mikrosekund40, a nawet co setki nanosekund41. Kiedy α-Syn przecina punkt konfokalny, może przejść tysiące przejść między konformacjami. Rzeczywiście, tak było, gdy użyto smFRET39,40. Tutaj wykonujemy pomiary smPIFE w celu zbadania lokalnej dynamiki konformacyjnej α-Syn.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadzono szeroko zakrojone badania biochemiczne i biofizyczne w celu zbadania cech strukturalnych α-Syn i jego nieuporządkowanej natury 33,34,35,36,37,38. W kilku pracach wykorzystano już swobodnie dyfuzyjny smFRET do zbadania wewnątrzcząsteczkowej dynamiki monomeru α-Syn wolnego od wiązania. Prace te wykazały wysoką dy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkich autorów nie łączy konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmid pT-t7 kodujący mutanta A56C α-Syn został nam podarowany w prezencie przez Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir i Dr. Elisha Haas. Artykuł ten był wspierany przez National Institutes of Health (NIH, grant R01 GM130942 dla E.L. jako subnagroda), Israel Science Foundation (grant 3565/20 w ramach KillCorona - Curbing Coronavirus Research Program), Milner Fund i Hebrew University of Jerusalem (fundusze startowe).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15MercC7715odcięcie: 100 kDa
siarczan amonuSigma-AldrichA4418
BSASigma-AldrichA9647
cysteaminaSigma-Aldrich30070
- MEGA GeBaFlex-tubeGene Bio-ApplicationMEGA320
ditiotreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Roztwór do barwienia Fast SeeBandBio-Applicationgenu SB050
GlicynaSigma-Aldrich50046
D-GlukozaSigma-AldrichG7021
HEPESSigma-Aldrich54457
HiTrap Odsalanie 5 mlSigma-AldrichGE17-1408
Kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowy (TROLOX)Sigma-Aldrich238813
izopropyl β-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Sigma-AldrichI5502
LB bulionSigma-AldrichL3152
Magnez chlorekSigma-Aldrich63068
Kolumna MonoQSigma-Aldrich54807
białkowa rurka LoBindSigma-AldrichEP00301080940,5 ml
Płukanie &mikroszkiełka 18Ibidi81816
SDSSigma-Aldrich75746
Octan soduSigma-AldrichS2889
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS8045
Fosforan sodu jednozasadowy jednowodnySigma-Aldrich71507
Rozsiewacze sterylnych komórek, szpatułki Drigalskiegomini-plast815-004-05-001
siarczan streptomycynySigma-AldrichS9137
sulfo-Cy3  maleimidowyabcamab146493
Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)Sigma-Aldrich75259
Tris-HClSigma-Aldrich93363
TryptonSigma-AldrichT7293
Ekstrakt drożdżowySigma-AldrichY1625
Worki dializacyjne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
  2. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  3. Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding. Journal of Physics Condensed Matter. 15 (32), R1291(2003).
  4. Schuler, B., Lipman, E. A., Eaton, W. A. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature. 419 (6908), 743-747 (2002).
  5. Michalet, X., Weiss, S., Jäger, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chemical Reviews. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  6. Ha, T., Enderle, T., Ogletree, D. F., Chemla, D. S., Selvin, P. R., Weiss, S. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  7. Deniz, A. A., et al. Single-molecule protein folding: Diffusion fluorescence resonance energy transfer studies of the denaturation of chymotrypsin inhibitor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5179-5184 (2000).
  8. Bialik, C. N., Wolf, B., Rachofsky, E. L., Ross, J. B. A., Laws, W. R. Dynamics of biomolecules: Assignment of local motions by fluorescence anisotropy decay. Biophysical Journal. 75 (5), 2564-2573 (1998).
  9. Jameson, D. M., Sawyer, W. H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods in Enzymology. 246, 283-300 (1995).
  10. Kempe, D., Schöne, A., Fitter, J., Gabba, M. Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry B. 119 (13), 4668-4672 (2015).
  11. Callis, P. R., Liu, T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins. Journal of Physical Chemistry B. 108, 4248-4259 (2004).
  12. Lehrer, S. S. Solute Perturbation of Protein Fluorescence. The Quenching of the Tryptophyl Fluorescence of Model Compounds and of Lysozyme by Iodide Ion. Biochemistry. 10 (17), 3254-3263 (1971).
  13. Xie, K. X., Liu, Q., Jia, S. S., Xiao, X. X. Fluorescence enhancement by hollow plasmonic assembly and its biosensing application. Analytica Chimica Acta. 1144, 96-101 (2021).
  14. Stennett, E. M. S., Ciuba, M. A., Lin, S., Levitus, M. Demystifying PIFE: The Photophysics behind the Protein-Induced Fluorescence Enhancement Phenomenon in Cy3. Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (10), 1819-1823 (2015).
  15. Nguyen, B., Ciuba, M. A., Kozlov, A. G., Levitus, M., Lohman, T. M. Protein Environment and DNA Orientation Affect Protein-Induced Cy3 Fluorescence Enhancement. Biophysical Journal. 117 (1), 66-73 (2019).
  16. Song, D., Graham, T. G. W., Loparo, J. J. A general approach to visualize protein binding and DNA conformation without protein labelling. Nature Communications. 7, 10976(2016).
  17. Ploetz, E., et al. Förster resonance energy transfer and protein-induced fluorescence enhancement as synergetic multi-scale molecular rulers. Scientific Reports. 6, 33257(2016).
  18. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  19. Hwang, H., Kim, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement as a single molecule assay with short distance sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7414-7418 (2011).
  20. Ray, P. C., Fan, Z., Crouch, R. A., Sinha, S. S., Pramanik, A. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: Fundamentals and applications. Chemical Society Reviews. 43, 6370-6404 (2014).
  21. Chen, H., Rhoades, E. Fluorescence characterization of denatured proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (4), 516-524 (2008).
  22. Alderson, T. R., Markley, J. L. Biophysical characterization of α-synuclein and its controversial structure. Intrinsically Disordered Proteins. 1 (1), 18-39 (2013).
  23. Mane, J. Y., Stepanova, M. Understanding the dynamics of monomeric, dimeric, and tetrameric α-synuclein structures in water. FEBS Open Bio. 6 (7), 666-686 (2016).
  24. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  25. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  26. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  27. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  28. Trexler, A. J., Rhoades, E. α-Synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Biochemistry. 48 (11), 2304-2306 (2009).
  29. Stephens, A. D., Zacharopoulou, M., Kaminski Schierle, G. S. The Cellular Environment Affects Monomeric α-Synuclein Structure. Trends in Biochemical Sciences. 44 (5), 453-466 (2019).
  30. Illes-Toth, E., Dalton, C. F., Smith, D. P. Binding of dopamine to alpha-synuclein is mediated by specific conformational states. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (9), 1346-1354 (2013).
  31. Frimpong, A. K., Abzalimov, R. R., Uversky, V. N., Kaltashov, I. A. Characterization of intrinsically disordered proteins with electrospray inization mass spectrometry: Conformationl heterogeneity of α-synuciein. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 78 (3), 714-722 (2010).
  32. Sandal, M., et al. Conformational equilibria in monomeric α-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biology. 6 (1), e6(2008).
  33. Brodie, N. I., Popov, K. I., Petrotchenko, E. V., Dokholyan, N. V., Borchers, C. H. Conformational ensemble of native α-synuclein in solution as determined by short-distance crosslinking constraint-guided discrete molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology. 15 (3), e1006859(2019).
  34. Ullman, O., Fisher, C. K., Stultz, C. M. Explaining the structural plasticity of α-synuclein. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19536-19546 (2011).
  35. Binolfi, A., Theillet, F. X., Selenko, P. Bacterial in-cell NMR of human α-synuclein: A disordered monomer by nature? Biochemical Society Transactions. 40 (5), 950-954 (2012).
  36. Waudby, C. A., et al. In-Cell NMR Characterization of the Secondary Structure Populations of a Disordered Conformation of α-Synuclein within E. coli Cells. PLoS ONE. 8 (8), e72286(2013).
  37. Yu, J., Malkova, S., Lyubchenko, Y. L. α-Synuclein Misfolding: Single Molecule AFM Force Spectroscopy Study. Journal of Molecular Biology. 384 (4), 992-1001 (2008).
  38. Guerrero-Ferreira, R., Kovacik, L., Ni, D., Stahlberg, H. New insights on the structure of alpha-synuclein fibrils using cryo-electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 61, 89-95 (2020).
  39. Trexler, A. J., Rhoades, E. Single molecule characterization of α-synuclein in aggregation-prone states. Biophysical Journal. 99 (9), 3048-3055 (2010).
  40. Ferreon, A. C. M., Gambin, Y., Lemke, E. A., Deniz, A. A. Interplay of α-synuclein binding and conformational switching probed by single-molecule fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5645-5650 (2009).
  41. Rezaei-Ghaleh, N., et al. Local and Global Dynamics in Intrinsically Disordered Synuclein. Angewandte Chemie - International Edition. 57 (46), 15262-15266 (2018).
  42. Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An Open File Format for Timestamp-Based Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  43. Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S. Y., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing Single-molecule FRET. PLoS ONE. 11 (8), e0160716(2016).
  44. Ingargiola, A., et al. Multispot single-molecule FRET: Highthroughput analysis of freely diffusing molecules. PLoS ONE. 12 (4), e0175766(2017).
  45. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. A. M. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  46. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102, 6601-6613 (1998).
  47. Hoffmann, A., et al. Quantifying heterogeneity and conformational dynamics from single molecule FRET of diffusing molecules: Recurrence analysis of single particles (RASP). Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (5), 1857-1871 (2011).
  48. Eakin, C. M., Berman, A. J., Miranker, A. D. A native to amyloidogenic transition regulated by a backbone trigger. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 202-208 (2006).
  49. Jahn, T. R., Parker, M. J., Homans, S. W., Radford, S. E. Amyloid formation under physiological conditions proceeds via a native-like folding intermediate. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 195-201 (2006).
  50. Chen, D., et al. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nature Communications. 10 (1), 2493(2019).
  51. Lerner, E., Ploetz, E., Hohlbein, J., Cordes, T., Weiss, S. A Quantitative Theoretical Framework for Protein-Induced Fluorescence Enhancement-Förster-Type Resonance Energy Transfer (PIFE-FRET). Journal of Physical Chemistry. B. 120 (26), 6401-6410 (2016).
  52. Valuchova, S., Fulnecek, J., Petrov, A. P., Tripsianes, K., Riha, K. A rapid method for detecting protein-nucleic acid interactions by protein induced fluorescence enhancement. Scientific Reports. 6, 39653(2016).
  53. Qiu, Y., Myong, S. Single-Molecule Imaging With One Color Fluorescence. Methods in Enzymology. 581, 33-51 (2016).
  54. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), eaan1133(2018).
  55. Lerner, E., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416(2021).
  56. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  57. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  58. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  59. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  60. Chen, J., et al. The structural heterogeneity of α-synuclein is governed by several distinct subpopulations with interconversion times slower than milliseconds. Structure. 29 (9), (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PIFE pojedynczych cz steczekmonomer alfa synukleinyczas ycia fluorescencjisubpopulacje strukturalneznakowanie specyficzne dla miejscaanaliza rozb ysk wdynamika konformacyjnaspektroskopowy sensor blisko cibia ko wewn trznie nieuporz dkowane

Powiązane artykuły