Wizualizacja powstawania falban błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Summary

Makropinocytoza to wysoce konserwatywny proces endocytarny, zainicjowany przez tworzenie bogatych w F-aktynę warstwowych wypustek błonowych, znanych również jako falbany błonowe. Zwiększona szybkość internalizacji substancji rozpuszczonej makropinocytozy jest związana z różnymi stanami patologicznymi. W protokole tym przedstawiono metodę ilościowego określania powstawania falban błonowych in vitro przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej.

Abstract

Zmarszczenie błony to tworzenie ruchliwych wypukłości błony plazmatycznej zawierających siatkę nowo spolimeryzowanych włókien aktynowych. Falbany błonowe mogą tworzyć się spontanicznie lub w odpowiedzi na czynniki wzrostu, cytokiny zapalne i estry forbolu. Niektóre z wypukłości błony mogą reorganizować się w okrągłe falbany błony, które łączą się na swoich dystalnych brzegach i tworzą miseczki, które zamykają się i rozdzielają w cytoplazmie jako duże, niejednorodne wakuole zwane makropinosomami. Podczas tego procesu falbany zatrzymują płyn zewnątrzkomórkowy i substancje rozpuszczone, które internalizują się w makropinosomach. Skaningowa mikroskopia elektronowa o wysokiej rozdzielczości (SEM) jest powszechnie stosowaną techniką obrazowania do wizualizacji i ilościowego określania powstawania falban błonowych, okrągłych wypukłości i zamkniętych miseczek makropinocytycznych na powierzchni komórki. Poniższy protokół opisuje warunki hodowli komórkowej, stymulację tworzenia się falban błony in vitro oraz sposób utrwalania, odwadniania i przygotowania komórek do obrazowania za pomocą SEM. Opisano również ilościowe oznaczanie marszczenia błony, normalizację danych oraz stymulatory i inhibitory powstawania falbowania błony. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli makropinocytozy w procesach fizjologicznych i patologicznych, zbadać nowe cele regulujące powstawanie falban błonowych oraz zidentyfikować jeszcze niescharakteryzowane stymulatory fizjologiczne, a także nowe farmakologiczne inhibitory makropinocytozy.

Introduction

Makropinocytoza to proces endocytarny odpowiedzialny za internalizację dużej ilości płynu pozakomórkowego i jego zawartości poprzez tworzenie dynamicznych i napędzanych aktyną wypukłości błony plazmatycznej zwanych falbankami błonowymi¹. Wiele z tych falban błony tworzy miseczki, które zamykają się i łączą z powrotem w komórce i oddzielają się od błony plazmatycznej jako duże, heterogeniczne endosomy wewnątrzkomórkowe, znane również jako makropinosomy¹. Chociaż makropinocytoza jest indukowana przez czynniki wzrostu, takie jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) w sz....

Protocol

UWAGA: Poniżej znajduje się ogólny protokół używany do ilościowego określania powstawania falban błonowych w makrofagach RAW 264.7 za pomocą mikroskopii SEM. Optymalizacja może być wymagana dla różnych typów komórek.

1. Linia komórkowa i hodowla komórkowa

1. Hoduj makrofagi RAW 264.7 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (vol/vol) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 IU / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Wymieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień.
2. Gdy komórki zlewają się w 80%, umyj pły....

Results

Tutaj opisujemy wyniki prezentowanej techniki. Reprezentatywne obrazy SEM pokazane w Rysunek 1 pokazują tworzenie się falban błonowych w makrofagach RAW 264.7 po leczeniu PMA i M-CSF. Obrazy zostały najpierw wykonane w powiększeniu 3500x w celu oceny ilościowej, a następnie w wyższym powiększeniu (od 8500x do 1600x), aby pokazać błonę plazmatyczną z większą szczegółowością. Wstępne traktowanie makrofagów inhibitorem makropinocytozy EIPA osłabiło tworzenie falban błonowych (Rysunek .......

Discussion

Obecny protokół obrazowania SEM zapewnia narzędzie do wizualizacji i ilościowego określenia powstawania falban błonowych, okrągłych wypukłości i miseczek makropinocytarnych na powierzchni komórki in vitro. Chociaż obecny protokół koncentruje się na makrofagach, badania wykazały, że tworzenie się falban błonowych występuje również na różnych innych typach komórek, w tym komórkach dendrytycznych, fibroblastach, neuronach i komórkach rakowych 11,12,14,21,30.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5% Trypsyna-EDTA	Gibco	15400-054
2% Aldehyd glutarowy	Mikroskopia elektronowa Nauki	16320
4% Paraformaldehyd	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-etylo-N-izopropylo)-amiloryd	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Cytometr
przepływowyZakładki z klejem węglowym	Mikroskopia elektronowa Nauki	77825-09
Dimetylosulfotlenek Corning		25-950-CQC
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Płodowa surowica bydlęca	Gemini Bio	900-108
FitC-dekstran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Termo Fisher Scientific	T13320
Inkubator CO2 HERAcell 150i	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Napylarka napylana	Anatech USA	58565
Skaningowy mikroskop			elektronowy JSM-IT500HR
Szklana osłona mikroskopu	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Pen Strep	Gibco	15140-122
forbol 12-mirystynian 13-octan	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 makrofag	ATCC	ATCC TIB-71
Rekombinowany ludzki M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Suszarka do punktów krytycznych	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Aluminiowe mocowania próbek	Mikroskopia elektronowa Sciences	75220
Mikroskopia elektronowa	kakodylanu sodu	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Roztwór błękitu trypanowego	Thermo Fisher Scientific	15250061
			konfokalny Zeiss LSM 780