Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja powstawania falban błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62658

⸱

27 maja 2021

 ,  ,  , 
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia at Augusta University, 2Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical College of Georgia at Augusta University

W tym artykule

Podsumowanie

Makropinocytoza to wysoce konserwatywny proces endocytarny, zainicjowany przez tworzenie bogatych w F-aktynę warstwowych wypustek błonowych, znanych również jako falbany błonowe. Zwiększona szybkość internalizacji substancji rozpuszczonej makropinocytozy jest związana z różnymi stanami patologicznymi. W protokole tym przedstawiono metodę ilościowego określania powstawania falban błonowych in vitro przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

Zmarszczenie błony to tworzenie ruchliwych wypukłości błony plazmatycznej zawierających siatkę nowo spolimeryzowanych włókien aktynowych. Falbany błonowe mogą tworzyć się spontanicznie lub w odpowiedzi na czynniki wzrostu, cytokiny zapalne i estry forbolu. Niektóre z wypukłości błony mogą reorganizować się w okrągłe falbany błony, które łączą się na swoich dystalnych brzegach i tworzą miseczki, które zamykają się i rozdzielają w cytoplazmie jako duże, niejednorodne wakuole zwane makropinosomami. Podczas tego procesu falbany zatrzymują płyn zewnątrzkomórkowy i substancje rozpuszczone, które internalizują się w makropinosomach. Skaningowa mikroskopia elektronowa o wysokiej rozdzielczości (SEM) jest powszechnie stosowaną techniką obrazowania do wizualizacji i ilościowego określania powstawania falban błonowych, okrągłych wypukłości i zamkniętych miseczek makropinocytycznych na powierzchni komórki. Poniższy protokół opisuje warunki hodowli komórkowej, stymulację tworzenia się falban błony in vitro oraz sposób utrwalania, odwadniania i przygotowania komórek do obrazowania za pomocą SEM. Opisano również ilościowe oznaczanie marszczenia błony, normalizację danych oraz stymulatory i inhibitory powstawania falbowania błony. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli makropinocytozy w procesach fizjologicznych i patologicznych, zbadać nowe cele regulujące powstawanie falban błonowych oraz zidentyfikować jeszcze niescharakteryzowane stymulatory fizjologiczne, a także nowe farmakologiczne inhibitory makropinocytozy.

Wprowadzenie

Makropinocytoza to proces endocytarny odpowiedzialny za internalizację dużej ilości płynu pozakomórkowego i jego zawartości poprzez tworzenie dynamicznych i napędzanych aktyną wypukłości błony plazmatycznej zwanych falbankami błonowymi1. Wiele z tych falban błony tworzy miseczki, które zamykają się i łączą z powrotem w komórce i oddzielają się od błony plazmatycznej jako duże, heterogeniczne endosomy wewnątrzkomórkowe, znane również jako makropinosomy1. Chociaż makropinocytoza jest indukowana przez czynniki wzrostu, takie jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) w szerokim zakresie typów komórek, w wrodzonych komórkach odpornościowych zaobserwowano również dodatkowy, unikalny, zależny od wapnia proces znany jako konstytutywna makropinocytoza2,3,4,5,6,7,8.

Wykazano, że zdolność komórek do internalizacji materiału zewnątrzkomórkowego poprzez makropinocytozę odgrywa ważną rolę w różnych procesach fizjologicznych, począwszy od pobierania składników odżywczych, a skończywszy na wychwytywaniu patogenów i prezentacji antygenów9,10,11. Ponieważ jednak proces ten jest nieselektywny i indukowalny, jest również związany z wieloma stanami patologicznymi. Rzeczywiście, wcześniejsze badania sugerowały, że makropinocytoza odgrywa ważną rolę w chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona, raku, kamicy nerkowej i miażdżycy12,13,14,15,16. Co więcej, wykazano, że niektóre bakterie i wirusy wykorzystują makropinocytozę, aby dostać się do komórek gospodarza i wywołać infekcję17,18. Co ciekawe, stymulacja makropinocytozy może być również wykorzystana do celowanego dostarczania środków terapeutycznych w różnych stanach chorobowych19,20.

Poprzednie badania badały makropinocytozę poprzez ilościowe określanie zinternalizowanych, fluorescencyjnie znakowanych markerów fazy płynnej przy braku i obecności środków farmakologicznych hamujących makropinocytozę za pomocą cytometrii przepływowej i obrazowania konfokalnego21,22. Obecnie dostępne narzędzia farmakologiczne hamujące makropinocytozę ograniczają się do 1) inhibitorów polimeryzacji aktyny (cytochalazyna D i latrunkuliny), 2) blokerów PI3K (LY-290042 i wortmanniny) oraz 3) inhibitorów wymieniaczy wodoru sodu (NHE) (amiloryd i EIPA)5,14,15,23,24,25. Ponieważ jednak inhibitory te mają działanie niezależne od endocytozy, trudno jest selektywnie określić udział makropinocytozy w wychwytywaniu substancji rozpuszczonej i patogenezie choroby, zwłaszcza in vivo21.

Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) to rodzaj mikroskopu elektronowego, który tworzy obrazy komórek o ultrawysokiej rozdzielczości za pomocą skupionej wiązki elektronów26. W badaniach nad makropinocytozą obrazowanie SEM jest uważane za złoty standard techniki wizualizacji cech topograficznych i morfologicznych błony plazmatycznej, ilościowego określania powstawania falban błony i badania ich postępu w kierunku internalizacji makropinosomów. Co więcej, skaningowa mikroskopia elektronowa w połączeniu z ilościowym oznaczaniem wychwytu substancji rozpuszczonej, w obecności i bez blokerów makropinocytozy, zapewnia wiarygodną strategię badania internalizacji substancji rozpuszczonej makropinocytozy in vitro. W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół przygotowania komórek do SEM, wizualizacji powierzchni komórki, ilościowego określenia powstawania falban i zbadania ich postępów w kierunku zamknięcia miseczki i internalizacji makropinosomów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Poniżej znajduje się ogólny protokół używany do ilościowego określania powstawania falban błonowych w makrofagach RAW 264.7 za pomocą mikroskopii SEM. Optymalizacja może być wymagana dla różnych typów komórek.

1. Linia komórkowa i hodowla komórkowa

  1. Hoduj makrofagi RAW 264.7 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (vol/vol) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 IU / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Wymieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień.
  2. Gdy komórki zlewają się w 80%, umyj płytkę dwa razy za pomocą sterylnego PBS.
  3. Odłączyć komórki, dodając 1 000 μl 0,5% trypsyny-EDTA i inkubować płytkę do hodowli komórkowej przez 3-5 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  4. Zbadaj płytkę pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić dysocjację komórek. Dodaj 10 ml pożywki wzrostowej zawierającej 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę.
  5. Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie zawiesić komórki w kompletnym pożywce do hodowli komórkowych i określić liczbę komórek oraz żywotność za pomocą barwienia błękitem trypanowym (0,4%).
    UWAGA: Zalecana minimalna żywotność komórek w tym eksperymencie wynosi >90%.
  6. Umieść sterylne szklane szkiełka nakrywkowe w dołkach na 24-dołkowej płytce za pomocą autoklawowanych kleszczy. Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych o gęstości 1 x 106 komórek/ml i inkubować płytkę przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Przed zabiegiem należy wymienić pożywkę z każdej studzienki na świeżą, kompletną pożywkę o pojemności 500 μl. Wstępnie potraktuj makrofagi nośnikiem (DMSO lub innymi rozpuszczalnikami używanymi do rozpuszczania EIPA) lub inhibitorem makropinocytozy 5-(N-etylo-N-izopropylo)-amilorydem (EIPA, 25 μM21) przez 30 minut.
  8. Traktuj komórki nośnikiem i stymulatorami makropinocytozy, aby promować marszczenie błony: 12-mirystynianianu 13-octanu forbolu (PMA, 1 μM, 30 min21) i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF, 100 ng/mL, 30 min3).
    UWAGA: Alternatywne inhibitory makropinocytozy [np. latrunkulina A (1 μM, 30 min) lub cytochalazyna D (1 μM, 30 min)] i stymulatory [np. naskórkowy czynnik wzrostu (EGF, 100 ng/ml, 10 min) lub płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] makropinocytozy mogą być również stosowane do charakteryzowania makropinocytozy w makrofagach i innych typach komórek16, 27,28,29. Komórki mogą wymagać głodzenia surowicy przez noc przed leczeniem fizjologicznymi stymulatorami makropinocytozy. Ważne jest, aby pamiętać, że najskuteczniejsze stężenia i czasy inkubacji będą musiały zostać określone, aby stymulować makropinocytozę w innych typach komórek.

2. Utrwalenie SEM

  1. Po zabiegu odessać pożywkę ze studzienek i dwukrotnie zmyć szkiełka nakrywkowe lodowatym PBS.
  2. Utrwalić komórki (4% paraformaldehydu i 2% aldehydu glutarowego w 0,1 M kakodylanu sodu) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przez noc inkubować w utrwalaczu w temperaturze 4 °C.
  3. Delikatnie przemyć i inkubować szkiełka nakrywkowe za pomocą 500 μl następujących odczynników, nie naruszając monowarstwy komórek.
    1. Przemyć raz w 0,1 M kakodylan sodu i inkubować przez 15 minut.
    2. Przemyć dwukrotnie dH2O z 10 minutową inkubacją w każdym praniu.
    3. Przemyć dwukrotnie 25% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.
    4. Przemyć dwukrotnie 50% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.
    5. Przemyć dwukrotnie 75% etanolem w 10-minutowej inkubacji w każdym praniu.
    6. Przemyć dwukrotnie 80% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.
    7. Przemyć dwukrotnie 95% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.
    8. Umyć dwukrotnie 100% etanolem. Wykonuj 10 minut inkubacji w każdym praniu.
      UWAGA: Wymiana/wymiana odczynników powinna odbywać się szybko, aby zapobiec wysuszeniu komórek powietrzem. Szkiełka nakrywkowe można pozostawić w 100% etanolu na kilka dni w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy dodać dodatkowe 100% etanolu i przykryć studzienki parafilmem, aby zapobiec wysuszeniu próbki na powietrzu.

3. Suszenie w punkcie krytycznym

  1. Umieść szkiełka nakrywkowe w suszarce w punkcie krytycznym i przykryj 100% etanolem. Naciśnij przycisk zasilania i otwórz zbiornik CO2 .
  2. Naciskać przycisk Cool przez około 30 s, aż temperatura spadnie do 0 °C. Naciskaj przycisk Fill, aż w okienku komory pojawi się bańka.
  3. Naciskaj przycisk Przedmuchiwanie, aż zniknie zapach etanolu z wydechu odpowietrzającego. Naciśnij ponownie przycisk Chłodzenie, aż temperatura spadnie do 0 °C.
  4. Ponownie naciśnij przyciski napełniania i oczyszczania, aby je wyłączyć i zamknąć zbiornik CO2. Ponownie naciśnij przycisk Chłodzenie, aby go wyłączyć, a następnie naciśnij przycisk podgrzewania.
  5. Ustawić temperaturę na 42 °C, a ciśnienie na 1 200 psi. Gdy ciśnienie i temperatura ustabilizują się, naciśnij przycisk odpowietrzania, aby umożliwić powolny spadek ciśnienia.
  6. Gdy ciśnienie w komorze osiągnie 150 psi, naciśnij przycisk Vent i poczekaj, aż ciśnienie spadnie do 0 psi. Wyłącz suszarkę do punktu krytycznego i usuń szkiełka nakrywkowe.
  7. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na próbkach aluminiowych SEM za pomocą zakładek Carbon Adhesive i poddaj powłoce napylającej za pomocą złota/palladu w powlekarce napylającej.
  8. Włącz przycisk zasilania i poczekaj, aż podciśnienie osiągnie 30 mTorr. Przepłucz komorę, aby usunąć wilgoć i powietrze, wyłączając przełącznik gazu i obracając zawór gazu Fine w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
  9. Gdy podciśnienie wzrośnie do 200 mTorr, wyłącz przełącznik gazu i poczekaj, aż podciśnienie osiągnie 30 mTorr. Powtórz ten krok 3 razy.
  10. Naciśnij przycisk Timer i wyreguluj Voltage pokrętło, aż miernik wskaże 10 mA. Usunąć powlekane szkiełka nakrywkowe z komory.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wykonać suszenie w punkcie krytycznym i napylanie próbki .

4. Obrazowanie i kwantyfikacja

  1. Włóż szkiełka nakrywkowe z próbką do komory skaningowego mikroskopu elektronowego. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk EVAC.
  2. Otwórz oprogramowanie operacyjne SEM. Ustaw napięcie przyspieszania na 15 kv i odległość roboczą na 10 mm.
  3. Naciśnij przycisk Współrzędne i poruszaj się po kontrolerze, aż komórki pojawią się na środku ekranu obserwacji. Ustaw powiększenie na 3,500x i zobrazuj próbkę, klikając przycisk Zdjęcie.
    UWAGA: Użyj wyższego poziomu powiększenia (od 8 500x do 16 000x), aby pokazać błonę plazmatyczną z większą szczegółowością.
  4. Rób zdjęcia z co najmniej 10 losowych miejsc na szkiełkach nakrywkowych, upewniając się, że każde pole mikroskopowe zawiera wiele komórek. Zapisuj obrazy jako pliki .tif.
  5. Na obrazach zlokalizuj falbanki błony, zdefiniowane jako wystające fałdy błony plazmatycznej przypominające koc, o rozmiarze większym niż 500 nm (Rysunek 1). Policz liczbę falban na komórkę.
    UWAGA: Falbany w kształcie litery C zostały zidentyfikowane jako zakrzywione wypukłości membranowe, które nie zrosły się na swoich bocznych końcach [(Rysunek 1 (leczenie M-CSF) i Rysunek 2B]. Stopione okrągłe falbany błonowe, przed ich zamknięciem, zostały zidentyfikowane jako miseczki makropinocytotyczne (Ryc. 2C).
  6. Znormalizuj liczbę zmarszczek błony do całkowitej liczby komórek w ocenianym polu mikroskopowym. Powtórzyć tę analizę dla próbek z każdej grupy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy opisujemy wyniki uzyskane przy zastosowaniu przedstawionej techniki. Reprezentatywne obrazy SEM przedstawione na Ryc. 1 wykazują tworzenie się fałdów błonowych w makrofagach RAW 264.7 po traktowaniu PMA i M-CSF. Obrazy zostały najpierw zarejestrowane przy powiększeniu 3 500x w celu ilościowego oznaczenia, a następnie przy większych powiększeniach (od 8 500x do 16 000x), aby ukazać błonę plazmatyczną w większych szczegółach. Wstępne traktowanie makrofagów inhibitorem makrop...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecny protokół obrazowania SEM zapewnia narzędzie do wizualizacji i ilościowego określenia powstawania falban błonowych, okrągłych wypukłości i miseczek makropinocytarnych na powierzchni komórki in vitro. Chociaż obecny protokół koncentruje się na makrofagach, badania wykazały, że tworzenie się falban błonowych występuje również na różnych innych typach komórek, w tym komórkach dendrytycznych, fibroblastach, neuronach i komórkach rakowych 11,12,14,21,30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Libby Perry (Augusta University) za pomoc w przygotowaniu próbki SEM. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) i K99HL146954 (B.S.)] oraz American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5% Trypsyna-EDTAGibco15400-054
2% Aldehyd glutarowyMikroskopia elektronowa Nauki16320
4% ParaformaldehydSanta Cruz Biotechnology281692
5-(N-etylo-N-izopropylo)-amilorydSigma Life ScienceA3085
Accuri C6 Cytometr
przepływowyZakładki z klejem węglowymMikroskopia elektronowa Nauki77825-09
Dimetylosulfotlenek Corning25-950-CQC
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle MediumCytiva Life SciencesSH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture PlateFalcon353047
Płodowa surowica bydlęcaGemini Bio900-108
FitC-dekstranThermo Fisher ScientificD1823
FM 4-64Termo Fisher ScientificT13320
Inkubator CO2 HERAcell 150iThermo Fisher Scientific51026282
Hummer Model 6.2 Napylarka napylanaAnatech USA58565
Skaningowy mikroskopelektronowy JSM-IT500HR
Szklana osłona mikroskopuThermo Fisher Scientific12-545-82
Pen StrepGibco15140-122
forbol 12-mirystynian 13-octanMillipore Sigma524400
RAW 264.7 makrofagATCCATCC TIB-71
Rekombinowany ludzki M-CSFPeprotech300-25
Samdri-790 Suszarka do punktów krytycznychTousimis Research Corporation8778B
SEM Aluminiowe mocowania próbekMikroskopia elektronowa Sciences75220
Mikroskopia elektronowakakodylanu sodu12300
Texas red-dextraThermo Fisher ScientificD1864
Roztwór błękitu trypanowegoThermo Fisher Scientific15250061
konfokalny Zeiss LSM 780
Sciences Mikroskop

Bibliografia

  1. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  2. Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286(2018).
  3. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
  4. Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8(2015).
  5. Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
  6. Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
  7. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
  8. Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  10. Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879(2014).
  11. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1(2015).
  12. Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277(2015).
  13. Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
  14. Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121(2020).
  15. Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
  16. Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
  17. Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
  18. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11 (5), 510-520 (2009).
  19. Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156(2019).
  21. Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
  22. Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537(2018).
  23. Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
  24. Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
  25. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  26. Fischer, E. R., et al. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).
  27. Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
  28. Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300(2015).
  29. Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360(2010).
  30. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of Macropinocytosis in Prostate Fibroblasts. Bio- Protocols. 9 (10), (2019).
  31. Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
  32. Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Makropinocytozawypustki błony plazmatycznejpolimeryzacja aktynykielichy makropinocytowecytometria przepływowamikroskopia konfokalnaobrazowanie powierzchni komórkistymulacja makrofagów
Wizualizacja powstawania falban błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.