Artykuł metodologiczny

Badanie transferu energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki w syntezie białek rybosomów

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62664

⸱

6 lipca 2021

1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

W tym artykule

Podsumowanie

Transfer energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki to metoda, która śledzi dynamikę tRNA podczas syntezy białek rybosomalnych. Śledząc poszczególne rybosomy, identyfikuje się niejednorodne populacje, które rzucają światło na mechanizmy. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia biologicznych zmian konformacyjnych w ogóle, aby ujawnić zależności dynamiczno-funkcyjne w wielu innych złożonych biosystemach. W metodach jednocząsteczkowych można zaobserwować etapy nieograniczające szybkości i nisko zaludnione kluczowe produkty pośrednie, które nie są dostępne za pomocą konwencjonalnych metod zespołowych ze względu na średni efekt.

Streszczenie

Rybosom to duży kompleks rybonukleoproteinowy, który procesowo składa białka wzdłuż matryc mRNA. Średnica rybosomu wynosi około 20 nm, aby pomieścić duże substraty tRNA w miejscach A, P i E. W związku z tym dynamika rybosomów jest naturalnie szybko defazowana. Metoda jednocząsteczkowa może wykryć każdy rybosom z osobna i rozróżnić niejednorodne populacje, co jest niezbędne do ujawnienia skomplikowanych mechanizmów układów wieloskładnikowych. Przedstawiamy szczegóły metody smFRET opartej na mikroskopie odwróconym Nikon Ti2 w celu zbadania dynamiki rybosomów między białkiem rybosomalnym L27 a tRNA. L27 jest oznaczony w swojej unikalnej pozycji Cys 53 i odtworzony w rybosom, który został zaprojektowany tak, aby nie zawierał L27. tRNA jest znakowane w okolicy łokcia. Ponieważ tRNA przemieszcza się do różnych miejsc wewnątrz rybosomu podczas cyklu wydłużania, takich jak przed i po translokacji, wydajność i dynamika FRET wykazują różnice, co sugeruje istnienie wielu subpopulacji. Te subpopulacje nie są wykrywalne metodami zespołowymi. Mikroskop smFRET oparty na TIRF jest zbudowany na ręcznym lub zmotoryzowanym mikroskopie odwróconym, z domowym oświetleniem laserowym. Próbki rybosomów są oczyszczane przez ultrawirowanie, ładowane do zbudowanej w domu wielokanałowej komórki próbki, a następnie oświetlane za pomocą ulotnego pola laserowego. Plamka lasera refleksyjnego może być wykorzystana do uzyskania kontroli sprzężenia zwrotnego idealnej ostrości. Sygnały fluorescencyjne są oddzielane przez zmotoryzowaną wieżyczkę filtracyjną i zbierane przez dwie cyfrowe kamery CMOS. Intensywności są pobierane za pomocą oprogramowania NIS-Elements.

Wprowadzenie

Rybosom to kompleks rybonukleoproteinowy ø 20 nm o dużej (50S) i małej (30S) podjednostce. Składa długie peptydy wzdłuż matrycy mRNA procesowo i kooperatywnie. Rybosom 30S wiąże się zfMet-tRNA fMet i mRNA, aby rozpocząć syntezę białek, a 50S następnie łączy się, tworząc kompleks inicjacyjny 70S. tRNA przenoszą aminokwasy do rybosomu w miejscu A (miejsce wiązania aminoacylo-tRNA), podczas gdy wydłużony łańcuch peptydylowy jest utrzymywany w miejscu P (miejsce wiązania peptydylo-tRNA). W kompleksie pre-translokacyjnym łańcuch peptydylowy jest przenoszony do tRNA w miejscu A z dodatkiem jednego aminokwasu. Tymczasem tRNA miejsca P ulega deacylacji. Następnie A-, P-tRNA przemieszczają się do miejsc P-, E-, tworząc kompleks post-translokacyjny, w którym E-miejsce reprezentuje miejsce wyjścia tRNA. W tym stanie peptydylo-tRNA przemieszcza się z powrotem do miejsca P. Cykl wydłużenia trwa między konformacjami wstępnymi i końcowymi, podczas gdy rybosom przemieszcza się na mRNA, jeden kodon na raz1. Rybosom jest wysoce skoordynowany z różnymi miejscami funkcjonalnymi, aby proces ten był wydajny i dokładny, takich jak zapadka między podjednostkami2, fluktuacje hybrydyzacji tRNA3, aktywacje GTPazy4, L1 otwieranie-zamykanie łodygi5, itd. W konsekwencji rybosomy szybko ulegają defazacji, ponieważ każda cząsteczka porusza się we własnym tempie. Konwencjonalne metody mogą wydedukować tylko pozorne średnie parametry, ale gatunki o niskiej populacji lub krótko żyjące zostaną zamaskowane w średnim efekcie6. Metoda jednocząsteczkowa może przełamać to ograniczenie, wykrywając każdy rybosom z osobna, a następnie identyfikując różne gatunki za pomocą rekonstrukcji statystycznej7. W celu zbadania dynamiki rybosomów zaimplementowano różne miejsca znakowania, takie jak interakcje między tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10, itp. Ponadto, oznaczając odpowiednio duże i małe podjednostki, obserwuje się kinetykę zapadki między podjednostkami i koordynację z czynnikami11,12. Tymczasem metoda smFRET ma szerokie zastosowanie w innych centralnych procesach biologicznych, a wielokolorowe metody FRET pojawiają się13.

Poprzednio opracowano nową parę rybosomów FRET14,15. Rekombinowane białko rybosomalne L27 zostało wyrażone, oczyszczone i znakowane, a następnie ponownie włączone do rybosomu. Białko to oddziaływało z tRNA w bliskiej odległości i pomogło ustabilizować tRNA miejsca P w kompleksie posttranslokacyjnym. Kiedy tRNA przemieszcza się z miejsca A- do P, odległość między tym białkiem a tRNA ulega skróceniu, co można odróżnić za pomocą sygnału smFRET. Wiele subpopulacji rybosomów zostało zidentyfikowanych przy użyciu metod statystycznych i mutagenezy, a spontaniczna wymiana tych populacji w kompleksie przed translokacją, ale nie po translokacji sugeruje, że rybosom jest bardziej elastyczny przed przemieszczeniem się na mRNA i bardziej sztywny podczas dekodowania16,17,18. Te zmiany są niezbędne do funkcjonowania rybosomów. W tym miejscu protokół opisuje szczegóły znakowania rybosomów/tRNA, ich włączenia do rybosomu, przygotowania próbki smFRET oraz pozyskiwania/analizy danych19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie znakowanego rybosomu i tRNA do wykrywania FRET

  1. Wyizoluj rybosom bez L27 ze szczepu E. coli IW312 zgodnie ze standardowymi protokołami20,21. Wyekstrahuj zwykły rybosom ze szczepu E. coli MRE600.
  2. Sklonuj gen rpmA L27 z C-końcowym znacznikiem His do plazmidu pET-21b (+), który jest przekształcany i ulega ekspresji w komórkach BL21(DE3)pLysS15. Oczyść białko za pomocą wstępnie zapakowanej kolumny sefarozy.
  3. Oznakowanie L27
    1. Inkubować 20-100 μM oczyszczonego L27 w 100 μL z 2-10-krotnym nadmiarem TCEP (Tris-2-karboksetylofosfiny) w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min. Roztwór należy wymienić na bufor PBS (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl), używając kolumny nap-5. Dodać 10-krotny nadmiar monoreaktywnego barwnika Cy5-maleimidu w DMSO do roztworu i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 2 godziny.
    2. Załaduj znakowany roztwór białkowy (500 μl) wspomniany powyżej do kolumny Nap-5, aby usunąć nadmiar barwnika. Upewnij się, że białko eluuje się w pierwszym kolorowym prążku, a następnie uwalnia wolny barwnik odpowiednio w drugim prążku. Zebrać eluowane białko w 1 ml buforu TAM10 (20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 0,5 mM EDTA i 7 mM BME (2-merkaptoetanol)).
  4. Rozpuść rybosom za pomocą L27. Wymieszać znakowane białko L27 z równą ilością rybosomu IW312 w buforze TAM10 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Usuń wolne białko przez ultrawirowanie z poduszką sacharozową (100 000 x g, przez noc), aby rybosom mógł utworzyć niebieski osad na dnie probówki.
  5. OznacztRNA Phe zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem22. Najpierw inkubować tRNA (10 A260 w 1 ml wody) ze 100 μl NaBH4 (100 mM bulionu, dodawać kroplami) w temperaturze 0 °C przez 1 godzinę. Uwolnij tRNA z nieprzereagowanego NaBH4 poprzez trzykrotne wytrącanie etanolu, dodając 1/10 objętości 3 M KAc (pH 5,0) i 2,5x objętość etanolu. Inkubować zredukowane tRNA z 1 μl roztworu barwnika Cy3-NHS (1 mg na 10 μL DMSO) w minimalnej objętości (~20 μL) 0,1 M mrówczanu sodu (pH 3,7). Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C oddzielić tRNA od nieprzereagowanego barwnika za pomocą małej kolumny G25 Sephadex, a następnie usunąć wolny barwnik poprzez dwukrotne wytrącanie etanolu.

2. Przygotowanie kompleksów rybosomów

  1. Ekspresja i oczyszczanie białek znakowanych przez His syntetaz IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts i tRNA przy użyciu standardowych metod15.
  2. Przygotować mieszaninę inicjacyjną, dodając następujące składniki do buforu TAM10 w temperaturze 37 °C przez 15 minut: 1 μM znakowanego rybosomu; po 1,5 μM IF1, IF2 i IF3; 2 μM biotynylowanego mRNA (kodującego MF dla pierwszych dwóch aminokwasów); 4 μM naładowanego fMet-tRNAfMet; i 1 mM GTP.
  3. Przygotować mieszankę EF-Tu_G, mieszając następujące składniki w buforze TAM10 w temperaturze 37 °C przez 15 minut: 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP i 0,02 mg/ml kinazy pirogronianowej.
  4. Przygotuj mieszankę EF-Tu_NoG podobnie jak w kroku 2.3 bez EF-G.
  5. Przygotować mieszaninę Phe, mieszając następujące składniki w wodzie wolnej od nukleaz o temperaturze 37 °C przez 15 minut: 100 mM Tris (pH 7,5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM syntetazy specyficznej dla fenyloalaniny, 2 A260/ml znakowanego tRNAPhe i 50 μM fenyloalaniny.
  6. Przygotować kompleks pre-translokacyjny (PRE) mieszając mieszaniny inicjujące, EF-Tu_NoG i Phe w stosunku 1:2:2, w temperaturze 37 °C przez 2 min. Po inkubacji oczyścić PRE przez ultrawirowanie 1,1 M z poduszką sacharozową przez noc w temperaturze 100 000 x g.
  7. Przygotować kompleks posttranslokacyjny (POST) mieszając mieszaniny inicjujące, EF-Tu_WG i Phe w stosunku 1:2:2, w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Po inkubacji oczyścić POST przez ultrawirowanie 1,1 M poduszki sacharozowej przez noc w temperaturze 100 000 x g.

3. Przygotowanie przykładowych preparatów

  1. Wyczyść szkiełka mikroskopowe (75 mm x 25 mm) zawierające sześć par otworów (o średnicy 1 mm). Każda para tworzy wlot-wylot komory próbki. Upewnij się, że odległość między każdym otworem wlotowym-wylotowym wynosi 13 mm, a odległość od środka do środka między dwoma kanałami wynosi 6 mm. Umieść sześć szkiełek w szklanym tyglu.
  2. Napełnij tygiel acetonem i poddaj je sonikacji przez 5 minut. Zdekantuj aceton i trzykrotnie przepłucz szkiełka ultraczystą wodą. Ponownie napełnić tygiel wodą i 1 ml 10 M KOH. Sonikacja przez 20 minut.
  3. Spłucz szkiełka trzykrotnie ultraczystą wodą. Ponownie napełnić tygiel etanolem i poddać sonikacji przez 5 minut. Całkowicie zdekantować rozpuszczalnik. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w dygestorium.
  4. Wyczyść szkiełka nakrywkowe mikroskopu (grubość #1.5, 24 x 40 mm). Wykonaj czynności czyszczenia zgodnie z opisem w krokach 3.1-3.3.
  5. Piecz oczyszczone szkiełka i szkiełka nakrywkowe w temperaturze 300 °C przez 3 godziny. Przechowuj je w piecu przez noc do ostygnięcia.
  6. Pokryj szkiełko nakrywkowe aminozelanem. Do tygla zawierającego szkiełka nakrywkowe wlać mieszaninę metanolu (100 ml metanolu, 5 ml wody, 0,5 ml HAc i 1 ml amiinozylanu). Ogrzewać tygiel w łaźni wodnej przez 10 minut, sonikować go przez 10 minut, a następnie grzać tygiel w łaźni wodnej przez kolejne 10 minut. Zdekantować mieszaninę metanolu, dobrze wypłukać szkiełko nakrywkowe w trzech tyglach czystej wody. Oczyść powierzchnie suchym strumieniem azotu przez igłę.
  7. Pokryj szkiełka nakrywkowe biotyną-PEG w laminarnym czystym kapturze.
    1. Do przygotowania roztworu PEG należy użyć 98 mg PEG i 2-3 mg biotyny-PEG w 200 μl 100 mM roztworu NaHCO3
      2. .
    2. Połóż jedno szkiełko nakrywkowe płasko na powierzchni. Ostrożnie upuść 60 μl roztworu PEG na górną krawędź. Następnie połóż na nim kolejne szkiełko nakrywkowe, pozwalając, aby efekt kapilarny rozprowadził roztwór między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Upewnij się, że nie tworzą się pęcherzyki.
    3. Powtórz krok 3.7.2 dla dwóch kolejnych par szkiełek nakrywkowych. Pokryj sześć kawałków szkiełek nakrywkowych biotyną. Jeśli potrzeba więcej szkiełek nakrywkowych, dostosuj odpowiednio ilość PEG i Biotyny PEG, aby uzyskać więcej roztworu PEG.
    4. Przechowuj te szkiełka nakrywkowe w pustym pudełku wypełnionym wodą i inkubuj przez 3 godziny w ciemności.
    5. Po 3 godzinach oddzielić szkiełka nakrywkowe, spłukać wodą w trzech kolejnych tyglach i przepłukać suchym strumieniem azotu. Umieść powlekane szkiełka nakrywkowe na ceramicznym stojaku. Zaznacz powierzchnię powłoką.
  8. Zmontuj komory próbki19.
    1. Przeciągnij ostre końcówki pipet przez otwory w szklanych szkiełkach, aż będą ściśle przylegać. Zeskrob ostre końce, aż całkowicie płasko przylegają do powierzchni szkła. Przyciąć drugi koniec końcówki tak, aby miał około 5 mm w celu załadowania próbki.
    2. Wytnij dwustronną taśmę z wzorem kanału (25 x 40 mm).
    3. Przyklej dwustronną taśmę do szkiełek szkiełkowych po płaskiej stronie.
    4. Przyklej powlekane szkiełko nakrywkowe do dwustronnej taśmy. Naciśnij go, aby szczelnie uszczelnić komorę próbki. Upewnij się, że powlekana strona jest skierowana do wewnątrz.

4. Obrazowanie pojedynczej cząsteczki FRET

  1. Włącz komputer.
  2. Włącz przełącznik mikroskopu.
  3. Uruchom interfejs sterowania laserem i włącz laser. Naciśnij przycisk włączania na skrzynce sterowniczej lasera, aby rozgrzać laser.
  4. Włącz kamery.
  5. Uruchom oprogramowanie powiązane z mikroskopem. Kliknij górną migawkę Wyłącz i kliknij lampę Włącz.
  6. Przygotować bufor TAM10_WT, dodając 10 μl 5% Tween-20 do 1 ml buforu TAM10.
  7. Przygotować roztwór deoksy, ważąc 3 mg oksydazy glukozowej w małej probówce do mikrowirówki. Dodać 45 μl katalazy. Delikatnie przemieszaj, aby rozpuścić ciało stałe. Wirować z prędkością 20 000 x g w mikrowirówce przez 1 minutę. Weź supernatant.
  8. Przygotować 30% roztwór glukozy w wodzie i 200 mM roztwór Trolox w DMSO.
  9. Przygotować 0,5 mg/ml roztworu streptawidyny w wodzie wolnej od nukleaz.
  10. Dodaj jedną kroplę olejku obrazowego do obiektywu TIRF.
  11. Umieść komory na próbki na obiektywie.
  12. Napełnij komorę 10 μl roztworu streptawidyny. Odczekaj 1 minutę.
  13. Przemyć komorę 30 ml buforu TAM10_WT i zebrać płynny roztwór za pomocą złożonej bibuły filtracyjnej. Odczekaj 1 minutę.
  14. Rozcieńczyć kompleksy rybosomów (PRE lub POST) do stężenia 10-50 nM buforem TAM10_WT.
  15. Załaduj 20 μl próbki rybosomu do kanału. Poczekaj 2 minuty.
  16. Sporządzić bufor do obrazowania (50 μl buforu TAM10 plus po 0,5 μl roztworów deoksy, glukozy i Troloxa). Dobrze wymieszaj bufor.
  17. Przepłukać komorę 30 μl buforu obrazowania.
  18. Ustaw kamerę tak, aby rejestrowała 100 ms/klatkę, 16 bitów, 4 x 4 binning.
  19. Kliknij górną migawkę Włącz, a lamp Wyłącz.
  20. Rozpocznij akwizycję kamery. Rozłóż obrazy w trzech oknach reprezentujących dwie pojedyncze kamery i nakładkę.
  21. Kliknij Autofokus. Dostosuj ustawienia, aby znaleźć najlepszą ostrość.
  22. Kliknij metodę. Ustaw punkty pola, przechowywanie plików i numer pętli.
  23. Kliknij Run.
    UWAGA: Pojawi się nowe okno z obrazowaniem w czasie rzeczywistym. Postęp szeregów czasowych i szeregów pola widzenia jest wyświetlany w górnej części okna.
  24. Po zakończeniu pobierania obrazu zamknij wyskakujące okienko.
  25. Otwórz plik ND (plik pobrany).
  26. Kliknij ROI / prosty edytor ROI. Wybierz opcję Okrąg.
  27. Wybierz ROI na obrazie. Kliknij Zakończ po zakończeniu.
  28. Kliknij Pomiar / Pomiar czasu, aby wyświetlić dane w postaci wykresu lub arkusza kalkulacyjnego.
  29. Otwórz zakładkę Eksport. Ustaw parametry eksportu.
  30. Kliknij Eksportuj, aby zapisać intensywność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W badaniu smFRET rybosom został znakowany w pozycji środkowej względem ruchu tRNA, aby odróżnić translokację tRNA z miejsca A do miejsca P (Rysunek 1)15. Odległość od reszty znakowanej L27 do tRNA w miejscu A lub P wynosi odpowiednio 52 lub 61 Å, co odpowiada wydajności FRET na poziomie 0,47 i 0,65. Po zebraniu obrazów pobrano intensywności fluorescencji z kanałów donora i akceptora i przedstawiono je jako przebiegi czasowe (Rysunek 1). W...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

SmFRET jest wrażliwy na sygnały tła. Najpierw konieczne jest pokrycie komory próbki 0,05% tkienem, a następnie dodanie go jednocześnie z roztworem rybosomu, aby zablokować niespecyficzne wiązanie rybosomu z powierzchnią. Aby zobaczyć fluorescencję z emisji akceptora Cy5, niezbędny jest koktajl pochłaniacza tlenu (roztwory deoksy, glukozy i Troloxa). Bez tego rozwiązania wybielanie jest zbyt szybkie w kanale akceptorowym, aby można było uzyskać użyteczne informacje. Kolejnym krytycznym krokiem w eksperymentach z rybosomam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Y. Wang deklaruje, że nie występuje w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (R01GM111452) i Fundację Welch (E-1721).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AminosilanLaysanbioMPEG-SIL-5000
Biotyna-PEGLaysanbioBiotyna-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS komórkiNovagen71403
Katalazamilipore sigmaC3515
CS150FNX Mikro ultrawirówkaz
ApexBioA8138/A8140
Mikroskop odwrócony ECLIPSE Ti2Nikon
EdgeGARD Kaptur z przepływem laminarnymBaker
Oksydaza glukozowamilipore sigmaG2133
Kolumna Histrap HP (wstępnie zapakowana kolumna sefarozy)Cytiva17524701
Szkiełko nakrywkowe mikroskopuVWR48393-230
Szkiełka mikroskopoweVWR470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 kameraHamamatsu
PEG (5,000)LaysanbioMPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plazmidNovagen69741
SonikatorVWRCPX-952-518R
TCEPApexbioB6055
Troloxmilipore sigma238813
Cy3/C5-maleimidem

Bibliografia

  1. Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, Pt 4 567-574 (2008).
  2. Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
  3. Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
  4. Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
  5. Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
  6. Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
  7. Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  8. Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
  9. Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
  10. Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
  11. Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
  12. Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
  13. Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
  14. Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
  15. Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
  16. Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
  17. Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
  18. Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
  19. Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
  20. Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
  21. Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
  22. Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
  23. Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
  24. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
  25. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  26. Tsai, T., et al. High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
  27. Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918(2019).
  28. Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

pojedynczy cz steczkowy FRETdynamika rybosom wruch tRNAmikroskopia TIRFoczyszczanie metod ultrawir wkiznakowanie bia ka L27inhibicja antybiotykowaobrazowanie poklatkowe

Powiązane artykuły