Synteza i charakterystyka multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej

Podsumowanie

W tym protokole opisane są metody syntezy i charakterystyki kropel porfiryny o wielomodalnej przemianie fazowej.

Streszczenie

Krople zmiennofazowe to klasa ultradźwiękowych środków kontrastowych, które mogą przekształcić się w echogeniczne mikropęcherzyki in situ przy zastosowaniu wystarczającej energii akustycznej. Kropelki są mniejsze i bardziej stabilne niż ich odpowiedniki z mikropęcherzykami. Jednak tradycyjne ultradźwiękowe środki kontrastowe nie są możliwe do śledzenia poza pomiarami akustycznego sprzężenia zwrotnego, co utrudnia ilościowe określenie biodystrybucji lub akumulacji środka kontrastowego ex vivo. Naukowcy mogą być zmuszeni do polegania na fluorescencyjnych lub optycznie absorbujących towarzyszących cząstkach diagnostycznych, aby wywnioskować biodystrybucję. Celem tego protokołu jest wyszczególnienie etapów tworzenia multimodalnych kropel porfiryny zmiennofazowych przy użyciu metody kondensacji. Porfiryny to cząsteczki fluorescencyjne o wyraźnych pasmach absorbancji, które mogą być sprzężone z lipidami i włączane do kropelek w celu rozszerzenia wszechstronności kropel, umożliwiając bardziej solidną biodystrybucję przy zachowaniu właściwości akustycznych. Stworzono siedem preparatów o różnej zawartości lipidów porfirynowych i zasadowych w celu zbadania rozkładu wielkości mikropęcherzyków i kropel. W protokole opisano również charakterystyki odpowiednie dla struktur zawierających porfirynę, aby wykazać ich analityczną wszechstronność w roztworze. Wymiarowanie wykazało, że średnie średnice po skondensowaniu były od 1,72 do 2,38 razy mniejsze niż populacje prekursorów. Charakterystyka absorbancji wykazała, że nienaruszone zespoły miały pik w paśmie Q 700 nm, podczas gdy próbki zakłócone miały pik absorbancji przy 671 nm. Charakterystyka fluorescencji wykazała, że nienaruszone 30% zespołów porfirynowo-lipidowych zostało wygaszonych fluorescencyjnie (>97%), z odzyskiem fluorescencji osiągniętym po rozerwaniu. Waporyzacja akustyczna wykazała, że kropelki porfiryny są nieechogeniczne przy niższych ciśnieniach i mogą być przekształcane w echogeniczne mikropęcherzyki przy wystarczającym ciśnieniu. Charakterystyki te wskazują na potencjał kropelek porfiryny w eliminowaniu potrzeby stosowania absorbancji lub towarzyszących strategii diagnostycznych opartych na fluorescencji w celu ilościowego określenia biodystrybucji ultradźwięków środka kontrastowego do dostarczania lub zastosowań terapeutycznych in vivo lub ex vivo.

Wprowadzenie

Obrazowanie ultradźwiękowe to nieinwazyjna, niejonizująca forma obrazowania medycznego, która wykorzystuje fale akustyczne. Podczas gdy ultrasonografy są bardziej przenośne i mogą dostarczać obrazy w czasie rzeczywistym, obrazowanie ultrasonograficzne może cierpieć z powodu niskiego kontrastu, co utrudnia ultrasonografom niezawodne rozróżnienie podobnie echogenicznych cech patologicznych. Aby przeciwdziałać temu ograniczeniu, mikropęcherzyki mogą być wstrzykiwane do gospodarza w celu poprawy kontrastu naczyniowego. Mikropęcherzyki to mikronowe środki kontrastowe wypełnione gazem, które są silnie echogeniczne w stosunku do fal akustycznych i mogą zapewniać zwiększony kontrast naczyń^1,2. Powłoki i rdzenie gazowe mikropęcherzyków mogą być dostosowane do różnych zastosowań, takich jak obrazowanie, tromboliza, przepuszczalność błony komórkowej lub przejściowe otwarcie naczyń krwionośnych².

Wadą mikropęcherzyków jest ich krótki okres półtrwania. Na przykład, klinicznie dostępne mikrosfery lipidowe perflutren mają tylko okres półtrwania 1,3 minut³. W przypadku długich sesji obrazowania konieczne jest wielokrotne wstrzyknięcie mikropęcherzyków. Kolejną wadą mikropęcherzyków są ich duże średnice. Podczas gdy mikrosfery lipidowe perflutrenu mają średnicę około 1 do 3 μm, wystarczająco małe, aby krążyć w układzie krwionośnym, są zbyt duże, aby wynaczynić i pasywnie gromadzić się w tkankach będących przedmiotem zainteresowania, takich jak nowotwory⁴. Jedną ze strategii przezwyciężenia tych ograniczeń jest skondensowanie mikropęcherzyków rdzenia gazowego w mniejsze kropelki z ciekłym rdzeniem^5,6. Chociaż kropelki nie są echogeniczne w stanie ciekłym, mogą zostać odparowane do mikropęcherzyków po wystawieniu na działanie ultradźwięków o wystarczająco wysokim szczytowym podciśnieniu, odzyskując zdolność do zapewniania kontrastu. Pozwala to na wykorzystanie korzystniejszej farmakokinetyki małego ciekłego rdzenia, zachowując jednocześnie zdolność do zapewnienia kontrastu podczas insonacji i bez zmiany składu chemicznego^4,7.

Dekafluorobutan jest idealnym związkiem perfluorowęglowodorowym do przechodzenia fazowo między stanem gazowym a ciekłym^5,6^,7. Dekafluorobutan pozwala na kondensację mikropęcherzyków w kropelki przy samym obniżeniu temperatury, podczas gdy mniej gęste perfluorowęglowodory wymagają dodatkowego zwiększania ciśnienia⁵. Ta delikatna metoda minimalizuje niszczenie pęcherzyków podczas kondensacji^7,8,9. Ponieważ ich rdzenie są płynne, kropelki są nieechogeniczne i niewidoczne dla ultradźwięków. Jednak przy zastosowaniu wystarczającej ilości energii akustycznej lub cieplnej, ciekłe rdzenie mogą odparować z powrotem do stanu gazowego, generując echogeniczne mikropęcherzyki⁸. Ta waporyzacja pozwala na kontrolę, kiedy i gdzie wytwarzać mikropęcherzyki.

Chociaż kropelki są przydatne do pasywnej akumulacji, waporyzacji in situ lub poprawy przepuszczalności komórek⁴, kropelki (i ich fragmenty) nie mogą być obrazowane ani określane ilościowo ex vivo. W związku z tym wymierne towarzyszące środki diagnostyczne, takie jak fluorescencyjne^4,10,11, cząsteczki magnetyczne¹², optycznie absorbujące środki¹³, są wykorzystywane jako analog do pomiaru dostarczania kropelek do tkanek będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład Helfield i in. zastosowali jednoczesną iniekcję fluorescencyjnych nanokulek do ilościowej oceny obrazu histologicznego narządów myszy, ponieważ kropelki nie mogły być wykryte fluorescencyjnie⁴. Wadą leków do diagnostyki w terapii towarzyszącej jest to, że śledzony składnik może działać niezależnie od kropli, w zależności od jej indywidualnego profilu farmakokinetycznego.

Na szczęście, powłokę mikropęcherzyków i kropelek można dostosować. Na przykład Huynh i wsp. zademonstrowali ultradźwiękowe środki kontrastowe z otoczkami porfirynowo-lipidowymi, tworząc multimodalne mikropęcherzyki¹⁴. Porfiryny to klasa związków organicznych o aromatycznej strukturze makrocyklicznej^14,15. Są optycznie chłonne, fluorescencyjne i mogą być chelatowane do szerokiej gamy metali do radioterapii, obrazowania opartego na radionuklidach lub kwantyfikacji na podstawie metali śladowych¹⁴. Jednym z przykładów porfiryny jest pirofeoforbid (Pyro). Poprzez sprzężenie Pyro z lipidami, włączenie Pyro-lipidów do mikropęcherzyków lub kropelek pozwala na ich obrazowanie i śledzenie za pomocą wielu modalności: akustycznie, fluorescencyjnie i poprzez absorbancję¹⁴. Ten multimodalny środek kontrastowy może być używany do śledzenia i ilościowego oznaczania akumulacji. Może to wyeliminować potrzebę stosowania towarzyszących środków diagnostycznych, ponieważ kwantyfikowalny składnik jest teraz sprzężony z powłoką, umożliwiając dokładniejsze kwantyfikowanie dostarczania¹⁶.

Tutaj nakreślony jest protokół tworzenia multimodalnych kropel porfiryny zmiennofazowej. Ponieważ ultrasonograficzne środki kontrastowe mogą być wykorzystywane jako platforma do dostarczania leków do tkanek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak nowotwory^2,4, rozszerzenie ich wykrywalności poza ultradźwięki może okazać się przydatne do ilościowego określenia skuteczności dostarczania. Celem tych kropelek jest dostarczenie możliwych do śledzenia ultradźwiękowych środków kontrastowych zdolnych do pasywnej akumulacji in vivo, parowania in situ i akustyki, a także z potencjałem do ilościowego określania biodystrybucji lub akumulacji z narządów ex vivo bez polegania na czujnikach wtórnych. Przedstawiono również metody charakteryzacji, aby pokazać potencjał kropelek porfiryny jako czujników biodystrybucji. Omówiono również wpływ obciążenia pirolipidami w skorupie (od 0% do 50% według stosunku molowego).

Protokół

1. Odwodnione błony lipidowe

1. Obliczyć masy każdego z potrzebnych składników powłoki (patrz plik uzupełniający "Arkusz formuł lipidowych").
   UWAGA: Dla tego protokołu skład otoczki będzie wynosił: 10% molowy 1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[methoxy(glikol polietylenowy)-5000] sól amonowa (DSPE-PEG5K), x molowy % pirofeoforbidu sprzężony z 1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholiną (Pyro-SPC) i (90 - x) molowy % 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC). Ilość Pyro-SPC będzie zróżnicowana w zależności od składu pocisku (x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Sprawdź masę cząsteczkową DSPE-PEG5K na butelce magazynowej.
   1. Skaluj protokół do dowolnej objętości lipidów o minimalnej objętości 1 ml. W tym protokole dla wszystkich preparatów zastosowano całkowitą objętość lipidów wynoszącą 10 ml przy całkowitym stężeniu lipidów wynoszącym 1 mg na ml. Roztwór substancji pomocniczej będzie składał się z: 10% glikolu propylenowego, 10% glicerolu i 80% soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS, 1X, 7,4 pH) (% v/v/v) (patrz Krok 2.3 i "Arkusz formuły lipidowej").
      UWAGA: Protokół syntezy pirolipidów jest opisany w pliku uzupełniającym "Inne protokoły i dane" Kroki od S1 do S1.19, który został zmodyfikowany na podstawie pracy wykonanej przez Zheng et al.¹⁵.
2. Na podstawie obliczonych mas (patrz Krok 1.1 i "Arkusz formuły lipidowej") zważyć każdy z niezawierających pirolipidów i przenieść do fiolki ze szkła borokrzemianowego o odpowiedniej wielkości z zakręcanym kapslem.
3. Nakrętkę należy nakręcić, oznaczyć nakrętkę i fiolkę, a następnie przykryć dno i ścianki fiolki z lipidami folią aluminiową. Ta fiolka będzie określana jako "Fiolka lipidowa" przez resztę protokołu. Przechowywać fiolkę z lipidami w chłodnym, suchym i ciemnym miejscu.
4. Jeżeli preparat zawiera Pyro-SPC, rozpuścić 10 mg suchej warstwy Pyro-SPC (patrz "Inne protokoły i dane") w 1 ml chloroformu. Wirować przez 5 sekund, zmierzyć absorbancję i obliczyć odpowiednią objętość do dodania do fiolki z lipidami.
   UWAGA: Chloroform stanowi zagrożenie dla zdrowia, działa drażniąco i toksycznie. Nosić ochronny fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, rękawice i unikać wdychania oparów.
   UWAGA: Ponieważ Pyro-SPC jest wrażliwy na światło, zmniejsz światła w obszarze roboczym, jeśli to możliwe podczas obchodzenia się z Pyro-SPC. Przechowywać Pyro-SPC szczelnie i przykryte, gdy nie jest używany.
   1. Na spektrofotometrze w ultrafiolecie w świetle widzialnym ustaw go tak, aby mierzył absorbancję w zakresie długości fal od 800 nm do 300 nm z przyrostem 0,5 nm i zmierzył linię podstawową za pomocą 2000 μl czystego metanolu w kompatybilnej kuwecie o długości ścieżki 1 cm.
      UWAGA: Metanol stanowi zagrożenie dla zdrowia, jest drażniący, toksyczny i łatwopalny. Nosić ochronny fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, rękawice i unikać wdychania oparów. Przechowywać z dala od iskier i ciepła.
   2. Dodać 2 μl Pyro-SPC w chloroformie do 2000 μl metanolu i wirować przez 30 s. Przenieś go do czystej, kompatybilnej kuwety o średnicy 1 cm i zmierz absorbancję. Dostosuj ten współczynnik rozcieńczenia, jeśli szczyt absorbancji przy 667 nm wykracza poza zakres absorbancji spektrofotometru w ultrafiolecie widzialnym.
      UWAGA: Za każdym razem, gdy przenosisz chloroform lub metanol, używaj czystej szklanej strzykawki lub pipety wyporowej, a nie pipety mechanicznej, aby uzyskać lepszą dokładność.
   3. Powtórz krok 1.4.2 jeszcze dwa razy, aby uzyskać trzykrotne wartości absorbancji.
   4. Uśrednić wartości szczytowe absorbancji przy 667 nm i użyć poniższego równania, aby obliczyć objętość Pyro-SPC w chloroformie potrzebną dla fiolki z lipidami^14,15:
      
      gdzie V jest objętością Pyro-SPC w chloroformie potrzebnym, m jest wymaganą masą Pyro-SPC (patrz Krok 1.1 i "Arkusz Formuły Lipidowej"), M jest masą cząsteczkową Pyro-SPC przy 1040,317 g·^mol-1, A jest uśrednioną absorbancją przy 667 nm, D jest współczynnikiem rozcieńczenia opartym na objętości metanolu i Pyro-SPC w objętościach chloroformu (Krok 1.4.2), L to długość ścieżki kuwety na 1 cm, a ε to współczynnik tłumienia molowego Pyro-SPC 667 nm przy 45000 L·^mol-1·^cm-1,
      UWAGA: Mianownikiem równania jest prawo Beera-Lamberta, które wiąże stężenie analitu w roztworze ze zmierzoną absorbancją optyczną na odległość.
   5. Dodaj obliczoną objętość Pyro-SPC w chloroformie z poprzedniego kroku do fiolki z lipidami za pomocą strzykawki z czystego szkła (Rysunek 1A), a następnie zakryj i przykryj fiolkę.
      UWAGA: Rysunek 1 pokazuje tylko 30% preparat pirolipidowy.
   6. Jeśli pozostał Pyro-SPC w chloroformie: W okapie oparowym odkręcić fiolkę z chloroformem Pyro-SPC + z kroku 1.4, częściowo przechylić fiolkę na bok i w sposób ciągły przepływać azot tak delikatnie, jak to możliwe, do fiolki z chloroformem. Obrócić fiolkę, aby wysuszyć chloroform za pomocą przepływu azotu gazowego i równomiernie pokryć Pyro-SPC na wewnętrznej ściance fiolki podczas jej wysychania. Upewnij się, że nie powstają rozpryski i żaden roztwór nie wypada.
   7. Gdy film lipidowy Pyro-SPC stanie się suchy i pokryty na ściance fiolki, należy wyłączyć dopływ azotu gazowego. Nakrętkę fiolki, zamknąć szyjkę fiolki folią woskową i przechowywać fiolkę w temperaturze -20 °C w ciemności.
5. Przygotować roztwór składający się z 90% chloroformu i 10% metanolu (% v/v) i dodać 5 ml do fiolki z lipidami. Zakręć fiolkę z lipidami i delikatnie zamieszaj, aby ujednolicić zawartość (Rysunek 1B).
   UWAGA: Jeśli preparat zawiera lipidy kwasu fosfatydowego (takie jak sól sodowa 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosforanu (DSPA)), do fiolki z lipidami należy dodać: 60% chloroformu, 32% metanolu i 8% ultraczystej wody (% v/v/v). Bardziej intensywne wirowanie może być konieczne, aby całkowicie rozpuścić zawartość lipidów.
6. W dygestorium odkręć nakrętkę fiolki z lipidami, częściowo przechyl fiolkę z lipidami na bok i w sposób ciągły wprowadzaj azot tak delikatnie, jak to możliwe, do fiolki z lipidami. Obróć fiolkę z lipidami, aby wysuszyć roztwór za pomocą przepływu azotu gazowego i równomiernie pokryj film lipidowy na wewnętrznej ściance fiolki z lipidami podczas jej wysychania. Upewnij się, że nie powstają rozpryski i żaden roztwór nie wypada.
7. Gdy lipidy wydają się suche i pokryte na wewnętrznych ściankach fiolki z lipidami (Rysunek 1C), wyłącz dopływ azotu gazowego, przykryj dno i ściankę fiolki lipidowej folią aluminiową i przykryj górny otwór folią aluminiową z kilkoma otworami z igłą do wentylacji ( Rysunek 1D).
8. Oznaczyć i umieścić pokrytą fiolkę z lipidami w eksykatorze próżniowym i pozostawić lipidy do dalszego wyschnięcia przez co najmniej 24 godziny, ale nie dłużej niż 72 godziny < br /> UWAGA: Protokół można wznowić później, po 24 do 72 godzinach.

2. Nawodnienie lipidów

1. Napełnij sonograf kąpielowy wodą i podgrzej go do temperatury 70 °C. Włącz sonikację, aby pomóc wymieszać wodę.
   UWAGA: Woda i sonikator są w wysokich temperaturach. Unikaj dotykania wody i sonikatora. Nosić okulary ochronne, ochronny fartuch laboratoryjny i rękawice ochronne.
2. Gdy sonikator kąpieli osiągnie temperaturę 70 °C, wyjmij fiolkę z lipidami z eksykatora próżniowego. Jeśli to możliwe, zmniejsz światła w obszarze roboczym.
3. Przygotować roztwór substancji pomocniczej składający się z 10% glikolu propylenowego, 10% glicerolu, 80% PBS (% v/v/v) i dodać 10 ml do fiolki z lipidami (patrz Krok 1.1.1 i "Arkusz formuły lipidowej").
   UWAGA: W przypadku korzystania ze standardowej pipety wyporowej należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z lepkimi rozpuszczalnikami, takimi jak glikol propylenowy i glicerol. Powoli zasysać i zanurzać objętość, a następnie poczekać, aż pozostała objętość dotrze do dna końcówki pipety. Upewnij się, że płyn nie przylega do zewnętrznej strony końcówki pipety podczas powolnego przenoszenia objętości.
4. Zakręć fiolkę z lipidami, zdejmij aluminiową osłonę i delikatnie obracaj fiolkę w sonikutorze do kąpieli przez 15 minut, podczas gdy trwa sonikacja, aby rozpuścić lipidy. Upewnij się, że szyjka fiolki z lipidami znajduje się nad wodą. Od czasu do czasu należy sprawdzić, czy wieczko fiolki jest prawidłowo zamknięte.
   1. Od czasu do czasu należy wyjmować fiolkę z lipidami z łaźni wodnej. Krótko przytrzymaj go pod światło, aby sprawdzić, czy zawartość jest całkowicie rozpuszczona (Rysunek 1E).
   2. Jeśli zawartość fiolki z lipidami nie homogenizuje, wyjmij fiolkę z lipidem z sonografu do kąpieli. Zabezpiecz nasadkę, obracaj bardziej agresywnie i włóż ją z powrotem do sonografu do kąpieli.
5. Wyjmij fiolkę z lipidami z sonografu do kąpieli i wyłącz sonizator do kąpieli. Osusz zewnętrzną stronę fiolki z lipidami ręcznikami papierowymi i ponownie oznacz fiolkę z lipidami.
6. Przykryj fiolkę lipidową folią aluminiową i schładzaj fiolkę z lipidami w temperaturze pokojowej w chłodnym, ciemnym i suchym miejscu przez 10 minut.
7. Podwielokrotność zawartości fiolki z lipidami: około 2 ml roztworu lipidów w 3 ml przezroczystych fiolek z surowicą ze szkła borokrzemianowego (7 mm wewnętrzna średnica otworu, 13 mm zewnętrzna średnica otworu).
   UWAGA: Niektóre protokoły mogą używać 1,5 ml roztworu lipidów w 3 ml fiolce⁷.
8. Zakryj fiolki z surowicą szarymi korkami z gumy chlorobutylowej w stylu liofilizacji (7 mm wewnętrzna średnica otworu, 13 mm zewnętrzna średnica otworu) i zabezpiecz gumowy korek odrywanymi aluminiowymi uszczelkami (13 mm zewnętrzna średnica otworu) i zaciskarką (Rysunek 1F).
9. Odkurz, odgazuj i ponownie zwiększ ciśnienie roztworu lipidów w każdej z fiolek surowicy^4,5,7 (Rysunek 2).
   UWAGA: Zapoznaj się z "Inne protokoły i dane", aby uzyskać instrukcje dotyczące montażu wymiennika gazu i więcej szczegółów.
   1. Zamknij wszystkie zawory pomiędzy zaworem ciśnieniowym A a zaworem butli gazowej (Rysunek 2). Podłączyć fiolki z surowicą do igieł kolektora, następnie otworzyć odpowiednie zawory kolektora, następnie otworzyć zawór podciśnieniowy A i zawór podciśnieniowy B i podciśnienie do -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) przez 5 minut w celu usunięcia powietrza atmosferycznego. NIE odsysaj żadnej cieczy (patrz "Inne protokoły i dane" Kroki od S3 do S3.1.5).
      UWAGA: Pompa próżniowa może pęknąć, jeśli jest obsługiwana nieprawidłowo. Nie używaj pompy próżniowej z organicznymi, kwaśnymi lub zasadowymi chemikaliami.
   2. Gdy próżnia jest nadal włączona, przytrzymaj fiolkę z surowicą (aby zapobiec jej kołysaniu) i szybko postukaj w nią długopisem lub markerem, aby odgazować. Kontynuuj stukanie, aż nie utworzą się pęcherzyki i nie będzie pęcherzyków w fiolce. NIE pozwól, aby jakikolwiek płyn został odkurzony. W razie potrzeby wstrzymaj stukanie. Powtórzyć te czynności dla wszystkich połączonych fiolek z surowicą. Po odgazowaniu wszystkich fiolek z surowicą, ZAMKNIJ zawór podciśnieniowy A i zawór podciśnieniowy B i WYŁĄCZ pompę próżniową (patrz "Inne protokoły i dane" Kroki od S3.2 do S3.2.3).
   3. Gdy fiolka z surowicą jest nadal podłączona do igły i gdy pompa próżniowa jest wyłączona, powoli przekręć zawór butli z gazem od 1/16 do 1/8 (około 22.5 do 45 ° pełnego obrotu) w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby częściowo otworzyć, a następnie otwórz zawór z uchwytem T i POWOLI przekręć zawór regulatora powietrza zgodnie z ruchem wskazówek zegara na manometr 3 psi (20.7 kPa). Następnie otwórz zawór ciśnieniowy A i zawór ciśnieniowy B (patrz "Inne protokoły i dane" Kroki od S3.3 do S3.3.21).
      UWAGA: Butla z dekafluorobutanem jest pod ciśnieniem i może eksplodować po podgrzaniu. Trzymaj się z dala od ciepła i uderzeń. Gaz dekafluorobutan może powodować wyparcie tlenu i uduszenie. Nosić odpowiednią ochronę oczu i uchwyt w okapie wyciągowym. W przypadku nieprawidłowego obchodzenia się z butlą z gazem możliwe jest odkurzenie butli z gazem, co może spowodować szybkie rozhermetyzowanie i implozję. Otwarcie zaworu butli gazowej o więcej niż 1/8 obrotu może spowodować uszkodzenie regulatora powietrza.
   4. Po 30 s zwiększania ciśnienia (manometr powinien nadal wskazywać 3 psi (20.7 kPa)), zamknij wszystkie zawory kolektora z fiolkami z surowicą, odłącz fiolki z surowicą, osłonij igły i ZAMKNIJ zawór butli z gazem.
   5. Uwolnij nagromadzone ciśnienie, częściowo otwierając pojedynczy zawór kolektora, aż wskazówka manometru regulatora powietrza przejdzie do pozycji spoczynkowej. Następnie zamknij wszystko pomiędzy zaworami kolektora i uchwytem T, w tym
   .
10. Oznaczyć fiolki surowicy i przechowywać je w temperaturze 4 °C w ciemności. Upewnij się, że wszystkie zawory wymiennika gazu są zamknięte, a pompa próżniowa jest następnie wyłączona.
    UWAGA: W tym stanie serum powinno być stabilne do 4 miesięcy. Na tym etapie protokół może zostać wznowiony później, maksymalnie po 4 miesiącach.

3. Fiolki dekafluorobutanu

1. Czystymi, pustymi fiolkami z przezroczystego serum ze szkła borokrzemianowego o pojemności 3 ml (7 mm wewnętrzna średnica otworu, 13 mm zewnętrzna średnica otworu) przykryj je szarymi korkami z gumy chlorobutylowej w stylu liofilizacji (7 mm wewnętrzna średnica otworu, 13 mm zewnętrzna średnica ust) i zabezpiecz gumowy korek odrywanymi aluminiowymi uszczelkami (13 mm zewnętrzna średnica otworu) i zaciskarką^{4, 7,8}.
2. Wykonaj krok 2.9.1, aby odkurzyć powietrze atmosferyczne (patrz "Inne protokoły i dane" Kroki od S3.1 do S3.1.5).
3. Pomiń odgazowywanie i postępuj zgodnie z krokami od 2.9.3 do 2.9.5, aby ponownie zwiększyć ciśnienie w fiolce (patrz "Inne protokoły i dane" Kroki od S3.3 do S3.3.21).
4. Oznaczyć fiolki z dekafluorobutanem i przechowywać je w temperaturze 4 °C, w ciemności. Upewnij się, że wszystkie zawory wymiennika gazu są zamknięte, a pompa próżniowa jest następnie wyłączona.
   UWAGA: Do kondensacji kropelek potrzebne będą fiolki surowicy wypełnione dekafluorobutanem. Powinny być stabilne do 4 miesięcy w tym stanie. Na tym etapie protokół może zostać wznowiony później, maksymalnie po 4 miesiącach.

4. Tworzenie się kropelek

1. Wyjąć z lodówki uwodniony roztwór lipidowy z fiolki z surowicą (z kroku 2.10).
2. Za pomocą dekapera usunąć aluminiową uszczelkę z fiolki surowicy i przenieść 1 ml roztworu lipidów do fiolki z próbką ze szkła borokrzemianowego o pojemności 1,85 ml (z zakrętką fenolową), pozwalając, aby roztwór lipidów spłynął po wewnętrznej ściance. Nie twórz bąbelków.
   1. Jeśli w fiolce z surowicą pozostał jakikolwiek roztwór lipidów, należy postępować zgodnie z krokami od 2.9 do 2.10 w celu odgazowania i ponownego zwiększenia ciśnienia w fiolce surowicy do przechowywania (patrz "Inne protokoły i dane" Kroki od S3 do S3.3.21).
3. Za pomocą fiolki z próbką o pojemności 1,85 ml delikatnie wlej dekafluorobutan do przestrzeni nad fiolką z próbką za pomocą wymiennika gazowego (patrz Rysunek 2 dla konkretnych nazw zaworów).
   1. Upewnij się, że wszystkie zawory na wymienniku gazowym są prawidłowo zamknięte, a pompa jest wyłączona.
      UWAGA: Jeśli zrobisz to nieprawidłowo, możliwe jest odessie butli z gazem, powodując szybką dekompresję i implozję.
   2. Otwórz jeden zawór kolektora i ostrożnie wyjmij odpowiednią igłę z kolektora.
      UWAGA: Ostre przedmioty, unikaj kontaktu/przekłuwania.
   3. Otwórz zawór ciśnieniowy A i zawór ciśnieniowy B i przekręć zawór butli gazowej od 1/16 do 1/8 (około 22,5 do 45 ° pełnego obrotu) w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby częściowo otworzyć, a następnie otworzyć zawór z uchwytem T.
      UWAGA: Nie otwieraj zaworu butli z gazem mocniej, ponieważ może to spowodować uszkodzenie regulatora powietrza.
   4. Odkręć fiolkę z próbką roztworem lipidów i przesuń ją tak, aby igła kolektora znajdowała się powyżej granicy faz ciecz-powietrze wewnątrz fiolki. Trzymać tam fiolkę.
   5. POWOLI obracaj zawór regulatora powietrza zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż wskazówka regulatora powietrza przesunie się nieznacznie z pozycji spoczynkowej, a gaz perfluorowęglowy delikatnie wypłynie z igły kolektora. Pozwól, aby gaz perfluorowęglowy delikatnie przepływał do przestrzeni nad fiolką przez 30 sekund. Nie twórz bąbelków. W razie potrzeby wyreguluj zawór regulatora powietrza.
      UWAGA: Granica faz ciecz-powietrze powinna być nieznacznie zakłócona przez przepływ gazu dekafluorobutan. Ponieważ system jest teraz otwarty, manometr regulatora powietrza nie może prawidłowo odczytać ciśnienia.
   6. Po upływie 30 s ostrożnie i szybko zakryć fiolkę z próbką, nie przesuwając jej zbyt mocno.
   7. Zamknij zawór butli gazowej (zgodnie z ruchem wskazówek zegara), zawór z uchwytem T, zawór regulatora powietrza (przeciwnie do ruchu wskazówek zegara), zawór ciśnieniowy A, zawór ciśnieniowy B i zawór kolektora.
   8. Ostrożnie owinąć igłę.
   9. Oznacz fiolkę z próbką i uszczelnij szyjkę folią woskową biegnącą zgodnie z ruchem wskazówek zegara (Rysunek 3A i 3B).
      UWAGA: Rysunki od 3B do 3F pokazują tylko 30% preparat pirolipidowy.
4. Przechowywać fiolkę z próbką w ciemności i w temperaturze 4 °C przez co najmniej 10 minut lub do 24 godzin
   UWAGA: Na tym etapie protokół może zostać wznowiony później, maksymalnie 24 godziny.
5. Umieść około 100 g suchego lodu (dwutlenku węgla) w izolowanym pojemniku, a zwykły lód umieść w innym izolowanym pojemniku. Pobrać przygotowane fiolki z surowicą dekafluorobutanu wymienione w kroku 3, dwie igły o średnicy 3,81 cm (1,5 cala) o rozmiarze 20, plastikową strzykawkę o pojemności 1 ml (odkręcić tłok przed użyciem), pojemnik o pojemności 200 ml, metalowe szczypce i termometr (od -20 do 100 °C).
   UWAGA: Jeśli robisz tylko mikropęcherzyki, nie ma potrzeby stosowania izopropanolu, suchego lodu i lodu.
6. Umieścić fiolkę z próbką z roztworem lipidów w mieszadle mechanicznym i mieszać przez 45 s (Rysunek 3C).
7. Po mechanicznym wymieszaniu ustaw fiolkę z próbką prawą stroną do góry, osłoniętą przed światłem i rozpocznij 15-minutowe odliczanie do schłodzenia fiolki i wybierz rozmiar mikropęcherzyków^8,17.
   1. Gdy 15-minutowe odliczanie osiągnie 10 minut (pozostało 5 minut do końca odliczania), napełnij pojemnik około 200 ml izopropanolu i schłodzić go do -20 °C suchym lodem za pomocą metalowych szczypiec.
      UWAGA: Temperatura docelowa wynosi od -15 do -17 °C, ale izopropanol rozgrzeje się podczas pracy z mikropęcherzykami.
      UWAGA: Izopropanol jest łatwopalny. Przechowywać z dala od źródeł ciepła i iskier. Suchy lód może spowodować uszkodzenie skóry. Uchwyt ze szczypcami. Nosić rękawice, okulary ochronne i ochronny fartuch laboratoryjny.
8. Po wybraniu rozmiaru mikropęcherzyków przez 15 minut, poszukaj wybranej wielkości przegrody wewnątrz fiolki z próbką (Rysunek 3D).
9. Trzymając fiolkę z próbką prawą stroną do góry, ostrożnie odkręć fiolkę z próbką i wyjmij około 0,7 ml dolnej przegrody za pomocą igły o średnicy 1,5 cala o rozmiarze 20 przymocowanej do plastikowej strzykawki o pojemności 1 ml. Upewnij się, że żadna z górnych partycji nie została wycofana. Nie trzepać strzykawką w celu usunięcia kieszeni powietrznych.
10. Wprowadzić inną igłę o rozmiarze 20 G do fiolki z dekafluorobutanem surowicy (trzymając igłę w pobliżu górnej części fiolki z surowicą) w celu odpowietrzenia, a następnie wprowadzić igłę/strzykawkę z mikropęcherzykami o wybranej wielkości.
11. Powoli przenoś mikropęcherzyki o wybranej wielkości. Przechylić fiolkę i ustawić strzykawkę pod odpowiednim kątem, aby płyn zsunął się po wewnętrznej ściance fiolki z dekafluorobutanem surowicy.
12. Po przeniesieniu całego roztworu mikropęcherzyków o wybranej wielkości, wyjmij igłę ze strzykawką, ale trzymaj igłę odpowietrzającą, aby zmniejszyć podciśnienie (Rysunek 3E).
    1. Jeśli robisz tylko mikropęcherzyki o wybranym rozmiarze, zatrzymaj się tutaj. Trzymaj igłę odpowietrzającą w górnej części i w jej pobliżu. Przechowywać fiolkę w ciemności i w temperaturze pokojowej.
13. Dodać niewielkie ilości suchego lodu lub izopropanolu o temperaturze pokojowej do kąpieli izopropanolowej, aby upewnić się, że temperatura kąpieli wynosi od -15 do -17 °C.
14. Z igłą odpowietrzającą o rozmiarze 20 włożoną w górną część fiolki z surowicą, umieścić fiolkę z surowicą w kąpieli izopropanolowej, utrzymując poziom mikropęcherzyków poniżej poziomu izopropanolu, ale szyjkę fiolki powyżej niego, i przerywanie obracać fiolkę z surowicą przez 2 minuty, aby skondensować mikropęcherzyki.
    UWAGA: Ten krok został zmodyfikowany na podstawie pracy wykonanej przez Sheerana i in.⁶
    1. Nie należy w sposób ciągły obracać fiolki z surowicą w izopropanolu i nie dopuścić do zamarznięcia roztworu. Wirować przez około 5 sekund i wyjąć fiolkę z surowicą z izopropanolu. Sprawdź, czy nie ma zarodkowania lodu i wznów wirowanie w izopropanolu. Jeśli tworzy się lód, należy zakręcić fiolkę z surowicą w powietrzu, aż się rozproszy.
15. Po 2-minutowej kondensacji wyjąć fiolkę surowicy z kąpieli izopropanolowej i wyjąć igłę odpowietrzającą.
    UWAGA: Mikropęcherzyki powinny zostać skondensowane w kropelki, na co wskazuje zmiana przezroczystości (Rysunek 3E w porównaniu z Rysunek 3F dla preparatu 30% Pyro-lipid).
16. Wytrzyj fiolkę z surowicą, oznacz ją i umieść na zwykłym lodzie w ciemnym, izolowanym pojemniku, aż będzie gotowa do użycia. Nieotwarte (nienaruszone aluminiowe uszczelnienie) kropelki powinny być stabilne w tym stanie do 6 godzin, o ile stopiony lód zostanie wymieniony w razie potrzeby.
Gdy produkt będzie
17. gotowy do użycia, usuń aluminiową uszczelkę za pomocą odkręcacza. Przechowywać kropelki (nawet otwarte fiolki) na lodzie i w ciemności, gdy nie są używane. Przechowuj mikropęcherzyki w ciemności i temperaturze pokojowej.

5. Charakterystyka morfologiczna i optyczna

1. Przygotuj 1% Triton poprzez: dodanie 5 ml Triton X-100 do 500 ml PBS (1x, pH 7,4) i mieszanie za pomocą mieszadła magnetycznego aż do uzyskania jednorodności¹⁴.
   UWAGA: Triton X-100 bardzo lepki. W przypadku korzystania ze standardowej pipety wyporowej należy zachować ostrożność podczas obsługi. Powoli zassać i zanurzyć objętość i poczekać, aż pozostała objętość dotrze do dna pipety. Upewnij się, że płyn nie przylega do zewnętrznej strony końcówki pipety podczas powolnego przenoszenia objętości.
2. Przygotuj kropelki (krok 4). Jeżeli charakteryzowane są również mikropęcherzyki, należy zebrać niewielką objętość mikropęcherzyków o wybranej wielkości przed kondensacją (krok 4.9).
3. Zwymiaruj mikropęcherzyki lub kropelki na liczniku redlic (CC) od 0,2 do 6 μm, aby uzyskać rozkład wielkości i stężenia (Rysunek 4).
   1. Napełnij czystą kuwetę o pojemności 20 ml 10 ml elektrolitu CC, który został przefiltrowany przez filtr membranowy z polieterosulfonu o średnicy 0,2 μm. Zmierz to na CC z trzema przebiegami, aby uzyskać linię bazową.
   2. Do tego samego elektrolitu CC dodać 5 μl próbki mikropęcherzyków lub kropelek i delikatnie wymieszać.
      UWAGA: Można dodać od 2 do 20 μl próbki w zależności od stopnia koncentracji próbki.
   3. Uruchom próbkę na CC (3 serie), odejmij uśrednioną linię bazową i oblicz rozkład wielkości i stężenie (liczba na ml).
4. Zmierz absorbancję kropel za pomocą spektroskopii UV-Vis (Rysunek 5).
   UWAGA: Rysunek 5 pokazuje tylko 30% preparat pirolipidowy.
   1. W spektrofotometrze UV-Vis ustaw pomiar absorbancji jako długości fal od 800 nm do 300 nm z przyrostem co 0,5 nm i włącz korekcję linii bazowej.
   2. Używając czystej kuwety o długości ścieżki 1 cm wypełnionej PBS, wykonaj pomiar podstawowy. Upewnij się, że objętość jest wystarczająco duża, aby przeciąć ścieżkę wiązki spektroskopu.
   3. Rozcieńczyć kropelki pirolipidów do PBS (zaleca się od 2 μl do 500 μl kropelek w 2000 μl rozcieńczalnika) i wymieszać pipetując.
      UWAGA: NIE WOLNO wirować, w przeciwnym razie zespoły zostaną zniszczone.
   4. Przenieś rozcieńczone kropelki do oczyszczonej kuwety i zmierz absorbancję. W razie potrzeby zmienić rozcieńczenia.
   5. Powtórz kroki od 5.4.1 do 5.4.4, ale użyj 1% Triton zamiast PBS. Po rozcieńczeniu przenieść próbkę do szczelnie zamkniętej/zasklepionej fiolki i wirować przez 30 s przed pomiarem.
5. Zmierz fluorescencję mikropęcherzyków lub kropelek (Rysunek 6).
   UWAGA: Rysunek 6 pokazuje tylko 30% preparat pirolipidowy.
   1. Na spektrofotometrze fluorescencyjnym ustaw długość fali wzbudzenia na 410 nm, a zakres długości fali emisji od 600 do 750 nm z przyrostami co 1 nm.
   2. Zmierz fluorescencję rozcieńczalnika PBS, aby uzyskać linię bazową za pomocą kuwety kompatybilnej ze spektrofotometrem fluorescencji.
   3. Rozcieńczyć mikropęcherzyki lub kropelki pirolipidów w PBS (zaleca się od 0,5 μl do 10 μl kropelek w 2000 μl rozcieńczalnika) i wymieszać pipetując.
      UWAGA: NIE WOLNO wirować, w przeciwnym razie zespoły zostaną zniszczone.
   4. Przenieść rozcieńczoną próbkę do oczyszczonej kuwety z podstawą i zmierzyć fluorescencję. W razie potrzeby zmień rozcieńczenia i unikaj nasycenia sygnału.
   5. Powtórz kroki od 5.5.1 do 5.5.4, ale użyj 1% Triton zamiast PBS. Po rozcieńczeniu w 1% Tritonie, przenieść rozcieńczoną próbkę do szczelnie zamkniętej/zasklepionej fiolki i wirować przez 30 s przed pomiarem. Dodaj wystarczającą objętość, aby pęcherzyki powstałe w wyniku wirowania znajdowały się powyżej ścieżki lasera.
      UWAGA: Sygnał fluorescencji próbki w Tritonie będzie znacznie wyższy niż w PBS ze względu na niewygaszenie fluorescencji (Rysunek 6).

6. Obrazowanie waporyzacji

1. Napełnij zbiornik na wodę o odpowiedniej wielkości wodą dejonizowaną i pozwól mu odpocząć przez 24 godziny, aby zrównoważyć gazy w wodzie z atmosferą.
2. Przygotuj kropelki i trzymaj na lodzie i w ciemności aż do użycia.
3. Wykonaj probówkę przepływową z 2% agaru, zgodnie z opisem Pellow et al.¹⁸ Zanurz fantom w zbiorniku na wodę podgrzaną do 37 °C.
4. Rozgrzać PBS do temperatury 37 °C i przepłynąć przez fantom.
5. Za pomocą przedklinicznego systemu ultrasonograficznego i przetwornika liniowego 21 MHz (patrz Tabela materiałów) wyrównaj widok do fantomu przepływu, ustaw go na obrazowanie w trybie B, ustaw ciśnienie wyjściowe i zarejestruj filmy lub obrazy, aby uzyskać linie bazowe przy każdym ciśnieniu.
6. Rozcieńczyć 20 μl kropli w 50 ml PBS o temperaturze 37 °C i delikatnie wymieszać. Przenieść roztwór do plastikowej strzykawki o pojemności 30 ml i przepchnąć roztwór przez fantom agaru.
7. Zachowując to samo wyrównanie co w kroku 6.5, zwiększaj ciśnienie wyjściowe, aż do momentu zaobserwowania parowania (jasne plamki na fantomie, patrz Rysunek 7).
   UWAGA: Rysunek 7 pokazuje 30% próbkę kropelki pirolipidów. Ten dostępny na rynku przetwornik liniowy 21 MHz jest zdolny zarówno do obrazowania, jak i odparowywania kropel.

Wyniki

Wstępnie skondensowane, wybrane próbki mikropęcherzyków (n = 3) i próbki kropelek po skondensowaniu (n = 3) zostały zwymiarowane na liczniku Coulter (CC) z aperturą 10 μm. Ograniczeniem apertury 10 μm jest to, że nie może ona mierzyć cząstek mniejszych niż 200 nm, co może wpływać na średnią wielkość i stężenie. Rysunek 4 pokazuje dane dotyczące rozmiarów dla każdego z preparatów o zawartości pirolipidów. Tabela 1 przedstawia statystyki oparte na danych dotyczących rozmiaru. Wykorzystując stosunek średnich średnic przed i po skondensowaniu, wyniki wykazały, że preparat 0% Pyro-lipid miał najmniejsze przesunięcie średniej średnicy na poziomie 1,72 ± 0,02. Preparat 50% Pyro-lipid miał największą średnią średnicę wynoszącą 2,38 ± 0,08. Próbka 1% kropelki pirolipidu miała najwyższe obserwowane stężenie (2,71 ± 0,13) × 10¹⁰ / ml, podczas gdy próbka kropelki 40% pirolipidu miała najniższe obserwowane stężenie (7,36 ± 0,81) × 10⁹ / ml. Dane dotyczące rozmiaru wykazały, że próbka kropelki 10% pirolipidów miała najmniejszy średnicę piku przy 261 ± 13 nm, podczas gdy próbka kropelki 50% pirolipidów miała największą przy 390 ± 55 nm. Ogólnie rzecz biorąc, wraz ze wzrostem zawartości pirolipidów, stężenie zmniejszało się, a średnia średnica wzrastała. Ze względu na to, że próbki po zagęszczeniu są oparte na prekursorowej próbce mikropęcherzyków, tendencja wystąpiła w przypadku obu rodzajów ultrasonograficznych środków kontrastowych. Wraz ze wzrostem zawartości pirolipidów zaczęła tworzyć się subpopulacja mikropęcherzyków (o wielkości piku około 2000 μm). Ten drugorzędowy pik nie był obecny w 0% próbce mikropęcherzyków pirolipidowych i najbardziej widoczny w populacjach 40% i 50% pirolipidów.

Rysunek 5 pokazuje reprezentatywne pomiary absorbancji próbki 30% kropelki pirolipidu. Pik nienaruszonej próbki w PBS wynosił 700 nm, podczas gdy zakłócona próbka w Tritonie przesunęła pik do 671 nm. Okazało się, że nienaruszone zespoły mają różne właściwości optyczne w porównaniu z pojedynczymi, niezmontowanymi składnikami lipidowymi.

Rysunek 6A pokazuje reprezentatywne pomiary fluorescencji wstępnie skondensowanej próbki mikropęcherzyków, podczas gdy Rysunek 6B pokazuje próbkę po skondensowaniu kropli z 30% pirolipidu. Nienaruszona próbka w PBS miała pik fluorescencji przy 704 nm, podczas gdy zakłócona forma miała pik przy 674 nm. Odjęcie zakłóconego obszaru pod krzywą z nienaruszonym obszarem pod krzywą i podzielenie różnicy przez zakłócony obszar pod krzywą daje skuteczność hartowania, która wynosi odpowiednio 98,61% i 98,07% dla 30% próbki mikropęcherzyków pirolipidowych i próbki kropelk.

Aby zademonstrować przekształcanie kropelek w mikropęcherzyki, rozcieńczone kropelki zostały zobrazowane i odparowane w fantomie przepływu o temperaturze 37 °C za pomocą systemu ultradźwiękowego. Rysunek 7 pokazuje reprezentatywne obrazy ultrasonograficzne próbki 30% kropelki pirolipidu, zobrazowane przy różnych ciśnieniach. Przy niskich ciśnieniach (Rysunek 7A) sygnał był bardzo słaby, tylko sygnał tła z pęcherzyków powietrza, które utknęły w wyniku syntezy agaru. Dzieje się tak, ponieważ kropelki są nieechogeniczne i nie rozpraszają ultradźwięków. Przy nieco dużej mocy wygenerowano kilka mikropęcherzyków (Rysunek 7B), co pokazuje pojawienie się jasnych plamek. Wraz ze wzrostem ciśnienia generowano więcej mikropęcherzyków (Rysunek 7C i 7D). Wykazano również, że kropelki nie odparowują spontanicznie w temperaturze 37 °C.

Rysunek 1: Obrazy etapów tworzenia 30% roztworu pirolipidowego. A) Lipid w proszku plus Pyro-SPC w chloroformie. B) Dodano roztwór rozpuszczający. C) Folia lipidowa wysuszona i pokryta na wewnętrznej ściance fiolki. D) Fiolka z lipidem owinięta w folię aluminiową (zewnętrzna folia zaklejona taśmą do ponownego użycia). E) Uwodniony roztwór lipidowy. F) Roztwór lipidów w fiolce surowicy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: 10-kolektorowy wymiennik gazowy. Zawory, o których mowa w protokole, są oznakowane. Zobacz plik uzupełniający "Inne protokoły i dane", aby uzyskać instrukcje dotyczące montażu wymiennika gazowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: A) Roztwory lipidów z 7 preparatów (0% do 50% Pyro-SPC) w fiolkach z próbkami. Rysunki od B do D pokazują obrazy kroków podjętych w celu wytworzenia 30% kropelek pirolipidów. B) 30% roztwór pirolipidowy w fiolce z próbką. C) Po agitacji. D) 15 min rozmiar do wyboru. E) Dolna przegroda przeniesiona do fiolki z dekafluorobutanem. D) Po kondensacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Dane dotyczące wielkości licznika redlic (CC) wybranych próbek mikropęcherzyków i kropel o różnej zawartości otoczki pirolipidowej (n = 3). Ciągłe zielone linie reprezentują mikropęcherzyki, a przerywane niebieskozielone linie reprezentują kropelki. a) 0% Piro-SPC. b) 1% Piro-SPC. c) 10% Piro-SPC. d) 20% Piro-SPC. E) 30% Piro-SPC. f) 40% Piro-SPC. g) 50% Piro-SPC. H) Całkowite zaobserwowane stężenia próbek mikropęcherzyków i kropelek z CC w oparciu o zawartość Pyro-SPC w skorupie. Wszystkie słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Wszystkie pomiary zostały wykonane przy użyciu apertury 10 μm, która ma zakres wielkości od 200 nm do 6000 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Reprezentatywne pomiary absorbancji spektroskopii ultrafioletowo-widzialnej (UV-Vis) od 300 do 800 nm postkondensowanej próbki kropelki 30% pirolipidu rozcieńczonej w PBS i w 1% Tritonie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Reprezentatywna emisja fluorescencji od 600 do 750 nm wzbudzona przy 410 nm. A) Dobrana pod względem wielkości, wstępnie skondensowana 30% próbka mikropęcherzyków pirolipidowych w PBS i w 1% Triton. B) Postskondensowana 30% próbka kropelki pirolipidów w PBS i w 1% Triton. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Reprezentatywne obrazy ultrasonograficzne fantomu przepływu agaru o temperaturze 37 °C wykonane za pomocą przedklinicznego przetwornika liniowego 21 MHz w trybie B (patrz Tabela Materiałów). Lewa kolumna (rysunki A, C, E i G) przedstawia kontrolki PBS. Prawa kolumna (rysunki B, D, F i H) pokazuje 20 μl postskondensowanej 30% próbki kropelek pirolipidów rozcieńczonej w 50 ml PBS o temperaturze 37 °C. Każdy wiersz reprezentuje szczytowe ujemne ciśnienia w polu swobodnym, które zostały oszacowane na podstawie pracy wykonanej przez Sheerana i wsp.⁸ Żółte trójkąty wskazują głębokość ostrości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział

metoda	agent	Pocisk Pyro %	0	1	10	20	Rozdział 30	Rozdział 40	50
DW	Pęcherzyki	Zawartość [/mL]	(2,76 ± 0,28) × 10^10	(3,04 ± 0,15) × 10^10	(2,02 ± 0,11) × 10^10	(1,91 ± 0,22) × 10^10	(1,47 ± 0,05) × 10^10	(8,47 ± 0,95) × 10^9	(9,89 ± 0,15) × 10^9
DW	Pęcherzyki	Wartość szczytowa [nm]	329 ± 6	297 ± 15	305 ± 21	273 ± 14	310 ± 40	266 ± 33	393 ± 89
DW	Pęcherzyki	Średnia [nm]	609 ± 2	603 ± 15	635 ± 6	690 ± 8	812 ± 1	935 ± 22	od 950 ± 55
DW	Pęcherzyki	Mediana [nm]	450 ± 6	421 ± 6	414 ± 6	432 ± 5	490 ± 2	596 ± 37	695 ± 41
DW	Kropelki	Zawartość [/mL]	(2,18 ± 0,07) × 10^10	(2,71 ± 0,13) × 10^10	(1,75 ± 0,18) × 10^10	(1,72 ± 0,13) × 10^10	(1,09 ± 0,01) × 10^10	(7,36 ± 0,81) × 10^9	(7,38 ± 0,28) × 10^9
DW	Kropelki	Wartość szczytowa [nm]	292 ± 0	297 ± 17	261 ± 13	280 ± 9	268 ± 17	287 ± 38	390 ± 55
DW	Kropelki	Średnia [nm]	353 ± 5	350 ± 5	347 ± 1	347 ± 4	397 ± 1	399 ± 6	400 ± 7
DW	Kropelki	Mediana [nm]	318 ± 4	318 ± 4	310 ± 1	315 ± 2	340 ± 0	367 ± 5	370 ± 9

Tabela 1: Statystyki danych wymiarowania próbek mikropęcherzyków i kropel o różnej zawartości Pyro-SPC z licznika Coulter (CC) (n = 3). Wszystkie błędy wskazują na odchylenie standardowe.

Informacje uzupełniające - Arkusz Formuł Lipidowych: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Informacje uzupełniające - Inne protokoły i dane: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Po dodaniu wszystkich składników lipidowych razem (kroki 1.2 i 1.4.5, rysunek 1A), dodano roztwór chloroformu i metanolu (oraz wody, jeśli obecne są lipidy kwasu fosfatydowego, takie jak DSPA), aby upewnić się, że składniki lipidowe pirolipidowe i niepirolipidowe były w pełni homogenizowane (krok 1.5, rysunek 1B). Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków lipidowych o niejednorodnym składzie lipidowym, rozpuszczone lipidy wysuszono i pokryto wnętrzem ścianki fiolki w postaci cienkiego filmu (ryc. 1C). Powłoka (krok 1.6) ułatwia również nawilżanie (kroki 2.1 do 2.4), ponieważ zwiększa powierzchnię wysuszonej folii. Suszenie (Krok 1.6, Rysunek 1C) i odkurzanie (Krok 1.8, Rysunek 1D) przeprowadzono w celu zapewnienia całkowitego odparowania chloroformu i metanolu, ponieważ te chemikalia mogą zakłócać tworzenie się mikropęcherzyków. Podczas gdy protokół można zmniejszyć, aby objętość roztworu lipidowego wynosiła zaledwie 1 ml, większe objętości mogą zmniejszyć różnice między fiolkami. Chociaż może to wiązać się z ryzykiem degradacji Pyro-SPC, gdy nie jest używany, warunki przechowywania roztworu lipidowego (kroki od 2.9 do 2.10) miały na celu zmniejszenie tego ryzyka. Etap odgazowywania za pomocą wymiennika gazowego (krok 2.9.2, rysunek 1F i rysunek 2) służy do wyeliminowania jak największej ilości tlenu, aby zapobiec utlenianiu. Nie zaleca się przechowywania roztworów lipidów zawierających lipidy porfirynowe, gdy gazy atmosferyczne są nadal rozpuszczone w roztworze (ryc. 1E).

W kroku 2.10 roztwór lipidów znajduje się w fiolce surowicy z ciśnieniową przestrzenią nad głową, podobnie jak sprzedawane są klinicznie zatwierdzone ultradźwięki kontrastowe mikrosfery lipidowe perflutren (podobnie jak na rycinie 1F). Prace wewnętrzne wykazały, że stabilne mikropęcherzyki nie mogą być generowane przez mechaniczne mieszanie z obecnością pirolipidów, jeśli nasadka jest miękka z materiału, takiego jak gumowy korek. W związku z tym roztwór lipidów przeniesiono do fiolki z próbką z niegumową nasadką fenolową (kroki 4.1 do 4.4, ryc. 3A i 3B). Gdy dekafluorobutan został wpłynęty do fiolki z próbką (kroki 4.1 do 4.4), gęstszy dekafluorobutan powinien wyprzeć powietrze atmosferyczne w przestrzeni nad fiolką z próbką. Obecnie nie wiadomo, dlaczego pirolipidy nie są w stanie tworzyć mikropęcherzyków za pomocą gumowych korków. Bez pirolipidów, stabilne mikropęcherzyki mogą być wytwarzane bezpośrednio w fiolkach z surowicą z gumowymi korkami ^4,7. W związku z tym zaleca się użycie wymiennika gazowego do odgazowania i ponownego zwiększenia ciśnienia w fiolce surowicy, a następnie poruszenia samej fiolki surowicy w przypadku preparatów niezawierających pirolipidów 4,5,6,7 (patrz "Inne protokoły i dane"). Zaletą możliwości mechanicznego mieszania w fiolce z surowicą jest to, że przestrzeń nad surowicą może być pod ciśnieniem, a wybór wielkości można dokonać, odwracając fiolkę z surowicą do góry nogami⁸. W tym protokole preparat 0% pirolipidów przeniesiono do fiolki z próbką (kroki 4.1 do 4.4), aby zachować spójność z preparatami, które zawierały pirolipidy. Dodatkowo, dłuższe łańcuchy lipidów acylowych skutkują bardziej stabilnymi kropelkami ze względu na lepsze interakcje van der Waalsa¹⁹. Skład otoczki lipidowej został wybrany na podstawie tego, co było dostępne na rynku, długości łańcucha 18-acylowego dla wszystkich typów lipidów. DSPE-PEG5K został włączony do całego preparatu (Krok 1.1), ponieważ obecność łańcuchów glikolu polietylenowego zapobiega koalescencji struktur poprzez odpychające siły steryczne¹⁹. Podczas hydratacji lipidów, kąpiel sonitora do kąpieli została ustawiona na 70 °C (Krok 2.1) jako wystarczająco wysoką, aby w pełni rozproszyć film lipidowy o długości łańcucha^{18-acylowego 18}. W przypadku dłuższych łańcuchów acylowych wymagane będą wyższe temperatury.

Wyższe obciążenie pirolipidami zwiększyłoby stężenie składników optycznie absorbujących i fluoryzujących, co może być pożądane w przypadku niektórych zastosowań, które korzystają z maksymalnego obciążenia porfiryną. Jednak wraz ze wzrostem zawartości pirolipidów obserwowane stężenie kropelek zmniejszało się, a średnice zwiększały się (ryc. 4 i tabela 1). Ilustruje to kompromis między właściwościami fluorescencji optycznej i absorbancji a stężeniem i średnicą kropel. Dla badaczy, którzy muszą priorytetowo traktować małe średnice do akumulacji in vivo przez małe nieszczelne naczynia lub jeśli konieczne jest wstrzyknięcie wysokiego stężenia kropel, zwiększenie obciążenia pirolipidami może nie być warte wzrostu średnicy kropli lub spadku stężenia kropel. Jeżeli duże stężenie kropel i/lub małe średnice kropel mają zasadnicze znaczenie, należy rozważyć zastosowanie towarzyszących środków diagnostycznych o podobnej wielkości zamiast pirolipidów. Podczas gdy 1% kropelki pirolipidów nie spowodowały zmniejszenia stężenia ani zwiększenia wielkości, 1% obciążenia pirolipidami może być zbyt niskie, aby można je było rozsądnie wykryć fluorescencyjnie na tle tkanki. Jednak elastyczność ugrupowania porfiryny zapewnia wiele opcji funkcjonalizacji, które zapewnią alternatywne sposoby oznaczania ilościowego, bardziej odpowiednie do zastosowań o niskim stężeniu. Na przykład pirolipidy mogą być chelatowane miedzią-64 do obrazowania metodą pozytonowej tomografii emisyjnej i zliczaniem promieniowania^{gamma 20} lub palladem do oznaczania ilościowego metali śladowych za pomocą spektrometrii mas lub manganem do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego¹⁴.

Podczas gdy niektóre eksperymenty mogą wymagać tylko niewielkiej objętości roztworu kropelkowego, 1 ml roztworu lipidowego jest potrzebny do napełnienia fiolki z próbką o pojemności 1,85 ml. Goertz i wsp. wykazali, że zmiany w obsłudze, ciśnieniu w przestrzeni nad głową, stosunku cieczy do gazu, a nawet kształtu fiolki mogą wpływać na populacje mikropęcherzyków¹⁷. Temperatura fiolki podczas mieszania i wyboru wielkości może również wpływać na rozkład wielkości. Dlatego w przypadku metod optymalizowanych przez użytkownika końcowego ważne jest, aby być jak najbardziej konsekwentnym podczas tworzenia kropel. Nieotwarte kropelki mogą zostać zamrożone (-20 °C) i rozmrożone później do wykorzystania w przyszłości, ale będzie to miało wpływ na populacje wielkościowe.

Procedura mieszania, która aktywuje roztwór lipidowy w mikropęcherzyki, nie wytwarza morfologicznie jednorodnej populacji (etap 4.6); Zamiast tego próbka jest wypełniona mikropęcherzykami, pęcherzykami wielopłytkowymi, liposomami i micelami 18,21,22^. Podczas gdy rozmiary mikropęcherzyków obejmują zakres mikronów i nanometrów, inne struktury są w dużej mierze poniżej 800 nm ²³. Zastosowane techniki sortowania nie pozwalają na rozróżnienie między tymi różnymi strukturami, a zatem próbki mikropęcherzyków po zmieszaniu (etap 4.6, rysunek 3C) i próbki kropel po skondensowaniu (etap 4.14, rysunek 3F) należy przyjąć jako mieszaniny. Zespoły niewrażliwe na ultradźwięki (pęcherzyki wielopłytkowe, liposomy i micele) są prawdopodobnie zachowane po kondensacji i nie zmienią rozmiaru, ponieważ nie mają rdzeni zmiennofazowych. Ponieważ licznik Coultera nie jest w stanie rozróżnić tych różnych zespołów supramolekularnych, zmiana wielkości populacji po kondensacji powinna być interpretowana przy założeniu, że pewna część struktur w nanoskali jest niekonwertowalna i przyczynia się do obserwowanej populacji w tym obszarze wielkości. Dodatkowo struktury te przyczyniają się do spektroskopowych i fluorescencyjnych sygnatur tych próbek¹⁴. Sygnatury fluorescencji i absorbancji miceli, liposomów/pęcherzyków i kropelek są podobne, w tym ich stopień wygaszania fluorescencji¹⁴. Dlatego ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że istnieje mieszanina zespołów na rysunkach od 3C do 3F, rysunek 4, rozcieńczona próbka PBS na rysunku 5 i rozcieńczona próbka PBS na rysunku 6.

Po wybraniu wielkości i przed kondensacją (krok 4.9) możliwe jest wyeliminowanie zespołów niepęcherzykowych poprzez odwirowanie próbki mikropęcherzyków w celu oddzielenia pęcherzyków pływających od zespołów bez pływalności, jak opisano przez Feshitana i ^wsp.21 Stopień separacji można kontrolować, dostosowując siłę wirowania i czas trwania. Jednak eksperymenty z kondensacją mikropęcherzyków takich odizolowanych próbek ujawniły, że użycie większych populacji mikropęcherzyków prekursorowych, które są wybierane przy użyciu procedur izolacji wielkości, dało większe kropelki (patrz "Inne protokoły i dane" Krok S5 dla wielkości pęcherzyków i kropel po odwirowaniu). Ponieważ zamierzonym zastosowaniem kropelek wytwarzanych za pomocą tego protokołu jest platforma do biernego wynaczynienia i akumulacji ze względu na ich mały rozmiar w porównaniu z mikropęcherzykami ^4,8, pożądane było jak najmniejsze populacje kropel. W związku z tym w protokole tym wykorzystano próbki mikropęcherzyków po zmieszaniu, które nie zostały wyizolowane przez wirowanie, nawet jeśli oznaczało to, że w końcowym roztworze obecne były niewrażliwe na ultradźwięki miceli, liposomy i pęcherzyki. Oznacza to, że procedury kwantyfikacji biodystrybucji będą generować sygnał dla wszystkich wstrzykniętych struktur i nie ograniczają się tylko do kropel. Ponieważ jednak te struktury o podobnej wielkości najprawdopodobniej kumulują się za pomocą mechanizmu pasywnego, który jest przede wszystkim podyktowany rozmiarem, nie podejrzewa się, że powinno to zmienić główne wnioski, które można wyciągnąć, jeśli platforma ta ma być wykorzystywana in vivo, chociaż wszystkie te aspekty powinny być rozpatrywane indywidualnie w zależności od kontekstu, w którym platforma może być używana. Testy z użyciem ramion eksperymentalnych z ultradźwiękami i bez nich można przeprowadzić, aby upewnić się, że to wrażliwe na ultradźwięki kropelki są odpowiedzialne za wszelkie zmiany w dystrybucji biologicznej, ponieważ tylko zespoły rdzeni perfluorowęglowych w roztworze będą reagować na ultradźwięki.

Po wstrząśnięciu fiolkę odstawiano na 15 minut i zaobserwowano przegrodę w fiolce (ryc. 3C w porównaniu z 3D). Selekcja wielkości za pomocą wyporu jest prostą metodą eliminacji większych struktur/pęcherzyków z aktywowanego roztworu mikropęcherzyków ^8,17. W tym przypadku cząstki o średnicach większych niż 5 μm zostały w większości usunięte po wybraniu wielkości (ryc. 4). Zakres wyboru rozmiaru można dostosować, kontrolując czas trwania wyboru rozmiaru¹⁷. Sheeran i wsp. wykazali, że brak wyboru rozmiaru może powodować powstawanie mikropęcherzyków, które zamykają naczynia krwionośne⁸.

Perfluorowęglowodory mają tę zaletę, że są biologicznie obojętne⁷. Podczas gdy temperatura wrzenia dekafluorobutanu wynosi -1,7 °C, powyżej temperatury ciała, kropelki nie parują natychmiast po wystawieniu na działanie 37 °C (ryc. 7B). Ponieważ kropelki są metastabilne w temperaturze 37 °C, do odparowania kropelek do postaci mikropęcherzyków^potrzebna jest dodatkowa energia akustyczna ^7,9. Poproski i wsp. wykazali kropelki porfiryny skondensowane przez zwiększenie ciśnienia²². Jest to opłacalna, a nawet niezbędna metoda w przypadku stosowania mniej gęstych perfluorowęglowodorów, ale wysokie ciśnienie może zniszczyć niektóre pęcherzyki w tym procesie. Oktafluoropropan (_C3F₈) ma temperaturę wrzenia -36,7 °C, więc do kondensacji kropel potrzebne jest zarówno chłodzenie, jak i zwiększanie ciśnienia. Jednak lżejszy perfluorowęglowodór prowadzi do mniej stabilnych kropel. Dodekafluoropentan (C_{, 5}, F_{, 12}) może prowadzić do bardziej stabilnych kropelek o temperaturze wrzenia 28 °C. Jest to jednak ciecz w temperaturze pokojowej i będzie potrzebowała silniejszych energii akustycznych do odparowania. W związku z tym przy wyborze gazu, w którym znajduje się ultradźwiękowy środek kontrastowy, oprócz parametrów jego wytwarzania, należy wziąć pod uwagę warunki jego zamierzonego zastosowania biologicznego. W tym protokole kąpiel izopropanolowa do kondensacji została ustawiona na -15 do -17 °C (krok 4.7.1 i krok 4.13), podczas gdy inne protokoły używały -10 °C ^5,6. Nawet w przypadku zwykłego rdzenia dekafluorobutanowego temperatura skraplania może się różnić w zależności od składu substancji pomocniczej, całkowitego stężenia lipidów i składu otoczki lipidowej. W przypadku stosowania innych preparatów może być wymagana optymalizacja, aby zapewnić prawidłową kondensację kropel bez powodowania zamarzania roztworu.

Ponieważ kropelki są mniejsze i bardziej stabilne niż ich prekursor^{mikropęcherzyków 7}, mogą lepiej wykorzystać mechanizmy pasywnej akumulacji do wynaczynienia do niektórych tkanek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak zwiększona przepuszczalność i efekt retencji niektórych typów nowotworów ^4,24. Dzięki fluorescencyjnym, optycznie absorbującym i akustycznym metodom detekcji¹⁴ możliwe jest użycie jednego preparatu do ilościowego określenia absorpcji. Ponadto platforma ta może być wykorzystana do zbadania, czy akustyczne odparowanie kropelek może poprawić frakcję dostarczanego czynnika powyżej pasywnych^{poziomów 16}. Aby określić ilościowo biodystrybucję czynnika w tkankach i narządach będących przedmiotem zainteresowania po wstrzyknięciu, należy wstrzyknąć zwierzęciu znaną ilość kropelek pirolipidów, ultradźwięki mogą być stosowane lub nie, w zależności od zestawu kontrolnego, zwierzę powinno zostać uśmiercone w określonym wcześniej punkcie czasowym, a narządy powinny zostać usunięte i zważone. Narządy powinny być homogenizowane, filtrowane, rozcieńczane w środkach powierzchniowo czynnych (detergentach) w celu decelularyzacji tkanki i oznaczane ilościowo za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej lub UV-Vis w celu uzyskania procentowej dawki wstrzykniętej na masę narządu w oparciu o sygnały Pyro. W Kroku 5.4.5 (Rysunek 5) i Kroku 5.5.5 (Rysunek 6) do rozerwania próbek użyto środka powierzchniowo czynnego Triton X-100 (detergentu), ponieważ jest on niefluorescencyjny przy długości fali 410 nm, a jego długości fal absorbancji nie pokrywają się z falami Pyro.

Mikropęcherzyki nie charakteryzowały się absorbancją UV-Vis. Ponieważ źródło lasera spektroskopu UV-Vis jest ustawione równolegle do detektora, wszelkie duże pęcherzyki mogą rozpraszać światło z dala od detektora, sprawiając, że wydają się bardziej absorbujące optycznie¹⁴. W przeciwieństwie do spektrofotometru UV-Vis, detektor spektrofotometru fluorescencyjnego jest/powinien być prostopadły do źródła lasera, aby zapobiec zakłóceniom źródła z detektorem. UV-Vis wykorzystano do ilościowego określenia absorbancji nienaruszonych i rozerwanych próbek kropel (Krok 5.4, Rysunek 5). Jako długości fal absorbancji wybrano od 300 do 800 nm, ponieważ dwa główne pasma absorbancji pirolipidów, pasmo Soreta (340 do 500 nm) i pasmo Q (640 do 730 nm), mieszczą się w tym zakresie¹⁴. Po złożeniu w kropelkę (lub inne struktury supramolekularne) pik pirolipidu w paśmie Q jest przesunięty ku czerwieni z 671 nm do 700 nm (ryc. 5). Kiedy ta supramolekularna struktura zostaje zakłócona przez środek powierzchniowo czynny, taki jak Triton, pik przesuwa się z powrotem do 671 nm^14,15. Na podstawie tego przesunięcia można stwierdzić, czy pirolipidy są w stanie złożonym, czy w stanie zakłóconym. Stosunek dwóch pików można wykorzystać do oszacowania rozpadu zespołów w czasie.

Do pomiarów fluorescencji (krok 5.5, rysunek 6) wybrano długość fali wzbudzenia 410 nm, ponieważ odpowiada ona pikowi pasma Soreta dla niezmontowanego pirolipidu¹⁴. Wybrano zakres długości fali emisji od 600 do 800 nm, ponieważ piki nienaruszonych zespołów w PBS i rozerwanych pirolipidów w Trytonie znajdują się w tym zakresie. Przesunięcie i wzrost fluorescencji (ryc. 6) między próbkami nienaruszonymi (704 nm w PBS) a zakłóconymi (674 nm w Trytonie) nastąpiły z powodu wygaszania wywołanego strukturą. W zmontowanej formie cząsteczki pirolipidów były upakowane blisko siebie, więc wygenerowane fotony zostały wchłonięte przez pobliskie cząsteczki pirolipidów. Jest to widoczne w nienaruszonej i zakłóconej wydajności hartowania. W związku z tym konieczne jest rozcieńczenie próbek w środku powierzchniowo czynnym (detergencie), takim jak 1% Triton X-100, aby złagodzić hartowanie i zmaksymalizować sygnał do ilościowego oznaczania biodystrybucji¹⁴.

Dla uproszczenia, ten sam liniowy przetwornik ultradźwiękowy został użyty zarówno do waporyzacji, jak i obrazowania (kroki 6.5 i 6.7, rysunek 7). Ten przetwornik ultradźwiękowy (Tabela Materiałów) był w stanie osiągnąć niezbędne szczytowe podciśnienia potrzebne do odparowania kropel⁸. Napełnianie zbiornika wodą dejonizowaną z kranu generuje gazy, które rozpuszczają się w wodzie (krok 6.1). Aby zminimalizować zakłócenia powodowane przez rozpuszczone gazy w wodzie podczas parowania i obrazowania, woda odpoczywała przez 24 godziny w zbiorniku, aby umożliwić gazom w wodzie zrównoważenie się z atmosferą (krok 6.1). Alternatywnie, woda dejonizowana może być odgazowana za pomocą wystarczająco dużego, zamykanego pojemnika podłączonego do wystarczająco silnej próżni. Obrazy ultrasonograficzne wykazały, że mikropęcherzyki zostały pomyślnie zagęszczone, ponieważ kropelki były nieobserwowalne/nieechogeniczne przy niskich ciśnieniach (ryc. 7B). Dopiero przy wyższych ciśnieniach wyjściowych kropelki odparowywały w obserwowalne, echogeniczne mikropęcherzyki (Rysunek 7D, 7F, 7H). Podczas gdy próbka po skondensowaniu kropelki zawiera micele i liposomy / pęcherzyki, zespoły te są nieechogeniczne i tylko kropelki mogą odparować do echogennych mikropęcherzyków. Kontrola PBS została przepuszczona przez fantom w celu ustalenia obrazów wyjściowych (ryc. 7A, 7C, 7E, 7G). Wraz ze wzrostem ciśnienia w PBS nie generowano żadnego kontrastu. Wskazywało to, że wysokie ciśnienie z przetwornika nie mogło wywołać spontanicznej kawitacji w samym ośrodku na bazie wody, a zatem cały inny wygenerowany kontrast można przypisać zastosowanemu ultradźwiękowemu środkowi kontrastowemu. Jeśli ciśnienie wyjściowe jest zbyt wysokie, wytworzone mikropęcherzyki mogą zostać zniszczone. Poprzez stopniowe zwiększanie ciśnienia i obserwację generowanego kontrastu, można znaleźć optymalne ciśnienie⁸. Okres półtrwania krążenia kropelek można określić w podobny sposób, odparowując kropelki w określonych odstępach czasu i obserwując kontrast generowany w czasie⁷.

Podsumowując, metodą kondensacyjną stworzono multimodalne kropelki przemiany fazowej o różnej zawartości pirolipidów. Wymiarowanie wykazało, że istnieje kompromis między obciążeniem pirolipidami a stężeniem mikropęcherzyków/kropel. Charakterystyki wykazały, że istniały różnice w nienaruszonych i zaburzonych formach zarówno pod względem absorbancji, jak i fluorescencji. Obrazowanie ultrasonograficzne wykazało, że kropelki były nieechogeniczne w temperaturze 37 °C i można je odparować do postaci echogenicznych mikropęcherzyków pod wystarczającym ciśnieniem. Charakterystyki wykazały również potencjał kropelek pirolipidów do zastąpienia towarzyszących środków diagnostycznych do testów biodystrybucji kropel lub akumulacji. Przyszłe prace będą dotyczyły progów waporyzacji w roztworze, stabilności w roztworze oraz czasu krążenia in vivo u nagich myszy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-5000] (sól amonowa)Avanti	Polar Lipids	880220	Znany również jako "DSPE-PEG5K"
1-stearoyl-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina	Avanti Polar Lipids	855775	Znany również jako "DSPC"
Folia aluminiowa	Dowolna marka
Uszczelki aluminiowe, Tear-Off	VWR	16171-840	Standardowe aluminium, średnica zewnętrzna 13 mm
Sonikator do kąpieli	Dowolna marka		Zdolny do  sonikacji i podgrzewania do 70 > C,
Fiolki z nakrętką Bio-Stor	Scientific	BS20NABP	Plastic, 2 ml z osłoną, z przezroczystymi
fiolkami na surowicę ze szkła borokrzemianowego	O-ring VWR	16171-285	3 ml, wewnętrzna średnica otworu 7 mm, zewnętrzna średnica otworu 13 mm
Fiolka na próbkę ze szkła borokrzemianowego z fenolową nakrętką	VWR	66011-020	1,85 mL, krótka forma, średnica zewnętrzna 12 mm, wysokość 35 mm, rozmiar
nakrętki 8-425Fiolka ze szkła borokrzemianowego z zakręcaną nakrętką	Dowolna marka		Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości
Chloroform	Dowolna marka
Licznik redlic Elctrolyte Diluent	Dowolna marka		Kompatybilny z Coulter Counter
Dekafluorobutan (C4F10)	FluoroMed	355-25-9
Woda dejonizowana	Dowolna marka
Suchy lód (dwutlenek węgla)	Dowolna marka
Analizator cząstek z dynamicznym rozpraszaniem światła (DLS)	Dowolna marka		Możliwość regulacji temperatury
Zaciskarka EZ 13 mm	Wheaton	W225302	13 mm Standardowe uszczelki aluminiowe
E-Z Decapper, 13 mm	Wheaton	W225352	13 mm Standardowe aluminiowe uszczelki
Spektrofotometr fluorescencyjny	Dowolna marka		Możliwość wzbudzenia od 400 do 600 i wykrywania emisji od 300 do 800 nm, detektor prostopadły do źródła
laseraKuweta kompatybilna ze spektrofotometrem fluorescencyjnym	Dowolna marka		Może pomieścić co najmniej 2 ml, zdolne do 300 do 800 nm, wszystkie cztery strony są  okna optyczne
Wymiennik gazowy	wykonany we własnym zakresie		Instrukcje montażu znajdują się w informacjach uzupełniających - "Inne protokoły i dane".
Szklane strzykawki	Dowolna marka		Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości
GLWR Custom Aperture Tube 10 um	Beckman Coulter	B42812	10 µ m otwór, kompatybilny z Beckman Coulter MultiSizer 4e
Glicerol	Dowolna marka
Izolowane pojemniki styrofaom z pokrywkami	Dowolna marka
Isopropanol	Dowolna marka
Korki gumowe do liofilizacji	VWR	71000-060	mm wewnętrzna średnica otworu, 13 mm zewnętrzna średnica otworu, 2-nożna, membrana chlorobutylowa
Membranowa pompa próżniowa	Sartorius Stedim	16694-1-60-06	Regulowane
ciśnienie Metalowe szczypce	Dowolna marka
Metanol	Dowolna marka
MS250 21 MHz Liniowy przetwornik ultradźwiękowy	VisualSonics		21 MHz, Zdolny do obrazowania w trybie B i nieliniowym.
Redlica		Beckman MultiSizer 4e	Możliwość sortowania od 0,2 i mikro; m do 6 i mikro; m
Nalgene Szybkoprzepływowe, sterylne, jednorazowe filtry próżniowe	Thermo Scientific	567-0010	Membrana polieterosulfonowa (PES), 0,1 i mu; m wielkość porów, objętość 1000 ml. Ponieważ Isoton II jest niesterylny, może wielokrotnie używać jednostek filtrujących
Igły, konwencjonalne	BD	305176	20 gauge, 1,5 cala długości
Azot	Dowolny marek		Upewnij się, że są zawory regulacyjne i rurki do kierowania przepływem. Konfiguracja będzie zależeć od marki i źródła.
Parafilm	Dowolna marka		Nazywana w protokole "folią woskową".
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Dowolna marka		Pipeta 1X, pH 7,4
	Dowolna marka		Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości
Końcówki do pipet	Dowolna marka		Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości
Plastikowe strzykawki	Dowolna marka		1 ml, 3 ml i 30 ml. Z połączeniami Luer Lock
Filtr membranowy z polieterosulfonu (PES)	Dowolna marka		0,2 i mikro; m wielkość porów
Glikol propylenowy	Dowolna marka
Pirofeoforbid sprzężony z 1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholiną	Wyprodukowano we własnym zakresie		Znany również jako "Pyro-SPC". Patrz "Informacje uzupełniające - Inne protokoły i dane" w celu syntezy.
Termometr	dowolnej marki		(od -20 do 100 stopni; C)
Triton X-100	Dowolna marka		Znany również jako "2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanol"
Ultraczysta woda	Dowolna marka		Typ 1 Czystość
Ultrafiolet– Spektrofotometr widzialny (UV-Vis)	Dowolna marka		Zdolny do absorbancji od 300 do 800 nm, rozdzielczość co najmniej 0,5 nm
Ultrafiolet– Spektrofotometr widzialny (UV-Vis) Kuweta kompatybilna, długość ścieżki 1 cm	Dowolna marka		Może pomieścić co najmniej 2 ml, zdolny do 300 do 800 nm
Eksykator próżniowy	dowolnej marki
Platforma obrazowania ultradźwiękowego Vevo 2100	VisualSonics		Przedkliniczny system obrazowania ultrasonograficznego
Vialmix	Bristol-Myers-Squibb		Nazywany w protokole "mieszadłem mechanicznym". Miesza przez 45 s.
Mikser Vortex	Dowolna marka