Synteza i charakterystyka multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej

Kimoon Yoo; Alexander Dhaliwal; Juan Chen; Paul S. Sheeran; Gang Zheng

doi:10.3791/62665

Artykuł metodologiczny

Synteza i charakterystyka multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62665

⸱

15 października 2021

Kimoon Yoo¹^,² , Alexander Dhaliwal¹^,² , Juan Chen¹ , Paul S. Sheeran³ , Gang Zheng¹^,²

¹Princess Margaret Cancer Centre, ²Department of Medical Biophysics, University of Toronto, ³Philips Healthcare

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole opisane są metody syntezy i charakterystyki kropel porfiryny o wielomodalnej przemianie fazowej.

Streszczenie

Krople zmiennofazowe to klasa ultradźwiękowych środków kontrastowych, które mogą przekształcić się w echogeniczne mikropęcherzyki in situ przy zastosowaniu wystarczającej energii akustycznej. Kropelki są mniejsze i bardziej stabilne niż ich odpowiedniki z mikropęcherzykami. Jednak tradycyjne ultradźwiękowe środki kontrastowe nie są możliwe do śledzenia poza pomiarami akustycznego sprzężenia zwrotnego, co utrudnia ilościowe określenie biodystrybucji lub akumulacji środka kontrastowego ex vivo. Naukowcy mogą być zmuszeni do polegania na fluorescencyjnych lub optycznie absorbujących towarzyszących cząstkach diagnostycznych, aby wywnioskować biodystrybucję. Celem tego protokołu jest wyszczególnienie etapów tworzenia multimodalnych kropel porfiryny zmiennofazowych przy użyciu metody kondensacji. Porfiryny to cząsteczki fluorescencyjne o wyraźnych pasmach absorbancji, które mogą być sprzężone z lipidami i włączane do kropelek w celu rozszerzenia wszechstronności kropel, umożliwiając bardziej solidną biodystrybucję przy zachowaniu właściwości akustycznych. Stworzono siedem preparatów o różnej zawartości lipidów porfirynowych i zasadowych w celu zbadania rozkładu wielkości mikropęcherzyków i kropel. W protokole opisano również charakterystyki odpowiednie dla struktur zawierających porfirynę, aby wykazać ich analityczną wszechstronność w roztworze. Wymiarowanie wykazało, że średnie średnice po skondensowaniu były od 1,72 do 2,38 razy mniejsze niż populacje prekursorów. Charakterystyka absorbancji wykazała, że nienaruszone zespoły miały pik w paśmie Q 700 nm, podczas gdy próbki zakłócone miały pik absorbancji przy 671 nm. Charakterystyka fluorescencji wykazała, że nienaruszone 30% zespołów porfirynowo-lipidowych zostało wygaszonych fluorescencyjnie (>97%), z odzyskiem fluorescencji osiągniętym po rozerwaniu. Waporyzacja akustyczna wykazała, że kropelki porfiryny są nieechogeniczne przy niższych ciśnieniach i mogą być przekształcane w echogeniczne mikropęcherzyki przy wystarczającym ciśnieniu. Charakterystyki te wskazują na potencjał kropelek porfiryny w eliminowaniu potrzeby stosowania absorbancji lub towarzyszących strategii diagnostycznych opartych na fluorescencji w celu ilościowego określenia biodystrybucji ultradźwięków środka kontrastowego do dostarczania lub zastosowań terapeutycznych in vivo lub ex vivo.

Wprowadzenie

Obrazowanie ultradźwiękowe to nieinwazyjna, niejonizująca forma obrazowania medycznego, która wykorzystuje fale akustyczne. Podczas gdy ultrasonografy są bardziej przenośne i mogą dostarczać obrazy w czasie rzeczywistym, obrazowanie ultrasonograficzne może cierpieć z powodu niskiego kontrastu, co utrudnia ultrasonografom niezawodne rozróżnienie podobnie echogenicznych cech patologicznych. Aby przeciwdziałać temu ograniczeniu, mikropęcherzyki mogą być wstrzykiwane do gospodarza w celu poprawy kontrastu naczyniowego. Mikropęcherzyki to mikronowe środki kontrastowe wypełnione gazem, które są silnie echogeniczne w stosunku do fal akustycznych i mogą zapewniać zwiększony kontrast naczyń¹^,². Powłoki i rdzenie gazowe mikropęcherzyków mogą być dostosowane do różnych zastosowań, takich jak obrazowanie, tromboliza, przepuszczalność błony komórkowej lub przejściowe otwarcie naczyń krwionośnych².

Wadą mikropęcherzyków jest ich krótki okres półtrwania. Na przykład, klinicznie dostępne mikrosfery lipidowe perflutren mają tylko okres półtrwania 1,3 minut³. W przypadku długich sesji obrazowania konieczne jest wielokrotne wstrzyknięcie mikropęcherzyków. Kolejną wadą mikropęcherzyków są ich duże średnice. Podczas gdy mikrosfery lipidowe perflutrenu mają średnicę około 1 do 3 μm, wystarczająco małe, aby krążyć w układzie krwionośnym, są zbyt duże, aby wynaczynić i pasywnie gromadzić się w tkankach będących przedmiotem zainteresowania, takich jak nowotwory⁴. Jedną ze strategii przezwyciężenia tych ograniczeń jest skondensowanie mikropęcherzyków rdzenia gazowego w mniejsze kropelki z ciekłym rdzeniem⁵^,⁶. Chociaż kropelki nie są echogeniczne w stanie ciekłym, mogą zostać odparowane do mikropęcherzyków po wystawieniu na działanie ultradźwięków o wystarczająco wysokim szczytowym podciśnieniu, odzyskując zdolność do zapewniania kontrastu. Pozwala to na wykorzystanie korzystniejszej farmakokinetyki małego ciekłego rdzenia, zachowując jednocześnie zdolność do zapewnienia kontrastu podczas insonacji i bez zmiany składu chemicznego⁴^,⁷.

Dekafluorobutan jest idealnym związkiem perfluorowęglowodorowym do przechodzenia fazowo między stanem gazowym a ciekłym^5,6^,⁷. Dekafluorobutan pozwala na kondensację mikropęcherzyków w kropelki przy samym obniżeniu temperatury, podczas gdy mniej gęste perfluorowęglowodory wymagają dodatkowego zwiększania ciśnienia⁵. Ta delikatna metoda minimalizuje niszczenie pęcherzyków podczas kondensacji⁷^,⁸^,⁹. Ponieważ ich rdzenie są płynne, kropelki są nieechogeniczne i niewidoczne dla ultradźwięków. Jednak przy zastosowaniu wystarczającej ilości energii akustycznej lub cieplnej, ciekłe rdzenie mogą odparować z powrotem do stanu gazowego, generując echogeniczne mikropęcherzyki⁸. Ta waporyzacja pozwala na kontrolę, kiedy i gdzie wytwarzać mikropęcherzyki.

Chociaż kropelki są przydatne do pasywnej akumulacji, waporyzacji in situ lub poprawy przepuszczalności komórek⁴, kropelki (i ich fragmenty) nie mogą być obrazowane ani określane ilościowo ex vivo. W związku z tym wymierne towarzyszące środki diagnostyczne, takie jak fluorescencyjne⁴^,¹⁰^,¹¹, cząsteczki magnetyczne¹², optycznie absorbujące środki¹³, są wykorzystywane jako analog do pomiaru dostarczania kropelek do tkanek będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład Helfield i in. zastosowali jednoczesną iniekcję fluorescencyjnych nanokulek do ilościowej oceny obrazu histologicznego narządów myszy, ponieważ kropelki nie mogły być wykryte fluorescencyjnie⁴. Wadą leków do diagnostyki w terapii towarzyszącej jest to, że śledzony składnik może działać niezależnie od kropli, w zależności od jej indywidualnego profilu farmakokinetycznego.

Na szczęście, powłokę mikropęcherzyków i kropelek można dostosować. Na przykład Huynh i wsp. zademonstrowali ultradźwiękowe środki kontrastowe z otoczkami porfirynowo-lipidowymi, tworząc multimodalne mikropęcherzyki¹⁴. Porfiryny to klasa związków organicznych o aromatycznej strukturze makrocyklicznej¹⁴^,¹⁵. Są optycznie chłonne, fluorescencyjne i mogą być chelatowane do szerokiej gamy metali do radioterapii, obrazowania opartego na radionuklidach lub kwantyfikacji na podstawie metali śladowych¹⁴. Jednym z przykładów porfiryny jest pirofeoforbid (Pyro). Poprzez sprzężenie Pyro z lipidami, włączenie Pyro-lipidów do mikropęcherzyków lub kropelek pozwala na ich obrazowanie i śledzenie za pomocą wielu modalności: akustycznie, fluorescencyjnie i poprzez absorbancję¹⁴. Ten multimodalny środek kontrastowy może być używany do śledzenia i ilościowego oznaczania akumulacji. Może to wyeliminować potrzebę stosowania towarzyszących środków diagnostycznych, ponieważ kwantyfikowalny składnik jest teraz sprzężony z powłoką, umożliwiając dokładniejsze kwantyfikowanie dostarczania¹⁶.

Tutaj nakreślony jest protokół tworzenia multimodalnych kropel porfiryny zmiennofazowej. Ponieważ ultrasonograficzne środki kontrastowe mogą być wykorzystywane jako platforma do dostarczania leków do tkanek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak nowotwory²^,⁴, rozszerzenie ich wykrywalności poza ultradźwięki może okazać się przydatne do ilościowego określenia skuteczności dostarczania. Celem tych kropelek jest dostarczenie możliwych do śledzenia ultradźwiękowych środków kontrastowych zdolnych do pasywnej akumulacji in vivo, parowania in situ i akustyki, a także z potencjałem do ilościowego określania biodystrybucji lub akumulacji z narządów ex vivo bez polegania na czujnikach wtórnych. Przedstawiono również metody charakteryzacji, aby pokazać potencjał kropelek porfiryny jako czujników biodystrybucji. Omówiono również wpływ obciążenia pirolipidami w skorupie (od 0% do 50% według stosunku molowego).

Protokół

1. Odwodnione filmy lipidowe

Obliczyć masy poszczególnych składników otoczki (patrz plik uzupełniający „Lipid Formula Sheet”).
UWAGA: W tym protokole skład otoczki będzie następujący: 10% molowych soli amonowej 1,2-distearoylo-sn-glycero-3-fosfoetanolaminy-N-[metoksy(polietylenoglikol)-5000] (DSPE-PEG5K), x% molowych pirofofeoborfidu sprzężonego z 1-stearoylo-2-hydroksy-sn-glycero-3-fosfocholiną (Pyro-SPC) oraz (90 - x)% molowych 1,2-distearoylo-sn-glycero-3-fosfocholiny (DSPC). Ilość Pyro-SPC będzie zróżnicowana w 7 składach otoczek (x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50). Sprawdzić masę cząsteczkową DSPE-PEG5K na butelce z odczynnikiem.
1. Przeskalować protokół do dowolnej objętości lipidów, przy minimalnej objętości 1 mL. W tym protokole dla wszystkich formulacji zastosowano całkowitą objętość lipidów 10 mL przy całkowitym stężeniu lipidów 1 mg/mL. Roztwór substancji pomocniczych będzie składał się z: 10% glikolu propylenowego, 10% glicerolu i 80% roztworu soli fizjologicznej (PBS, 1X, pH 7,4) (% v/v/v) (patrz krok 2.3 i „Lipid Formula Sheet”).
  UWAGA: Protokół syntezy Pyro-lipidów opisano w pliku uzupełniającym „Other Protocols and Data”, kroki S1 do S1.19, który został zmodyfikowany na podstawie pracy Zheng i wsp.¹⁵.
Na podstawie obliczonych mas (patrz krok 1.1 i „Lipid Formula Sheet”) odważyć każdy z lipidów innych niż Pyro-lipidy i przenieść je do odpowiednio dużej fiolki z borokrzemianowego szkła z nakrętką.
Zakręcić fiolkę, opisać nakrętkę oraz fiolkę, a następnie osłonić dno i ścianki fiolki z lipidami folią aluminiową. Fiolka ta będzie w dalszej części protokołu określana jako „Fiolka z Lipidami”. Przechowywać Fiolkę z Lipidami w chłodnym, suchym i ciemnym miejscu.
Jeśli formulacja zawiera Pyro-SPC, rozpuścić 10 mg suchego filmu Pyro-SPC (patrz „Other Protocols and Data”) w 1 mL chloroformu. Mieszać w wortexie przez 5 s, zmierzyć absorbancję i obliczyć odpowiednią objętość do dodania do Fiolki z Lipidami.
OSTRZEŻENIE: Chloroform jest niebezpieczny dla zdrowia, drażniący i toksyczny. Należy nosić ochronny fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, rękawiczki i unikać wdychania oparów.
UWAGA: Ponieważ Pyro-SPC jest światłoczułe, podczas pracy z tym odczynnikiem należy, jeśli to możliwe, ograniczyć oświetlenie w obszarze roboczym. Pyro-SPC powinno być zamknięte i osłonięte, gdy nie jest używane.
1. W spektrofotometrze UV-Vis ustawić pomiar absorbancji w zakresie długości fal od 800 nm do 300 nm z przyrostem 0,5 nm i zmierzyć linię bazową dla 2000 µL czystego metanolu w kompatybilnej kuwecie o drodze optycznej 1 cm.
  OSTRZEŻENIE: Metanol jest niebezpieczny dla zdrowia, drażniący, toksyczny i łatwopalny. Należy nosić ochronny fartuch laboratoryjny, okulary ochronne, rękawiczki i unikać wdychania oparów. Trzymać z dala od iskier i źródeł ciepła.
2. Dodać 2 µL Pyro-SPC w chloroformie do 2000 µL metanolu i mieszać w wortexie przez 30 s. Przenieść roztwór do czystej, kompatybilnej kuwety 1 cm i zmierzyć absorbancję. Skorygować ten czynnik rozcieńczenia, jeśli peak absorbancji przy 667 nm wykracza poza zakres pomiarowy spektrofotometru UV-Vis.
  UWAGA: Przy przenoszeniu chloroformu lub metanolu należy używać czystej szklanej strzykawki lub pipety wypierającej zamiast pipety mechanicznej w celu zapewnienia lepszej dokładności.
3. Powtórzyć krok 1.4.2 jeszcze dwa razy, aby uzyskać potrójne wartości absorbancji.
4. Obliczyć średnią z wartości peaków absorbancji przy 667 nm i użyć następującego równania do obliczenia objętości Pyro-SPC w chloroformie potrzebnej do Fiolki z Lipidami¹⁴^,¹⁵:
  
  gdzie V to wymagana objętość Pyro-SPC w chloroformie, m to wymagana masa Pyro-SPC (patrz krok 1.1 i „Lipid Formula Sheet”), M to masa cząsteczkowa Pyro-SPC wynosząca 1040,317 g·mol^-1, A to średnia absorbancja przy 667 nm, d to czynnik rozcieńczenia oparty na objętościach metanolu i Pyro-SPC w chloroformie (krok 1.4.2), L to droga optyczna kuwety wynosząca 1 cm, a ε to molowy współczynnik tłumienia Pyro-SPC przy 667 nm wynoszący 45000 L·mol^-1·cm^-1.
  UWAGA: Mianownik równania stanowi prawo Beer-Lamberta, które wiąże stężenie anality w roztworze z pomierzoną absorbancją optyczną na danej odległości.
5. Obliczoną objętość Pyro-SPC w chloroformie z poprzedniego kroku dodać do Fiolki z Lipidami za pomocą czystej szklanej strzykawki (Rysunek 1A), a następnie zakręcić i osłonić fiolkę.
  UWAGA: Rysunek 1 przedstawia wyłącznie formulację z 30% zawartością Pyro-lipidów.
6. Jeśli pozostało jeszcze Pyro-SPC w chloroformie: w komorze z wyciągiem odessać nakrętkę z fiolki Pyro-SPC + chloroform z kroku 1.4, lekko przechylić fiolkę na bok i delikatnie wdmuchiwać strumień gazu azotowego do wnętrza fiolki. Obracać fiolkę, aby odparować chloroform za pomocą strumienia azotu i równomiernie pokryć wewnętrzną ściankę fiolki warstwą Pyro-SPC podczas wysychania. Upewnić się, że nie powstają rozpryski i żaden roztwór nie wylewa się na zewnątrz.
7. Gdy film lipidowy Pyro-SPC wyda się suchy i pokryje ściankę fiolki, wyłączyć dopływ azotu. Zakręcić fiolkę, uszczelnić szyjkę fiolki woskiem i przechowywać fiolkę w temperaturze -20 °C i w ciemności.
Przygotować roztwór 90% chloroformu i 10% metanolu (% v/v) i dodać 5 mL tego roztworu do Fiolki z Lipidami. Zakręcić Fiolkę z Lipidami i delikatnie zamieszać, aby zhomogenizować zawartość (Rysunek 1B).
UWAGA: Jeśli formulacja zawiera lipidy kwasu fosfatydowego (np. sól sodową 1,2-distearoylo-sn-glycero-3-fosforanu (DSPA)), zamiast tego dodać do Fiolki z Lipidami: 60% chloroformu, 32% metanolu i 8% ultraczystej wody (% v/v/v). Może być konieczne intensywniejsze mieszanie, aby całkowicie rozpuścić zawartość lipidową.
W komorze z wyciągiem odessać nakrętkę z Fiolki z Lipidami, lekko przechylić ją na bok i delikatnie wdmuchiwać strumień gazu azotowego do wnętrza fiolki. Obracać Fiolkę z Lipidami, aby odparować roztwór za pomocą strumienia azotu i równomiernie pokryć wewnętrzną ściankę Fiolki z Lipidami filmem lipidowym podczas wysychania. Upewnić się, że nie powstają rozpryski i żaden roztwór nie wylewa się na zewnątrz.
Gdy lipidy wyda się suche i pokryją wewnętrzne ścianki fiolki lipidowej (Rysunek 1C), wyłączyć dopływ azotu, osłonić dno i ściankę Fiolki z Lipidami folią aluminiową, a otwór górny przykryć folią aluminiową przebitą igłą kilkoma otworami w celu wentylacji (Rysunek 1D).
Opisać i umieścić osłoniętą Fiolkę z Lipidami w desykatorze próżniowym i pozostawić lipidy do dalszego wysychania przez co najmniej 24 h, ale nie więcej niż 72 h.
UWAGA: Protokół można wznowić później, po upływie od 24 do 72 h.

2. Nawadnianie lipidów

Napełnij myjkę ultradźwiękową wodą i podgrzej ją do 70 °C. Włącz sonikację, aby pomóc w wymieszaniu wody.
UWAGA: Woda i myjka ultradźwiękowa osiągają wysokie temperatury. Unikaj dotykania wody i urządzenia. Stosuj ochronę oczu, ochronny fartuch laboratoryjny oraz rękawice ochronne.
Gdy myjka ultradźwiękowa osiągnie temperaturę 70 °C, wyjmij fiolkę z lipidami z deskryptora próżniowego. Jeśli to możliwe, zmniejsz oświetlenie w obszarze roboczym.
Przygotuj roztwór substancji pomocniczych składający się z 10% propylenoglikolu, 10% glicerolu i 80% PBS (% v/v/v), a następnie dodaj 10 mL tego roztworu do fiolki z lipidami (patrz Krok 1.1.1 i „Karta formuły lipidowej”).
UWAGA: W przypadku użycia standardowej pipety wyporowej należy zachować ostrożność podczas pracy z lepkimi rozpuszczalnikami, takimi jak propylenoglikol i glicerol. Wolno zasysaj i wydzielaj objętość, czekając, aż pozostała ciecz dotrze do dna końcówki pipety. Podczas przenoszenia objętości poruszaj się powoli, aby ciecz nie przylegała do zewnętrznej strony końcówki pipety.
Zamknij fiolkę z lipidami korkiem, usuń aluminiową osłonę i delikatnie obracaj fiolką w myjce ultradźwiękowej przez 15 min przy włączonej sonikacji, aby rozpuścić lipidy. Upewnij się, że szyjka fiolki z lipidami znajduje się powyżej poziomu wody. Okazyjnie sprawdzaj, czy korek fiolki jest szczelnie zamknięty.
1. Od czasu do czasu wyjmij fiolkę z lipidami z łaźni wodnej. Przetrzymuj ją krótko pod światło, aby sprawdzić, czy zawartość jest całkowicie rozpuszczona (Rysunek 1E).
2. Jeśli zawartość fiolki z lipidami nie ulega homogenizacji, wyjmij ją z myjki ultradźwiękowej. Zabezpiecz korek, mocniej potrząśnij fiolką i ponownie umieść ją w myjce.
Wyjmij fiolkę z lipidami z myjki ultradźwiękowej i wyłącz urządzenie. Osusz zewnętrzną stronę fiolki ręcznikami papierowymi i ponownie ją opisz.
Owijaj fiolkę z lipidami folią aluminiową i chłodź ją w temperaturze pokojowej w chłodnym, ciemnym i suchym miejscu przez 10 minut.
Rozdziel zawartość fiolki z lipidami: około 2 mL roztworu lipidowego do szklanych przezroczystych fiolek serum z borokrzemianu o pojemności 3 mL (średnica wewnętrzna wlotu 7 mm, średnica zewnętrzna wlotu 13 mm).
UWAGA: W niektórych protokołach do fiolki 3 mL może być użyte 1,5 mL roztworu lipidowego⁷.
Zamknij fiolki serum szarymi chlorobutylowymi gumowymi stoprami do liofilizacji (średnica wewnętrzna wlotu 7 mm, średnica zewnętrzna wlotu 13 mm) i zabezpiecz stopry aluminiowymi uszczelkami zrywkowymi (średnica zewnętrzna wlotu 13 mm) za pomocą zaciskacza (Rysunek 1F).
Poddaj roztwór lipidowy w każdej z fiolek serum próżniowi, odgazuj i ponownie zapresuryzuj⁴^,⁵^,⁷ (Rysunek 2).
UWAGA: Instrukcje dotyczące montażu wymiennika gazowego i więcej szczegółów znajdują się w sekcji „Inne protokoły i dane”.
1. Zamknij wszystkie zawory pomiędzy Zaworem Ciśnieniowym A a Zaworem Butli Gazowej włącznie (Rysunek 2). Podłącz fiolki serum do igieł kolektora, otwórz odpowiednie zawory kolektora, następnie otwórz Zawór Próżniowy A i Zawór Próżniowy B i stosuj próżnię na poziomie -90 kPa (-13 psi, -900 mbar) przez 5 min, aby usunąć powietrze atmosferyczne. NIE odsysaj żadnej cieczy (patrz „Inne protokoły i dane”, Kroki od S3 do S3.1.5).
  UWAGA: Pompa próżniowa może ulec uszkodzeniu w przypadku niewłaściwego obchodzenia się z nią. Nie używaj pompy próżniowej z chemikaliami organicznymi, kwasowymi lub zasadowymi.
2. Przy wciąż włączonej pompie próżniowej przytrzymaj fiolkę serum (aby zapobiec jej kołysaniu) i szybko opukuj ją długopisem lub markerem w celu odgazowania. Opukuj do momentu, aż przestaną tworzyć się pęcherzyki i nie będzie ich w fiolce. NIE dopuść do odessania cieczy. W razie potrzeby przerwij opukiwanie. Powtórz czynność dla wszystkich podłączonych fiolek serum. Po odgazowaniu wszystkich fiolek serum ZAMKNIJ Zawór Próżniowy A oraz Zawór Próżniowy B i WYŁĄCZ pompę próżniową (patrz „Inne protokoły i dane”, Kroki od S3.2 do S3.2.3).
3. Przy fiolce serum wciąż podłączonej do igły i wyłączonej pompie próżniowej, powoli przekręć Zawór Butli Gazowej o 1/16 do 1/8 (około 22,5 do 45° pełnego obrotu) przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby częściowo go otworzyć, następnie otwórz Zawór z uchwytem w kształcie T i POWOLI przekręć Zawór Regulatora Powietrza zgodnie z ruchem wskazówek zegara do wartości 3 psi (20,7 kPa) na manometrze. Następnie otwórz Zawór Ciśnieniowy A i Zawór Ciśnieniowy B (patrz „Inne protokoły i dane”, Kroki od S3.3 do S3.3.21).
  UWAGA: Butla z decafluorobutanem jest pod ciśnieniem i może wybuchnąć pod wpływem ciepła. Trzymać z dala od źródeł ciepła i uderzeń. Gaz decafluorobutan może powodować wypieranie tlenu i uduszenie. Stosuj odpowiednią ochronę oczu i pracuj pod wyciągiem. Niewłaściwe posługiwanie się urządzeniem może doprowadzić do wytworzenia próżni w butli gazowej, co może spowodować gwałtowną dekompresję i implozję. Otwarcie Zaworu Butli Gazowej o więcej niż 1/8 obrotu może uszkodzić regulator powietrza.
4. Po 30 s zapresuryzowania (manometr powinien nadal wskazywać 3 psi (20,7 kPa)), zamknij wszystkie zawory kolektora z fiolkami serum, odłącz fiolki, zabezpiecz igły osłonami i ZAMKNIJ Zawór Butli Gazowej.
5. Zredukuj nagromadzone ciśnienie, częściowo otwierając jeden zawór kolektora, aż wskazówka manometru regulatora powietrza powróci do pozycji spoczynkowej. Następnie zamknij wszystko pomiędzy zaworami kolektora a uchwytem w kształcie T włącznie.
Opisz fiolki serum i przechowuj je w temperaturze 4 °C w ciemności. Upewnij się, że wszystkie zawory wymiennika gazowego są zamknięte, a pompa próżniowa została wyłączona.
UWAGA: Serum powinno być stabilne w tym stanie do 4 miesięcy. Na tym etapie protokół można wznowić w późniejszym terminie, maksymalnie po 4 miesiącach.

3. Fiolki z decafluorobutanem

Czyste, puste borokrzemowe szklane fiolki do surowic o pojemności 3 mL (średnica wewnętrzna wlotu 7 mm, zewnętrzna 13 mm) zamyka się szarymi gumowymi korkami chlorobutylowymi do liofilizacji (średnica wewnętrzna wlotu 7 mm, zewnętrzna 13 mm), a następnie zabezpiecza korki aluminiowymi kapslami zrywanymi (średnica zewnętrzna wlotu 13 mm) za pomocą zaciskarki⁴^,⁷^,⁸.
Należy postępować zgodnie z krokiem 2.9.1, aby odessać powietrze atmosferyczne (patrz „Inne protokoły i dane”, kroki od S3.1 do S3.1.5).
Należy pominąć etap odpowietrzania i postępować zgodnie z krokami od 2.9.3 do 2.9.5, aby ponownie zwiększyć ciśnienie w fiolce (patrz „Inne protokoły i dane”, kroki od S3.3 do S3.3.21).
Fiolki z decafluorobutanem należy oznakować i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności. Po zakończeniu należy upewnić się, że wszystkie zawory wymiennika gazowego są zamknięte, a pompa próżniowa jest wyłączona.
UWAGA: Fiolki do surowic wypełnione gazem decafluorobutan będą potrzebne do kondensacji kropel. W tym stanie powinny być stabilne do 4 miesięcy. Na tym etapie protokół można przerwać i wznowić później, maksymalnie po 4 miesiącach.

4. Tworzenie kropel

Wyjąć z lodówki nawodniony roztwór lipidów w fiolce z surowicą (z kroku 2.10).
Za pomocą dekapsulatora usuń aluminiową plombę z fiolki z serum i przelej 1 ml roztworu lipidowego do borokrzemianowej fiolki na próbki o pojemności 1,85 ml (z zakrętką fenolową), pozwalając roztworowi lipidowemu spływać po wewnętrznej ściance. Nie dopuść do powstania pęcherzyków powietrza.
1. Jeśli w fiolce z surowicą pozostał roztwór lipidowy, należy wykonać kroki od 2.9 do 2.10 w celu odgazowania i ponownego zwiększenia ciśnienia w fiolce przed przechowywaniem (patrz „Inne protokoły i dane”, kroki od S3 do S3.3.21).
Do fiolki z próbką o pojemności 1,85 ml należy powoli wprowadzić gaz w postaci decafluorobutanu do przestrzeni nad próbką, korzystając z wymiennika gazów (patrz Rysunek 2 (dla konkretnych nazw zaworów).
1. Należy upewnić się, że wszystkie zawory w wymienniku gazowym są prawidłowo zamknięte, a pompa jest wyłączona.
  UWAGANieprawidłowe wykonanie tej czynności może doprowadzić do odessania gazu z cylindra, co spowoduje gwałtowną dekompresję i implozję.
2. Otwórz jeden zawór kolektora i ostrożnie wysuń odpowiadającą mu igłę z kolektora.
  OSTRZEŻENIEOstre narzędzie, unikać kontaktu/nakłucia.
3. Otwórz zawór ciśnieniowy A i zawór ciśnieniowy B, a następnie przekręć zawór butli z gazem z pozycji 1/16 na 1/8 (około 22,5 do 45 ° przeciwnie do ruchu wskazówek zegara (o pełny obrót), aby częściowo otworzyć, a następnie całkowicie otworzyć zawór z uchwytem w kształcie litery T.
  UWAGANie otwierać zaworu butli z gazem bardziej niż do tego stopnia, ponieważ może to spowodować uszkodzenie regulatora powietrza.
4. Odkręć zakrętkę z fiolki z roztworem lipidów i przesuń ją tak, aby igła manifoldu znajdowała się nad granicą fazy ciecz-powietrze wewnątrz fiolki. Przytrzymaj fiolkę w tej pozycji.
5. powoli przekręć zawór regulatora powietrza (Air Regulator Valve) zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż wskazówka manometru regulatora powietrza lekko przesunie się z pozycji spoczynkowej, a gaz perfluorowęglowy zacznie łagodnie wypływać z igły kolektora. Pozostaw gaz perfluorowęglowy, aby łagodnie napływał do przestrzeni nad cieczą w fiolce przez 30 s. Nie dopuść do powstania pęcherzyków. W razie potrzeby wyreguluj zawór regulatora powietrza.
  UWAGA: Powierzchnia styku cieczy z powietrzem powinna być lekko zaburzona przez przepływ gazu w postaci decafluorobutanu. Ponieważ układ jest teraz otwarty, manometr regulatora powietrza nie może prawidłowo wskazać ciśnienia.
6. Po 30 s należy ostrożnie i szybko zakręcić fiolkę z próbką, unikając nadmiernego poruszania naczyniem.
7. Zamknij zawór butli z gazem (zgodnie z ruchem wskazówek zegara), zawór z uchwytem w kształcie litery T, zawór regulatora powietrza (przeciwnie do ruchu wskazówek zegara), zawór ciśnienia A, zawór ciśnienia B oraz zawór kolektora.
8. Ostrożnie załóż osłonkę na igłę.
9. Oznakuj fiolkę z próbką i uszczelnij jej szyjkę folią woskową, owijając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara (Rysunek 3A i 3B).
  UWAGA: Ryciny 3B Proszę o podanie tekstu źródłowego do przetłumaczenia. 3F wyświetl tylko formulację pirolipidową 30%.
Przechowywać fiolkę z próbką w ciemności i w temperaturze 4 °C przez co najmniej 10 min lub do 24 h.
UWAGA: Na tym etapie protokół można wznowić w późniejszym czasie, maksymalnie po 24 h.
Umieść około 100 g suchego lodu (dwutlenku węgla) w izolowanym pojemniku, a zwykły lód w innym izolowanym pojemniku. Przygotuj fiolki z decafluorobutanem wspomniane w kroku 3, dwie igły 20G o długości 3,81 cm (1,5 cala), plastikową strzykawkę o pojemności 1 ml (przed użyciem rozluźnij tłok), pojemnik o pojemności 200 ml, szczypce metalowe oraz termometr (zakres od -20 do 100 °C).
UWAGA: W przypadku przygotowywania wyłącznie mikropęcherzyków nie ma potrzeby stosowania izopropanolu, suchego lodu ani lodu.
Umieść fiolkę z próbką zawierającą roztwór lipidów w wytrząsarce mechanicznym i wytrząsaj przez 45 s (Rycina 3C).
Po mechanicznym mieszaniu ustaw fiolkę z próbką pionowo, chroniąc ją przed światłem, i rozpocznij 15-minutowe odliczanie w celu schłodzenia fiolki oraz selekcji mikrobąbelków pod kątem wielkości.⁸^,¹⁷.
1. Gdy licznik odliczający 15 minut osiągnie wartość 10 minut (pozostało 5 minut), napełnić naczynie około 200 ml izopropanolu i schłodzić go do -20 °C z suchym lodem, używając metalnych szczypiec.
  UWAGA: Docelowa temperatura wynosi od -15 do -17 °C jednak izopropanol będzie się ogrzewać podczas manipulowania mikropęcherzykami.
  OSTRZEŻENIEIzopropanol jest łatwopalny. Należy go przechowywać z dala od źródeł ciepła i iskier. Suchy lód może powodować uszkodzenia skóry. Należy go przenosić za pomocą kleszczy. Należy stosować rękawice, ochronę oczu oraz ochronny fartuch laboratoryjny.
Po 15-minutowej selekcji mikropęcherzyków pod względem wielkości, należy zlokalizować frakcję o wyselekcjonowanej wielkości wewnątrz fiolki z próbką (Rysunek 3D).
Trzymając fiolkę z próbką w pozycji pionowej, ostrożnie zdejmij korek i pobierz około 0,7 mL z dolnej warstwy, używając 1-mililitrowej strzykawki plastikowej z igłą o rozmiarze 20G i długości 1,5 cala. Upewnij się, że nie pobrano żadnej ilości z górnej warstwy. Nie opukuj strzykawki w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
Wprowadź inną igłę o rozmiarze 20 G do fiolki z surowicą decafluorobutanu (trzymając igłę w górnej części fiolki), aby wyrównać ciśnienie, a następnie wprowadź igłę i strzykawkę z mikropęcherzykami o wybranym rozmiarze.
Powoli przenieś wyselekcjonowane pod względem wielkości mikropęcherzyki. Przechyl fiolkę i ustaw strzykawkę pod kątem, aby ciecz spłynęła po wewnętrznej ściance fiolki z surowicą decafluorobutanu.
Po przeniesieniu całego roztworu mikropęcherzyków o wyselekcjonowanym rozmiarze, należy wyjąć igłę wraz ze strzykawką, pozostawiając jednak igłę odpowietrzającą w celu wyrównania podciśnienia (Rysunek 3E).
1. Jeśli przygotowywane są wyłącznie mikropęcherzyki o wyselekcjonowanej wielkości, należy zakończyć procedurę w tym miejscu. Igłę odpowietrzającą należy pozostawić w fiolce, blisko jej górnej części. Fiolkę należy przechowywać w ciemności, w temperaturze pokojowej.
Dodaj niewielkie ilości suchego lodu lub izopropanolu w temperaturze pokojowej do kąpieli izopropanolowej, aby zapewnić, że temperatura kąpieli mieści się w zakresie od -15 do -17 °C.
Po wprowadzeniu igły wentylacyjnej o rozmiarze 20 G w górnej części fiolki z surowicą, należy umieścić fiolkę w kąpieli z izopropanolu, dbając o to, aby poziom mikropęcherzyków znajdował się poniżej poziomu izopropanolu, natomiast szyjka fiolki pozostawała ponad nim, a następnie okresowo obracać fiolkę z surowicą przez 2 min w celu skondensowania mikropęcherzyków.
UWAGA: Krok ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Sheeran i wsp.⁶
1. Nie należy stale obracać fiolki z surowicą w izopropanolu i nie wolno dopuścić do zamrożenia roztworu. Obracać fiolkę przez około 5 s, a następnie wyjąć ją z izopropanolu. Sprawdzić, czy nastąpiła nukleacja lodu, a następnie wznowić obracanie w izopropanolu. W przypadku powstania lodu obracać fiolkę z surowicą w powietrzu, aż do jego rozpuszczenia.
Po 2-minutowej kondensacji wyjmij fiolkę z surowicą z kąpieli w izopropanolu i usuń igłę odpowietrzającą.
UWAGA: Mikropęcherzyki powinny skondensować się w kropelki, co objawia się zmianą przezierności (Rycina 3E wobec Rycina 3F (dla 30% formulacji pirolipidowej).
Przetrzyj fiolkę z surowicą, opisz ją i umieść na zwykłym lodzie w ciemnym, izolowanym pojemniku do momentu użycia. Nieotwarte krople (z nienaruszoną aluminiową plombą) powinny pozostawać stabilne w tym stanie do 6 g, pod warunkiem regularnego uzupełniania roztopionego lodu w razie potrzeby.
Przed użyciem usuń aluminiową plombę za pomocą dekapera. Krople (w tym otwarte fiolki) należy przechowywać w lodzie i w ciemności, gdy nie są używane. Mikropęcherzyki należy przechowywać w ciemności i w temperaturze pokojowej.

5. Charakterystyka morfologiczna i optyczna

Przygotować 1% Triton w następujący sposób: dodać 5 mL Triton X-100 do 500 mL PBS (1x, pH 7.4) i mieszać za pomocą magnetycznego mieszadła aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny¹⁴.
UWAGA: Triton X-100 jest bardzo lepki. W przypadku korzystania ze standardowej pipety wypierającej powietrze, należy zachować ostrożność podczas obsługi. Wolno zasysać i wypuszczać ciecz, czekając, aż pozostała objętość opadnie na dno pipety. Podczas przenoszenia cieczy należy poruszać się powoli, aby upewnić się, że płyn nie przykleja się do zewnętrznej strony końcówki pipety.
Przygotować kropelki (Krok 4). Jeśli analizowane są również mikropęcherzyki, należy pobrać niewielką objętość wyselekcjonowanych pod względem wielkości mikropęcherzyków przed kondensacją (Krok 4.9).
Oznaczyć wielkość mikropęcherzyków lub kropelek za pomocą licznika Coulter (CC) w zakresie od 0,2 do 6 µm, aby uzyskać rozkłady wielkości i stężenia (Rysunek 4).
1. Wypełnić czystą kuwetę o pojemności 20 mL ilością 10 mL elektrolitu CC, który został przefiltrowany przez membranowy filtr z polietersulfonu o porach 0,2 µm. Zmierzyć go na CC w trzech powtórzeniach, aby uzyskać linię bazową.
2. Do tego samego elektrolitu CC dodać 5 µL próbki mikropęcherzyków lub kropelek i delikatnie wymieszać.
  UWAGA: W zależności od stężenia próbki można dodać od 2 do 20 µL próbki.
3. Przemierzyć próbkę na CC (3 pomiary), odjąć uśrednioną linię bazową i obliczyć rozkład wielkości oraz stężenie (liczba na mL).
Zmierzyć absorbancję kropelek za pomocą spektroskopii UV-Vis (Rysunek 5).
UWAGA: Rysunek 5 przedstawia wyłącznie formulację Pyro-lipid 30%.
1. W spektrofotometrze UV-Vis ustawić pomiar absorbancji w zakresie długości fal od 800 nm do 300 nm z przyrostami 0,5 nm i włączyć korekcję linii bazowej.
2. Używając czystej kuwety o drodze optycznej 1 cm wypełnionej PBS, przeprowadzić pomiar linii bazowej. Upewnić się, że objętość jest wystarczająco wysoka, aby przecinała drogę wiązki spektroskopu.
3. Rozcieńczyć kropelki Pyro-lipid w PBS (zaleca się 2 µL do 500 µL kropelek w 2000 µL rozcieńczalnika) i wymieszać poprzez pipetowanie.
  UWAGA: NIE mieszać w wortexie, w przeciwnym razie kompleksy zostaną zniszczone.
4. Przenieść rozcieńczone kropelki do czystej kuwety i zmierzyć absorbancję. W razie potrzeby zmienić stopień rozcieńczenia.
5. Powtórzyć kroki od 5.4.1 do 5.4.4, stosując 1% Triton zamiast PBS. Po rozcieńczeniu przenieść próbkę do szczelnej probówki z zakrętką i mieszać w wortexie przez 30 s przed pomiarem.
Zmierzyć fluorescencję mikropęcherzyków lub kropelek (Rysunek 6).
UWAGA: Rysunek 6 przedstawia wyłącznie formulację Pyro-lipid 30%.
1. W spektrofotometrze fluorescencyjnym ustawić długość fali wzbudzenia na 410 nm oraz zakres długości fali emisji od 600 do 750 nm z przyrostami 1 nm.
2. Zmierzyć fluorescencję rozcieńczalnika PBS w celu uzyskania linii bazowej, używając kuwety kompatybilnej ze spektrofotometrem fluorescencyjnym.
3. Rozcieńczyć mikropęcherzyki lub kropelki Pyro-lipid w PBS (zaleca się 0,5 µL do 10 µL kropelek w 2000 µL rozcieńczalnika) i wymieszać poprzez pipetowanie.
  UWAGA: NIE mieszać w wortexie, w przeciwnym razie kompleksy zostaną zniszczone.
4. Przenieść rozcieńczoną próbkę do czystej kuwety z wyznaczoną linią bazową i zmierzyć fluorescencję. W razie potrzeby zmienić stopień rozcieńczenia, aby uniknąć nasycenia sygnału.
5. Powtórzyć kroki od 5.5.1 do 5.5.4, stosując 1% Triton zamiast PBS. Po rozcieńczeniu w 1% Triton przenieść rozcieńczoną próbkę do szczelnej probówki z zakrętką i mieszać w wortexie przez 30 s przed pomiarem. Dodać wystarczającą objętość, aby upewnić się, że pęcherzyki powstałe podczas wortexowania znajdują się powyżej drogi lasera.
  UWAGA: Sygnał fluorescencji próbki w Tritonie będzie znacznie wyższy niż w PBS ze względu na zniesienie wygaszania fluorescencji (Rysunek 6).

6. Obrazowanie parowania

Napełnić zbiornik na wodę o odpowiedniej pojemności wodą dejonizowaną i pozostawić go na 24 godziny, aby gazy w wodzie osiągnęły równowagę z atmosferą.
Przygotować kropelki i przechowywać je w lodzie oraz w ciemności do momentu użycia.
Przygotuj rurkę fantomową do pomiaru przepływu z 2% agaru zgodnie z opisem Pellow i współpracowników.¹⁸ Zanurz fantom w zbiorniku z wodą podgrzaną do 37 °C.
Podgrzać PBS do 37 °C i przepływa przez fantom.
Za pomocą przedklinicznego systemu ultrasonograficznego i liniowego przetwornika o częstotliwości 21 MHz (patrz Tabela materiałów), dostosuj widok do fantoma przepływowego, ustaw obrazowanie w trybie B, ustaw ciśnienia wyjściowe i zarejestruj filmy lub obrazy, aby uzyskać wartości bazowe dla każdego ciśnienia.
Rozcieńczony 20 µL kropli do 50 mL 37 °C do PBS i delikatnie wymieszać. Przenieść roztwór do plastikowej strzykawki o pojemności 30 ml i przepchnąć go przez fantom agarowy.
Zachowując to samo ustawienie co w kroku 6.5, zwiększaj ciśnienie wylotowe do momentu zaobserwowania waporyzacji (jasne punkty w fantomie, patrz Rycina 7).
UWAGA: Rycina 7 przedstawia próbkę kropli piro-lipidowych 30%. Ten dostępny w sprzedaży przetwornik liniowy o częstotliwości 21 MHz umożliwia zarówno obrazowanie, jak i waporyzację kropli.

Wyniki

Przedskondensowane, wyselekcjonowane pod kątem wielkości próbki mikropęcherzyków (n = 3) oraz poskondensowane próbki kropel (n = 3) poddano pomiarowi wielkości za pomocą licznika Coulter (CC) z aperturą 10 µm. Ograniczeniem apertury 10 µm jest fakt, że nie pozwala ona na pomiar cząstek mniejszych niż 200 nm, co może wpływać na średnią wielkość i stężenie. Rycina 4 przedstawia dane dotyczące wielkości dla każdej z formulacji o różnej zawartości Pyro-lipidów. Tabela 1 przedstawia statystyki oparte na danych o wielkości. Wykorzystując stosunek średnich średnic przed i po kondensacji, wyniki wykazały, że formulacja z 0% Pyro-lipidów miała najmniejszą zmianę średniej średnicy, wynoszącą 1,72 ± 0,02. Formulacja z 50% Pyro-lipidów miała największą średnią średnicę, wynoszącą 2,38 ± 0,08. Próbka kropel z 1% Pyro-lipidów wykazała najwyższe zaobserwowane stężenie wynoszące (2,71 ± 0,13) × 10¹⁰ /mL, podczas gdy próbka kropel z 40% Pyro-lipidów miała najniższe zaobserwowane stężenie wynoszące (7,36 ± 0,81) × 10⁹ /mL. Dane o wielkości wykazały, że próbka kropel z 10% Pyro-lipidów miała najmniejszą średnicę szczytową wynoszącą 261 ± 13 nm, natomiast próbka kropel z 50% Pyro-lipidów miała największą, wynoszącą 390 ± 55 nm. Ogólnie, wraz ze wzrostem zawartości Pyro-lipidów, stężenie spadało, a średnia średnica rosła. Ponieważ próbki poskondensowane bazują na prekursorowych próbkach mikropęcherzyków, trend ten wystąpił dla obu typów środków kontrastowych do ultradźwięków. Wraz ze wzrostem zawartości Pyro-lipidów zaczęła tworzyć się subpopulacja mikropęcherzyków (z rozmiarem szczytowym wynoszącym około 2000 µm). Ten wtórny szczyt nie występował w próbce mikropęcherzyków z 0% Pyro-lipidów i był najbardziej widoczny w populacjach z 40% i 50% Pyro-lipidów.

Rysunek 5 przedstawia reprezentatywne pomiary absorbancji próbki kropli lipidowych Pyro 30%. Szczyt nienaruszonej próbki w PBS wynosił 700 nm, natomiast w przypadku próbki zniszczonej w Triton szczyt przesunął się do 671 nm. Wykazało to, że nienaruszone kompleksy posiadają inne właściwości optyczne w porównaniu do pojedynczych, niezłożonych komponentów lipidowych.

Rycina 6A przedstawia reprezentatywne pomiary fluorescencji próbki mikropęcherzyków przed kondensacją, natomiast Rycina 6B przedstawia próbkę kropel po kondensacji z 30% Pyro-lipid. Próbka nienaruszona w PBS wykazywała szczyt fluorescencji przy 704 nm, natomiast forma rozbita miała szczyt przy 674 nm. Odjęcie pola pod krzywą dla formy rozbitej od pola pod krzywą dla formy nienaruszonej, a następnie podzielenie różnicy przez pole pod krzywą dla formy rozbitej pozwala wyznaczyć wydajność wygaszania, która wyniosła odpowiednio 98,61% dla próbki mikropęcherzyków i 98,07% dla próbki kropel z 30% Pyro-lipid.

Aby zademonstrować proces przekształcania się kropel w mikropęcherzyki, wykonano obrazowanie i waporyzację rozcieńczonych kropel w fantomie przepływowym o temperaturze 37 °C przy użyciu systemu ultradźwiękowego. Rycina 7 przedstawia reprezentatywne obrazy ultradźwiękowe próbki kropel piro-lipidowych 30% obrazowanych przy różnych ciśnieniach. Przy niskich ciśnieniach (Rycina 7A) sygnał był bardzo słaby, ograniczając się jedynie do sygnału tła pochodzącego z pęcherzyków powietrza pozostałych po syntezie agaru. Wynika to z faktu, że krople są nieechogeniczne i nie rozpraszają fal ultradźwiękowych. Przy nieco wyższej mocy wygenerowano kilka mikropęcherzyków (Rycina 7B), co objawiło się pojawieniem jasnych plamek. Wraz ze wzrostem ciśnienia generowano coraz więcej mikropęcherzyków (Rycina 7C oraz 7D). Wykazano tym samym, że krople nie waporyzują się samoistnie w temperaturze 37 °C.

Etapy procesu chemicznego w zamkniętych fiolkach; roztwory w słoikach (A-F) do analizy eksperymentu syntezy.
Rysunek 1: Zdjęcia kroków prowadzących do otrzymania 30% roztworu Pyro-lipidów. A) Proszek lipidowy oraz Pyro-SPC w chloroformie. B) Dodany roztwór rozpuszczający. C) Wysuszony film lipidowy osadzony na wewnętrznej ściance fiolki. D) Fiolka z lipidami owinięta folią aluminiową (zewnętrzna folia zaklejona taśmą w celu ponownego użycia). E) Nawodniony roztwór lipidowy. F) Roztwór lipidowy w fiolce do surowic. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

System próżniowy i kolektor gazowy, schemat przedstawiający zawory i pompę membranową dla układu transportu gazów.
Rysunek 2: 10-kanałowy wymiennik gazowy. Oznaczone są zawory wspomniane w protokole. Instrukcje dotyczące montażu wymiennika gazowego znajdują się w pliku uzupełniającym „Other Protocols and Data”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Fiolki z różnymi stężeniami do eksperymentu rozpuszczalności, pokazujące zmianę koloru cieczy i osad.
Rycina 3: A) Roztwory lipidowe 7 formulacji (0% do 50% Pyro-SPC) w fiolkach z próbkami. Ryciny B do D przedstawiają etapy przygotowania 30% kropli Pyro-lipidowych. B) 30% roztwór Pyro-lipidowy w fiolce z próbką. C) Po agitacji. D) Po 15 min selekcji rozmiaru. E) Przeniesienie dolnej frakcji do fiolki z decafluorobutanem. D) Po kondensacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy stężeń pęcherzyków i kropel; analiza średnicy w stosunku do stężenia z wynikami na wykresie słupkowym.
Rysunek 4: Dane dotyczące wielkości z licznika Coulter (CC) dla próbek mikro-pęcherzyków i kropel o wyselekcjonowanym rozmiarze z różną zawartością otoczki pirolipidowej (n = 3). Ciągłe zielone linie reprezentują mikro-pęcherzyki, a przerywane cyjanowe linie reprezentują krople. A) 0% Pyro-SPC. B) 1% Pyro-SPC. C) 10% Pyro-SPC. D) 20% Pyro-SPC. E) 30% Pyro-SPC. F) 40% Pyro-SPC. G) 50% Pyro-SPC. H) Całkowite zaobserwowane stężenia próbek mikro-pęcherzyków i kropel z CC w zależności od zawartości Pyro-SPC w otoczce. Wszystkie słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Wszystkie pomiary zostały wykonane przy użyciu apertury 10 µm, która posiada zakres wielkości od 200 nm do 6000 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres widma absorbancji; porównanie Triton, PBS z kroplami Pyro; piki absorpcji przy 430, 700 nm.
Rycina 5: Reprezentatywne pomiary absorbancji w spektroskopii ultrafioletowej i widzialnej (UV-Vis) w zakresie od 300 do 800 nm dla próbki post-kondensowanych kropel lipidowych Pyro 30% rozcieńczonych w PBS oraz w 1% Triton. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres widm fluorescencji; pęcherzyki/kropelki pyro, Triton/PBS; długość fali, intensywność, wykres porównawczy.
Rycina 6: Reprezentatywna emisja fluorescencji od 600 do 750 nm przy wzbudzeniu 410 nm. A) Próbka mikropęcherzyków Pyro-lipidowych 30% w PBS i w 1% Triton, wyselekcjonowana pod względem wielkości, przed kondensacją. B) Próbka kropelek Pyro-lipidowych 30% w PBS i w 1% Triton, po kondensacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat analizy dynamicznego przepływu, krople pyro w PBS, zmiana ciśnienia od 0,73 do 4,36 MPa.
Rycina 7: Reprezentatywne obrazy ultrasonograficzne fantomu przepływowego z agaru w temperaturze 37 °C, wykonane przy użyciu przedklinicznego liniowego przetwornika 21 MHz w trybie B (patrz Tabela Materiałów). Lewa kolumna (Ryciny A, C, E,& G) przedstawia kontrole PBS. Prawa kolumna (Ryciny B, D, F,& H) przedstawia próbkę 20 µL po-kondensowanych kropli 30% Pyro-lipid rozcieńczonych w 50 mL PBS w temperaturze 37 °C. Każdy wiersz reprezentuje szczytowe ujemne ciśnienia w polu swobodnym, które zostały oszacowane na podstawie pracy Sheeran et al.⁸ Żółte trójkąty wskazują głębokość ogniskowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Metoda	Odczynnik	Powłoka pirolityczna %	0	1	10	20	30	40	50
CC	Pęcherzyki	Stęż. [/mL]	(2.76 ± 0.28) × 10^10	(3.04 ± 0.15) × 10^10	(2.02 ± 0.11) × 10^10	(1.91 ± 0.22) × 10^10	(1.47 ± 0.05) × 10^10	(8.47 ± 0.95) × 10^9	(9.89 ± 0.15) × 10^9
CC	Pęcherzyki	Szczyt [nm]	329 ± 6	297 ± 15	305 ± 21	273 ± 14	310 ± 40	266 ± 33	393 ± 89
CC	Pęcherzyki	Średnia [nm]	609 ± 2	603 ± 15	635 ± 6	690 ± 8	812 ± 1	935 ± 22	950 ± 55
CC	Pęcherzyki	Mediana [nm]	450 ± 6	421 ± 6	414 ± 6	432 ± 5	490 ± 2	596 ± 37	695 ± 41
CC	Kropelki	Stężenie [/mL]	(2.18 ± 0.07) × 10^10	(2.71 ± 0.13) × 10^10	(1.75 ± 0.18) × 10^10	(1.72 ± 0.13) × 10^10	(1.09 ± 0.01) × 10^10	(7.36 ± 0.81) × 10^9	(7.38 ± 0.28) × 10^9
CC	Kropelki	Szczyt [nm]	292 ± 0	297 ± 17	261 ± 13	280 ± 9	268 ± 17	287 ± 38	390 ± 55
CC	Kropelki	Średnia [nm]	353 ± 5	350 ± 5	347 ± 1	347 ± 4	397 ± 1	399 ± 6	400 ± 7
CC	Krople	Mediana [nm]	318 ± 4	318 ± 4	310 ± 1	315 ± 2	340 ± 0	367 ± 5	370 ± 9

Tabela 1: Statystyki danych dotyczących rozmiarów próbek mikropęcherzyków i kropli z różną zawartością Pyro-SPC, zmierzone za pomocą licznika Coulter (CC) (n = 3). Wszystkie błędy oznaczają odchylenie standardowe.

Informacje uzupełniające - Arkusz wzorów lipidowych: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Informacje uzupełniające – pozostałe protokoły i dane: Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Po dodaniu wszystkich składników lipidowych razem (kroki 1.2 i 1.4.5, rysunek 1A), dodano roztwór chloroformu i metanolu (oraz wody, jeśli obecne są lipidy kwasu fosfatydowego, takie jak DSPA), aby upewnić się, że składniki lipidowe pirolipidowe i niepirolipidowe były w pełni homogenizowane (krok 1.5, rysunek 1B). Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków lipidowych o niejednorodnym składzie lipidowym, rozpuszczone lipidy wysuszono i pokryto wnętrzem ścianki fiolki w postaci cienkiego filmu (ryc. 1C). Powłoka (krok 1.6) ułatwia również nawilżanie (kroki 2.1 do 2.4), ponieważ zwiększa powierzchnię wysuszonej folii. Suszenie (Krok 1.6, Rysunek 1C) i odkurzanie (Krok 1.8, Rysunek 1D) przeprowadzono w celu zapewnienia całkowitego odparowania chloroformu i metanolu, ponieważ te chemikalia mogą zakłócać tworzenie się mikropęcherzyków. Podczas gdy protokół można zmniejszyć, aby objętość roztworu lipidowego wynosiła zaledwie 1 ml, większe objętości mogą zmniejszyć różnice między fiolkami. Chociaż może to wiązać się z ryzykiem degradacji Pyro-SPC, gdy nie jest używany, warunki przechowywania roztworu lipidowego (kroki od 2.9 do 2.10) miały na celu zmniejszenie tego ryzyka. Etap odgazowywania za pomocą wymiennika gazowego (krok 2.9.2, rysunek 1F i rysunek 2) służy do wyeliminowania jak największej ilości tlenu, aby zapobiec utlenianiu. Nie zaleca się przechowywania roztworów lipidów zawierających lipidy porfirynowe, gdy gazy atmosferyczne są nadal rozpuszczone w roztworze (ryc. 1E).

W kroku 2.10 roztwór lipidów znajduje się w fiolce surowicy z ciśnieniową przestrzenią nad głową, podobnie jak sprzedawane są klinicznie zatwierdzone ultradźwięki kontrastowe mikrosfery lipidowe perflutren (podobnie jak na rycinie 1F). Prace wewnętrzne wykazały, że stabilne mikropęcherzyki nie mogą być generowane przez mechaniczne mieszanie z obecnością pirolipidów, jeśli nasadka jest miękka z materiału, takiego jak gumowy korek. W związku z tym roztwór lipidów przeniesiono do fiolki z próbką z niegumową nasadką fenolową (kroki 4.1 do 4.4, ryc. 3A i 3B). Gdy dekafluorobutan został wpłynęty do fiolki z próbką (kroki 4.1 do 4.4), gęstszy dekafluorobutan powinien wyprzeć powietrze atmosferyczne w przestrzeni nad fiolką z próbką. Obecnie nie wiadomo, dlaczego pirolipidy nie są w stanie tworzyć mikropęcherzyków za pomocą gumowych korków. Bez pirolipidów, stabilne mikropęcherzyki mogą być wytwarzane bezpośrednio w fiolkach z surowicą z gumowymi korkami ^4,7. W związku z tym zaleca się użycie wymiennika gazowego do odgazowania i ponownego zwiększenia ciśnienia w fiolce surowicy, a następnie poruszenia samej fiolki surowicy w przypadku preparatów niezawierających pirolipidów 4,5,6,7 (patrz "Inne protokoły i dane"). Zaletą możliwości mechanicznego mieszania w fiolce z surowicą jest to, że przestrzeń nad surowicą może być pod ciśnieniem, a wybór wielkości można dokonać, odwracając fiolkę z surowicą do góry nogami⁸. W tym protokole preparat 0% pirolipidów przeniesiono do fiolki z próbką (kroki 4.1 do 4.4), aby zachować spójność z preparatami, które zawierały pirolipidy. Dodatkowo, dłuższe łańcuchy lipidów acylowych skutkują bardziej stabilnymi kropelkami ze względu na lepsze interakcje van der Waalsa¹⁹. Skład otoczki lipidowej został wybrany na podstawie tego, co było dostępne na rynku, długości łańcucha 18-acylowego dla wszystkich typów lipidów. DSPE-PEG5K został włączony do całego preparatu (Krok 1.1), ponieważ obecność łańcuchów glikolu polietylenowego zapobiega koalescencji struktur poprzez odpychające siły steryczne¹⁹. Podczas hydratacji lipidów, kąpiel sonitora do kąpieli została ustawiona na 70 °C (Krok 2.1) jako wystarczająco wysoką, aby w pełni rozproszyć film lipidowy o długości łańcucha^{18-acylowego 18}. W przypadku dłuższych łańcuchów acylowych wymagane będą wyższe temperatury.

Wyższe obciążenie pirolipidami zwiększyłoby stężenie składników optycznie absorbujących i fluoryzujących, co może być pożądane w przypadku niektórych zastosowań, które korzystają z maksymalnego obciążenia porfiryną. Jednak wraz ze wzrostem zawartości pirolipidów obserwowane stężenie kropelek zmniejszało się, a średnice zwiększały się (ryc. 4 i tabela 1). Ilustruje to kompromis między właściwościami fluorescencji optycznej i absorbancji a stężeniem i średnicą kropel. Dla badaczy, którzy muszą priorytetowo traktować małe średnice do akumulacji in vivo przez małe nieszczelne naczynia lub jeśli konieczne jest wstrzyknięcie wysokiego stężenia kropel, zwiększenie obciążenia pirolipidami może nie być warte wzrostu średnicy kropli lub spadku stężenia kropel. Jeżeli duże stężenie kropel i/lub małe średnice kropel mają zasadnicze znaczenie, należy rozważyć zastosowanie towarzyszących środków diagnostycznych o podobnej wielkości zamiast pirolipidów. Podczas gdy 1% kropelki pirolipidów nie spowodowały zmniejszenia stężenia ani zwiększenia wielkości, 1% obciążenia pirolipidami może być zbyt niskie, aby można je było rozsądnie wykryć fluorescencyjnie na tle tkanki. Jednak elastyczność ugrupowania porfiryny zapewnia wiele opcji funkcjonalizacji, które zapewnią alternatywne sposoby oznaczania ilościowego, bardziej odpowiednie do zastosowań o niskim stężeniu. Na przykład pirolipidy mogą być chelatowane miedzią-64 do obrazowania metodą pozytonowej tomografii emisyjnej i zliczaniem promieniowania^{gamma 20} lub palladem do oznaczania ilościowego metali śladowych za pomocą spektrometrii mas lub manganem do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego¹⁴.

Podczas gdy niektóre eksperymenty mogą wymagać tylko niewielkiej objętości roztworu kropelkowego, 1 ml roztworu lipidowego jest potrzebny do napełnienia fiolki z próbką o pojemności 1,85 ml. Goertz i wsp. wykazali, że zmiany w obsłudze, ciśnieniu w przestrzeni nad głową, stosunku cieczy do gazu, a nawet kształtu fiolki mogą wpływać na populacje mikropęcherzyków¹⁷. Temperatura fiolki podczas mieszania i wyboru wielkości może również wpływać na rozkład wielkości. Dlatego w przypadku metod optymalizowanych przez użytkownika końcowego ważne jest, aby być jak najbardziej konsekwentnym podczas tworzenia kropel. Nieotwarte kropelki mogą zostać zamrożone (-20 °C) i rozmrożone później do wykorzystania w przyszłości, ale będzie to miało wpływ na populacje wielkościowe.

Procedura mieszania, która aktywuje roztwór lipidowy w mikropęcherzyki, nie wytwarza morfologicznie jednorodnej populacji (etap 4.6); Zamiast tego próbka jest wypełniona mikropęcherzykami, pęcherzykami wielopłytkowymi, liposomami i micelami 18,21,22^. Podczas gdy rozmiary mikropęcherzyków obejmują zakres mikronów i nanometrów, inne struktury są w dużej mierze poniżej 800 nm ²³. Zastosowane techniki sortowania nie pozwalają na rozróżnienie między tymi różnymi strukturami, a zatem próbki mikropęcherzyków po zmieszaniu (etap 4.6, rysunek 3C) i próbki kropel po skondensowaniu (etap 4.14, rysunek 3F) należy przyjąć jako mieszaniny. Zespoły niewrażliwe na ultradźwięki (pęcherzyki wielopłytkowe, liposomy i micele) są prawdopodobnie zachowane po kondensacji i nie zmienią rozmiaru, ponieważ nie mają rdzeni zmiennofazowych. Ponieważ licznik Coultera nie jest w stanie rozróżnić tych różnych zespołów supramolekularnych, zmiana wielkości populacji po kondensacji powinna być interpretowana przy założeniu, że pewna część struktur w nanoskali jest niekonwertowalna i przyczynia się do obserwowanej populacji w tym obszarze wielkości. Dodatkowo struktury te przyczyniają się do spektroskopowych i fluorescencyjnych sygnatur tych próbek¹⁴. Sygnatury fluorescencji i absorbancji miceli, liposomów/pęcherzyków i kropelek są podobne, w tym ich stopień wygaszania fluorescencji¹⁴. Dlatego ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że istnieje mieszanina zespołów na rysunkach od 3C do 3F, rysunek 4, rozcieńczona próbka PBS na rysunku 5 i rozcieńczona próbka PBS na rysunku 6.

Po wybraniu wielkości i przed kondensacją (krok 4.9) możliwe jest wyeliminowanie zespołów niepęcherzykowych poprzez odwirowanie próbki mikropęcherzyków w celu oddzielenia pęcherzyków pływających od zespołów bez pływalności, jak opisano przez Feshitana i ^wsp.21 Stopień separacji można kontrolować, dostosowując siłę wirowania i czas trwania. Jednak eksperymenty z kondensacją mikropęcherzyków takich odizolowanych próbek ujawniły, że użycie większych populacji mikropęcherzyków prekursorowych, które są wybierane przy użyciu procedur izolacji wielkości, dało większe kropelki (patrz "Inne protokoły i dane" Krok S5 dla wielkości pęcherzyków i kropel po odwirowaniu). Ponieważ zamierzonym zastosowaniem kropelek wytwarzanych za pomocą tego protokołu jest platforma do biernego wynaczynienia i akumulacji ze względu na ich mały rozmiar w porównaniu z mikropęcherzykami ^4,8, pożądane było jak najmniejsze populacje kropel. W związku z tym w protokole tym wykorzystano próbki mikropęcherzyków po zmieszaniu, które nie zostały wyizolowane przez wirowanie, nawet jeśli oznaczało to, że w końcowym roztworze obecne były niewrażliwe na ultradźwięki miceli, liposomy i pęcherzyki. Oznacza to, że procedury kwantyfikacji biodystrybucji będą generować sygnał dla wszystkich wstrzykniętych struktur i nie ograniczają się tylko do kropel. Ponieważ jednak te struktury o podobnej wielkości najprawdopodobniej kumulują się za pomocą mechanizmu pasywnego, który jest przede wszystkim podyktowany rozmiarem, nie podejrzewa się, że powinno to zmienić główne wnioski, które można wyciągnąć, jeśli platforma ta ma być wykorzystywana in vivo, chociaż wszystkie te aspekty powinny być rozpatrywane indywidualnie w zależności od kontekstu, w którym platforma może być używana. Testy z użyciem ramion eksperymentalnych z ultradźwiękami i bez nich można przeprowadzić, aby upewnić się, że to wrażliwe na ultradźwięki kropelki są odpowiedzialne za wszelkie zmiany w dystrybucji biologicznej, ponieważ tylko zespoły rdzeni perfluorowęglowych w roztworze będą reagować na ultradźwięki.

Po wstrząśnięciu fiolkę odstawiano na 15 minut i zaobserwowano przegrodę w fiolce (ryc. 3C w porównaniu z 3D). Selekcja wielkości za pomocą wyporu jest prostą metodą eliminacji większych struktur/pęcherzyków z aktywowanego roztworu mikropęcherzyków ^8,17. W tym przypadku cząstki o średnicach większych niż 5 μm zostały w większości usunięte po wybraniu wielkości (ryc. 4). Zakres wyboru rozmiaru można dostosować, kontrolując czas trwania wyboru rozmiaru¹⁷. Sheeran i wsp. wykazali, że brak wyboru rozmiaru może powodować powstawanie mikropęcherzyków, które zamykają naczynia krwionośne⁸.

Perfluorowęglowodory mają tę zaletę, że są biologicznie obojętne⁷. Podczas gdy temperatura wrzenia dekafluorobutanu wynosi -1,7 °C, powyżej temperatury ciała, kropelki nie parują natychmiast po wystawieniu na działanie 37 °C (ryc. 7B). Ponieważ kropelki są metastabilne w temperaturze 37 °C, do odparowania kropelek do postaci mikropęcherzyków^potrzebna jest dodatkowa energia akustyczna ^7,9. Poproski i wsp. wykazali kropelki porfiryny skondensowane przez zwiększenie ciśnienia²². Jest to opłacalna, a nawet niezbędna metoda w przypadku stosowania mniej gęstych perfluorowęglowodorów, ale wysokie ciśnienie może zniszczyć niektóre pęcherzyki w tym procesie. Oktafluoropropan (_C3F₈) ma temperaturę wrzenia -36,7 °C, więc do kondensacji kropel potrzebne jest zarówno chłodzenie, jak i zwiększanie ciśnienia. Jednak lżejszy perfluorowęglowodór prowadzi do mniej stabilnych kropel. Dodekafluoropentan (C_{, 5}, F_{, 12}) może prowadzić do bardziej stabilnych kropelek o temperaturze wrzenia 28 °C. Jest to jednak ciecz w temperaturze pokojowej i będzie potrzebowała silniejszych energii akustycznych do odparowania. W związku z tym przy wyborze gazu, w którym znajduje się ultradźwiękowy środek kontrastowy, oprócz parametrów jego wytwarzania, należy wziąć pod uwagę warunki jego zamierzonego zastosowania biologicznego. W tym protokole kąpiel izopropanolowa do kondensacji została ustawiona na -15 do -17 °C (krok 4.7.1 i krok 4.13), podczas gdy inne protokoły używały -10 °C ^5,6. Nawet w przypadku zwykłego rdzenia dekafluorobutanowego temperatura skraplania może się różnić w zależności od składu substancji pomocniczej, całkowitego stężenia lipidów i składu otoczki lipidowej. W przypadku stosowania innych preparatów może być wymagana optymalizacja, aby zapewnić prawidłową kondensację kropel bez powodowania zamarzania roztworu.

Ponieważ kropelki są mniejsze i bardziej stabilne niż ich prekursor^{mikropęcherzyków 7}, mogą lepiej wykorzystać mechanizmy pasywnej akumulacji do wynaczynienia do niektórych tkanek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak zwiększona przepuszczalność i efekt retencji niektórych typów nowotworów ^4,24. Dzięki fluorescencyjnym, optycznie absorbującym i akustycznym metodom detekcji¹⁴ możliwe jest użycie jednego preparatu do ilościowego określenia absorpcji. Ponadto platforma ta może być wykorzystana do zbadania, czy akustyczne odparowanie kropelek może poprawić frakcję dostarczanego czynnika powyżej pasywnych^{poziomów 16}. Aby określić ilościowo biodystrybucję czynnika w tkankach i narządach będących przedmiotem zainteresowania po wstrzyknięciu, należy wstrzyknąć zwierzęciu znaną ilość kropelek pirolipidów, ultradźwięki mogą być stosowane lub nie, w zależności od zestawu kontrolnego, zwierzę powinno zostać uśmiercone w określonym wcześniej punkcie czasowym, a narządy powinny zostać usunięte i zważone. Narządy powinny być homogenizowane, filtrowane, rozcieńczane w środkach powierzchniowo czynnych (detergentach) w celu decelularyzacji tkanki i oznaczane ilościowo za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej lub UV-Vis w celu uzyskania procentowej dawki wstrzykniętej na masę narządu w oparciu o sygnały Pyro. W Kroku 5.4.5 (Rysunek 5) i Kroku 5.5.5 (Rysunek 6) do rozerwania próbek użyto środka powierzchniowo czynnego Triton X-100 (detergentu), ponieważ jest on niefluorescencyjny przy długości fali 410 nm, a jego długości fal absorbancji nie pokrywają się z falami Pyro.

Mikropęcherzyki nie charakteryzowały się absorbancją UV-Vis. Ponieważ źródło lasera spektroskopu UV-Vis jest ustawione równolegle do detektora, wszelkie duże pęcherzyki mogą rozpraszać światło z dala od detektora, sprawiając, że wydają się bardziej absorbujące optycznie¹⁴. W przeciwieństwie do spektrofotometru UV-Vis, detektor spektrofotometru fluorescencyjnego jest/powinien być prostopadły do źródła lasera, aby zapobiec zakłóceniom źródła z detektorem. UV-Vis wykorzystano do ilościowego określenia absorbancji nienaruszonych i rozerwanych próbek kropel (Krok 5.4, Rysunek 5). Jako długości fal absorbancji wybrano od 300 do 800 nm, ponieważ dwa główne pasma absorbancji pirolipidów, pasmo Soreta (340 do 500 nm) i pasmo Q (640 do 730 nm), mieszczą się w tym zakresie¹⁴. Po złożeniu w kropelkę (lub inne struktury supramolekularne) pik pirolipidu w paśmie Q jest przesunięty ku czerwieni z 671 nm do 700 nm (ryc. 5). Kiedy ta supramolekularna struktura zostaje zakłócona przez środek powierzchniowo czynny, taki jak Triton, pik przesuwa się z powrotem do 671 nm^14,15. Na podstawie tego przesunięcia można stwierdzić, czy pirolipidy są w stanie złożonym, czy w stanie zakłóconym. Stosunek dwóch pików można wykorzystać do oszacowania rozpadu zespołów w czasie.

Do pomiarów fluorescencji (krok 5.5, rysunek 6) wybrano długość fali wzbudzenia 410 nm, ponieważ odpowiada ona pikowi pasma Soreta dla niezmontowanego pirolipidu¹⁴. Wybrano zakres długości fali emisji od 600 do 800 nm, ponieważ piki nienaruszonych zespołów w PBS i rozerwanych pirolipidów w Trytonie znajdują się w tym zakresie. Przesunięcie i wzrost fluorescencji (ryc. 6) między próbkami nienaruszonymi (704 nm w PBS) a zakłóconymi (674 nm w Trytonie) nastąpiły z powodu wygaszania wywołanego strukturą. W zmontowanej formie cząsteczki pirolipidów były upakowane blisko siebie, więc wygenerowane fotony zostały wchłonięte przez pobliskie cząsteczki pirolipidów. Jest to widoczne w nienaruszonej i zakłóconej wydajności hartowania. W związku z tym konieczne jest rozcieńczenie próbek w środku powierzchniowo czynnym (detergencie), takim jak 1% Triton X-100, aby złagodzić hartowanie i zmaksymalizować sygnał do ilościowego oznaczania biodystrybucji¹⁴.

Dla uproszczenia, ten sam liniowy przetwornik ultradźwiękowy został użyty zarówno do waporyzacji, jak i obrazowania (kroki 6.5 i 6.7, rysunek 7). Ten przetwornik ultradźwiękowy (Tabela Materiałów) był w stanie osiągnąć niezbędne szczytowe podciśnienia potrzebne do odparowania kropel⁸. Napełnianie zbiornika wodą dejonizowaną z kranu generuje gazy, które rozpuszczają się w wodzie (krok 6.1). Aby zminimalizować zakłócenia powodowane przez rozpuszczone gazy w wodzie podczas parowania i obrazowania, woda odpoczywała przez 24 godziny w zbiorniku, aby umożliwić gazom w wodzie zrównoważenie się z atmosferą (krok 6.1). Alternatywnie, woda dejonizowana może być odgazowana za pomocą wystarczająco dużego, zamykanego pojemnika podłączonego do wystarczająco silnej próżni. Obrazy ultrasonograficzne wykazały, że mikropęcherzyki zostały pomyślnie zagęszczone, ponieważ kropelki były nieobserwowalne/nieechogeniczne przy niskich ciśnieniach (ryc. 7B). Dopiero przy wyższych ciśnieniach wyjściowych kropelki odparowywały w obserwowalne, echogeniczne mikropęcherzyki (Rysunek 7D, 7F, 7H). Podczas gdy próbka po skondensowaniu kropelki zawiera micele i liposomy / pęcherzyki, zespoły te są nieechogeniczne i tylko kropelki mogą odparować do echogennych mikropęcherzyków. Kontrola PBS została przepuszczona przez fantom w celu ustalenia obrazów wyjściowych (ryc. 7A, 7C, 7E, 7G). Wraz ze wzrostem ciśnienia w PBS nie generowano żadnego kontrastu. Wskazywało to, że wysokie ciśnienie z przetwornika nie mogło wywołać spontanicznej kawitacji w samym ośrodku na bazie wody, a zatem cały inny wygenerowany kontrast można przypisać zastosowanemu ultradźwiękowemu środkowi kontrastowemu. Jeśli ciśnienie wyjściowe jest zbyt wysokie, wytworzone mikropęcherzyki mogą zostać zniszczone. Poprzez stopniowe zwiększanie ciśnienia i obserwację generowanego kontrastu, można znaleźć optymalne ciśnienie⁸. Okres półtrwania krążenia kropelek można określić w podobny sposób, odparowując kropelki w określonych odstępach czasu i obserwując kontrast generowany w czasie⁷.

Podsumowując, metodą kondensacyjną stworzono multimodalne kropelki przemiany fazowej o różnej zawartości pirolipidów. Wymiarowanie wykazało, że istnieje kompromis między obciążeniem pirolipidami a stężeniem mikropęcherzyków/kropel. Charakterystyki wykazały, że istniały różnice w nienaruszonych i zaburzonych formach zarówno pod względem absorbancji, jak i fluorescencji. Obrazowanie ultrasonograficzne wykazało, że kropelki były nieechogeniczne w temperaturze 37 °C i można je odparować do postaci echogenicznych mikropęcherzyków pod wystarczającym ciśnieniem. Charakterystyki wykazały również potencjał kropelek pirolipidów do zastąpienia towarzyszących środków diagnostycznych do testów biodystrybucji kropel lub akumulacji. Przyszłe prace będą dotyczyły progów waporyzacji w roztworze, stabilności w roztworze oraz czasu krążenia in vivo u nagich myszy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Brandonowi Helfieldowi za pomoc w budowie wymiennika gazu oraz dr Miffy Hok Yan Cheng za dyskusje techniczne. Autorzy pragną podziękować następującym źródłom finansowania: Ontario Graduate Scholarship, Canadian Institutes of Health Research, Terry Fox Research Institute oraz Princess Margaret Cancer Foundation.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-5000] (sól amonowa)Avanti	Polar Lipids	880220	Znany również jako "DSPE-PEG5K"
1-stearoyl-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholina	Avanti Polar Lipids	855775	Znany również jako "DSPC"
Folia aluminiowa	Dowolna marka
Uszczelki aluminiowe, Tear-Off	VWR	16171-840	Standardowe aluminium, średnica zewnętrzna 13 mm
Sonikator do kąpieli	Dowolna marka		Zdolny do sonikacji i podgrzewania do 70 > C,
Fiolki z nakrętką Bio-Stor	Scientific	BS20NABP	Plastic, 2 ml z osłoną, z przezroczystymi
fiolkami na surowicę ze szkła borokrzemianowego	O-ring VWR	16171-285	3 ml, wewnętrzna średnica otworu 7 mm, zewnętrzna średnica otworu 13 mm
Fiolka na próbkę ze szkła borokrzemianowego z fenolową nakrętką	VWR	66011-020	1,85 mL, krótka forma, średnica zewnętrzna 12 mm, wysokość 35 mm, rozmiar
nakrętki 8-425Fiolka ze szkła borokrzemianowego z zakręcaną nakrętką	Dowolna marka		Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości
Chloroform	Dowolna marka
Licznik redlic Elctrolyte Diluent	Dowolna marka		Kompatybilny z Coulter Counter
Dekafluorobutan (C4F10)	FluoroMed	355-25-9
Woda dejonizowana	Dowolna marka
Suchy lód (dwutlenek węgla)	Dowolna marka
Analizator cząstek z dynamicznym rozpraszaniem światła (DLS)	Dowolna marka		Możliwość regulacji temperatury
Zaciskarka EZ 13 mm	Wheaton	W225302	13 mm Standardowe uszczelki aluminiowe
E-Z Decapper, 13 mm	Wheaton	W225352	13 mm Standardowe aluminiowe uszczelki
Spektrofotometr fluorescencyjny	Dowolna marka		Możliwość wzbudzenia od 400 do 600 i wykrywania emisji od 300 do 800 nm, detektor prostopadły do źródła
laseraKuweta kompatybilna ze spektrofotometrem fluorescencyjnym	Dowolna marka		Może pomieścić co najmniej 2 ml, zdolne do 300 do 800 nm, wszystkie cztery strony są okna optyczne
Wymiennik gazowy	wykonany we własnym zakresie		Instrukcje montażu znajdują się w informacjach uzupełniających - "Inne protokoły i dane".
Szklane strzykawki	Dowolna marka		Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości
GLWR Custom Aperture Tube 10 um	Beckman Coulter	B42812	10 µ m otwór, kompatybilny z Beckman Coulter MultiSizer 4e
Glicerol	Dowolna marka
Izolowane pojemniki styrofaom z pokrywkami	Dowolna marka
Isopropanol	Dowolna marka
Korki gumowe do liofilizacji	VWR	71000-060	mm wewnętrzna średnica otworu, 13 mm zewnętrzna średnica otworu, 2-nożna, membrana chlorobutylowa
Membranowa pompa próżniowa	Sartorius Stedim	16694-1-60-06	Regulowane
ciśnienie Metalowe szczypce	Dowolna marka
Metanol	Dowolna marka
MS250 21 MHz Liniowy przetwornik ultradźwiękowy	VisualSonics		21 MHz, Zdolny do obrazowania w trybie B i nieliniowym.
Redlica		Beckman MultiSizer 4e	Możliwość sortowania od 0,2 i mikro; m do 6 i mikro; m
Nalgene Szybkoprzepływowe, sterylne, jednorazowe filtry próżniowe	Thermo Scientific	567-0010	Membrana polieterosulfonowa (PES), 0,1 i mu; m wielkość porów, objętość 1000 ml. Ponieważ Isoton II jest niesterylny, może wielokrotnie używać jednostek filtrujących
Igły, konwencjonalne	BD	305176	20 gauge, 1,5 cala długości
Azot	Dowolny marek		Upewnij się, że są zawory regulacyjne i rurki do kierowania przepływem. Konfiguracja będzie zależeć od marki i źródła.
Parafilm	Dowolna marka		Nazywana w protokole "folią woskową".
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Dowolna marka		Pipeta 1X, pH 7,4
	Dowolna marka		Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości
Końcówki do pipet	Dowolna marka		Rozmiary będą zależeć od pożądanych objętości
Plastikowe strzykawki	Dowolna marka		1 ml, 3 ml i 30 ml. Z połączeniami Luer Lock
Filtr membranowy z polieterosulfonu (PES)	Dowolna marka		0,2 i mikro; m wielkość porów
Glikol propylenowy	Dowolna marka
Pirofeoforbid sprzężony z 1-stearoilo-2-hydroksy-sn-glicero-3-fosfocholiną	Wyprodukowano we własnym zakresie		Znany również jako "Pyro-SPC". Patrz "Informacje uzupełniające - Inne protokoły i dane" w celu syntezy.
Termometr	dowolnej marki		(od -20 do 100 stopni; C)
Triton X-100	Dowolna marka		Znany również jako "2-[4-(2,4,4-trimetylopentan-2-ylo)fenoksy]etanol"
Ultraczysta woda	Dowolna marka		Typ 1 Czystość
Ultrafiolet– Spektrofotometr widzialny (UV-Vis)	Dowolna marka		Zdolny do absorbancji od 300 do 800 nm, rozdzielczość co najmniej 0,5 nm
Ultrafiolet– Spektrofotometr widzialny (UV-Vis) Kuweta kompatybilna, długość ścieżki 1 cm	Dowolna marka		Może pomieścić co najmniej 2 ml, zdolny do 300 do 800 nm
Eksykator próżniowy	dowolnej marki
Platforma obrazowania ultradźwiękowego Vevo 2100	VisualSonics		Przedkliniczny system obrazowania ultrasonograficznego
Vialmix	Bristol-Myers-Squibb		Nazywany w protokole "mieszadłem mechanicznym". Miesza przez 45 s.
Mikser Vortex	Dowolna marka

National 7

Bibliografia

Gramiak, R., Shah, P. M. Echocardiography of the aortic root. Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).
Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).
Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (8), 1298-1308 (2009).
Helfield, B. L., et al. Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors. Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891(2020).
Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).
Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).
Yoo, K., et al. Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).
Sheeran, P. S., et al. Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).
Sheeran, P. S., et al. More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).
Chen, C. C., et al. Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets. Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).
Wu, S. Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002(2018).
Lee, J. Y., et al. Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246(2017).
Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).
Zheng, G., et al. Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).
Dhaliwal, A., Zheng, G. Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery. Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).
Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations. Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376(2007).
Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications. Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001(2018).
Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).
Overchuk, M., et al. Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia. Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).
Feshitan, J., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
Paproski, R. J., et al. Porphyrin nanodroplets: Sub-micrometer ultrasound and photoacoustic contrast imaging agents. Small. 12 (3), 371-380 (2016).
Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs. Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).
Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Krople zmieniające fazę środki kontrastowe do USG kondensacja mikropęcherzyków przygotowanie filmu lipidowego charakterystyka fluorescencyjna charakterystyka absorbancji waporyzacja akustyczna rozkład wielkości kropli analiza biodystrybucji

Synteza i charakterystyka multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej