Artykuł metodologiczny

Przystępna cenowo i wydajna "domowa" platforma do badań behawioralnych Drosophila oraz towarzyszący jej protokół respirometrii mitochondrialnej larw

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62669

⸱

24 września 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Biomedicina, Universidade do Oeste Paulista

W tym artykule

Podsumowanie

Udostępniamy protokoły dla każdego, kto ma umysł "kultury tworzenia", aby rozpocząć budowę laboratorium do analizy ilościowej niezliczonych parametrów behawioralnych u Drosophila melanogaster, poprzez drukowanie 3D wielu niezbędnych elementów wyposażenia. Opisujemy również protokół respirometrii o wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem larw do łączenia danych dotyczących metabolizmu behawioralnego i mitochondrialnego.

Streszczenie

Przydatność Drosophila jako organizmu modelowego do badania ludzkich chorób, zachowań i podstawowej biologii jest niekwestionowana. Chociaż praktyczne, badania nad Drosophila nie są popularne w krajach rozwijających się, prawdopodobnie ze względu na błędne przekonanie, że założenie laboratorium i przeprowadzenie odpowiednich eksperymentów na tak małych owadach jest trudne i wymaga drogiej, specjalistycznej aparatury. Tutaj opisujemy, jak zbudować niedrogi flylab, aby ilościowo analizować niezliczone parametry behawioralne u D. melanogaster, drukując 3D wiele niezbędnych elementów wyposażenia. Dostarczamy protokoły do budowy wewnętrznych stojaków na fiolki, aren zalotów, aparatury do testów lokomotorycznych itp., które mają być używane do ogólnej konserwacji much i przeprowadzania eksperymentów behawioralnych z wykorzystaniem dorosłych much i larw. Udostępniamy również protokoły dotyczące korzystania z bardziej wyrafinowanych systemów, takich jak oksygraf o wysokiej rozdzielczości, do pomiaru zużycia tlenu w mitochondriach w próbkach larwalnych i wykazywania jego związku ze zmianami behawioralnymi larw w ksenotopowej ekspresji alternatywnej oksydazy mitochondrialnej (AOX). AOX zwiększa aktywność larw i oddychanie przecieku mitochondrialnego oraz przyspiesza rozwój w niskich temperaturach, co jest zgodne z termogeniczną rolą enzymu. Mamy nadzieję, że te protokoły zainspirują badaczy, zwłaszcza z krajów rozwijających się, do wykorzystania Drosophila do łatwego łączenia danych dotyczących zachowania i metabolizmu mitochondriów, co może prowadzić do uzyskania informacji o genach i/lub warunkach środowiskowych, które mogą również regulować ludzką fizjologię i stany chorobowe.

Wprowadzenie

Drosophila melanogaster została przedstawiona społeczności naukowej jako potencjalnie potężny organizm modelowy ponad 100 lat temu. Potencjał ten został mocno potwierdzony w kilku dziedzinach nauk biologicznych i biomedycznych, takich jak genetyka, ewolucja, biologia rozwojowa, neurobiologia oraz biologia molekularna i komórkowa. W rezultacie, sześć Nagród Nobla w dziedzinie medycyny lub fizjologii zostało przyznanych dziesięciu badaczom Drosophila, którzy znacząco przyczynili się do naszego zrozumienia dziedziczności, mutagenezy, odporności wrodzonej, rytmów okołodobowych, węchu i rozwoju1. Być może ważniejsze jest to, że D. melanogaster nie przestał dostarczać nam nowych modeli biologii i chorób człowieka, ponieważ szybkie wyszukiwanie w PubMed ujawnia prawie 600 publikacji w ciągu ostatnich 5 lat, w których użyto hasła "model drosophila" (2, stan na luty 2021 r.). W Stanach Zjednoczonych, gdzie Drosophila jest szeroko rozpowszechnionym organizmem modelowym w społeczności biomedycznej, około 2,2% wszystkich nagród badawczych R01 przyznanych przez NIH w 2015 r. zostało przydzielonych badaczom Drosophila3. Z kolei w Brazylii wyszukiwanie aktualnie finansowanych projektów na stronie internetowej Fundacji Badawczej Sao Paulo (FAPESP), najważniejszej agencji finansującej badania we wszystkich obszarach naukowych w stanie Sao Paulo, wykazało tylko 24 granty i stypendia, których głównym przedmiotem badań była Drosophila4. Biorąc pod uwagę wszystkie 13205 projektów obecnie finansowanych przez FAPESP (5, stan na luty 2021 r.), te 24 projekty Drosophila stanowią mniej niż 0,2% wszystkich projektów, czyli prawie 12 razy mniej niż NIH. Jeśli usuniemy finansowane projekty, które mają na celu badanie Drosophila z ekologicznego i/lub ewolucyjnego punktu widzenia, i założymy, że pozostałe projekty wykorzystują ten organizm jako model do zrozumienia ludzkich procesów biologicznych w zdrowiu i chorobie, stosunek ten spada do szokującego ~0,1%.

Właściwie, konieczne jest przeprowadzenie odpowiedniego badania, aby odkryć powody, dla których badania nad Drosophila w Brazylii/Sao Paulo nie wydają się być tak znaczące pod względem liczby finansowanych projektów. Hodowla Drosophila nie jest kosztowna6,7,8 i jest stosunkowo prosta, ponieważ w przeciwieństwie do kręgowców, do eksperymentów nie jest wymagana zgoda komisji bioetycznej9,10. Zgoda na pracę z genetycznie modyfikowanymi liniami muchowymi jest jednak wymagana w Brazylii11, co dodaje warstwę biurokracji nieodłącznie związaną z każdą pracą dotyczącą organizmów modyfikowanych genetycznie. Jednak prawdopodobnie nie przeszkodziłoby to zainteresowanym badaczom w zainicjowaniu flylabu. Spekulujemy, że błędne informacje na temat mocy modelu oraz na temat spodziewanych wysokich kosztów związanych z założeniem flylab i przeprowadzeniem znaczących eksperymentów są ważnymi czynnikami przy podejmowaniu tej decyzji. Podobnie jak w przypadku większości sprzętu i materiałów naukowych, odpowiednie aparaty do przeprowadzania ogólnych analiz utrzymania much i analiz behawioralnych muszą być importowane do Brazylii z Ameryki Północnej, Europy i/lub innych krajów, co jest kosztownym i niezwykle czasochłonnym procesem12,13.

Ostatnio pojawiła się alternatywa dla importu specjalistycznych urządzeń, ponieważ drukarki 3D stały się bardziej przystępne cenowo i dostępne dla każdej osoby, w tym dla badaczy Drosophila w krajach rozwijających się. Technologia druku 3D była szeroko stosowana w ciągu ostatnich 10 lat przez członków "kultury twórców", która opiera się na idei samowystarczalności, a nie poleganiu wyłącznie na produktach wytwarzanych przez firmę14. Taki pomysł od zawsze był obecny w akademickich laboratoriach badawczych na całym świecie, nic więc dziwnego, że drukarki 3D stały się standardowym wyposażeniem laboratoriów w wielu miejscach15,16. Od wielu lat drukujemy w 3D stojaki na muchy, areny do łączenia much, aparaty wspinaczkowe i inne urządzenia za ułamek ceny markowych odpowiedników. Obniżone koszty drukowania i montażu domowego sprzętu laboratoryjnego są klasycznie reprezentowane przez FlyPi, który można zbudować za mniej niż 100,00 € i służy jako mikroskop świetlny i fluorescencyjny, który jest w stanie wykorzystać zaawansowaną stymulację opto- i termogenetyczną genetycznie podatnego danio pręgowanego, Drosophila i nicieni15. W tym miejscu udostępniamy szereg protokołów dla każdego, kto chce zostać badaczem Drosophila (lub rozszerzyć swój własny istniejący flylab), aby wydrukować w 3D wiele niezbędnych materiałów. Inwestując czas i rozwijając trochę wiedzy specjalistycznej, czytelnik będzie nawet w stanie zoptymalizować przedstawione tutaj protokoły, aby drukować aparaty lepiej dostosowane do jego własnych potrzeb badawczych.

Jednakże, flylab to nie miejsce tylko dla "taniego" sprzętu, zwłaszcza gdy zamierza się powiązać analizy behawioralne z podstawowymi zjawiskami metabolicznymi. Byliśmy również zainteresowani rolą mitochondriów w modulacji wzorców zachowań Drosophila, ponieważ te organelle są odpowiedzialne za masową produkcję ATP w większości tkanek poprzez kilka szlaków metabolicznych, których produkty zbiegają się do fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS). Analiza zużycia tlenu w mitochondriach jako sposób na zrozumienie metabolizmu mitochondriów wymaga oksygrafu, który jest bardziej wyrafinowanym sprzętem, którego niestety nie można jeszcze wydrukować w 3D. Ponieważ OXPHOS wpływa praktycznie na wszystkie procesy komórkowe, ponieważ zależy od serii egzergonicznych reakcji redoks, które zachodzą w komórce17,18, wskaźniki zużycia tlenu oparte na utleniającym się substracie dostarczonym do mitochondriów mogą pomóc w ustaleniu, czy funkcjonowanie organelli jest przyczyną, czy konsekwencją określonego zachowania. Dlatego podajemy tutaj również protokół pomiaru zużycia tlenu w mitochondriach w próbkach larw, ponieważ zdajemy sobie sprawę, że zdecydowana większość opublikowanych protokołów koncentruje się na analizie próbek dorosłych. Pokazujemy, że zmiany w oddychaniu mitochondrialnym, indukowane przez transgeniczną ekspresję alternatywnej oksydazy Ciona intestinalis (AOX), prowadzą do zwiększonej ruchliwości larw w warunkach stresu zimna. Jest to najprawdopodobniej spowodowane termogenezą, ponieważ AOX jest niepompującą protonów oksydazą końcową, która może ominąć aktywność kompleksów OXPHOS III i IV (CIII i CIV), nie przyczyniając się do potencjału błony mitochondrialnej (ΔΨm) i produkcji ATP19,20,21. Żaden owad, w tym Drosophila, ani kręgowiec naturalnie nie posiada AOX21,22,23, ale jego wyrażenie w niezliczonych systemach modelowych24,25,26,27,28,29 z powodzeniem wykazano jego potencjał terapeutyczny w stanach ogólnego mitochondrialnego stresu oddechowego, zwłaszcza gdy jest on spowodowany przeciążeniem CIII i/lub CIV. AOX nadaje odporność na toksyczne poziomy antymycyny A24 i cyjanku24,25, i łagodzi różne fenotypy związane z dysfunkcją mitochondriów24,25,30,31,32. Fakt, że ekspresja AOX zmienia zachowanie larw i funkcję mitochondriów, uzasadnia bardziej dogłębne badania roli tego enzymu w metabolizmie i fizjologii komórek i tkanek metazoanu33,34.

Mamy nadzieję, że dzięki temu artykułowi przyczynimy się do podniesienia świadomości w społeczności naukowej krajów rozwijających się, takich jak Brazylia, że korzystanie z doskonałego zestawu narzędzi genetycznych, które prezentuje D. melanogaster, w połączeniu z wydajnymi i niedrogimi domowymi aparatami do analiz behawioralnych, może generować stosunkowo szybkie podstawowe dane badawcze na temat interesujących procesów biologicznych o znaczącym wpływie translacyjnym, wspieranie przyszłych badań terapeutycznych w badaniach klinicznych. Rozwinięcie takich ideałów wspólnotowych przyniosłoby ogromne korzyści drozofilom, badaczom medycznym oraz naukom biologicznym i biomedycznym. Co najważniejsze, przyniosłoby to korzyści całemu społeczeństwu, ponieważ finansowanie publiczne mogłoby być wykorzystywane w sposób bardziej translacyjny do zrozumienia i leczenia chorób ludzkich.

Protokoły, które tutaj udostępniamy do druku 3D, aparaty do flylabu zostały zaprojektowane do użytku z drukarką 3D RepRap, opartą na modelu Prusa I3 DIY dostępnym pod adresem35. Używamy 1,75-milimetrowego białego filamentu kwasu polimlekowego (PLA) (SUNLU) jako surowca do drukowania, platformy Tinkercad36 do projektowania modeli oraz oprogramowania Repetier-Host37 do konwersji STL na G-Code, co jest niezbędnym krokiem do dostarczenia współrzędnych do drukarki. Dalsza optymalizacja protokołów jest wymagana, jeśli czytelnik chce korzystać z alternatywnego sprzętu, materiałów i oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. 3D projekt modelu

UWAGA: Przepływ pracy dla druku 3D składa się z trzech podstawowych kroków: (1) Modelowanie 3D; (2) zaimportowanie modelu do oprogramowania do krojenia; oraz (3) wybór odpowiedniego filamentu, konfiguracja drukarki i wreszcie drukowanie. Podstawowy protokół modelowania małego stojaka/tacki na fiolki muchowe pokazano poniżej; Ten stojak jest przeznaczony do użytku ze standardowymi fiolkami muchowymi, które mają około 2,5 cm średnicy i 9,8 cm wysokości. W przypadku nowych projektów modeli, narzędzia dostarczane przez oprogramowanie Tinkercad pozwalają na łatwą obsługę trójwymiarowych konstrukcji, poprzez tworzenie elementów o różnych kształtach, rozmiarach i grubościach, zgodnie z własnymi potrzebami. Dla drozofilów, którzy po raz pierwszy zapuszczają się w sferę druku 3D, przestrzeganie poniższych protokołów, nawet ze wszystkimi ich szczegółami, może nadal być wyzwaniem, dlatego zdecydowanie zalecamy zapoznanie się z oprogramowaniem w celu uzyskania najlepszych wyników.

  1. Zaloguj się do Tinkercad online38 (Rysunek 1A). Aby uzyskać bezpłatny dostęp do platformy, wymagana jest wcześniejsza rejestracja z danymi osobowymi.
  2. Kliknij Utwórz nowy projekt, aby rozpocząć nowy projekt i odpowiednio zmień nazwę projektu w prawym górnym rogu okna. Naciśnij Enter, aby zostać przekierowanym do płaszczyzny roboczej projektu (Rysunek 1B).
  3. Sprawdź, czy płaszczyzna robocza ma prawidłowe wymiary 200 mm x 200 mm, klikając lewym przyciskiem myszy na Edytuj siatkę w prawym dolnym rogu (czerwony kwadrat w Rysunek 1B). W wyskakującym okienku (Rysunek 1C) upewnij się, że "Jednostki" to milimetry, a "Ustawienia wstępne" są domyślne. Wpisz 200.00 w polach "Szerokość" i "Długość", a następnie kliknij Aktualizuj siatkę, aby zapisać zmiany.
  4. Sprawdź, czy siatka przyciągania jest ustawiona na 1,0 mm (czerwony kwadrat w Rysunek 1B). Jeśli tak nie jest, kliknij menu rozwijane i wybierz 1,0 mm.
  5. W menu Kształty podstawowe po prawej stronie (niebieski kwadrat 2 w Rysunek 1B) wybierz solidne pole i przeciągnij je na środek płaszczyzny roboczej.
  6. Kliknij w dowolnym miejscu pola na płaszczyźnie roboczej lewym przyciskiem myszy, aby wyświetlić jego krawędzie i wierzchołki. Kliknij dowolny wierzchołek (który następnie zmieni kolor na czerwony), aby wyświetlić wymiary pola (czerwone kwadraty w Rysunek 1D). Kliknij lewym przyciskiem myszy na każdy wymiar i wpisz 130 mm dla długości (L), 130 mm dla szerokości (W) i 40 mm dla wysokości (H). Wyśrodkuj pole, przeciągając je na środek płaszczyzny roboczej.
  7. Kliknij na narzędzie Linijka w prawym górnym rogu ekranu (czerwony kwadrat 1 w Rysunek 1E). Natychmiast kliknij lewy dolny wierzchołek pola, jak pokazano w Rysunek 1E (czerwony kwadrat 2), aby ustawić punkt początkowy (x = 0, y = 0, z = 0) trójwymiarowego kartezjańskiego układu współrzędnych. Zauważ, że odległość między wybranym wierzchołkiem a punktem początkowym współrzędnych będzie teraz pokazana (czerwone kwadraty w Rysunek 1F), gdzie "A", "B" i "C" reprezentują odległość do osi x, y i z (która w tym przypadku powinna wynosić odpowiednio zero).
  8. Następnie wybierz puste pole (otwór) z menu Podstawowe kształty po prawej stronie (niebieski kwadrat 2 w Rysunek 1B) i przeciągnij je na płaszczyznę roboczą. Ustaw jego wymiary na 30 (dł.) x 30 (szer.) x 40 (wys.) mm i podnieś go o 2 mm od płaszczyzny roboczej, wpisując "2.00" w polu tekstowym obok zielonego grotu strzałki w prawym dolnym rogu pustego pola (czerwony kwadrat w Rysunek 1G). Umieść puste pole wewnątrz pełnego pola w odległości 2 mm od punktu początkowego współrzędnych x,y, wpisując "2.00" w polach tekstowych obok zielonych strzałek w lewym dolnym rogu pola (czerwone kwadraty w Rysunek 1H; porównaj z Rysunek 1G).
  9. Mając nadal zaznaczone puste pole, naciśnij CtrL+D na klawiaturze, aby wdrożyć polecenie "duplikat" i utworzyć nowe puste pole o dokładnie tych samych wymiarach. Umieść nowe puste pole w pełnym polu, obok pierwszego pustego pola, wpisując "34.00" w polu tekstowym obok zielonej strzałki wzdłuż osi y i "2.00" w polach tekstowych obok dwóch pozostałych zielonych strzałek (czerwone kwadraty w Rysunek 1I).
  10. Powtórz ten krok, dostosowując do prawidłowych odległości od punktu początkowego współrzędnych, aż całe pudełko zostanie wypełnione pustymi polami oddalonymi od siebie o 2 mm (Rysunek 1J).
  11. Zaznacz wszystkie pola (pełne i puste), klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając na cały obszar. Naciśnij CtrL+G na klawiaturze, aby uruchomić polecenie "group" i utworzyć pojedyncze pudełko z 16 pustymi miejscami na fiolki z muchami (Rysunek 1K). To jest ostateczny projekt stojaka na fiolki.
  12. Kliknij Eksportuj w prawym górnym rogu okna Tinkercad. W wyświetlonym oknie (Rysunek 1L) wybierz opcję Wszystko w projekcie obok opcji Uwzględnij, a następnie . STL w obszarze Do druku 3D jako typ pliku. Wybierz odpowiednią nazwę dla pliku projektu i zapisz go w odpowiednim miejscu w komputerze.

2. 3D drukowanie

UWAGA: W tej sekcji podajemy instrukcje, jak korzystać z pliku STL utworzonego w Kroku 1 i konwertować go na plik G-Code zawierający instrukcje drukowania na drukarce 3D. Jest to proces krojenia, do którego używamy oprogramowania Repetier-Host.

  1. Pobierz Plik Uzupełniający 1 i zapisz go w odpowiednim miejscu w komputerze. Jest to plik .rcp zawierający konfiguracje drukarek, które mają być używane poniżej. Aby uzyskać więcej informacji na temat typu pliku .rcp, odwiedź stronę39.
  2. Otwórz oprogramowanie Repetier-Host, które powinno być już zainstalowane na komputerze, postępując zgodnie z instrukcjami z37. Naciśnij CtrL+O na klawiaturze, aby otworzyć plik STL na komputerze utworzony w protokole 1.
  3. Po otwarciu kliknij na zaprojektowany stojak na fiolki i naciśnij R na klawiaturze, aby otworzyć menu edycji po prawej stronie ekranu (czerwony kwadrat 1 w Rysunek 2A). Wyśrodkuj obiekt na stole drukarskim, klikając przycisk Wyśrodkuj obiekt, oznaczony czerwonym kwadratem 2 w Rysunek 2A, na karcie Umieszczanie obiektów.
  4. Kliknij zakładkę Slicer (czerwony kwadrat 1 w Rysunek 2B) obok zakładki Umieszczanie obiektów, a następnie kliknij przycisk Konfiguracja (czerwony kwadrat 2 w Rysunek 2B) poniżej. Zwróć uwagę, że otworzy się nowe okno po lewej stronie, w którym można zdefiniować parametry drukarki, takie jak prędkość, grubość warstwy i uchwyty (zobacz więcej szczegółów w Dyskusji poniżej).
  5. Kliknij przycisk Importuj (czerwony kwadrat 3 w Rysunek 2E), wybierz Plik uzupełniający 1 z plików i naciśnij Enter. Zwróć uwagę, że ten plik .rcp (pobrany w kroku 2.1) zawiera parametry automatycznej konfiguracji drukarki, którą zoptymalizowaliśmy dla tego stojaka na fiolki.
  6. Aby zakończyć konfigurację parametrów drukowania, wybierz Brak dla Typ podpory w menu po prawej stronie (czerwony kwadrat 4 w Rysunek 2E), ponieważ drukowanie tego elementu nie wymaga podpory, aby zapobiec wygięciu lub innym deformacjom. W polu Gęstość wypełnienia (czerwony kwadrat 5 w Rysunek 2E) wybierz 20%, aby utworzyć solidną konstrukcję (więcej szczegółów na temat tych parametrów znajdziesz w Dyskusji poniżej).
  7. Kliknij Slice with CuraEngine w prawym górnym rogu ekranu, aby uruchomić program do krojenia i wygenerować G-Code, który zawiera informacje niezbędne drukarce do wydrukowania elementu. Zwróć uwagę, że w zakładce Podgląd wydruku w menu po prawej stronie (obok karty Slicer) pojawią się informacje o czasie i ilości materiału wymaganego do wykonania zadania drukowania (czerwony kwadrat 1 w Rysunek 2F).
  8. Kliknij Zapisz do wydruku SD, aby zapisać plik G-Code na karcie SD (czerwony kwadrat 2 w Rysunek 2F). Zwróć uwagę, że G-Code zawiera współrzędne 3D zaprojektowanego elementu, pocięte na warstwy, dla prawidłowego działania drukarki.
  9. Włóż kartę SD do drukarki 3D RepRap, a następnie postępuj zgodnie z informacjami wyświetlanymi na ekranie drukarki, aby wybrać drukowanie z karty SD.
  10. Wybierz G-Code file z półki na fiolki. Zwróć uwagę, że drukarka automatycznie się rozgrzeje i rozpocznie drukowanie zaprojektowanego elementu, co powinno zająć kilka godzin. Stojak (Rysunek 3A) powinien być gotowy do użycia natychmiast po zakończeniu zadania drukowania.

3. Aparaty do analizy behawioralnej

UWAGA: Kroki opisane w Protokołach 1 i 2 mogą być powtórzone z odpowiednimi poprawkami, aby wydrukować kilka potrzebnych elementów wyposażenia laboratorium. Zdajemy sobie jednak sprawę, że projektowanie nowych elementów może być trudne i czasochłonne dla początkujących użytkowników Tinkercada, dlatego zamiast dostarczać protokoły krok po kroku, jak zaprojektować wszystkie modele, udostępniamy do pobrania kilka modeli projektowych, które stworzyliśmy jako pliki STL (patrz Pliki uzupełniające 2-11).

  1. Pobierz plik uzupełniający 2 dla modelu małego lejka (Rysunek 3B), rutynowo używanego w laboratoriach muchowych, aby pomóc w przenoszeniu dorosłych much do nowych fiolek lub butelek, unikając pełzania much po wewnętrznych ściankach tych pojemników w celu ucieczki.
  2. Pobierz plik uzupełniający 3 dla podpórki pod matę do stukania (Rysunek 3C), która może pomieścić piankę etylenowo-octanu winylu lub grubą bawełnianą matę, na którą można stukać szklanymi fiolkami lub butelkami, gdy przerzuca się muchy do nowych pojemników ze świeżo przygotowanym jedzeniem.
  3. Pobierz plik uzupełniający 4 i plik uzupełniający 5 dla modelu statywu do aparatu, który nazwaliśmy Stalker (Rysunek 3D).
    UWAGA: Urządzenie umożliwia umieszczenie dowolnej kamery (profesjonalnej, kamer internetowych, telefonów komórkowych itp.) na podstawie, na której można obrazować lub nagrywać wideo szalkę Petriego zawierającą larwy lub dorosłe muchy. Stalker pozwala na obrazowanie zachowań zwierząt, które odbywają się w poziomie, zawsze w tej samej odległości od szalki Petriego, co pozwala uniknąć wprowadzania zmienności do pomiarów eksperymentalnych, jeśli nagrania muszą być wykonane na przykład w różnych dniach lub jeśli kamera musi być używana do innego celu pomiędzy nagraniami. Aparatura jest wygodnie modułowa i można ją łatwo zmontować po wydrukowaniu podstawy i góry z pliku uzupełniającego 4, a boków z pliku uzupełniającego 5. Kwadraty o długości 1cm2 u podstawy, które można podświetlić za pomocą trwałego markera, pomagają śledzić dystans przebyty przez poszczególne zwierzęta. Wydrukuj aparat (przynajmniej podstawę) za pomocą białego filamentu, tak aby kontrast między tłem a zwierzętami był wystarczający, aby oprogramowanie śledzące mogło zidentyfikować każdą muchę.
  4. Pobierz plik uzupełniający 6 do projektu do druku Fly Motel (Rysunek 3E), który ma dziesięć aren zalotów i godowych (pomieszczeń) zorganizowanych w sposób ułatwiający nagrywanie wideo dziesięciu indywidualnych par godowych jednocześnie. Zauważ, że Fly Motel jest oparty na urządzeniu opublikowanym w40, gdzie znajduje się szczegółowe wyjaśnienie jego użycia w badaniach behawioralnych. Oprócz części wydrukowanych w 3D, aparat wymaga 12 (3 x 8 mm) do mocowania górnej części do dolnej w celu stabilizacji zmontowanego urządzenia, płyty akrylowej (60 x 60 x 3 mm) oraz zamka błyskawicznego. Ponieważ konstrukcja Fly Motel jest bardziej złożona, udostępniamy również film instruktażowy (plik uzupełniający 7), jak go prawidłowo złożyć, biorąc pod uwagę, że wszystkie wymagane elementy i śrubokręt są dostępne.
  5. Pobierz plik uzupełniający 8 dla modelu labiryntu T-Maze (Rysunek 3F), który jest używany do testów pamięciowych z użyciem dorosłych muszek. Szczegółowe wyjaśnienie, w jaki sposób T-Maze jest używany do tego, aby muchy kojarzyły odpychające bodźce zapachowe z ich fototropowym zachowaniem, znajduje się w oryginalnej publikacji41. Aparat wykorzystuje również dwie półprzezroczyste stożkowe rurki o pojemności 15 ml, które są powszechnie spotykane w każdym laboratorium i są przymocowane do okrągłych otworów o szerokości 2 cm z każdej strony centralnego elementu. Zauważ, że drukowanie T-Maze wymaga podpory (zobacz więcej szczegółów w legendzie do Rysunek 2). Wybierz "Wszędzie" dla Typu podpory (czerwony kwadrat 4 w Rysunek 2E) po wykonaniu kroków 2.1-2.6 powyżej.
  6. Pobierz Plik Uzupełniający 9 i Plik Uzupełniający 10 w celu zaprojektowania drukowalnych części naszej wersji aparatury do szybkich iteracyjnych testów geotaksji ujemnej (RING) (Rysunek 3G), używanej do wykonywania testów wspinaczkowych z dorosłymi muchami o kilku genotypach lub warunkach środowiskowych jednocześnie, generując wyniki w bardziej ustandaryzowany i bardziej przepustowy sposób42. Aparat RING jest również modułowy, a oprócz części drukowanych w 3D wymaga innych elementów, które można łatwo kupić online lub w sklepie z narzędziami po niskich kosztach: dwa wałki rektyfikowane Φ8 x 300 mm, cztery łożyska liniowe Φ8 mm, gumki (lub kawałki sznurka), kawałek drewna o wymiarach 240 x 60 x 20 mm na podstawę, i osiem wkrętów do drewna (8 mm) do przymocowania wydrukowanych części do drewnianej podstawy. Pobierz plik uzupełniający 11, aby uzyskać instrukcje dotyczące montażu urządzenia po wydrukowaniu lub zakupie wszystkich części. Szczegółowe wyjaśnienie, jak korzystać z aparatu RING, znajduje się w oryginalnej publikacji42.

4. Test mobilności larw

UWAGA: Zoptymalizowaliśmy ten protokół, pierwotnie oparty na Nichols et al.42, aby zbadać wpływ ekspresji AOX na rozwój Drosophila w warunkach stresu zimna. Linie 3xtubAOX25 i w1118, użyte jako przykłady larw eksprymujących i kontrolujących AOX, odpowiednio, były hodowane na standardowej diecie24 w temperaturze 12 °C, zgodnie z Saari et al.34. Zalecamy ten protokół do analizy ruchliwości próbek larw dowolnej choroby genetycznej, hodowanych w dowolnych warunkach środowiskowych

.
  1. Przygotuj 2% płytki agarowe, gotując równoważną ilość agaru w wodzie dejonizowanej, wlewając do szalek Petriego o wymiarach Φ90 X 15 mm i pozwalając im zestalić się w temperaturze pokojowej. W przypadku płytek o końcowej objętości 20 ml każda należy użyć 0,4 g agaru.
  2. Ostrożnie zebrać wędrujące larwy L3 z boku fiolek/kolb hodowlanych za pomocą kleszczy z okrągłą końcówką lub szczotki i umieścić osobniki na szalce Petriego o wymiarach Φ90 x 15 mm z dejonizowaną wodą na mniej niż 10 sekund, aby spłukać cząsteczki pokarmu przyczepione do ich ciała.
  3. Przenieś pojedyncze larwy do naczyń z agarozą i odczekaj 5 minut, aż zwierzęta się zaaklimatyzują.
  4. Umieść szalki zawierające pojedynczą larwę na papierze milimetrowym (siatka 0,2cm2) i policz liczbę linii przeciętych przez zwierzę przez 1 minutę, gdy porusza się na wierzchu agaru. Każda przecięta linia reprezentuje odległość 2 mm. Powtórz procedurę z tą samą osobą 10-15 razy, aby uzyskać kontrpróby techniczne.
  5. Powtórzyć krok 4.4 z co najmniej 8-10 osobnikami z różnych probówek/kolb, hodowanymi w różnym czasie, w celu uzyskania biologicznych powtórzeń tej samej linii.
  6. Powtórz kroki 4.4 i 4.5, aby uzyskać dane dla drugiej linii muchowej (lub dla tylu linii, ile zamierza się przeanalizować).
  7. Te same pojedyncze larwy, które zostały użyte w krokach 4.4-4.6, mogą być wykorzystane do uzyskania dodatkowych danych na temat ruchów ciała poprzez umieszczenie szalek agarowych z pojedynczą larwą pod mikroskopem stereoskopowym i zliczanie liczby skurczów perystaltycznych ściany ciała przez 1 minutę. Uzyskanie kontrprób technicznych i biologicznych w celu oszacowania średniej ruchliwości między analizowanymi liniami much.
  8. Zastosować test statystyczny w celu obliczenia prawdopodobieństwa, że wartości tych parametrów ruchliwości larw będą różne wśród linii zainteresowania. Ponieważ porównujemy tutaj dane tylko z dwóch linii, można zastosować test t Studenta.

5. Respirometria mitochondrialna z wykorzystaniem homogenatów larw

UWAGA: Poniższy protokół został zoptymalizowany do pomiaru zużycia tlenu w mitochondriach z homogenatów larw linii 3xtubAOX i kontrolnej w1118, hodowanych w temperaturze 12°C, ale zalecamy również jego stosowanie do próbek larw o dowolnym stanie genetycznym i środowiskowym. Zdajemy sobie sprawę, że przeprowadzanie takich eksperymentów nie powinno być uwzględniane jako "przystępny" cel dla "domowej" flylab, w przeciwieństwie do wszystkich innych protokołów, które przedstawiamy w tym artykule, ponieważ laboratorium musi dokonać znacznej inwestycji początkowej, aby nabyć oksygraf o wysokiej rozdzielczości. Protokół ma być używany z Oxygraph-2k (O2k) i oprogramowaniem DatLab firmy Oroboros Instruments, więc dalsza optymalizacja jest wymagana, jeśli czytnik chce skorzystać z alternatywnego sprzętu.

  1. Włącz O2k i uruchom oprogramowanie DatLab w komputerze podłączonym do oksygrafu. Pręty magnetyczne wewnątrz komór testowych powinny zacząć mieszać się automatycznie. Usuń roztwór do przechowywania etanolu z komór.
  2. Umyj komory co najmniej 3 razy 100% etanolem i 3 razy ultraczystą wodą.
  3. W DatLab okno O2k Control otworzy się automatycznie. W polu Temperatura bloku [°C] wprowadź 12 °C (lub preferowaną temperaturę w zakresie 2-47 °C) i naciśnij OK.
  4. Drugie okno, Edytuj eksperyment, otworzy się automatycznie. Wprowadź nazwy próbek w polach Próbka, zgodnie z tym, co zostanie dodane w komorach A i B, a następnie naciśnij Zapisz.
  5. Dodać 1800 μl buforu testowego (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM Hepes, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 2% BSA, pH 7,4) do każdej komory i częściowo je zamknąć, nadal umożliwiając wymianę tlenu z powietrzem zewnętrznym. Pozwól, aby sygnały stężenia tlenu i strumienia tlenu ustabilizowały się, wykazując minimalne wahania przez co najmniej 10 minut. Ten krok zapewni kalibrację sprzętu przy użyciu powietrza zewnętrznego w dniu eksperymentu (patrz kroki 6.3 i 6.4 poniżej, aby uzyskać więcej informacji na temat kalibracji eksperymentalnych).
  6. Na etapie kalibracji powietrza należy rozpocząć przygotowanie próbki, ostrożnie pobierając z probówek/kolb hodowlanych 20 wędrujących larw o odpowiednim genotypie, używając kleszczy lub małego pędzla.
  7. Szybko, ale dokładnie wypłukać każdą larwę wodą dejonizowaną lub 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 i 2 mM KH2PO4) i przenieść je do 1 ml szklanego homogenizatora na lodzie, zawierającego 500 μl lodowatego buforu izolacyjnego (250 mM sacharozy, 5 mM Tris HCl, 2 mM EGTA, pH 7,4)
  8. Homogenizować całe larwy za pomocą 5 pociągnięć i wlać homogenat do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie.
  9. Dodać 300 μl buforu izolacyjnego do szklanego homogenizatora, następnie zmacerować pozostałe tkanki larw za pomocą 3 pociągnięć i ponownie wlać homogenat do tej samej probówki do mikrowirówki na lodzie.
  10. Dodać 200 μl buforu izolacyjnego do szklanego homogenizatora, następnie macerować pozostałe tkanki larwalne za pomocą 2 pociągnięć i ponownie wlać homogenat do tej samej probówki do mikrowirówki na lodzie.
  11. Wymieszać końcowy homogenat (~1 ml), delikatnie odwracając probówkę dwa razy i trzymać ją na lodzie do czasu przetworzenia drugiej próbki.
  12. Powtórzyć kroki 5.6-5.11 w celu uzyskania homogenatu larwalnego drugiego genotypu.
  13. Otworzyć komory oksygraficzne A i B i przenieść 200 μl każdego homogenatu do buforu testowego w każdej komorze, który w tym miejscu musi mieć dokładnie temperaturę 12 °C. Całkowicie zamknij komory i pozwól, aby sygnały stężenia tlenu i strumienia tlenu ustabilizowały się przez około 10 minut.
  14. Pomiary zużycia tlenu należy rozpocząć od dodania do każdej komory 5 μL roztworu 2 M pirogronianu, 2 M proliny (końcowe stężenie w komorach = 5 mM każda) i 7,5 μL roztworu 0,4 M jabłczanu (1,5 mM). Odczekaj co najmniej 5 minut na ustabilizowanie sygnału. Należy pamiętać, że w tym momencie mitochondria zostaną naładowane utleniającymi się substratami, aby zainicjować reakcje cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA). Jakikolwiek wzrost sygnału zużycia tlenu może wynikać z funkcji rozprzęgania białek (lub z powodu innych zjawisk rozprzęgających) i może być wykorzystany do obliczenia ogólnego oddychania niesprzężonego (określanego również jako oddychanie nieszczelne przy braku adenylanów, LN- patrz Reprezentatywne wyniki w celu uzyskania szczegółowych informacji).
  15. Dodać do każdej komory 4 μl roztworu 0,5 M ADP (1 mM) i odczekać co najmniej 5 minut na stabilizację sygnału. Zwykle natychmiast obserwuje się znaczny wzrost sygnału zużycia tlenu, co odpowiada oddychaniu oksydacyjnemu fosforylacyjnemu (OXPHOS). Zdecydowana większość tego oddychania OXPHOS jest napędzana przez kompleks I (CI).
  16. Dodać do każdej komory 2 μl roztworu 0,05 M antymycyny A (0,05 mM) w celu zahamowania CIII i odczekać co najmniej 5 minut na stabilizację sygnału. Dla próbki kontrolnej w1118 należy zaobserwować spadek sygnału zużycia tlenu do poziomów podstawowych obserwowanych przed dodaniem pirogronianu, proliny i jabłczanu. Oddychanie mitochondrialne od larw wykazujących ekspresję AOX będzie częściowo odporne na antymycynę-A, ponieważ elektrony mogą być teraz kierowane do AOX. Około 40% całkowitego oddechu OXPHOS powinno pozostać po zahamowaniu CIII, które powinno być w całości wspierane wyłącznie przez AOX.
  17. Dodać do każdej komory 4 μl roztworu 0,1 M galusanu propylu (0,2 mM) w celu zahamowania AOX i odczekać co najmniej 15 minut na stabilizację sygnału. Poziomy zużycia tlenu w próbkach larw wykazujących ekspresję AOX powinny teraz spaść do poziomu podstawowego obserwowanego przed dodaniem pirogronianu, proliny i jabłczanu. Spadek ten dowodzi, że obserwowane oddychanie oporne na antymycynę-A jest spowodowane funkcją AOX.
  18. Dodać do każdej komory 1 μl 0,01 M rotenonu (0,005 mM) w celu zahamowania CI i odczekać co najmniej 5 minut na stabilizację sygnału w celu uzyskania sygnału zużycia tlenu przez próbkę niezależnie od oddychania mitochondrialnego. Sygnał ten jest zwykle tak niski, jak ten obserwowany przed dodaniem pirogronianu, proliny i jabłczanu.
  19. Zapisz eksperyment i zamknij oprogramowanie DatLab.

6. Przetwarzanie danych respirometrii mitochondrialnej

UWAGA: Wartości zużycia tlenu są uzyskiwane jako średnia sygnałów strumienia tlenu w określonym okresie czasu i są wyrażone jako pmol O2 zużyte na sekundę na mg całkowitego białka w próbce. Wartości są najpierw porównywane z maksymalnym stężeniem tlenu dostępnym w buforze testowym w dniu doświadczenia, w oparciu o temperaturę doświadczalną (określaną jako nasycenie powietrza) oraz minimalne stężenie tlenu, które jest ustalane wcześniej w każdej komorze przez dodanie Na2S2O4 do buforu testowego (patrz 43 zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi uzyskania kalibracji tlenu zerowego). Wartości są również normalizowane przez ilość białka całkowitego w homogenatach larw dodanych do buforu testowego każdej komory.

  1. Określ całkowite stężenie białka w każdej próbce za pomocą metody Bradforda44. Ponownie otwórz zapisany eksperyment w oprogramowaniu DatLab, naciśnij Eksperyment w górnym menu, a następnie Edytuj. W otwartym oknie należy w sekcji Jednostka wybrać mg i w sekcji Ilość wprowadzić ilość białka zawartego w 200 μL próbki dodanej w każdej komorze. Stężenie zostanie automatycznie obliczone przez oprogramowanie, biorąc pod uwagę całkowitą objętość komory wynoszącą 2 ml. Naciśnij przycisk Zapisz.
  2. Naciśnij pozycję Wykres w górnym menu, a następnie wybierz wykresy. W otwartym oknie wybierz Strumień na masę dla obu wykresów (1 i 2, które odnoszą się odpowiednio do komór A i B). Naciśnij przycisk OK. Wynik eksperymentu jest teraz znormalizowany przez stężenie białka w próbkach (pmol O2/s/mg białka całkowitego).
  3. W prawym górnym rogu każdego wykresu (1 i 2) na głównej stronie wyników eksperymentu kliknij na Stężenie O2. Wzdłuż osi x zidentyfikuj zakres czasu przed dodaniem próbek do komór, w którym sygnały stężenia tlenu i strumienia są bardzo stabilne.
    1. Naciśnij i przytrzymaj Shift na klawiaturze komputera, kliknij lewym przyciskiem myszy na początkowo wybranym czasie, przeciągnij kursor wzdłuż osi czasu, aby wybrać żądany region, a następnie zwolnij przycisk myszy. Wykonaj tę procedurę dla każdego z wykresów z osobna.
    2. Kliknij dwukrotnie niebieskie paski wybranych obszarów u dołu wykresów i wpisz "powietrze", aby wskazać, że są to wybrane obszary używane do obliczania nasycenia powietrza tlenem.
  4. Kliknij Kalibracja na górnym pasku menu i wybierz A: Tlen, O2, aby skalibrować komorę A. W otwartym oknie sprawdź, czy wybrano O2 Calib (kolor żółty).
    1. W celu kalibracji zera kliknij Kopiuj z pliku i wybierz plik z wcześniej wykonaną kalibracją zera tlenu (patrz 43 dla wytycznych producenta).
    2. W polu Air Calibration (Kalibracja powietrza) wybierz opcję Air (Powietrze selektora) w kolumnie Select Mark (Wybierz znacznik). Kliknij Kalibruj i kopiuj do schowka.
  5. Kliknij Kalibracja na górnym pasku menu, wybierz B: Tlen, O2 i powtórz krok 6.4, aby skalibrować komorę B.
  6. W prawym górnym rogu każdego wykresu (1 i 2) głównej strony z wynikami eksperymentu kliknij na O2 strumień na masę. Wybierz żądane stabilne obszary sygnału zużycia tlenu, przytrzymując Shift na klawiaturze, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając kursor wzdłuż osi czasu. Stabilne regiony wybrane między dodatkami pirogronianu/proliny/jabłczanu i ADP reprezentują LN; między ADP a antymycyną A, OXPHOS; między antymycyną A a galusanem propylu (po zahamowaniu CIII), oddychanie oporne na antymycynę A; między galusanem propylu a rotenonem (po zahamowaniu CIII+AOX), oddychanie resztkowe; po rotenonie (po inhibicji CI+CIII+AOX), resztkowe oddychanie niemitochondrialne. Kliknij dwukrotnie na czerwone paski zaznaczonych obszarów u dołu wykresów i wprowadź odpowiednie etykiety.
  7. Kliknij Znaczniki na górnym pasku menu, a następnie Statystyki. W zakładce Pokaż w otwartym oknie odznacz wszystkie opcje z wyjątkiem strumienia O2 na masę. Na karcie Select (Wybierz) w tym samym oknie wybierz komorę A, aby uzyskać dane dotyczące oddychania dla pierwszej próbki. Kliknij Kopiuj do schowka i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego. Powtórzyć procedurę w celu uzyskania danych dla drugiej próbki w komorze B.
  8. W arkuszu kalkulacyjnym odejmij wszystkie wartości oddychania przez resztkowe oddychanie niemitochondrialne (dane po dodaniu rotenonu). Oblicz średnie z wielu powtórzeń eksperymentalnych i wykreśl dane zgodnie z preferencjami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Postępując zgodnie z krokami opisanymi w Protokołach 1 i 2, można zaprojektować prosty stojak na fiolki z muszkami oraz przetworzyć model w formacie STL w programie do slicingu, aby wygenerować współrzędne dla drukarki 3D. Rysunek 3A przedstawia wydrukowany egzemplarz modelu obok jego projektu. Mamy również nadzieję, że krok 1 pozwoli nabyć podstawowe umiejętności korzystania z kształtów dostępnych na platformie Tinkercad w celu tworzenia użytecznych urządzeń laboratoryjnych. Rozwijanie tych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Udostępnione tutaj protokoły druku 3D i pliki STL mają na celu ułatwienie konfiguracji nowego flylabu lub zwiększenie repertuaru aparatów w istniejącym ośrodku behawioralnym Drosophila , przy użyciu sprzętu "domowej roboty". Strategia druku 3D może być szczególnie przydatna w krajach rozwijających się, takich jak Brazylia, gdzie badania z wykorzystaniem Drosophila jako organizmu modelowego do badania biologii człowieka wydają się być niedostatecznie reprezentowane, a specjalistyczny sprzęt jest kosztown...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Emily A. McKinney za angielską redakcję manuskryptu. G.S.G. było wspierane przez stypendium Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, numer grantu 141001/2019-4). M.T.O. pragnie podziękować za dofinansowanie z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, granty o numerach 2014/02253-6 i 2017/04372-0) oraz CNPq (numery grantów 424562/2018-9 i 306974/2017-7). C.A.C.-L. Pragnie podziękować za wewnętrzne wsparcie finansowe ze strony Universidade do Oeste Paulista. Praca z genetycznie zmodyfikowanymi liniami Drosophila została zatwierdzona przez Lokalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (CIBio) Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal, na mocy protokołów 001/2014 i 006/2014, oraz przez Krajowy Komitet Techniczny ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (CTNBio), na mocy protokołów 36343/2017/SEI-MCTIC, 01200.706019/2016-45 i 5488/2017.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drukarka 3D RapRepPopularna drukarka 3D oparta na trybie Prusa I3 DIY, instrukcje dostępne w
https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/ 3xtubAOX fly lineHowy Jacobs´ s lab, Tampere UniversityLinia Drosophila wyrażająca gen AOX z C. intestinalis pod kontrolą konstytutywnego promotora &alfa;-tubuliny. 5 i 6 kopii tego konstruktu jest obecnych odpowiednio u mężczyzn i kobiet w homo/półkrwi, po jednej w każdym z chromosomów X, 2 i 3,
Płytka60 x 60 x 3 mm
ADPSigma-AldrichA2754adenozyno-5′-difosforan sodu (numer CAS 20398-34-9); ≥ 95%; masa cząsteczkowa = 427,20 g/mol; rozpuszczalność w wodzie przy 50 mg/ml
Antimycin-ASigma-AldrichA8674Antymycyna A firmy Streptomyces sp. (numer CAS 1397-94-0); masa cząsteczkowa ~ 548,63 g/mol; rozpuszczalność w 95% etanolu przy 50 mg/ml
AgarKasvK25-611001Do stosowania bakteriologicznego; proszek; substancja zestalająca (12-20 g/L)
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA7030Frakcja szoku cieplnego, wolna od proteazy, wolna od kwasów tłuszczowych, zasadniczo wolna od globulin (numer CAS 9048-46-8); pH 7; ≥ 98%; rozpuszczalność w wodzie 40g/ml
dejonizowana
EGTASigma-AldrichE4378Glikol-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowy (numer CAS 67-42-5); ≥ 97%; masa cząsteczkowa = 380,35 g / mol
Etanol 99,5%
PiankaMożna zastąpić grubymi kawałkami bawełny
PapierSiatka 0,2 cm2
HepesSigma-AldrichH4034Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (numer CAS 7365-45-9), Certyfikat BioPerformance; ≥ 99,5% (miareczkowanie), testowane na hodowlach komórkowych; masa cząsteczkowa = 238,30 g / mol
HomogenizatorSartoriusRęczny homogenizator szklany (S), 1 mL; składa się z cylindra wykonanego ze szkła borokrzemianowego i tłoka S; często używany do prostego przygotowania próbek, np. kruszenia próbek tkanek.
KClAmresco0395-2Chlorek potasu (numer CAS 7447-40-7); ≥ 99,0%; masa cząsteczkowa = 74,55 g/mol
KH2PO4Sigma-AldrichP5379Fosforan potasu jednozasadowy (numer CAS 7778-77-0); Odczynnik Plus; masa cząsteczkowa = 136,09 g / mol
Łożyska liniowe (LM8UU)8 mm, dowolnej marki
JabłczanSigma-AldrichM1000Kwas L-(-)-jabłkowy (numer CAS 97-67-6); ≥ 95-100%; masa cząsteczkowa = 134,09 g/mol), rozpuszczalność w wodzie: 100 mg/mL. Roztwór ma pH dostosowane do około 7,0.
MgCl2Amresco0288-1KGChlorek magnezu, sześciowodny (numer CAS 7791-18-6); 99%-102%; masa cząsteczkowa = 203,3 g/mol
do mikrowirówek1,5 ml; Stopniowane co 100&mikro; L, autoklawowalne
Na2HPO4Amresco0348-1KGFosforan sodu, dwuzasadowy, siedmiowodny (numer CAS 7782-85-6); 98-102%; masa cząsteczkowa = 268.07 g/mol
NaClHoneywell31434-1KGChlorek sodu (numer CAS 7647-14-5); ≥ 99,5%; Masa cząsteczkowa 58,44g/mol. Wyłącznie do użytku laboratoryjnego.
Oxigraph-O2kOroboros10000-02Seria DG; O2k-Core: zawiera jednostkę główną O2k z obudową ze stali nierdzewnej, zestaw montażowy O2k, dwa OroboPOS (polarograficzne czujniki tlenu) i zestaw serwisowy OroboPOS, oprogramowanie DatLab, zintegrowany system ssący ISS oraz zestaw do miareczkowania O2k.
MarkerNajlepiej czarne
szalkiSzalki 90 X 15 mm; powszechnie stosowane do hodowli bakteriologicznych
Filament do druku 3D PLAQuantumDruk 3Dhttp://quantum3dprinting.com/Wysokiej jakości filament kwasu polilatynowego (PLA), zdecydowanie zalecane, (rolka 1,0 kg), dowolnej marki
ProlineSigma-AldrichP0380L-prolina (numer CAS 147-85-3); proszek; 99%; masa cząsteczkowa = 115.13 g/mol
Galusan propyluSigma-AldrichP3130Galusan propylu (numer CAS 121-79-9); proszek; ≥ 98%; masa cząsteczkowa = 212,2 0 g / mol; rozpuszczalność w etanolu przy 50 mg/ml
PirogronianSigma-AldrichP2256Pirogronian sodu (numer CAS 113-24-6), ≥ 99%; masa cząsteczkowa = 110,04 g/mol; rozpuszczalność w wodzie przy 100 mg/ml
Rektyfikowane wały8 x 300 mm, dowolnej marki
RotenoneSigma-AldrichR8875Rotetone (numer CAS 83-79-4); ≥ 95%, masa cząsteczkowa 394,42 g/mol
Gumki recepturkiMożna zastąpić kawałkami sznurka
ŚrubokrętDo montażu niektórych urządzeń wydrukowanych w 3D
Screews
Rozmiar co najmniej 32 MB; zwykle dostarczany z drukarkami 3D
Oprogramowanie Repetier HostHot-World GmbH & Co. KGhttps://www.repetier.com/Doskonałe oprogramowanie do krojenia, dostępne bezpłatnie
Oprogramowanie TinkercadAutodeskhttps://www.tinkercad.comoprogramowanie do projektowania modeli 3D, dostępne bezpłatnie
Mikroskop stereoskopowyLeicaM-80Mikroskop stereoskopowy, zoom 7,5-60X + źródło światła LED Leica cls 150
SacharozaMerck107,651,000Sacharoza do użytku mikrobiologicznego (numer CAS 57-50-1);
TrisAmersham Biosciences17-1321-01Tris (hydroksymetylo)-aminometan (numer CAS 77-86-1); 99,8-100,1%; masa cząsteczkowa 121,14 g/mol
Pęseta/kleszczeStarkST08710Pęseta histologiczna, prosta, okrągła końcówka, 12 cm, stal nierdzewna AISI-410
w1118 linka muchowaHowy Jacobs´ s lab, Tampere UniversityLinia Drosophila używana jako kontrola tła genetycznego dla 3XtubAOX
Płyta240 x 60 x 20 mm
Rajstopy suwakowe2 x 210 mm, dowolna marka
akrylowa Woda etylenowo-octanu winylu milimetrowy Probówki permanentny Petriego Karta SD M3 x 8 mm drewniana

Bibliografia

  1. nobelprize.org. , Available from: http://www.nobelprize.org/prizes/medicine/ (2021).
  2. Drosophila Model Filter. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=%22drosophilia+model%22&filter=datesearch.y_5 (2021).
  3. A Look at Trends in NIHS Model Organism Research Support. , Available from: https://nexus.od.nih.gov/all/2016/07/14/a-look-at-trends-in-nihs-model-organism-research-support/ (2021).
  4. Drosophila. , Available from: https://bv.fapesp.br/pt/metapesquisa/?q=drosophila (2021).
  5. Metapesquisa. , Available from: https://bv.fapesp.br/pt/metapesquisa/ (2021).
  6. Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  7. Brandt, A., Vilcinskas, A. The Fruit Fly Drosophila melanogaster as a Model for Aging Research. Yellow Biotechnology I. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 135, 63-77 (2013).
  8. Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613(2019).
  9. Cheluvappa, R., Scowen, P., Eri, R. Ethics of animal research in human disease remediation, its institutional teaching; and alternatives to animal experimentation. Pharmacology Research and Perspectives. 5 (4), (2017).
  10. Plan Alto.gov. , Available from: http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2007-2010/2008/lei/|11794.htm (2021).
  11. Plan Alto.gov. , Available from: https://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2004-2006/2005/decreto/d5591.htm (2021).
  12. Revistapesquisa.fapesp.br. , Available from: https://revistapesquisa.fapesp.br/en/supply-side-research-constraints/ (2021).
  13. ABC.org.br. , Available from: http://www.abc.org.br/2014/05/08/em-depoimento-a-cell-dario-zamboni-fala-dos-desafios-de-produzir-boa-ciencia-no-brasil/ (2021).
  14. Nascimento, S., Pólvora, A. Maker Cultures and the Prospects for Technological Action. Science and Engineering Ethics. 24 (3), 927-946 (2018).
  15. Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), (2017).
  16. Baden, T., Chagas, A. M., Gage, G., Marzullo, T., Prieto-Godino, L. L., Euler, T. Open Labware: 3-D Printing Your Own Lab Equipment. PLOS Biology. 13 (3), 1002086(2015).
  17. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  18. Hock, D. H., Robinson, D. R. L., Stroud, D. A. Blackout in the powerhouse: Clinical phenotypes associated with defects in the assembly of OXPHOS complexes and the mitoribosome. Biochemical Journal. 477 (21), 4085-4132 (2020).
  19. Juszczuk, I. M., Rychter, A. M. Alternative oxidase in higher plants. Acta Biochimica Polonica. 50 (4), 1257-1271 (2003).
  20. McDonald, A. E. Alternative oxidase: An inter-kingdom perspective on the function and regulation of this broadly distributed "cyanide-resistant" terminal oxidase. Functional Plant Biology. 35 (7), 535-552 (2008).
  21. McDonald, A. E., Vanlerberghe, G. C., Staples, J. F. Alternative oxidase in animals: Unique characteristics and taxonomic distribution. Journal of Experimental Biology. 212, 2627-2634 (2009).
  22. McDonald, A., Vanlerberghe, G. Branched Mitochondrial Electron Transport in the Animalia: Presence of Alternative Oxidase in Several Animal Phyla. IUBMB Life (International Union of Biochemistry and Molecular Biology: Life. 56 (6), 333-341 (2004).
  23. McDonald, A. E., Costa, J. H., Nobre, T., De Melo, D. F., Arnholdt-Schmitt, B. Evolution of AOX genes across kingdoms and the challenge of classification. Alternative Respiratory Pathways in Higher Plants. , 267-272 (2015).
  24. Fernandez-Ayala, D. J. M., et al. Expression of the Ciona intestinalis Alternative Oxidase (AOX) in Drosophila Complements Defects in Mitochondrial Oxidative Phosphorylation. Cell Metabolism. 9 (5), 449-460 (2009).
  25. Kemppainen, K. K., et al. Expression of alternative oxidase in Drosophila ameliorates diverse phenotypes due to cytochrome oxidase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (8), 2078-2093 (2014).
  26. Andjeiković, A., Kemppainen, K. K., Jacobs, H. T. Ligand-bound geneswitch causes developmental aberrations in drosophila that are alleviated by the alternative oxidase. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (9), 2839-2846 (2016).
  27. Hakkaart, G. A. J., Dassa, E. P. E. P., Jacobs, H. T., Rustin, P. Allotopic expression of a mitochondrial alternative oxidase confers cyanide resistance to human cell respiration. EMBO Reports. 7 (3), 341-345 (2006).
  28. Dassa, E. P., et al. Expression of the alternative oxidase complements cytochrome c oxidase deficiency in human cells. EMBO Molecular Medicine. 1 (1), 30-36 (2009).
  29. Szibor, M., et al. Broad AOX expression in a genetically tractable mouse model does not disturb normal physiology. DMM Disease Models and Mechanisms. 10 (2), 163-171 (2017).
  30. El-Khoury, R., Kaulio, E., Lassila, K. A., Crowther, D. C., Jacobs, H. T., Rustin, P. Expression of the alternative oxidase mitigates beta-amyloid production and toxicity in model systems. Free Radical Biology and Medicine. 96, 57-66 (2016).
  31. Mills, E. L., et al. Succinate Dehydrogenase Supports Metabolic Repurposing of Mitochondria to Drive Inflammatory Macrophages. Cell. 167 (2), 457-470 (2016).
  32. Giordano, L., et al. Alternative Oxidase Attenuates Cigarette Smoke-induced Lung Dysfunction and Tissue Damage. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60 (5), 515-522 (2019).
  33. Camargo, A. F., et al. Xenotopic expression of alternative electron transport enzymes in animal mitochondria and their impact in health and disease. Cell biology International. 42 (6), 664-669 (2018).
  34. Saari, S., et al. Alternative respiratory chain enzymes: Therapeutic potential and possible pitfalls. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 854-866 (2019).
  35. Instructables.com. , Available from: https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisted/ (2021).
  36. Tindercad.com. , Available from: https://www.tinkercad.com/ (2021).
  37. Repetier.com. , Available from: https://www.repetier.com/ (2021).
  38. Tinkercad.com. , Available from: https://www.tinkercad.com/login (2021).
  39. Knowledge.autodesk.com. , Available from: https://knowledge.autodesk.com/support/revit-products/learn_explore/caas/CloudHelp/cloudhelp/2016/ENU/Revit-Model/files/GUID-B89AD692-C705-458F-A638-EE7DD83D694C-htm.html (2021).
  40. Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808(2017).
  41. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  42. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments JoVE. (61), e3795(2012).
  43. Oroboros. , Available from: https://www.oroboros.at/">"https://www.oroboros.at/">https://www.oroboros.at/ (2021).
  44. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  45. Tinkercad. , Available from: https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ">"https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ">https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ (2021).
  46. Morton, J. D., Barnes, M. F., Zyskowski, R. F. Respiratory control ratio: A computer simulation of oxidative phosphorylation. Biochemical Education. 24 (2), 110-111 (1996).
  47. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. The Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 383-393 (1955).
  48. Geissmann, Q., Garcia Rodriguez, L., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. F. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026(2017).
  49. Github.com. , Available from: https://github.com/amchagas/Flypi">"https://github.com/amchagas/Flypi">https://github.com/amchagas/Flypi (2021).
  50. Gilestrolab.github.io. , Available from: https://gilestrolab.github.io/ethoscope/">"https://gilestrolab.github.io/ethoscope/">https://gilestrolab.github.io/ethoscope/ (2021).
  51. Imagej.nih.gov. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/">"https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  52. Open-Neuroscience.com. , Available from: https://open-neuroscience.com/">"https://open-neuroscience.com/">https://open-neuroscience.com/ (2021).
  53. Appropedia.org. , Available from: https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment">"https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment">https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment (2021).
  54. McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  55. Schou, M. F., Kristensen, T. N., Pedersen, A., Karlsson, B., Loeschcke, V., Malmendal, A. Metabolic and functional characterization of effects of developmental temperature in Drosophila melanogaster. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 312 (2), 211-222 (2017).
  56. Meeuse, B. J. D. Thermogenic Respiration in Aroids. Annual Review of Plant Physiology. , (1975).
  57. Watling, J. R., Robinson, S. A., Seymour, R. S. Contribution of the alternative pathway to respiration during thermogenesis in flowers of the sacred lotus. Plant Physiology. , (2006).
  58. Inaba, Y. I., et al. Alternative oxidase capacity of mitochondria in microsporophylls may function in cycad thermogenesis. Plant Physiology. 180 (2), 743-756 (2019).
  59. Sanz, A., Stefanatos, R., McIlroy, G. Production of reactive oxygen species by the mitochondrial electron transport chain in Drosophila melanogaster. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 42 (2), 135-142 (2010).
  60. Miwa, S., St-Pierre, J., Partridge, L., Brand, M. D. Superoxide and hydrogen peroxide production by Drosophila mitochondria. Free Radical Biology and Medicine. 35 (8), 938-948 (2003).
  61. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control An Introduction to OXPHOS Analysis. Bioenergetics Communications. 2, Bionergetics Communications. Innsbruck, Austria. (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Budowa Flylabsprz t do druku 3Dmitochondrialne zu ycie tlenutesty lokomozyjneareny godoweekspresja alternatywowej oksydazytesty behawioralnebadania nad organizmami modelowymi
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły