Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62675

⸱

22 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Ocular Research & Education (CORE), School of Optometry & Vision Science, University of Waterloo, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje procedury używane do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotnej i nieśmiertelnej linii komórkowej.

Streszczenie

Ten artykuł opisuje metody pomiaru toksyczności promieniowania ultrafioletowego (UV) i toksyn ocznych na pierwotnych (pHCEC) i unieśmiertelnionych (iHCEC) ludzkich hodowlach komórek nabłonka rogówki. Komórki wystawiono na działanie promieniowania UV i toksycznych dawek chlorku benzalkoniowego (BAK), nadtlenku wodoru (H2O2) i dodecylosiarczanu sodu (SDS). Aktywność metaboliczną mierzono za pomocą testu metabolicznego. Uwalnianie cytokin zapalnych mierzono za pomocą testu interleukiny multi-plex (IL)-1β, IL-6, IL-8 i czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α), a komórki oceniano pod kątem żywotności za pomocą barwników fluorescencyjnych.

Szkodliwy wpływ promieniowania UV na aktywność metaboliczną komórek i uwalnianie cytokin wystąpił po 5 minutach ekspozycji na promieniowanie UV dla iHCEC i 20 minutach dla pHCEC. Podobne procentowe spadki aktywności metabolicznej iHCEC i pHCEC wystąpiły po ekspozycji na BAK,H2O2lub SDS, a najbardziej znaczące zmiany w uwalnianiu cytokin wystąpiły w przypadku IL-6 i IL-8. Mikroskopia komórek naświetlonych fluorescencyjnie i pHCEC BAK wykazała śmierć komórek przy 0,005% ekspozycji na BAK, chociaż stopień zabarwienia etydyną był większy w iHCEC niż pHCEC. Wykorzystując wiele metod oceny skutków toksycznych za pomocą mikroskopii, oceny aktywności metabolicznej i produkcji cytokin, można określić toksyczność promieniowania UV i toksyn chemicznych zarówno dla pierwotnych, jak i unieśmiertelnionych linii komórkowych.

Wprowadzenie

Badania toksykologiczne in vitro są przeprowadzane w celu przewidywania toksycznych skutków chemikaliów i innych czynników, które mogą powodować uszkodzenia komórek. W ocenie toksyczności dla rogówki ludzkie komórki nabłonka rogówki (HCEC) zostały wykorzystane w modelach do oceny tych efektów1,2,3,4. Modele te zazwyczaj oceniają efekty fizjologiczne, takie jak zmiany w aktywności metabolicznej komórki, proliferacja komórek i inne funkcje komórki, takie jak produkcja i uwalnianie cytokin zapalnych. Do tych badań toksykologicznych wybrano komórki z różnych źródeł, aby ocenić szkodliwy wpływ chemikaliów i promieniowania UV na HCECs2,3. Linie pHCEC są dostępne w firmach, które dostarczają te komórki z tkanek dawców dorosłych. Komórki pierwotne można potraktować dypazą i delikatnie zeskrobać z rogówki w celu hodowli5. Komórki są następnie testowane pod kątem wirusów i zanieczyszczeń, a następnie wysyłane w kriokonserwacji w 10% sultlenku dimetylu.

Zaletą pierwotnych linii komórkowych jest to, że komórki są genetycznie identyczne z komórkami dawcy. Jest to idealne rozwiązanie, ponieważ model in vitro powinien w jak największym stopniu naśladować tkankę in vivo. Wadą pierwotnych linii komórkowych jest to, że mają ograniczoną liczbę podziałów komórkowych lub pasaży6. Ograniczona liczba dostępnych komórek ogranicza liczbę eksperymentów, które można przeprowadzić z pojedynczą hodowlą pierwotną, zwiększając koszt eksperymentów.

Uwiecznione linie komórkowe były również używane w modelach toksyczności hodowli komórkowych. Jednak w przeciwieństwie do pierwotnej linii komórkowej uzyskanej z tkanki in vivo, unieśmiertelniona linia komórkowa została genetycznie zmieniona. Unieśmiertelnione komórki są tworzone przez włączenie genów wirusa do DNA komórek pierwotnych6,7,8. Komórki z udaną inkorporacją genów wirusa są wybierane do unieśmiertelnionej linii komórkowej. Zaletą nieśmiertelności jest to, że pozwala na nieskończoną szybką proliferację, zapewniając nieograniczoną liczbę komórek do wykonywania wielu eksperymentów przy użyciu tej samej linii komórkowej. Pozwala to na zachowanie spójności między eksperymentami i zmniejszenie kosztów.

Oprócz zmian w genach, które ograniczały proliferację komórek, mogą również wystąpić zmiany w ekspresji genów o krytycznej funkcjonalności9. Dlatego wadą stosowania unieśmiertelnionych komórek jest to, że mogą one już nie reprezentować oryginalnych komórek in vivo pod względem ich reakcji na różne bodźce zewnętrzne10. Porównania obejmowały obserwację toksycznego wpływu chemikaliów na pierwotne i unieśmiertelnione ludzkie keratocyty rogówki11, a także unieśmiertelnione HCEC i pierwotne komórki nabłonka rogówki królika12. Porównanie wpływu toksyn na pierwotne ludzkie keratocyty i unieśmiertelnione keratocyty nie wykazało istotnych różnic11. Korzystając z metod opisanych w tym artykule, zostanie określona skuteczność tych testów do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn ocznych na pHCEC i iHCECs.

Wybrano trzy toksyny do oczu powszechnie stosowane w testach in vitro: BAK,H2O2 i SDS. BAK to kationowy środek konserwujący powszechnie stosowany w roztworach okulistycznych13,14, H2O2 jest powszechnie stosowany do dezynfekcji soczewek kontaktowych15, a SDS to anionowy środek powierzchniowo czynny występujący w detergentach i szamponach14. Podobnie jak toksyny oczne, promieniowanie UV może również powodować znaczne uszkodzenia HCECs3. Ponadto nadmierna ekspozycja na promieniowanie UV może powodować stan oczu znany jako fotokeratitis charakteryzujący się objawami łzawienia, wrażliwości na światło i uczuciem szorstkości16.

Istnieje nieograniczona liczba pierwotnych kultur komórkowych, które mogą być użyte, oraz różne unieśmiertelnione linie komórkowe, które zostały już opracowane. W związku z tym podjęto badanie w celu porównania pierwotnych HCEC z unieśmiertelnioną linią HCEC w celu określenia podobieństw i różnic między modelami, które zawierają te typy komórek.

W tym badaniu użyto mikroskopii, aby ocenić możliwe różnice między pHCEC i iHCEC w fizjologicznej reakcji komórek na promieniowanie UV i toksyny. Oceniono również wpływ promieniowania UV i substancji chemicznych na aktywność metaboliczną komórek i uwalnianie cytokin zapalnych dla dwóch linii komórkowych. Znaczenie określenia różnic między dwiema liniami komórkowymi polega na zrozumieniu optymalnego wykorzystania tych linii komórkowych do oceny: 1) wpływu promieniowania UV na komórki, 2) wpływu toksyn na komórki oraz 3) wynikających z tego zmian w metabolizmie, żywotności komórek i uwalnianiu cytokin komórkowych do przyszłych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Kultura pHCEC i iHCEC

  1. Hoduj pHCEC i iHCEC w ludzkim podłożu nabłonkowym oka (HOEM) z następującymi suplementami: 6 mM L-glutaminy, 0,002% suplementu pożywki komórkowej O (tabela materiałów), 1,0 μM epinefryny, 0,4% suplementu pożywki komórkowej P (tabela materiałów), 5 μg/ml insuliny rh, 5 μg/ml apo-transferyny i 100 ng/ml hemibursztynianu hydrokortyzonu w kolbach hodowlanych pokrytych kolagenem-1 (18 ml w kolbie hodowlanej o długości 75 cm2).
  2. Zmieniaj pożywkę w kolbach co 2-3 dni, usuwając pożywkę po tym, jak komórki osiągną ~80% konfluencji. Dodać roztwór dysocjacyjny bez czerwieni fenolowej i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C aż do całkowitego odłączenia komórek. Zneutralizować roztwór dysocjacyjny za pomocą DMEM/F12 za pomocą surowicy, a następnie odwirować komórki przy 500 × g. Usunąć pożywkę sklarowaną nad osadem i ponownie zawiesić komórki w pożywce HOEM.

2. Określanie wielkości komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Wysiewać zarówno pHCEC, jak i iHCEC na pokrytych kolagenem szalkach Petriego ze szkiełkami nakrywkowymi o stężeniu 1 × 105 z 1 ml HOEM. Hodować pHCEC i iHCECs, jeden zestaw kultur przez 24 godziny, a drugi zestaw kultur przez 48 godzin, w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Po okresie inkubacji wybarwić komórki 500 μl roztworu buforowego do barwienia aneksyny zawierającego kalceinę (4 μM), homodimer-1 etydyny-1 (8 μM) i anektynę V (5 μl w 500 μl buforu – koniugat Alexa Fluor 647) przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Po wybarwieniu komórek wyreguluj mikroskop pod kątem wychwytywania długości fal wzbudzenia/emisji 488/515 nm dla kalceiny-AM, 543/600 nm dla homodimeru etydyny-1 i 633/665 nm dla aneksyny V za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.
  3. Uzyskaj obrazy i wykonaj stosy Z, aby ocenić rozmiar komórki w trzech wymiarach.
    1. Aby uzyskać obrazy dwuwymiarowe (2D) i trójwymiarowe (3D), znajdź obszar do zobrazowania za pomocą apochromatycznego obiektywu wodnego 40x/1,2. Za pomocą laserów Argon (488) (pierwszy skan), HeNe1 (543) (drugi skan i HeNe2 (633) (trzeci skan) skanuj w trzech oddzielnych kanałach za pomocą rozdzielaczy wiązki, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis i NFT 545 LP560, LP505.
    2. Użyj wielościeżkowego skanowania sekwencyjnego, aby zredukować przesłuchy.
      UWAGA: LP505 jest używany do kanału 2 z laserem 488 do wychwytywania emisji barwnika kalceinowego. LP560 jest używany w kanale 3 z laserem 543 do przechwytywania emisji homodimeru etydyny 1. NFT 635 jest używany z laserem 633 do przechwytywania emisji aneksyny V. Zadaniem HFT jest oddzielenie światła wzbudzającego i emisyjnego. NFT rozdziela światło, odbijając światło < określonej długości fali do oddzielnego kanału, jednocześnie przepuszczając światło > określoną długość fali do drugiego kanału. Filtry LP blokują fale krótsze niż określona długość fali i przepuszczają dłuższe fale.
    3. Aby obrazować w 3D, ustaw konfokalną na stos Z i zeskanuj co najmniej 20 klatek.

3. Narażenie komórek na promieniowanie UV

  1. Wysiewać komórki w 5 × 104/ml HOEM w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem-1 i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 godziny. Po okresie inkubacji zmniejszyć objętość pożywki w studzienkach do 300 μl. Następnie wystaw komórki na działanie promieniowania UV (zarówno UVA o sile 6,48 W/m2, jak i UVB o sile 1,82 W/m2, ponieważ w tym samym czasie w inkubatorze włączane są lampy UVA i UVB) w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 5 i 20 minut w oddzielnych eksperymentach.
  2. Po napromieniowaniu UV dodać 200 μl świeżego HOEM do każdej studzienki i inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  3. Po inkubacji zebrać supernatant komórkowy do każdej studzienki i przenieść go do sterylnych probówek polipropylenowych o pojemności 2 ml. Zamrażać w temperaturze -80 °C. Aby określić poziomy cytokin uwalnianych przez pHCEC i iHCEC po ekspozycji na promieniowanie UV, użyj testu cytokin multipleksowych i postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby określić ilościowo następujące cztery cytokiny: IL-6, IL-8, IL-1β i TNF-α.
  4. Dodaj odczynnik do oznaczania metabolicznego do komórek w studzienkach.
  5. Przygotować 10% odczynnik do oznaczania metabolizmu w DMEM/F12. Zastąpić pożywkę hodowlaną w każdym dołku 1 ml 10% roztworu do oznaczania metabolizmu i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 godziny.
  6. Zmierzyć fluorescencję każdego roztworu za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych przy długościach fal wzbudzenia/emisji 530/590 nm.

4. Narażenie komórek na toksyny chemiczne

  1. Komórki nasienne w wieku 5 × 104/ml HOEM w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem-1 i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 godziny. Po okresie inkubacji usunąć pożywkę i wystawić komórki na działanie 1 ml toksyn chemicznych (BAK 0,001%,H2O20,01% i SDS 0,0025% w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)) przez 5 i 15 minut.
  2. Po wystawieniu na działanie toksyn chemicznych usuń toksyny ze studzienek, spłucz 1 ml PBS i dodaj 1 ml HOEM do każdej studzienki. Po 20 godzinach inkubacji przeprowadzić test metaboliczny, zastępując pożywkę 1 ml 10% roztworu do oznaczania metabolizmu i inkubując w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 godziny. Zmierz fluorescencję za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek wielodołkowych przy długościach fal wzbudzenia/emisji 530/590 nm.
  3. Po 20-godzinnej inkubacji przenieść supernatanty komórkowe z dołków do oddzielnych sterylnych probówek polipropylenowych o pojemności 2 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C. Określić ilościowo cytokiny uwalniane przez pHCEC i iHCEC po ekspozycji na chemikalia. Użyj tej samej platformy multipleksowej, która służy do oceny cytokin z komórek poddanych działaniu promieniowania UV. Użyj testu cytokin multipleksowych zgodnie z instrukcjami zestawu, aby określić ilościowo następujące cztery cytokiny: IL-6, IL-8, IL-1β i TNF-α.

5. Badanie komórek wystawionych na działanie różnych stężeń BAK

  1. Komórki nasienne w temperaturze 1 × 105/ml HOEM w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem-1 i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny. Po okresie inkubacji należy usunąć pożywkę i wystawić komórki na działanie 1 ml toksyn chemicznych (BAK 0,001%, BAK 0,005% i BAK 0,01% w PBS) przez 5 minut.
  2. Po ekspozycji usuń toksyny chemiczne, przepłucz studzienki 1 ml PBS i dodaj 1 ml HOEM do każdej studzienki. Po 20 godzinach inkubacji wybarwić komórki 500 μl roztworu buforowego do barwienia aneksyny zawierającego kalceinę (4 μM), homodimer-1 etydyny-1 (8 μM) i anektynę V (5 μl w 500 μl buforu-koniugat Alexa Fluor 647) przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Ustawić mikroskop do pomiaru intensywności aneksyny V, barwienie kalceiną AM i etydyną-1 przy długościach fal wzbudzenia/emisji odpowiednio 630/675 nm, 495/515 nm i 528/617 nm. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego

6. Analiza danych

  1. Przeprowadź test normalności i test równych wariancji przed wykonaniem analizy wariancji (ANOVA), testu Welch ANOVA lub testu Kruskala-Wallisa. Użyj odpowiedniego testu post-hoc do porównania każdej badanej grupy. Ustaw p < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wielkość komórek
Pierwotne i unieśmiertelnione HCECs wizualizowano za pomocą trzech barwników fluorescencyjnych, które odzwierciedlają trzy różne stadia żywotności komórek. Komórki żywe są zielone (calcein-AM), martwe są czerwone (ethidium homodimer-1), a komórki apoptotyczne są żółte (annexin V – kolor skorygowany komputerowo w celu lepszej wizualizacji sygnału fluorescencyjnego). Komórki żywe zawierają esterazy w cytoplazmie i przekształcają calcein-AM w kalceinę. Komórki martwe posiadają błony kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oceniono potencjalne różnice w stosowaniu dwóch rodzajów HCEC. Komórki umieszczono w tym samym pożywce (HOEM) o identycznych stężeniach komórek, a następnie wystawiono na działanie krótkich i długich okresów promieniowania UV i trzech toksyn ocznych. Dawki promieniowania UV i substancji chemicznych zostały dobrane na podstawie ich efektów fizjologicznych, które były wystarczająco szkodliwe dla komórek, aby wywołać reakcje pośrednie, które można było porównać. Czasy ekspozycji wynoszące 5 i 20 minut dla promieniowania UV ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor, Lyndon W. Jones, w ciągu ostatnich 3 lat, za pośrednictwem CORE, otrzymał wsparcie badawcze lub honoraria wykładowców od następujących firm: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage i Visioneering. Lyndon Jones jest również konsultantem i/lub zasiada w radzie doradczej firm Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis i Ophtecs. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy nie otrzymali żadnych funduszy na tę pracę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
75 cm2 Kolba wentylowanaCorning354485To jest marka BioCoat, pokryta kolagenem
96-dołkowa płytkacostar3370
alamarBlueFisher Scientificdal 1025
Annexin Roztwór buforowy do barwieniaInvitrogen, Burlington, ON, Kanada
Annexin VInvitrogen, Burlington, ON, Mikroskop Canada
Axiovert 100 z konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym Zeiss System 510Carl Zeiss Inc., Niemcy
Corning 48 Płytki dołkoweCorning354505To jest marka BioCoat, pokryta kolagenem
Cytacja 5BioTekCYT5MPVPotrafi odczytać fluorescencję od 280 - 700 nm (do testu 540/590)
Hykon surowicy bydlęcej płoduSH30396.03
szkiełka nakrywkowe ze szklanym dnemMatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Ludzkie komórki nabłonka rogówkiUniversity of OttawaN/ASV40-unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonka rogówki od dr M. Griffitha (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Kanada) i zostały scharakteryzowane Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Funkcjonalne odpowiedniki ludzkiej rogówki zbudowane z linii komórkowych. Nauka. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) z następującymi suplementami:Millipore, Billerica, MA, USASCMC001Pożywka bazowa Epigro uzupełniona 6 mM L-glutaminą, 0,002% EpiFactor O (suplement pożywki komórkowej O w artykule), 1,0 i mu; M Epinefryna, 0,4% EpiFactor P (suplement pożywki komórkowej P w artykule), 5 i mu; g/ml rh Insulina, 5 μ g / ml Apo-transferyny i 100 ng / ml hemibursztynianu hydrokortyzonu w kolbach hodowlanych pokrytych kolagenem-1 (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Żywy martwy homodimer kalcien i etydynyInvitrogen, Burlington, ON, Kanada
MezoScale Discovery (MSD) Instrument QuickPlex SQ 120Rockville, MD, USA
Panel prozapalny człowieka MSD II (4-Plex) Test V-PlexRockville, MD, USA
Penicylina StreptomycynaGibco15140-122100x stężenie, więc dodaj 1 ml do każdych 99 ml pożywki
Pierwotne komórki nabłonka rogówkiMillipore, Billerica, MA, USASCCE016
Czytnik fluorescencyjnych płytek wielodołkowych SpectraMaxUrządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (roztwór do dysocjacji komórek)Fisher Scientific12605036

Bibliografia

  1. McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
  2. Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
  3. Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
  4. Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
  5. Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
  6. Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
  7. Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  8. Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
  9. Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
  10. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  11. Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
  12. Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
  13. Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
  14. Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
  15. Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
  16. Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
  17. Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
  18. Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640(2015).
  19. Muller, P. A., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).
  20. Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
  21. Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
  22. Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
  23. Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
  24. Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
  25. Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
  26. Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
  27. Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
  28. Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132(2006).
  29. Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Toksyczno UVtoksyczno chemicznatest metabolicznyuwalnianie cytokinmikroskopia fluorescencyjnachlorek benzalkoniunadtlenek wodorudodecylosiarczan sodutoksyczno in vitro
Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.