Artykuł metodologiczny

Obrazowanie kolców dendrytycznych u Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/62676

⸱

27 września 2021

 , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 2Program of Neuroscience, Vanderbilt University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolce dendrytyczne są ważnymi cechami komórkowymi układu nerwowego. W tym miejscu opisano metody obrazowania na żywo służące do oceny struktury i funkcji kolców dendrytycznych u C. elegans. Podejścia te wspierają rozwój zmutowanych badań przesiewowych dla genów, które definiują kształt lub funkcję kolców dendrytycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolce dendrytyczne są wyspecjalizowanymi miejscami unerwienia synaptycznego, modulowanymi przez aktywność i służą jako substraty do uczenia się i pamięci. Ostatnio kolce dendrytyczne zostały opisane dla neuronów DD GABA-ergic jako miejsca wejściowe z presynaptycznych neuronów cholinergicznych w obwodzie motorycznym Caenorhabditis elegans. Ten obwód synaptyczny może teraz służyć jako nowy, potężny model morfogenezy i funkcji kręgosłupa in vivo, który wykorzystuje łatwą genetykę i łatwą dostępność C. elegans do obrazowania żywych komórek.

Ten protokół opisuje eksperymentalne strategie oceny struktury i funkcji kręgosłupa DD. W tym podejściu strategia obrazowania w superrozdzielczości jest wykorzystywana do wizualizacji skomplikowanych kształtów bogatych w aktynę kolców dendrytycznych. Aby ocenić funkcję kręgosłupa DD, aktywowana światłem opsynana, Chrimson, stymuluje presynaptyczne neurony cholinergiczne, a wskaźnik wapnia, GCaMP, informuje o wywołanych stanach przejściowych wapnia w postsynaptycznych kolcach DD. Razem metody te stanowią potężne podejścia do identyfikacji genetycznych determinantów kolców dendrytycznych u C. elegans, które mogą również kierować morfogenezą i funkcją kręgosłupa w mózgu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolce dendrytyczne to wyspecjalizowane struktury komórkowe, które otrzymują dane wejściowe od sąsiednich neuronów do transmisji synaptycznej. Aktywacja receptorów neuroprzekaźników podnosi wewnątrzkomórkowy wapń i dalsze szlaki sygnałowe w tych charakterystycznych wypukłościach neuronalnych1. Ze względu na fundamentalne znaczenie kolców dendrytycznych dla neuroprzekaźnictwa i ich nieprawidłowej regulacji w chorobach neurorozwojowych1, odkrycie czynników modulujących morfogenezę i funkcję kolców dendrytycznych jest bardzo interesujące dla dziedziny neuronauki.

Ostatnio, kolce dendrytyczne zostały zidentyfikowane w układzie nerwowym C. elegans na podstawie kluczowych cech wspólnych dla kolców ssaków2. Ustalenie to ma kluczowe znaczenie, ponieważ otwiera możliwość wykorzystania zalet C. elegans do badania biologii kręgosłupa. Kolce dendrytyczne na grzbietowych neuronach ruchowych D (DD) otrzymują dane wejściowe od neuronów cholinergicznych (VA i VB) w brzusznym rdzeniu nerwowym (Rysunek 1A)2,3,4. W tym miejscu przedstawiono metody obrazowania w celu zbadania struktury kolców dendrytycznych DD i ich funkcji in vivo w nienaruszonym układzie nerwowym, który jest łatwo dostępny do obrazowania na żywo i analizy genetycznej. Do monitorowania kształtu kolców dendrytycznych, (1) cytozolowe białka fluorescencyjne, które wypełniają proces dendrytyczny i kolce; (2) białka fluorescencyjne związane z błoną, które zdobią granicę kolców dendrytycznych i dendrytów; lub (3) używane są markery aktynowe, LifeAct5 lub Utrophin6, które są wzbogacone w kolce dendrytyczne, ujawniając w ten sposób ich kształt. Aby monitorować funkcjonalność kolców DD, fluorescencja GCaMP jest używana do wykrywania stanów przejściowych Ca++ wywołanych przez aktywację przesuniętej ku czerwieni opsyny, Chrimson, w presynaptycznych neuronach cholinergicznych7. Oczekuje się, że obie strategie ułatwią badanie kolców dendrytycznych DD u zwierząt typu dzikiego i zmutowanego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Określenie struktury kolców dendrytycznych DD

  1. Twórz transgeniczne robaki, aby oznaczyć kolce DD
    1. Użyj promotora flp-13, aby zbudować wektor ekspresji dla interesującej Cię etykiety (np. cytoplazmatyczne mCherry, MYR::mRuby, LifeAct::GFP, GFP::utrophina) (Rysunek 1). Zobacz pełną listę plazmidów w pliku uzupełniającym 1.
    2. Użyj sprawdzonych metod, aby wygenerować linię transgeniczną oznaczającą kolce DD kolce8,9.
  2. Przygotuj szczeliwo
    1. Przygotuj mieszaninę 1:1 podłoża do zatapiania na bazie parafiny10 (patrz Tabela Materiałów).
    2. Podgrzać pożywkę w temperaturze 60 °C aż do stopienia, a następnie rozdzielić porcję w 1,5 ml zaślepionych probówkach wirówkowych i utrzymywać blok grzewczy w temperaturze 60-70 °C.
      UWAGA: Szczeliwo może wytrzymać 4 tygodnie w bloku grzewczym.
  3. Przygotuj środek znieczulający.
    1. Sporządzać roztwory podstawowe w destylowanymH2Oz 1% trikainy i 1 M lewamizolu (patrz tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotuj roztwór roboczy składający się z 0,05% trikainy i 15 mM środka znieczulającego lewamizolem, zgodnie z opisem w krokach 1.3.3-1.3.511.
    3. Wymieszaj 75 μl 1% wywaru trikainowego i 22,5 μl 1 M lewamizolu.
    4. Dodać bufor M9 do końcowej objętości 1,5 ml.
    5. Podwielokrotność 10 μl 0,05% trikainy, 15 mM lewamizolu do probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Mieszanina znieczulająca jest wrażliwa na temperaturę, a poszczególne porcje roztworu roboczego nie powinny być ponownie zamrażane po rozmrożeniu dla każdego eksperymentu. Zobacz Plik uzupełniający 2, aby zapoznać się z przepisem na bufor M9.
  4. Uzyskiwanie obrazów w wysokiej rozdzielczości
    1. Przygotować 10% agarozy i przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C.
      UWAGA: Zobacz raport Moniki Driscoll w WormBook12.
    2. Zamontuj 15-20 młodych dorosłych na 10% płatkach agarozowych i dodaj 3 μl środka znieczulającego (patrz krok 3).
    3. Nałożyć szkiełko nakrywkowe (robaki unieruchamiają się w ciągu 5 minut).
    4. Uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego stopioną mieszaniną kleju i uszczelniacza (patrz Tabela materiałów).
    5. Uzyskiwanie obrazów
      1. Akwizycja w super rozdzielczości
        1. Użyj laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w mikroskopię superrozdzielczą z soczewką obiektywową olejową Plan-Apochromat 63x/1,40, aby uzyskać mały rozmiar piksela (np. < 50 nm). Kup stosy Z, używając rozmiaru kroku zalecanego przez oprogramowanie producenta (patrz Tabela materiałów).
        2. Zbierz serię przekrojów optycznych, które obejmują całkowitą objętość wyrostka brzusznego DD (np. 15-20 warstw o rozmiarze kroku 0,19 μm lub grubości 2-3 μm). Prześlij stosy Z do przetwarzania obrazu za pomocą oprogramowania producenta i przeanalizuj obrazy z wynikiem wyższym niż 7 (Rysunek 1B, Rysunek 2 i Rysunek 3).
      2. Przejęcie firmy Nyquist
        1. Użyj laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, aby wybrać optymalny rozmiar piksela dla długości fali światła i apertury numerycznej używanej soczewki obiektywu (np. obiektyw 40x/1.4 Plan Fluor oil).
          UWAGA: Mniejszy rozmiar piksela ujawni delikatną strukturę kolców DD.
        2. Prześlij stos do dekonwolucji 3D za pomocą algorytmu automatycznego (patrz Tabela materiałów) (Rysunek 3).
      3. Użyj najmniejszego możliwego kroku Z (np. określonego przez stolik piezoelektryczny), ponieważ nadpróbkowanie w Z może dać ostrzejsze obrazy po dekonwolucji 3D13.
  5. Analiza obrazu
    1. Użyj odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz Tabela materiałów), aby utworzyć projekcje maksymalnej intensywności dla Z-stacks14.
    2. Ręcznie policz występy na dendrycie DD.
      UWAGA: Wystające elementy są prostopadłymi przedłużeniami wału głównego (Rysunek 1B, groty strzałek).
    3. Określ długość naciętego dendrytu DD, aby obliczyć gęstość kolców na 10 μm dendrytu DD (Rysunek 1C).
    4. Klasyfikuj kolce jako cienkie/grzybowe, filopodialne, przysadziste lub rozgałęzione (Rysunek 2A).
      UWAGA: Cienkie/grzybkowe kolce mają wąską podstawę (szyjkę) i szerszą końcówkę (głowę). Kolce strzałkowo-podzieniowe nie mają zwężonej podstawy (bez szyi), ale mają stałą szerokość. Przysadziste kolce mają szeroką podstawę i końcówkę. Rozgałęzione kolce to wypukłości z więcej niż jedną końcówką.

2. Ocena aktywacji kolców dendrytycznych DD przez presynaptyczną sygnalizację cholinergiczną

  1. Twórz transgeniczne robaki przy użyciu konwencjonalnych technik (np. mikroiniekcji)8,9
    1. Użyj promotora flp-13 do sterowania ekspresją czujnika Ca + +, GCaMP6s, w neuronach DD i promotora unc-4 do sterowania ekspresją Chrimson, przesuniętej ku czerwieni rodopsyny kanałowej, w presynaptycznych neuronach VA (Figura 4A). Patrz lista plazmidów w pliku uzupełniającym 1.
  2. Przygotuj płytki All-trans Retinal (ATR) i kontrolne.
    UWAGA: ATR jest kofaktorem wymaganym, aby Chrimson działał jako optogenetycznie aktywowany kanał jonowy.
    1. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy ATR w etanolu (100%). Przechowywać w temperaturze -20 °C w 1 ml porcji.
    2. Pod okapem z przepływem laminarnym dodaj 300 μl nocnej kultury bakteryjnej OP50 i 0,25 μl ATR do każdej płytki agarowej o średnicy 60 mm NGM (Nematode Growth Medium) i rozprowadź sterylną szklaną pałeczką.
    3. W przypadku kontroli dodaj 300 μl bakterii OP50 i 0,25 μl etanolu (100%) do oddzielnej grupy płytek NGM.
    4. Pozostaw talerze w okapie w temperaturze pokojowej na 24 godziny (chronione przed światłem otoczenia), aby umożliwić rozwój bakterii.
      UWAGA: Płytki mogą być używane po początkowej 24 godzinnej inkubacji lub utrzymywane w temperaturze 4 °C do użycia w ciągu 5 dni.
  3. Przygotowanie eksperymentu
    1. Umieść pięć larw w stadium L4 NC3569 na płytkach ATR lub kontrolnych z nasionami OP50, które nie mają ATR i rosną w ciemności w temperaturze 23°C.
    2. Trzy dni później użyj stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, aby potwierdzić rozwój sromu, aby pobrać potomstwo w stadium L4 z ATR i płytek kontrolnych do obrazowania, jak opisano w krokach 2.4.1-2.4.3.
    3. Na szkiełku mikroskopowym umieść 2 μl wielokulek 0,05 μm (2,5% ciał stałych w/v) (patrz Tabela materiałów).
    4. Użyj platynowego drutu ("szpikulca ślimakowego"), aby dodać małą kuleczkę super kleju do roztworu i delikatnie zamieszaj, aby wytworzyć nitkowate "pasma" kleju. Następnie dodaj 3 μl buforu M9 (Rysunek 4B).
    5. Umieścić około dziesięciu larw L4 w roztworze i nałożyć szkiełko nakrywkowe.
      UWAGA: Włókna kleju będą losowo stykać się z robakami i unieruchamiać je po nałożeniu szkiełka nakrywkowego. Robaki, które są osadzone w dużych kulełkach kleju, wyglądają na wysuszone i nie powinny być obrazowane.
    6. Uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego, jak wspomniano w kroku 1.4.4.
  4. Rejestracja wywołanych stanów przejściowych Ca++ w kolcach dendrytycznych.
    1. Użyj mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem wyposażonego w czułą kamerę CCD, soczewkę obiektywu olejowego TIRF 100x oraz linie laserowe 488 nm i 561 nm (patrz tabela materiałów).
    2. Dostosuj stolik mikroskopu, aby ustawić kolce DD w płaszczyźnie ogniskowej.
    3. Konfiguracja akwizycji poklatkowej w celu oświetlenia próbki linią laserową 488 nm co klatkę (w celu wykrycia fluorescencji GCaMP6s) i linią laserową 561 nm w odstępach czasu (w celu wzbudzenia Chrimsona).
      UWAGA: Na przykład, użyj światła 488 nm, aby uchwycić kolejne migawki (200 ms) sygnału GCaMP6s sprzężonego z impulsem 200 ms światła 561 nm co 5 klatkę (Rysunek 4C-E). Dzięki tej konfiguracji poziomy GCaMP przed i po każdym impulsie 561 nm są wykrywane w odstępie ~1 s (200 ms lasera 488 nm do wykrywania GCaMP przed aktywacją VA, 200 ms impulsu 561 nm do aktywacji VA i ~600 ms do przełączania między liniami laserowymi a filtrami emisyjnymi. Dzięki takiemu ustawieniu neurony VA są aktywowane co 2,5 s.
  5. Analiza obrazowania Ca++ in vivo
    1. Użyj dekonwolucji 2D i wyrównania obrazu, aby skorygować drobne odchylenia wynikające z ruchu robaka podczas akwizycji (patrz Tabela materiałów).
    2. Zdefiniuj grzbiet dendrytyczny DD jako obszar zainteresowania (ROI w Rysunki 4C-D).
    3. Zduplikuj ROI i przenieś się do sąsiedniego regionu wewnątrz robaka, aby zebrać sygnał tła (tj. szum).
    4. Użyj odpowiedniego oprogramowania (patrz tabela materiałów), aby wyeksportować intensywności GCaMP6s do Excela dla każdego punktu czasowego. Odejmij fluorescencję tła od fluorescencji ROI kręgosłupa.
    5. Określ zmianę fluorescencji, odejmując fluorescencję GCaMP6s w ramce bezpośrednio przed wzbudzeniem 561 nm (F0) od każdego punktu czasowego po wzbudzeniu (ΔF), a następnie dzieląc przez F0, aby określić ΔF/F0 (Rysunek 4E).
    6. Proszę narysować na wykresie znormalizowane ścieżki (patrz tabela materiałów).
    7. Wykonaj sparowany test statystyczny dla każdego pomiaru fluorescencji GCaMP6s przed i po każdym impulsie światła o długości fali 561 nm.
      UWAGA: Takie podejście skutecznie wyklucza losowe fluktuacje fluorescencji GCaMP6s, które w przeciwnym razie zmniejszają moc statystyczną porównywania średniego sygnału GCaMP6s ze wszystkich pomiarów przed i po wzbudzeniu 561 nm (Rysunek 4F).
    8. W przypadku pomiarów, które pokazują rozkład normalny lub gaussowski, należy użyć sparowanego parametrycznego testu ANOVA i skorygować dla wielokrotnych porównań dla każdej z dwóch grup (ATR przed i po, brak ATR przed i po). Alternatywnie, w przypadku danych, które nie mają rozkładu normalnego, należy użyć nieparametrycznej ANOVA z poprawką posthoc dla wielu testów.
      UWAGA: Robaki hodowane na płytkach, które nie mają ATR ("brak ATR") są niezbędne do kontroli i nie powinny wykazywać stanów nieustalonych Ca++ aktywowanych przez 561 nm, ponieważ ATR jest wymagany do funkcji Chrimson.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiary trzema niezależnymi markerami (cytozolowy mCherry, LifeAct::GFP, MYR::mRuby) dały średnią gęstość 3,4 ± 1,03 kolców dendrytycznych DD na 10 μm dendrytu DD u młodych dorosłych typu dzikiego (Rysunek 1B,C). Na potrzeby tej analizy wykluczono pomiary uzyskane za pomocą markera GFP::Utropfiny, które dały znacznie niższą gęstość kręgosłupa (2,4 ± 0,74, Rysunek 1) ze względu na interakcje Utrophiny z cytoszkieletem aktyny6, który potencjalnie napędza morfogenezę kręgosłupa15. Pomiary gęstości kolców w mikroskopie świetlnym są porównywalne z wartością 4,2 kolca/10 μm dendrytu uzyskaną z rekonstrukcji 12 kolców z mikrofotografii elektronowych DD1 neuron2. Podejście oparte na obrazowaniu żywych komórek potwierdziło, że cienka/grzybkowata morfologia kolców DD dominuje w dorosłych i alternatywnych kształtach kręgosłupa (np. filopodialny, przysadzisty, rozgałęziony) (Ryc. 2B), co jest również typowe dla kolców w dojrzałym układzie nerwowym ssaków16.

Użyto strategii optogenetycznej, aby sprawdzić, czy przypuszczalne kolce dendrytyczne wykryte przez mikroskopię świetlną o wysokiej rozdzielczości (Rysunek 1 i Rysunek 2) reagują na uwalnianie neuroprzekaźników z miejsc presynaptycznych, co jest charakterystyczną cechą kolców dendrytycznych w neuronach ssaków. Światło zielone (561 nm) użyto do aktywacji wariantu rodopsyny kanałowej, Chrimson, w presynaptycznych neuronach cholinergicznych, a światło niebieskie (488 nm) do wykrycia fluorescencji zależnej od Ca++ emitowanej przez cytoplazmatyczną sondę GCaMP w postsynaptycznych kolcach dendrytycznych DD. W tym eksperymencie wykryto przejściowe wybuchy sygnału GCaMP w kolcach DD natychmiast po optogenetycznej aktywacji Chrimson w presynaptycznych neuronach VA (Ryc. 3). Powodzenie tego eksperymentu zależy od niezawodnej ekspresji Chrimson we wszystkich presynaptycznych neuronach VA. W tym przypadku zastosowano integrant chromosomalny17 markera Punc-4::Chrimson, aby zapewnić spójną ekspresję VA. Eksperyment ten można również przeprowadzić z matrycą pozachromosomalną. Ekspresja Chrimson w określonym neuronie VA może być niezależnie potwierdzona, na przykład poprzez sprzężenie transgenu Chrimson z transplicowaną sekwencją lidera SL2 z zlokalizowanym dalej jądrowo GFP jako markerem koekspresji2. Konieczne jest przeprowadzenie eksperymentu kontrolnego przy braku ATR, aby potwierdzić, że zmierzony sygnał GCaMP zależy od optogenetycznej aktywacji Chrimson, która jest ściśle zależna od ATR (Rysunek 4D). Wreszcie, ponieważ wywołane sygnały Ca++ są przejściowe, kluczowe znaczenie ma przyjęcie protokołu obrazowania, który umożliwia szybkie przełączanie (<1 s) między wzbudzeniem 561 nm a akwizycją sygnału GCaMP za pomocą lasera 488 nm (Rysunek 4).

figure-results-1
Rysunek 1: Oznaczanie kolców dendrytycznych DD. (A) (Góra) Sześć grzbietowych neuronów D (DD1-DD6) w brzusznym rdzeniu nerwowym C. elegans. (Na dole) U dorosłych brzusznie skierowane kolce DD (grot strzałki) stykają się z presynaptycznymi zakończeniami neuronów ruchowych brzusznych A (VA) i brzusznych B (VB) (magenta), a spoidła DD rozciągają się do rdzenia nerwowego grzbietowego, aby zapewnić wyjście GABA-ergiczne do mięśni ciała (strzałka)18. Ten rysunek został zmodyfikowany z Reference2. (B) Mikrofotografie fluorescencyjne (Airyscan) kolców DD znakowanych cytozolowym mCherry, mirystoilowanym mRuby (MYR::mRuby), LifeAct::GFP i GFP::Utrophin u młodych dorosłych robaków. Szare groty strzał wskazują na kolce. Pasek skali = 2 μm. (C) Gęstość (kolce/10 μm) kolców dendrytycznych neuronów DD oznaczonych cytozolowym mCherry (3,77 ± 0,9), MYR::mRuby (3,09 ± 0,8), LifeAct::GFP (3,44 ± 1,1) lub GFP::Utrophin (2,41 ± 0,8). Wszystkie próbki mają rozkład normalny. Jednokierunkowa ANOVA pokazuje, że gęstości kręgosłupa dla cytozolowego mCherry, MYR::mRuby i LifeAct::GFP nie różnią się znacząco (NS), podczas gdy gęstość kręgosłupa jest zmniejszona dla GFP::Utrophin vs. cytozolowo oznaczone mCherry (p = 0,0016) i LifeAct::GFP (p = 0,0082). Przerywana czerwona linia reprezentuje gęstość kręgosłupa neuronów DD ocenianą na podstawie rekonstrukcji 3D EM (4,2 kolców/10 μm). Ten rysunek został zmodyfikowany z Reference2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Obrazowanie kolców dendrytycznych DD. (A) (Góra) Schemat kształtów grzbietu. (Na dole) Obrazy Airyscan każdego typu kręgosłupa (podziałka = 500 nm) oznaczone LifeAct::GFP (zielony) oraz rekonstrukcje 3D za pomocą seryjnych mikrofotografii elektronowych zamrożonej osoby dorosłej pod wysokim ciśnieniem (niebieskie). (B) Częstość występowania kręgosłupa według typu, uwidoczniona za pomocą LifeAct::GFP: Cienki/Grzybowy (55,5 ± 14,5%), Filopodial (10,3 ± 8,70%), Stubby (18,8 ± 10,7%), Rozgałęziony (15,42 ± 6,01%). Częstość występowania kolców według typu wizualizowana za pomocą MYR::mRuby: Cienkie/Grzybowe (52,2 ± 16,5%), Filopodial (5,68 ± 7,0%), Stubby (33,1 ± 14,8%), Rozgałęzione (9,02 ± 9,6%). Niesparowany test T, Filopodial (p = 0,0339); Krótkie (p = 0,0009) i rozgałęzione (p = 0,011) kolce oznaczone markerem MYR::mRuby znacznie różnią się od LifeAct::GFP. Ten rysunek został zmodyfikowany z Reference2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Strategie pozyskiwania obrazów kolców DD w wysokiej rozdzielczości. (A-B) (Góra) Obrazy fluorescencyjne dendrytów DD1 oznaczone markerem cytozolowym (mCherry) przez (A) detektor Airyscan i (B) akwizycję Nyquist. (Na dole) Dendryt DD (czerwony) jest przedstawiany za pomocą oprogramowania do analizy obrazu (opcja automatycznej ścieżki śledzenia filamentu), a kolce DD (niebieskie) są ilustrowane graficznie za pomocą półautomatycznego modułu wykrywania kolców. Strzałka wskazuje na rozgałęziony grzbiet powiększony w C i D. Groty strzałek oznaczają sąsiednie cienkie/grzybkowe kolce powiększone w C i D. Pasek skali = 2 μm. (C-D) Powiększone przykłady (górnego) rozgałęzionego grzbietu (strzałka) i (na dole) dwóch sąsiednich cienkich/grzybkowych kolców (grotów strzałek) uzyskanych za pomocą detektora (C) Airyscan lub przez (D) akwizycję Nyquista. Podziałka liniowa = 500 nm. Dane odtworzone z2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ocena funkcji kolców DD. (A) Neurony ruchowe DD wyrażają wskaźnik Ca++ GCaMP6s (zielony), a neurony ruchowe VA wyrażają wariant rodopsyny kanałowej, Chrimson (magenta)7. (B) Schemat przedstawiający metodę montażu ślimaków do pomiarów Ca++. (1) Na czystym szkiełku mikroskopowym (2) umieść 2 μl kulek poliamidowych o wielkości 0,05 μm, (3) użyj drutu platynowego ("wykałaczek ślimakowy"), aby dodać małą kulkę super kleju i (4) zamieszaj w roztworze, aby wytworzyć nitkowate pasma kleju. (5) Dodać 3 μl buforu M9. (6) Umieścić około dziesięciu larw L4 w roztworze, (7) nałożyć szkiełko nakrywkowe i uszczelnić krawędzie wazeliną/woskiem. (C-D) Aktywacja neuronów VA koreluje z stanami przejściowymi Ca++ w kolcach DD1. Fluorescencja GCaMP6s zobrazowana (w odstępach 0,5 s) z okresową aktywacją światłem Chrimson (interwały 2,5 s) wywołuje stany nieustalone Ca++ z (C) + ATR (n = 12), ale nie w kontrolach (D) (-ATR, n = 12). Panele to migawki w czasie (s), przed i po impulsie światła 561 nm (pionowa różowa linia). Podziałka liniowa = 2 μm. Sygnał GCaMP6s jest uzyskiwany z ROI (Region of Interest) na końcu każdego grzbietu. (E) Fluorescencja GCaMP6s podczas 10-sekundowego okresu nagrywania wykreślona dla +ATR (zielony) vs -ATR (kontrolny, szary) (n = 12 filmów). Pionowe różowe paski oznaczają podświetlenie 561 nm (np. aktywacja Chrimson). Każde zwierzę było stymulowane 4 razy światłem o długości fali 561 nm. Pomiary wykonano przed i po każdym impulsie światła o długości fali 561 nm. (F) Wykres fluorescencji GCaMP6s przed i po każdym impulsie światła o długości fali 561 nm. Fluorescencję GCaMP6s mierzono 1 s po każdym impulsie światła o długości fali 561 nm. Ponieważ próbki nie mają rozkładu normalnego, zastosowano sparowany nieparametryczny test Friedmana, aby skorygować wielokrotne porównania fluorescencji GCaMP6s przed vs. po stymulacji światłem 561 nm dla robaków hodowanych za pomocą ATR (+ATR, zielony) (*** p = 0,0004, n = 48 pomiarów) lub przy braku ATR (-ATR, szary) (NS, nieistotny, p = 0,0962, n = 48 pomiarów). Ten rysunek został zmodyfikowany z Reference2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Lista plazmidów użytych w badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Skład i przygotowanie bufora M9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Detektor Airyscan został wybrany do wykonywania zdjęć kolców DD, ponieważ zapewnia wyższy stosunek sygnału do szumu i lepszą rozdzielczość niż konwencjonalne mikroskopy konfokalne19,20. Obrazowanie AiryScan pozwala również na wykorzystanie konwencjonalnych białek fluorescencyjnych (np. GFP, mCherry itp.), które są obecnie powszechnie dostępne dla C. elegans. Chociaż obrazy o wyższej rozdzielczości można uzyskać za pomocą innych metod superrozdzielczych (np. STORM, STED, PALM), metody te wymagają fotoaktywowanych lub fotoprzełączalnych białek fluorescencyjnych21. Jako alternatywę dla Airyscan polecane są konwencjonalne mikroskopy konfokalne. Na przykład obrazowanie z akwizycją Nyquista (ryc. 3) pozwala osiągnąć rozmiar piksela przy użyciu obiektywu 40x/1,3 nm 123,9 nm, co jest wystarczające do rozróżnienia typów morfologicznych kręgosłupa (ryc. 2).

Do określenia gęstości kręgosłupa zaleca się użycie cytozolowego białka fluorescencyjnego, takiego jak (1) mCherry lub GFP, (2) LifeAct do znakowania cytoszkieletu aktynowego lub (3) mirystoylowanego białka fluorescencyjnego (np. MYR::mRuby) do znakowania błony plazmatycznej (Figura 1B). Dla porównania, białko wiążące F-aktynę Utrophin zmniejsza gęstość kręgosłupa (Figura 1C), co wskazuje na negatywny wpływ na morfogenezę kręgosłupa, gdy utropina jest nadmiernie eksprymowana.

Obecne metody obrazowania powinny pomóc w identyfikacji wariantów genetycznych, które regulują morfologię kręgosłupa 1,16. Morfologia kręgosłupa DD (tj. cienki/grzybowaty, filopodialny, przysadzisty, rozgałęziony, patrz ryc. 2) można ocenić na podstawie pojedynczych projekcji 2D bocznych obrazów brzusznego rdzenia nerwowego, ponieważ większość kolców DD przyjmuje charakterystyczną orientację skierowaną brzusznie. W tych porównaniach ważne jest, aby użyć tego samego markera fluorescencyjnego dla każdego schorzenia, ponieważ pozorne typy morfologiczne kręgosłupa wydają się być pod wpływem metody znakowania (np. MYR::mRuby vs. LifeAct::GFP). Ponadto zauważono, że kształty kręgosłupa są dynamiczne i prawdopodobnie zmieniają kształt w odpowiedzi na sygnały zewnętrzne 2,16. W związku z tym niezbędne jest również porównanie kształtów kręgosłupa między genotypami na podobnych etapach rozwoju i w podobnych warunkach.

Orientacja rdzenia brzusznego C. elegans ma kluczowe znaczenie dla dokładnego uzyskania obrazu. Zarówno sznur brzuszny, jak i grzbietowy po przeciwnych stronach zwierzęcia powinny być widoczne w tej samej płaszczyźnie Z, co wskazuje, że robak jest zorientowany na boku (ryc. 1B). Najlepiej nie zbierać obrazów robaków poruszających się lub mających kontakt z innymi robakami lub pęcherzykami w pobliżu rdzenia brzusznego, ponieważ może to zdegradować obrazy kolców.

W przypadku obrazowania wapnia in vivo świeże preparaty należy przygotować bezpośrednio przed każdym pobraniem. Najlepiej jest obrazować robaki w kontakcie tylko z cienkimi włóknami kleju vs. "kulki" kleju, które mają tendencję do wysuszania robaków i degradacji obrazu (ryc. 4B). W eksperymencie pokazanym na rysunku 4 impuls światła o długości fali 561 nm aktywuje całe pole widzenia. W celu zwiększenia rozdzielczości czasowej i przestrzennej w celu wykrycia lokalnych stanów nieustalonych Ca++ , na przykład w obrębie pojedynczych kolców DD, można użyć miniskanera galvo skonfigurowanego dla linii laserowej 561 nm do stymulacji mniejszego obszaru zainteresowania17.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczamy, że nie występujemy w przypadku konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie i analiza na Imaris zostały przeprowadzone w Vanderbilt Cell Imaging Shared Resource (CIRS) wspieranym przez NIH (CA68485, DK20593, DK58404, DK59637, i EY08126). LSM 880 jest wspierany przez grant 1S10OD201630. Obrazowanie na obracającym się dysku firmy Nikon zostało wykonane w Centrum Doskonałości firmy Nikon. Dziękujemy Jenny Schafer, dyrektorce CISR, Bryanowi Millisowi za szkolenie i wnikliwe dyskusje, a także członkom laboratorium Burnette: Dylanowi Burnette'owi, Aidanowi Fenixowi i Nilayowi Taneji za rady. Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health dla DMM (R01NS081259 i R01NS106951) oraz grant American Heart Association dla ACC (18PRE33960581).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
All-trans retinal (ATR)Sigma-AldrichR2500-100MGNiezbędny kofaktor do pobudzenia neuronów za pomocą Chrimson
diH2OMilliQAby przygotować bufor M9
Etanol 100%Sigma64-17-5Aby rozcieńczyć ATR i wykonać płytki kontrolne do wzbudzenia neuronów
Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (trikaina)Do unieruchamiania zwierząt do obrazowania kolców dendrytycznych
ImageJNIH(Schindelin J i wsp., 2012)Oprogramowanie do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym
KH2PO4Fisher Bioreagents7758-11-4Aby przygotować bufor M9
Chlorowodorek lewamizoluSigma16595-80-5Do unieruchamiania zwierząt do obrazowania kolców
dendrytycznychMgSO4Fisher ChemicalM63-500Do przygotowania buforu M9
Szkło pokrywy mikroskopuFisherbrand12542BDo montażu zwierząt do akwizycji mikroskopowej
Na2HPO4Fisher ScientificS369-500Aby przygotować bufor M9
NaClFisher ChemicalS671-3Aby przygotować bufor M9
NIS Elements wersja 05.21NikonDo analizy obrazów i filmów (np. Dekonwolucja, wyrównanie obrazu)
Polybeads karboksylan 0,05um mikrosferyPolysciences, Inc15913-10Do unieruchamiania zwierząt do obrazowania stanów nieustalonych Ca++
PryzmatDo analizy statystycznej i tworzenia wykresów znormalizowanych stanów nieustalonych Ca++
SeaKen ME agarozaLonza50014Do produkcji podkładek agarozowych do mocowania zwierząt do obrazowania
Super GlueFirmagoryli Do unieruchamiania zwierząt do obrazowania stanów nieustalonych Ca++
Szkiełka mikroskopowe SuperfrostFisherbrand22-034-980Do montażu zwierząt do mikroskopii Akwizycja
wazelinyCovidien8884430300Do uszczelniania próbki do zdjęć konfokalnych
WoskFisherbrand23-021-399Paraplast do zatapiania tkanek medium
mikroskop do obrazowania superrozdzielczego
LSM880Detektor Zeiss
Plan Apochromat (olej) 63x/ 1,40 NA, WD = 0,19 mm
Linie
Kontroler stopnia
Mikroskop do akwizycji obrazów Nyquist
A1R KonfokalnyNikon
Plan Fluor (olej) 40x/1.3 NA, WD 0.24 mm
488 nm, 16mW
561 nm, 17mW
Mikroskop do monitorowania wywołanych stanów nieustalonych Ca++ w kolcach dendrytycznych
Spinning Disk Konfokalnyaparat Nikon
Andor DU-897 EMCCD
Głowica z wirującym dyskiem CSU-X1Yokogawa
Apo TIRF (olej) 100x/1.49 NA, WD 0.12 mm
488 nm, 65mW
561 nm, 86 mW
525 nm (+/- 18 nm)
605 nm (+/- 35 nm)
AiryScan Zeiss laserowe,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sala, C., Segal, M. Dendritic Spines: The Locus of Structural and Functional Plasticity. Physiological Reviews. 94 (1), 141-188 (2014).
  2. Cuentas-Condori, A., et al. C. elegans neurons have functional dendritic spines. Elife. 8, 47918(2019).
  3. Philbrook, A., et al. Neurexin directs partner-specific synaptic connectivity in C. Elegans. Elife. 7, 35692(2018).
  4. Oliver, D., Alexander, K., Francis, M. M. Molecular Mechanisms Directing Spine Outgrowth and Synaptic Partner Selection in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 10-13 (2018).
  5. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  6. Ladt, K., Ganguly, A., Roy, S. Axonal actin in action: Imaging actin dynamics in neurons. Methods of Cell Biology. 131, 91-106 (2016).
  7. Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual color neural activation and behavior control with chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (4), 1029-1034 (2015).
  8. Mello, C., Kramer, J., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrahcormosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  9. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C . elegans Using Microinjection. Journal of Visualized Experiments. (18), e833(2008).
  10. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-specific expression profiling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developemntal Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  11. Mccarter, J., Bartlett, B., Dang, T., Schedl, T. Soma - Germ Cell Interactions in Caenorhabditis elegans : Multiple Events of Hermaphrodite Germline Development Require the Somatic Sheath and Spermathecal Lineages. Developemntal Biology. 181 (2), 121-143 (1997).
  12. Driscoll, M. Mounting animals for observation with Nomarski DIC optics. WormBook. , (2008).
  13. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  15. Hotulainen, P., Hoogenraad, C. C. Actin in dendritic spines connecting dynamics to function. Journal of Cell Biology. 189 (4), 619-629 (2010).
  16. Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are They All the Same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
  17. Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121 (9), 2877-2886 (1995).
  18. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The Structure of the Ventral Nerve Cord of Caenorhadbitis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society. 275 (938), 327-348 (1976).
  19. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
  20. Huff, J. The Fast mode for ZEISS LSM 880 with Airyscan high-speed confocal imaging with super-resolution and improved signal-to-noise ratio. Nature Methods. 13, (2016).
  21. Jacquemet, G., Carisey, A. F., Hamidi, H., Henriques, R., Leterrier, C. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. Journal of Cell Science. 133 (11), 240713(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie o superrozdzielczo cineurony GABA ergiczneobrazowanie wapniowemikroskopia konfokalnamorfogeneza kolc waktywacja optogenetycznafluorescencja GCaMPsygnalizacja cholinergiczna

Powiązane artykuły