Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wzrost, oczyszczanie i miareczkowanie onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62677

⸱

13 maja 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunotherapeutics and Biotechnology, Jerry H. Hodge School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Molecular Neurosurgery Laboratory and the Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym manuskrypcie opisujemy prostą metodę wzrostu, oczyszczania i miareczkowania onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej do użytku przedklinicznego.

Streszczenie

Wirusy onkolityczne (OV), takie jak onkolityczny wirus opryszczki pospolitej (oHSV), są szybko rozwijającą się strategią leczenia w dziedzinie immunoterapii nowotworów. OV, w tym oHSV, selektywnie replikują się i zabijają komórki rakowe (oszczędzając zdrowe/normalne komórki), jednocześnie indukując odporność przeciwnowotworową. Ze względu na te unikalne właściwości, strategie leczenia oparte na oHSV są coraz częściej stosowane w leczeniu raka, przedklinicznie i klinicznie, w tym zatwierdzony przez FDA talimogene laherparevec (T-Vec). Wzrost, oczyszczanie i miareczkowanie to trzy podstawowe techniki laboratoryjne dla wszystkich OV, w tym oHSV, zanim będą mogły zostać wykorzystane do badań eksperymentalnych. W tym artykule opisano prostą metodę amplifikacji oHSV krok po kroku w komórkach Vero. Gdy oHSV się namnażają, wywołują efekt cytopatyczny (CPE) w komórkach Vero. Gdy 90-100% zakażonych komórek wykazuje CPE, są one delikatnie zbierane, traktowane benzonazą i chlorkiem magnezu (MgCl2), filtrowane i poddawane oczyszczaniu metodą gradientu sacharozy. Po oczyszczeniu liczbę zakaźnych oHSV (oznaczonych jako jednostki tworzące płytki nazębne lub PFU) określa się za pomocą "testu płytkiowego" w komórkach Vero. Protokół opisany w niniejszym dokumencie może być wykorzystany do przygotowania materiału wyjściowego oHSV o wysokim mianie do badań in vitro w hodowlach komórkowych i doświadczeń in vivo na zwierzętach.

Wprowadzenie

Wirusy onkolityczne (OV) są nową i unikalną formą immunoterapii nowotworów. OV selektywnie replikują się w komórkach nowotworowych i poddają je lizie (oszczędzając normalne/zdrowe komórki)1, jednocześnie indukując odporność przeciwnowotworową2. Onkolityczny wirus opryszczki pospolitej (oHSV) jest jednym z najszerzej przebadanych wirusów spośród wszystkich OV. Jest najdalej posunięty w klinice, a Talimogene laherparepvec (T-VEC) jest pierwszym i jedynym OV, który otrzymał zgodę FDA w USA na leczenie zaawansowanego czerniaka3. Oprócz T-VEC, wiele innych genetycznie modyfikowanych oHSV jest testowanych przedklinicznie i klinicznie w różnych typach raka3,4,5,6,7,8. Obecna zaawansowana biotechnologia rekombinacji DNA jeszcze bardziej zwiększyła możliwości opracowania nowych kodów oHSV dla terapeutycznych transgenów3,5. Skuteczny system namnażania, oczyszczania i oznaczania miana oHSV ma kluczowe znaczenie, zanim jakikolwiek (nowo opracowany) oHSV będzie mógł zostać przetestowany do badań in vitro i in vivo. W tym artykule opisano prostą metodę krok po kroku wzrostu oHSV (w komórkach Vero), oczyszczania (metodą gradientu sacharozy) i miareczkowania (za pomocą testu płytki oHSV w komórkach Vero) (Rysunek 1). Można go łatwo zastosować w dowolnym środowisku laboratoryjnym o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) w celu uzyskania wysokiej jakości zapasów wirusa do badań przedklinicznych.

Vero, linia komórkowa nerki afrykańskiej zielonej małpy, jest najczęściej używaną linią komórkową do rozmnażania oHSV9,10,11,12,13 ponieważ komórki Vero mają wadliwy szlak sygnałowy interferonu przeciwwirusowego14. Inne linie komórkowe z inaktywowanym stymulatorem sygnalizacji genów interferonu (STING) mogą być również wykorzystywane do wzrostu oHSV 12,13. Protokół ten wykorzystuje komórki Vero do wzrostu oHSV i testu płytki nazębnej. Po namnażaniu komórki zakażone oHSV są zbierane, poddawane lizie i poddawane oczyszczaniu, w którym lizowane komórki są najpierw traktowane nukleazą benzonazy w celu degradacji DNA komórki gospodarza, zapobieżenia agregacji kwasu nukleinowego i białka i zmniejszenia lepkości lizatu komórkowego. Ponieważ prawidłowa aktywacja benzonazy często wymaga Mg2+, w tym protokole stosuje się 1-2 mM MgCl2 15. Szczątki komórek gospodarza z lizatu komórkowego poddanego działaniu benzonazy są dalej eliminowane przez filtrację seryjną przed wirowaniem z dużą prędkością w gradieniu sacharozy. Lepka poduszka z 25% roztworem sacharozy pomaga zapewnić wolniejsze tempo migracji wirusa przez warstwę sacharozy, pozostawiając składniki związane z komórkami gospodarza w supernatancie, poprawiając w ten sposób oczyszczanie i ograniczając utratę wirusa w granulce16. Oczyszczony oHSV jest następnie miareczkowany na komórkach Vero, a blaszki wirusowe są wizualizowane za pomocą barwienia Giemsa17 lub barwienia X-gal (dla oHSV kodujących LacZ)18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1) wzrost oHSV

UWAGA: Upewnij się, że instytucjonalny komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzi przed rozpoczęciem pracy z oHSV. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem IBC nr 18007. Zachowaj środki ostrożności BSL2: wybielaj wszystkie pipety, końcówki, rurki i inne materiały, które mają kontakt z wirusem. Spryskaj rękawice 70% alkoholem izopropylowym przed opuszczeniem kaptura do hodowli komórkowych BSL2. Zawsze dokładnie myj ręce wodą z mydłem po pracy z wirusem.

  1. W dniu -1 zasiej niskopasażowe komórki Vero w 20 kolbach T-150 cm2 o gęstości 7-8 × 106 komórek/kolbę w zwykłym podłożu komórkowym Vero.
    UWAGA: Pożywka Vero jest przygotowywana przez uzupełnienie zmodyfikowanej pożywki orła (DMEM) firmy Dulbecco 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (IFCS).
  2. W dniu 0 (komórki zlewają się w 80-90%) dodaj inokulum oHSV na komórki Vero.
    1. Przygotowanie inokulum wirusa
      1. Do amplifikacji wirusa należy użyć wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 0,01 (MOI może wahać się od 0,01 do 0,1 w zależności od zdolności replikacji wirusa). Użyj wzoru (1), aby obliczyć ilość wirusa (ml) na 20 kolb.
        Ilość wirusa (ml) na 20 kolb = ilość potrzebnego wirusa (pfu)/miano wirusa (pfu/ml)(1)
      2. Do przygotowania inokulum wirusa należy użyć soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 1% IFCS (7 ml na kolbę T-150 cm2, tj. ~140 ml na 20 kolb). Dodaj wymaganą ilość oHSV do 140 ml wysokoglukozowego roztworu DPBS/1% IFCS, wiruj przez 1 minutę i utrzymuj mieszaninę gotową do dodania do komórek Vero.
    2. Umyj kolby T-150 cm2 2x DPBS o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionym 1% IFCS (10 ml/pranie). Odessać DPBS/1% IFCS i dodać 7 ml inokulum wirusa/kolby T-150 cm2.
    3. Delikatnie kołysać kolby przez 5 minut za pomocą kołyski kolby w celu prawidłowego rozprowadzenia inokulum na monowarstwie Vero, a następnie inkubować kolby w temperaturze 37 °C przez 1,5-2 godziny. Upewnij się, że półka inkubatora jest wypoziomowana.
    4. Usunąć inokulum i dodać DMEM uzupełniony 1% IFCS (25 ml / kolbę). Inkubować kolby przez 2-4 dni.
  3. Codziennie sprawdzaj kolby pod kątem 90-100% CPE (patrz Rysunek 2).
  4. Zbierz zakażone oHSV komórki Vero.
    1. Zebrać supernatant hodowli (~20 ml) z każdej kolby (pozostawić ~5 ml w każdej kolbie) do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml lub pojemnika na pożywkę.
    2. Użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie zeskrobać komórki z dna kolb.
      UWAGA: Komórki powinny szybko zejść z kolb.
    3. Dodać ~15 ml supernatantu do hodowli (zebranego w kroku 1.4.1) do każdej kolby (co daje objętość ~20 ml w każdej kolbie, tj. 400 ml na 20 kolb) i delikatnie umyć dno kolb kilka razy za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
      UWAGA: Nie pipetować energicznie. Staraj się, aby wszystkie komórki pozostały nienaruszone.
    4. Zebrać komórki (+ pożywkę) do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml na lodzie (użyć 8 probówek na 400 ml pobranych komórek z 20 kolb).
    5. Wirować komórki z masą 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
    6. Dodać 1,25 ml (50%) buforu wirusa (VB) i 1,25 ml (50%) supernatantu hodowlanego (zebranego w kroku 1.4.1) do każdej probówki wirówkowej i dokładnie zawiesić każdą osadkę. Przenieś ponownie zawieszone komórki z ośmiu probówek wirówkowych o pojemności 50 ml do jednej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Patrz przygotowanie roztworu VB w Tabeli 1. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór VB za pomocą filtra do sterylizacji mediów. Użyć 0,5 ml VB + 0,5 ml supernatantu na kolbę T-150 cm2 do ponownego zaparcia, tj. dla 20 kolb (20 ml) użyć 10 ml VB i 10 ml supernatantu do hodowli.
    7. Ponownie zawieszone komórki należy zamrozić za pomocą suchego lodu/100% etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2) oczyszczanie oHSV

  1. Szybkie zamrażanie (w suchym lodzie i 100% etanolu)/rozmrażanie (w ciepłej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C), a następnie sonikacja w kąpieli wodnej przez 1 minutę, w sumie 3 cykle, aby zapewnić prawidłową lizę komórek w celu uwolnienia wirusa w supernatancie.
    UWAGA: Wykonuj sonikację przez 1 minutę przy użyciu zasilania 40 kHz, 120 V. Jeśli przestrajalny sonikator nie jest dostępny, użyj ultradźwiękowego sonikatora w kąpieli wodnej. Pobrać porcję o objętości 50 μl do miareczkowania w sekcji 3, która pomoże określić, który z poniższych etapów jest odpowiedzialny za potencjalną utratę wirusa podczas procedury oczyszczania.
  2. Potraktować lizat komórkowy nukleazą benzonazową (175 jednostek/ml) + 2 mM MgCl2 (1 M zapas = 2 μl/ml), wirować i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Umieścić probówkę na lodzie i wykonać następujące czynności w temperaturze 4 °C.
  3. Osadzaj resztki komórek przez wirowanie na niskiej prędkości.
    1. Wirować lizat komórkowy z prędkością 300 g przez 10 minut.
    2. Zebrać supernatant w nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml VB, oznaczyć go jako osad-1 i przechowywać w temperaturze 4 °C do użycia w kroku 2.3.5; patrz Rysunek 1).
    3. Ponownie odwirować supernatant (otrzymany w kroku 2.3.2) z prędkością 500 g przez 10 minut.
    4. Zebrać supernatant w nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml VB, oznaczyć go jako granulkę-2 i przechowywać w temperaturze 4 °C do użycia w kroku 2.3.5; patrz Rysunek 1).
    5. Połączyć ponownie zawieszone osady-1 (z 2.3.2) i osady-2 (z 2.3.4) w nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,7 ml, wirować/sonikować (łaźnia wodna) 2x i wirować z prędkością 400 g przez 10 minut. Zebrać supernatant i połączyć go z supernatantem otrzymanym w kroku 2.3.4; patrz Rysunek 1).
      UWAGA: Wykonuj sonikację przez 1 minutę przy użyciu zasilania 40 kHz, 120 V, aby zapobiec agregacji wirusów przed procedurą filtracji w kroku 2.4. Pobrać 50 μl podwielokrotności połączonego supernatantu do miareczkowania zgodnie z sekcją 3.
  4. Przefiltrować złożony supernatant (~21 ml, tj. 20 ml z 1.4.6, 0,5 ml z 2.3.2 i 0,5 ml z 2.3.4) stosując następującą 3-etapową metodę filtracji.
    1. Pobrać 21 ml supernatantu za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml (5-7 ml za każdym razem dla łatwego przejścia przez filtr) i przepuścić go przez sterylny filtr membranowy z polifluorku winylidenu (PVDF) o grubości 5 μm umieszczony na nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (oznaczonej jako PROBÓWKA 1).
      1. Dodać 1 ml VB do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml opróżnionej w 2.4.1 (w celu zebrania pozostałej śladowej ilości supernatantu wirusa), odwirować i przepuścić przez ten sam filtr PVDF 5 μm umieszczony na probówce 1 (co daje w sumie 22 ml filtratu). Przejdź do kroku 2.4.2.
    2. Pobrać 22 ml filtratu z probówki 1 (jak w ppkt 2.4.1) i przepuścić go przez sterylny filtr membranowy z mieszanego estru celulozy (MCE) o objętości 0,8 μm umieszczony na nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (oznaczonej jako PROBÓWKA 2).
      1. Dodaj 1 ml VB do probówki 1 opróżnionej w kroku 2.4.2, wir i przepuść przez ten sam filtr MCE 0,8 μm umieszczony na probówce 2 (co daje w sumie 23 ml filtratu). Przejdź do kroku 2.4.3.
    3. Pobrać 23 ml filtratu z probówki 2 (jak w ppkt 2.4.1) i przepuścić go przez sterylny filtr PVDF o pojemności 0,45 μm umieszczony na nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (oznaczonej jako PROBÓWKA 3).
      1. Dodaj 1 ml VB do probówki 2 opróżnionej w kroku 2.4.3, wiruj i przepuść przez ten sam filtr PVDF 0,45 μm umieszczony na probówce 3 (co daje w sumie 24 ml filtratu).
        UWAGA: Pobrać 50 μl podwielokrotności filtratu do miareczkowania w sekcji 3.
  5. Szybkie wirowanie metodą gradientu sacharozy
    UWAGA: W tym protokole zastosowano wirnik F13-14x50cy o stałym kącie. Zarówno wirnik, jak i wirówka muszą mieć temperaturę 4 °C przed przystąpieniem do następujących kroków.
    1. Dodaj 10 ml lodowatego, sterylnie przefiltrowanego 25% roztworu sacharozy (przygotowanego przez rozpuszczenie 25 g sacharozy w proszku w 100 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka) do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    2. Powoli (3 ml/min) dodać 24 ml filtratu wirusa (otrzymanego z kroku 2.4.3.1) na wierzch warstwy sacharozy. Należy zwrócić uwagę na zachowanie oddzielnych warstw filtratu wirusa i roztworu sacharozy.
      UWAGA: Do 10 ml roztworu sacharozy można dodać do 30 ml warstwy wirusa.
    3. Odwirowywać probówkę przez 90 minut w temperaturze 22 620 g w temperaturze 4 °C.
    4. Usunąć warstwę sklaratyny i sacharozy ze stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Osadek wirusa powinien być białawy. Pobrać 50 μl podwielokrotności supernatantu i 50 μl podwielokrotności warstwy sacharozy do miareczkowania w sekcji 3.
  6. Ponownie zawiesić osad w 10% roztworze glicerolu/PBS.
    1. Dodać 1 ml sterylnego 10% glicerolu (rozcieńczonego w PBS) do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, aby przykryć osad.
      UWAGA: Ilość ponownie zawieszonej mieszaniny może się różnić (np. 0,8-1,2 ml) w zależności od wielkości granulki. Mniejsza objętość dałaby wyższe stężenie wirusa.
    2. Umieść stożkową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na lodzie na 2-4 godziny. W tym okresie należy sonicate/wirtex granulki co 15 minut przez 30 sekund, aby pomóc w usunięciu/ponownym zawieszeniu granulki.
    3. Zbierz ponownie zawieszony osad (1 ml 10% glicerolu/PBS + wielkość granulki zwiększy całkowitą objętość do ~1,3 ml) w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml. [Opcjonalnie: Dodaj kolejne 0,3 ml 10% glicerolu/PBS do tej samej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, aby zebrać pozostałą śladową ilość osadu, pipetować w górę iw dół i połączyć z ponownie zawieszonym osadem w kroku 2.6.3, aby uzyskać całkowitą objętość do ~1,6 ml.]
      1. Jeżeli zawiesina w kroku 2.6.3 jest mętna lub mętna (z powodu resztek komórek), odwirować probówkę o masie 500 g przez 10 minut, przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml i przejść do etapu 2.6.4.
    4. Pobrać porcję 50 μl do miareczkowania oHSV w sekcji 3. Resztę roztworu (250 μl/podwielokrotność) przelać do sterylnych probówek do mikrowirówek z nakrętkami (dobrze zamkniętymi do długotrwałego przechowywania), zamknąć i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia (gotowe do badań eksperymentalnych po ustaleniu miana oHSV).
      UWAGA: Wszystkie materiały, które mają kontakt z wirusem, muszą zostać wybielone lub poddane działaniu promieniowania ultrafioletowego przed wyjęciem z okapu lub utylizacją.

3. Miareczkowanie oHSV i test płytki nazębnej

  1. Nasiona 1,7-1,8 x 105 komórek Vero/basenik w 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w pożywce z komórek Vero (DMEM z 10% IFCS; patrz krok 1.1).
    UWAGA: Upewnij się, że komórki są jednorodnie rozmieszczone w całej studzience; Nie obracaj płytki, ponieważ może to spowodować gromadzenie się komórek w środku studzienek. Aby zapobiec wirowaniu, powoli kołysz płytką ręcznie w pionie, następnie w poziomie, a następnie delikatnie umieść płytkę w inkubatorze.
  2. Następnego dnia (gdy komórki osiągną 70-80% zbieżności), odessać pożywkę hodowlaną i dodać 1 ml / studzienkę PBS o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 1% IFCS. Pozostawić płytkę w kapturze do hodowli komórkowej do czasu zakończenia kroku 3.3.
  3. Seryjnie rozcieńczyć wirusa w probówkach polipropylenowych o pojemności 5 ml przy użyciu PBS/1% IFCS (Rysunek 3).
    UWAGA: Do rozcieńczania szeregowego użyć 50 μl podwielokrotności zebranej w kroku 2.6.4. Dopierwszej probówki (rozcieńczenie 10-3) dodać 2 μl wirusa w 1998 r. μL PBS/1% IFCS, wir. Do 2. probówki (rozcieńczenie 10-5) pobrać 10 μl z 1. probówki w 990 μl PBS/1% IFCS, wirować. Wtrzeciej probówce (rozcieńczenie 10-6) pobrać 100 μl zdrugiej probówki w 900 μl PBS/1% IFCS, wir; Kontynuować to 10-krotne seryjne rozcieńczanie aż do rozcieńczenia 10-9. Zobacz szczegóły w Rysunek 3.
  4. Odessać PBS/1% IFCS i dodać 0,7 ml/studzienkę seryjnie rozcieńczonego wirusa (zaczynając od 10-5 do 10-9) do komórek Vero.
    UWAGA: Nie pozwól, aby komórki wyschły.
  5. Delikatnie kołysz płytką na kołysku przez 5 minut w temperaturze pokojowej (aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum wirusa).
  6. Inkubować płytkę przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Podczas tego okresu inkubacji należy przygotować rozcieńczenie ludzkiej immunoglobuliny G (IgG) w stosunku 1:1000 w DMEM uzupełnione 1% IFCS. W przypadku płytki 6-dołkowej przygotuj 12,5 ml tak, aby można było użyć 2 ml / dołek w kroku 3.7. Dostosuj rozcieńczenie, aby uwzględnić zmiany partii w ludzkiej IgG.
  7. Usunąć inokulum wirusa z dołków i dodać 2 ml / studzienkę 0,1% ludzkiej IgG (w celu zneutralizowania oHSV w pożywce hodowlanej i zapobieżenia tworzeniu się wtórnych blaszek) w DMEM uzupełnionym 1% IFCS. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3-4 dni.
    UWAGA: Przezroczyste blaszki nazębne tworzą się zwykle w ciągu 3 dni.
  8. Mocowanie i barwienie płyt
    1. Usunąć supernatant i umieścić komórki w czystym metanolu (1 ml/studzienkę) na 5 minut. Usunąć metanol i pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu.
    2. Rozcieńczyć barwnik Giemsa (1:5) wodą dejonizowaną i dodać 1 ml rozcieńczonej plamy Giemsa do studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut.
    3. Usuń plamę, spłucz wodą z kranu i pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu.
    4. Policz blaszki za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
    5. Opcjonalnie dla oHSV z wyrażeniem lacZ:
      1. Usuń supernatant i utrwal komórki zimnym 0,2% aldehydem glutarowym/2% paraformaldehydem przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Usuń roztwór utrwalający i przemyj komórki 3x PBS.
      3. Dodać roztwór X-gal do komórek (1 ml/basenik) i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny
        UWAGA: Plama X-gal powinna być przygotowana na świeżo w dniu barwienia; Długotrwałe przechowywanie może prowadzić do blaknięcia koloru. Patrz przygotowanie roztworu X-gal w Tabeli 1.
      4. Usuń plamę X-gal i umyj płytkę wodą z kranu przez 1 minutę.
      5. Przeciwbarwienie roztworem czerwieni neutralnej (1 ml / studzienkę) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Patrz przygotowanie roztworu czerwieni obojętnej w Tabeli 1.
      6. Myj talerz wodą z kranu przez 1 minutę; pozostaw talerze do wyschnięcia na powietrzu.
      7. Policz niebieskie blaszki za pomocą mikroskopu preparacyjnego (Rysunek 4).
  9. Oblicz miano za pomocą wzoru (2)
    Miano w pfu/ml (jednostki tworzące blaszkę miażdżycową) = liczba blaszek/0,7 ml × współczynnik rozcieńczenia (2)
    UWAGA: Na przykład, jeśli w studzience do rozcieńczenia 10-9 znajduje się 25 blaszek, miano wynosi 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/ml. Jest to końcowe miano podwielokrotności oHSV przygotowane w kroku 2.6.4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Krótki przegląd całego protokołu przedstawiono na Ryc. 1, która obrazuje krytyczne etapy wzrostu, oczyszczania i miareczkowania oHSV. Efekt cytopatyczny (CPE) w komórkach Vero można wykryć już 4 h po infekcji HSV19. Ryc. 2 pokazuje CPE w komórkach Vero w trzech różnych punktach czasowych po infekcji oHSV. Stopień CPE wzrasta wraz z upływem czasu. W niniejszym protokole CPE na poziomie 90-100% obserwuje się zazwyczaj w ciągu 48 h od inokul...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół rozpoczyna się od wzrostu oHSV w komórkach Vero o niskim pasażu. Zbieganie się monowarstwy komórek Vero powinno wynosić ~ 80% w momencie inokulacji wirusa, ponieważ przerośnięte komórki mogą rozwijać ciasne struktury włókniste, które mogą zmniejszyć wnikanie oHSV do komórek Vero20. Po zaobserwowaniu 90-100% CPE, supernatant hodowli jest usuwany, komórki są zbierane, ponownie zawieszane w VB/supernatantze (patrz krok 1.4.6), zamrażane błyskawicznie i przechowywane w temperaturze -80 °C w c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

SDR jest współwynalazcą patentów związanych z onkolityczną wirusem opryszczki pospolitej, będących własnością i zarządzanych przez Uniwersytet Georgetown i Massachusetts General Hospital, które otrzymały tantiemy od Amgen i ActiVec Inc. i jest członkiem Naukowej Rady Doradczej EG 427. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania w laboratorium Saha były częściowo wspierane przez fundusze z DOD (W81XWH-20-1-0702) i Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin i Melissa R.M. Humphrey byli częściowo wspierani przez NIH (R01 CA160762).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe 1,7 mlSigmaCLS3620
15 ml polipropylenowe probówkiFalcon352097
5 ml probówki polipropylenoweFalcon352063
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowychFalcon353046
Benzonaza NukleazaSigmaE8263-25KU
Skrobak do komórekFisher Scientific179693
DimetylosulfotlenekSigmaD2650-100ML
Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle MediumCorningMT-10-013-CV
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiCorningMT-21-031-CV
Płodowa surowica bydlęcaHyklonSH3007003
Giemsa StainSigmaG3032
Aldehyd glutarowyFisher Scientific50-262-23
GlicerolSigmaG5516
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)CorningMT-21-021-CV
Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigmaD4031
Ludzka immunoglobulinaGamastanNDC 13533-335-12
Chlorek magnezuFisher ChemicalM33-500
, 250 mlNalgene, Fisher Scientific09-740-25E
Filtr do sterylizacji mediów, 500 mlNalgene, Fisher Scientific09-740-25C
Neutralny czerwony roztwórSigmaN4638
ParaformaldehydFisher scientific  15710S
Wahacz płytowyFisher88861043
Żelazocyjanek potasuSigmaP8131
Żelazocyjanek potasuSigmaP9387
Chlorek soduFisher ChemicalS271-3
Wirówka Sorvall ST 16RThermoFisher Scientific75004381
Sorvall ST 21R WirówkaThermoFisher Scientific75002446
sterylne probówki do mikrowirówek z nakrętkamiFisher Scientific02-681-371
SacharozaFisher ScientificBP220-1
Filtr strzykawkowy, 0,45 PVDFMilliporeFiltrSLHV033RS
0,8 MCEMilliporeSigmaSLAA033SS
Filtr strzykawkowy, 5 i mikro; m PVDFMilliporeKolba hodowlana SigmaSLSV025LS
T150Falcon355001
Tris-HClMP Biomedicals LLC816116
Ultradźwiękowa kąpiel wodnaBransonCPX-952-116R
X-galCorning46-101-RF
wirówkowe 50 ml polipropylenowe probówki Falcon 352098 Filtr do sterylizacji mediów strzykawkowy Sigma ,

Bibliografia

  1. Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
  2. Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
  3. Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
  4. Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010(2015).
  5. Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
  6. Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514(2020).
  7. Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310(2020).
  8. Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400(2020).
  9. Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
  10. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).
  11. Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
  12. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407(2020).
  13. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477(2021).
  14. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
  15. Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
  16. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
  17. Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
  18. Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40(2006).
  19. Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
  20. Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1(2005).
  21. Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
  22. Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
  23. Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
  24. Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224(2013).
  25. Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
  26. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).
  27. Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065(2014).
  29. Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
  30. Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Onkolityczny wirus opryszczkioczyszczanie wirusatest plackowyefekt cytopatycznykomórki Verogradient sacharozyimmunoterapia nowotworówmiareczkowanie wirusatraktowanie Benzonaząprzygotowanie zapasu wirusa
Wzrost, oczyszczanie i miareczkowanie onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.