Artykuł metodologiczny

Automatyczna identyfikacja gałęzi dendrytycznych i ich orientacji

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62679

⸱

17 września 2021

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Ariel University, 2Department of Physics, Ariel University

W tym artykule

Podsumowanie

Presented to narzędzie obliczeniowe, które umożliwia prosty i bezpośredni automatyczny pomiar orientacji gałęzi dendrytycznych neuronów na podstawie obrazów fluorescencyjnych 2D.

Streszczenie

Struktura neuronalnych drzew dendrytycznych odgrywa kluczową rolę w integracji wejść synaptycznych w neuronach. Dlatego charakterystyka morfologii dendrytów jest niezbędna do lepszego zrozumienia funkcji neuronów. Jednak złożoność drzew dendrytycznych, zarówno gdy są izolowane, jak i zwłaszcza gdy znajdują się w sieciach neuronowych, nie została w pełni poznana. Opracowaliśmy nowe narzędzie obliczeniowe SOA (Segmentation and Orientation Analysis), które umożliwia automatyczny pomiar orientacji gałęzi dendrytycznych na podstawie obrazów fluorescencyjnych kultur neuronalnych 2D. SOA, napisany w Pythonie, wykorzystuje segmentację do odróżnienia gałęzi dendrytycznych od tła obrazu i gromadzi bazę danych na temat kierunku przestrzennego każdej gałęzi. Baza danych jest następnie wykorzystywana do obliczania parametrów morfologicznych, takich jak kierunkowy rozkład gałęzi dendrytycznych w sieci i częstość występowania równoległego wzrostu gałęzi dendrytycznych. Uzyskane dane mogą być wykorzystane do wykrywania zmian strukturalnych dendrytów w odpowiedzi na aktywność neuronalną oraz bodźce biologiczne i farmakologiczne.

Wprowadzenie

Morfogeneza dendrytyczna jest centralnym tematem w neurobiologii, ponieważ struktura drzewa dendrytycznego wpływa na właściwości obliczeniowe integracji synaptycznej w neuronach1,2,3. Co więcej, nieprawidłowości morfologiczne i modyfikacje w gałęziach dendrytycznych są związane z zaburzeniami zwyrodnieniowymi i neurorozwojowymi4,5,6. W kulturach neuronalnych, w których rozgałęzienie dendrytyczne może być łatwiej uwidocznione, interakcje między niesiostrzanymi gałęziami dendrytycznymi regulują miejsca i zakres grupowania synaptycznego wzdłuż gałęzi, zachowanie, które może wpływać na koaktywność i plastyczność synapsów7,8,9. W związku z tym charakterystyka parametrów morfologicznych drzewa dendrytycznego przy użyciu dwuwymiarowych (2D) kultur neuronalnych jest korzystna dla zrozumienia morfogenezy dendrytycznej i funkcjonalności neuronów pojedynczych i sieci neuronów. Jest to jednak trudne zadanie, ponieważ gałęzie dendrytyczne tworzą złożoną siatkę nawet w "uproszczonych" kulturach neuronalnych 2D.

Kilka narzędzi zostało opracowanych do automatycznego śledzenia i analizowania struktur dendrytycznych10,11,12,13. Jednak większość z tych narzędzi jest zaprojektowana dla sieci neuronowych 3D i są naturalnie zbyt złożone, aby można było ich używać z sieciami 2D. W przeciwieństwie do tego, mniej zaawansowane narzędzia do analizy morfologicznej zazwyczaj obejmują znaczny składnik pracy ręcznej wspomaganej komputerowo, co jest bardzo czasochłonne i podatne na stronniczość operatora14. Istniejące półautomatyczne narzędzia, takie jak 'ImageJ'15 (pakiet do przetwarzania obrazów NIH o otwartym kodzie źródłowym z ogromną kolekcją opracowanych przez społeczność narzędzi do analizy obrazów biologicznych), znacznie zmniejszają nakład pracy użytkownika. Jednak podczas przetwarzania obrazu nadal potrzebne są pewne ręczne interwencje, a jakość segmentacji może być mniej niż pożądana.

Ten artykuł przedstawia SOA, proste zautomatyzowane narzędzie, które umożliwia bezpośrednią segmentację i analizę orientacji gałęzi dendrytycznych w sieciach neuronowych 2D. SOA może wykrywać różne obiekty przypominające linie na obrazach 2D i charakteryzować ich właściwości morfologiczne. W tym przypadku użyliśmy SOA do segmentacji gałęzi dendrytycznych w obrazach fluorescencyjnych 2D sieci dendrytycznych w hodowli. Oprogramowanie identyfikuje gałęzie dendrytyczne i z powodzeniem wykonuje pomiary parametrów morfologicznych, takich jak równoległość i rozkład przestrzenny. SOA można łatwo dostosować do analizy procesów komórkowych innych typów komórek oraz do badania sieci niebiologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Izraelskie Ministerstwo Zdrowia zatwierdziło wykorzystanie myszy zgodnie z protokołem IL-218-01-21 dotyczącym etycznego wykorzystywania zwierząt doświadczalnych. SOA jest kompatybilne wyłącznie z systemem Windows 10 i językiem Python 3.9. Jest dostępne jako kod open-source: https://github.com/inbar2748/DendriteProject. Pod tym linkiem znajduje się również plik README.DM zawierający instrukcje pobierania oprogramowania, link do strony internetowej programu oraz plik wymagań z informacjami o niezbędnych wersjach wszystkich pakietów. Udostępniono tam również dodatkowe przykłady analiz wykonanych przy użyciu tego oprogramowania. 

figure-protocol-1
Rycina 1Przebieg pracy SOA w zakresie segmentacji i analizy kierunku wzrostu. Przedstawiono etapy przetwarzania obrazów fluorescencyjnych sieci dendrytycznych oraz analizy danych. Obraz 2D zostaje wgrany, a następnie poddany segmentacji (w dwóch krokach: najpierw wykrywane są odgałęzienia dendrytyczne jako linie, a następnie odpowiednie linie są łączone), co pozwala na uzyskanie informacji przestrzennych o każdym odgałęzieniu dendrytycznym. Dane są zbierane dla wszystkich odgałęzień dendrytycznych na obrazie. Na koniec dane są analizowane w celu uzyskania pożądanych parametrów morfologicznych. Skrót: SOA = analiza segmentacji i orientacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Otwórz aplikację SOA.

  1. Otwórz adres URL: https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA, znajdź skompresowany folder SOA.zip i pobierz plik ZIP, klikając go dwukrotnie.
  2. Rozpakuj folder, klikając prawym przyciskiem myszy na SOA.zip i wybierając opcję Wyodrębnij pliki. W oknie Ścieżka i opcje wyodrębniania, które się pojawi, zwróć uwagę na pole tekstowe Adres docelowy, w którym wyświetlana jest ścieżka dla wyodrębnionych plików. Aby wyodrębnić pliki w innym miejscu, kliknij jeden z folderów w prawym panelu okna, aby ustanowić go folderem docelowym. Kliknij OK , aby wyodrębnić pliki do tego folderu.
  3. Otwórz wyodrębniony folder SOA i kliknij dwukrotnie plik SOA.exe. Poczekaj na otwarcie czarnego okna, po czym pojawi się aplikacja.

figure-protocol-2
Rycina 2: Przykład przepływu pracy (workflow) z wykorzystaniem GUI SOA. Lewa kolumna: sekcje GUI przepływu pracy. Środkowa kolumna: obraz sieci dendrytycznej przetwarzany w ramach przepływu pracy (Pasek skali: 20 µm). Prawa kolumna: powiększenie obszaru zaznaczonego czerwonym prostokątem na obrazach w kolumnie środkowej (Pasek skali: 4 µm). Krok 1: Wybór i przesyłanie obrazu. Krok 2: Pierwszy etap segmentacji to detekcja linii reprezentujących zidentyfikowane gałęzie dendrytyczne. Krok 3: Drugi etap segmentacji to łączenie segmentów linii w poszczególnych gałęziach dendrytycznych na podstawie bliskości. Ustawienia wszystkich kroków mogą być modyfikowane. Skróty: SOA = segmentation and orientation analysis (analiza segmentacji i orientacji); GUI = graphical user interface (graficzny interfejs użytkownika). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Otwórz obraz do analizy.

  1. W Przesyłanie do przeglądarki SOA pasek menu | wybierz Wybierz plik | wybierz obraz z plików komputerowych | kliknij go (tylko pliki .png, .jpg, .tif, .bmp) | Otwórz obserwować ścieżka do pliku | Dalej.

3. Optymalizacja segmentacji

UWAGA: W pasku menu SOA Viewer Properties zmień wartości wybranych parametrów, aby dostosować ustawienia procesu segmentacji. Szczegółowy opis parametrów, takich jak Threshold, znajduje się w Supplemental Material.

  1. W sekcji Edges (Krawędzie) dostosuj próg wyświetlania, wybierając pole Threshold  i wprowadzając odpowiednią liczbę.
    UWAGA: Im niższa wartość progu, tym więcej linii zostanie wykrytych. Próg jest liczbą z zakresu od 0 do 255. Wartość domyślna została ustawiona na 0.
  2. W sekcji Merge Lines (Łączenie linii):
    1. Dostosuj minimalną odległość łączenia dla wyświetlania, wybierając pole Min distance to merge i wprowadzając liczbę.
      UWAGA: Parametr Min distance to merge przyjmuje wartości od 0 do 30 pikseli. Wartość domyślna jest ustawiona na 20.
    2. Dostosuj minimalny kąt łączenia dla wyświetlania, wybierając pole Min angle to merge i wprowadzając liczbę.
      UWAGA: Parametr Min angle to merge przyjmuje wartości od 0 do 30°. Wartość domyślna jest ustawiona na 10.
  3. Kliknij Create Preview Segmentation Image (Utwórz podgląd obrazu segmentacji).
    UWAGA: Zgodnie z zaktualizowanymi wartościami wyświetlony zostanie obraz podglądu wyników segmentacji. Dodatkowo wyświetlona zostanie liczba linii przed oraz po połączeniu.
  4. Zmieniaj parametry, aby uzyskać maksymalną identyfikację segmentów. Jeśli konieczna jest zmiana właściwości, kliknij przycisk Close window (Zamknij okno) i wykonaj kroki 3.1-3.4.

4. Utwórz pliki wyjściowe.

  1. Naciśnij OK, aby wyświetlić obrazy segmentacji oraz wykresy analizy. W oknie, które pojawi się w celu wybrania lokalizacji zapisu pliku .xlsx, wskaż odpowiedni folder.
  2. Wprowadź nazwę pliku | Wybierz Save | poczekaj, aż plik .xlsx z danymi zostanie utworzony i zapisany.
    ​UWAGA: Oprócz pliku .xlsx automatycznie zostaną wyświetlone następujące pliki: plik z obrazem oryginalnym, obraz rozpoznawania linii, końcowy obraz segmentacji oraz trzy wykresy analizy.

5. Pasek nawigacji

UWAGA: We wszystkich oknach z rysunkami znajduje się pasek narzędzi nawigacyjnych, który można wykorzystać do przeglądania zestawu danych. Każdy z przycisków u dołu paska narzędzi został opisany poniżej.

  1. Aby przechodzić między wcześniej zdefiniowanymi widokami, należy używać przycisków W przód (Forward) i Wstecz (Back).
    UWAGA: Przyciski Strona główna (Home), W przód (Forward) i Wstecz (Back) działają podobnie jak przyciski Strona główna, W przód i Wstecz w przeglądarce internetowej. Strona główna (Home) powraca do domyślnego ekranu, czyli obrazu oryginalnego.
  2. Do przesuwania i powiększania obrazu należy używać przycisku Zoom . Aby aktywować te funkcje, należy nacisnąć przycisk Zoom, a następnie przesunąć mysz w wybrane miejsce na obrazie.
    1. Aby przesunąć rysunek, należy nacisnąć i przytrzymać lewy przycisk myszy, przeciągając go w nową pozycję. Po zwolnieniu przycisku wybrany punkt obrazu pojawi się w nowym położeniu. Podczas przesuwania można przytrzymać klawisze x lub y, aby ograniczyć ruch odpowiednio do osi x lub y.
    2. Aby powiększyć obraz, należy przytrzymać prawy przycisk myszy i przeciągnąć go w nową lokalizację. Przesunięcie w prawo powoduje powiększenie wzdłuż osi x, a w lewo – pomniejszenie wzdłuż osi x. Analogicznie postępuj w przypadku osi y oraz ruchów góra/dół. Należy pamiętać, że podczas powiększania punkt znajdujący się pod kursorem pozostaje nieruchomy, co pozwala na przybliżanie lub oddalanie obrazu wokół tego punktu. Używaj klawiszy modyfikujących x, y lub CONTROL, aby ograniczyć powiększanie odpowiednio do osi x, y lub zachować proporcje obrazu.
  3. Aby aktywować tryb powiększania do prostokąta, należy kliknąć przycisk Zoom-to-rectangle. Należy ustawić kursor nad obrazem i nacisnąć lewy przycisk myszy. Przytrzymując przycisk, należy przeciągnąć mysz w nową lokalizację, aby zdefiniować obszar prostokątny.
    UWAGA: Po naciśnięciu lewego przycisku myszy granice widoku osi zostaną powiększone do zdefiniowanego obszaru. Po naciśnięciu prawego przycisku myszy granice widoku osi zostaną pomniejszone tak, aby oryginalne osie zmieściły się w zdefiniowanym obszarze.
  4. Do konfiguracji wyglądu wykresu pomocniczego należy używać narzędzia Subplot-configuration.
    UWAGA: Lewą, prawą, górną i dolną krawędź wykresu pomocniczego, a także odstępy między wierszami i kolumnami, można rozciągać lub zwężać.
  5. Aby otworzyć okno dialogowe zapisu pliku, należy kliknąć przycisk Save i zapisać plik w jednym z następujących formatów: .png, .ps, .eps, .svg lub .pdf.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadzono reprezentacyjną analizę obrazów sieci dendrytycznych w hodowli. Komórki wyizolowano zgodnie z opisem Baranes et al.16,17. W skrócie, komórki hipokampa wyizolowano z mózgów szczurów postnatalnych i hodowano na dwuwymiarowych szkiełkach przedmiotowych przez 1-2 tygodnie. Następnie hodowle utrwalono i zabarwiono metodą pośredniej immunofluorescencji z użyciem przeciwciała przeciwko markerowi białek dendrytycznych, białku MAP2 (microtubule-ass...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pilnie potrzebne są skuteczne strategie wydobywania informacji morfologicznych z obrazów 2D, aby nadążyć za danymi z obrazowania biologicznego. Chociaż dane obrazowe mogą być generowane w ciągu kilku godzin, dogłębna analiza obrazów zajmuje dużo czasu. W rezultacie przetwarzanie obrazu stało się w oczywisty sposób poważną przeszkodą w wielu dziedzinach. Wynika to częściowo z dużej złożoności danych, zwłaszcza w przypadku próbek biologicznych. Ponadto, ponieważ wielu użytkowników nie ma specjalistycznych umiejętności prog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Orly Weiss za przygotowanie obrazów kulturowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Matplotlib  2002 - 2012 John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom i zespół programistów Matplotlib; 2012 - 2021 Zespół programistów Matplotlib.3.4.2Biblioteka do kreślenia 2D w Pythonie
matplotlib-scalebarPhilippe Pinard0.7.2artysta dla matplotlib do wyświetlania paska skali
NumPySpołeczność NumPy.1.20.3podstawowy pakiet dla naukowej biblioteki obliczeniowej
OpenCVZespół OpenCV4.5.2.54Biblioteka wizji komputerowej Open
Source PyCharmJetBrains2020.3.1 (Community Edition) wersjaKompilacja #PC-203.6682.86, zbudowana 18 grudnia 2020 r. Wersja środowiska uruchomieniowego: 11.0.9.1+11-b1145.37 amd64. Maszyna wirtualna: 64-bitowa maszyna wirtualna serwera OpenJDK firmy JetBrains s.r.o. Okna 10 10.0. Pamięć: 978M, Rdzenie: 4
PyQt5Riverbank Computing5.15.4zarządzanie GUI
pythonPython Software Foundation License3.9 wersja
QtDesigner The QT Company Ltd.5.11.1 wersja
scipyCommunity library project1.6.3Oparty na Pythonie ekosystem oprogramowania open source dla matematyki, nauk ścisłych i inżynierii
SeabornMichael Waskom.0.11.1Biblioteka wizualizacji danych statystycznych w Pythonie.
Windows 10Microsoft
XlsxwriterJohn McNamara1.4.3Moduł Pythona do tworzenia plików Excel XLSX

Bibliografia

  1. Ferrante, M., Migliore, M., Ascoli, G. Functional impact of dendritic branch-point morphology. Journal of Neuroscience. 33 (5), 2156-2165 (2013).
  2. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 206-221 (2008).
  3. Chklovskii, D. Synaptic Connectivity and Neuronal Morphology: Two Sides of the Same Coin. Neuron. 43 (5), 609-617 (2004).
  4. Chapleau, C., Larimore, J., Theibert, A., Pozzo-Miller, L. Modulation of dendritic spine development and plasticity by BDNF and vesicular trafficking: fundamental roles in neurodevelopmental disorders associated with mental retardation and autism. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 1 (3), 185-196 (2009).
  5. Irwin, S. Dendritic Spine Structural Anomalies in Fragile-X Mental Retardation Syndrome. Cerebral Cortex. 10 (10), 1038-1044 (2000).
  6. Kaufmann, W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral Cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
  7. Pinchas, M., Baranes, D. Dendritic branch intersections are structurally regulated targets for efficient axonal wiring and synaptic clustering. PLoS ONE. 8 (12), 82083(2013).
  8. Cove, J., Blinder, P., Baranes, D. Contacts among non-sister dendritic branches at bifurcations shape neighboring dendritic branches and pattern their synaptic inputs. Brain Research. 1251, 30-41 (2009).
  9. Blinder, P., Cove, J., Foox, M., Baranes, D. Convergence among non-sister dendritic branches: An activity-controlled mean to strengthen network connectivity. PLoS ONE. 3 (11), 3782(2008).
  10. Glaser, J., Glaser, E. Neuron imaging with neurolucida - PC-based system for image combining microscopy. Computerized Medical Imaging and Graphics. 14 (5), 307-317 (1990).
  11. Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nature Protocols. 3 (5), 866-876 (2008).
  12. Torben-Nielsen, B. An efficient and extendable python library to analyze neuronal morphologies. Neuroinformatics. 12 (4), 619-622 (2014).
  13. Parekh, R., Ascoli, G. Neuronal morphology goes digital: A research hub for cellular and system neuroscience. Neuron. 78 (1), 206(2013).
  14. heng, J., Zhou, X., Sabatini, B. L., Wong, S. T. C. NeuronIQ: A novel computational approach for automatic dendrite SPINES detection and analysis. 2007 IEEE/NIH Life Science Systems and Applications Workshop. , 168-171 (2007).
  15. Image processing and analysis in Java. NIH. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2021).
  16. Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13, 461-472 (2007).
  17. Morad, T. I., Hendler, R. M., Weiss, O. E., Canji, E. A., Merfeld, I., Dubinsky, Z., Minnes, R., Francis, Y. I., Baranes, D. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Orientacja dendryt wmorfologia neuron wanaliza segmentacjiobrazowanie fluorescencyjner wnoleg y wzrost ga ziparametry morfologicznesieci neuronalneobliczeniowe narz dzie Pythonanaliza kierunku wzrostu

Powiązane artykuły