Artykuł metodologiczny

Automatyczna identyfikacja gałęzi dendrytycznych i ich orientacji

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62679

⸱

17 września 2021

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Ariel University, 2Department of Physics, Ariel University

W tym artykule

Podsumowanie

Presented to narzędzie obliczeniowe, które umożliwia prosty i bezpośredni automatyczny pomiar orientacji gałęzi dendrytycznych neuronów na podstawie obrazów fluorescencyjnych 2D.

Streszczenie

Struktura neuronalnych drzew dendrytycznych odgrywa kluczową rolę w integracji wejść synaptycznych w neuronach. Dlatego charakterystyka morfologii dendrytów jest niezbędna do lepszego zrozumienia funkcji neuronów. Jednak złożoność drzew dendrytycznych, zarówno gdy są izolowane, jak i zwłaszcza gdy znajdują się w sieciach neuronowych, nie została w pełni poznana. Opracowaliśmy nowe narzędzie obliczeniowe SOA (Segmentation and Orientation Analysis), które umożliwia automatyczny pomiar orientacji gałęzi dendrytycznych na podstawie obrazów fluorescencyjnych kultur neuronalnych 2D. SOA, napisany w Pythonie, wykorzystuje segmentację do odróżnienia gałęzi dendrytycznych od tła obrazu i gromadzi bazę danych na temat kierunku przestrzennego każdej gałęzi. Baza danych jest następnie wykorzystywana do obliczania parametrów morfologicznych, takich jak kierunkowy rozkład gałęzi dendrytycznych w sieci i częstość występowania równoległego wzrostu gałęzi dendrytycznych. Uzyskane dane mogą być wykorzystane do wykrywania zmian strukturalnych dendrytów w odpowiedzi na aktywność neuronalną oraz bodźce biologiczne i farmakologiczne.

Wprowadzenie

Morfogeneza dendrytyczna jest centralnym tematem w neurobiologii, ponieważ struktura drzewa dendrytycznego wpływa na właściwości obliczeniowe integracji synaptycznej w neuronach1,2,3. Co więcej, nieprawidłowości morfologiczne i modyfikacje w gałęziach dendrytycznych są związane z zaburzeniami zwyrodnieniowymi i neurorozwojowymi4,5,6. W kulturach neuronalnych, w których rozgałęzienie dendrytyczne może być łatwiej uwidocznione, interakcje między niesiostrzanymi gałęziami dendrytycznymi regulują miejsca i zakres grupowania synaptycznego wzdłuż gałęzi, zachowanie, które może wpływać na koaktywność i plastyczność synapsów7,8,9. W związku z tym charakterystyka parametrów morfologicznych drzewa dendrytycznego przy użyciu dwuwymiarowych (2D) kultur neuronalnych jest korzystna dla zrozumienia morfogenezy dendrytycznej i funkcjonalności neuronów pojedynczych i sieci neuronów. Jest to jednak trudne zadanie, ponieważ gałęzie dendrytyczne tworzą złożoną siatkę nawet w "uproszczonych" kulturach neuronalnych 2D.

Kilka narzędzi zostało opracowanych do automatycznego śledzenia i analizowania struktur dendrytycznych10,11,12,13. Jednak większość z tych narzędzi jest zaprojektowana dla sieci neuronowych 3D i są naturalnie zbyt złożone, aby można było ich używać z sieciami 2D. W przeciwieństwie do tego, mniej zaawansowane narzędzia do analizy morfologicznej zazwyczaj obejmują znaczny składnik pracy ręcznej wspomaganej komputerowo, co jest bardzo czasochłonne i podatne na stronniczość operatora14. Istniejące półautomatyczne narzędzia, takie jak 'ImageJ'15 (pakiet do przetwarzania obrazów NIH o otwartym kodzie źródłowym z ogromną kolekcją opracowanych przez społeczność narzędzi do analizy obrazów biologicznych), znacznie zmniejszają nakład pracy użytkownika. Jednak podczas przetwarzania obrazu nadal potrzebne są pewne ręczne interwencje, a jakość segmentacji może być mniej niż pożądana.

Ten artykuł przedstawia SOA, proste zautomatyzowane narzędzie, które umożliwia bezpośrednią segmentację i analizę orientacji gałęzi dendrytycznych w sieciach neuronowych 2D. SOA może wykrywać różne obiekty przypominające linie na obrazach 2D i charakteryzować ich właściwości morfologiczne. W tym przypadku użyliśmy SOA do segmentacji gałęzi dendrytycznych w obrazach fluorescencyjnych 2D sieci dendrytycznych w hodowli. Oprogramowanie identyfikuje gałęzie dendrytyczne i z powodzeniem wykonuje pomiary parametrów morfologicznych, takich jak równoległość i rozkład przestrzenny. SOA można łatwo dostosować do analizy procesów komórkowych innych typów komórek oraz do badania sieci niebiologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Izraelskie Ministerstwo Zdrowia zatwierdziło wykorzystanie myszy zgodnie z protokołem IL-218-01-21 dotyczącym etycznego wykorzystania zwierząt doświadczalnych. Oprogramowanie SOA jest kompatybilne wyłącznie z systemem Windows 10 i językiem Python 3.9. Jest ono dostępne jako kod otwartoźródłowy: https://github.com/inbar2748/DendriteProject. Pod tym linkiem znajduje się również plik README.DM zawierający instrukcje pobierania oprogramowania, link do strony internetowej programu oraz plik wymagań z informacjami o niezbędnych wersjach wszystkich pakietów. Udostępniono tam również dodatkowe przykłady analiz przeprowadzonych przy użyciu tego oprogramowania.

Schemat analizy odgałęzień dendrytycznych; segmentacja, ekstrakcja informacji przestrzennych, klasyfikacja.
Rycina 1: Przepływ pracy SOA w zakresie segmentacji i analizy kierunku wzrostu. Przedstawiono etapy przetwarzania obrazów fluorescencyjnych sieci dendrytycznych oraz analizy danych. Obraz 2D zostaje przesłany, poddany segmentacji (w dwóch krokach: odgałęzienia dendrytyczne są wykrywane jako linie, a następnie odpowiednie linie są łączone) i pozyskiwane są informacje przestrzenne dla każdego odgałęzienia dendrytycznego. Dane są gromadzone dla wszystkich odgałęzień dendrytycznych na obrazie. Na koniec dane są analizowane w celu uzyskania pożądanych parametrów morfologicznych. Skrót: SOA = segmentation and orientation analysis. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

1. Otwórz aplikację SOA.

  1. Otwórz adres URL: https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA, znajdź skompresowany folder SOA.zip i pobierz plik ZIP, klikając go dwukrotnie.
  2. Rozpakuj folder, klikając prawym przyciskiem myszy na SOA.zip i wybierając opcję Wyodrębnij pliki. Zwróć uwagę na otwierające się okno Ścieżka i opcje wyodrębniania oraz pole tekstowe Adres docelowy, w którym wyświetlana jest ścieżka dla wyodrębnionych plików. Aby wyodrębnić pliki do innej lokalizacji, kliknij jeden z folderów w prawym panelu okna, aby ustawić go jako folder docelowy. Kliknij OK, aby wyodrębnić pliki do tego folderu.
  3. Otwórz wyodrębniony folder SOA i kliknij dwukrotnie w plik SOA.exe. Poczekaj na otwarcie czarnego okna, po którym pojawi się aplikacja.

Schemat metody segmentacji SOA, etapy przetwarzania obrazu: przesyłanie, detekcja linii, łączenie linii.
Rycina 2: Przykład przepływu pracy z wykorzystaniem GUI programu SOA. Lewa kolumna: sekcje GUI w przepływie pracy. Środkowa kolumna: obraz sieci dendrytycznej przetwarzanej w trakcie przepływu pracy (Pasek skali: 20 µm). Prawa kolumna: powiększenie obszaru zaznaczonego czerwonym prostokątem na obrazach w kolumnie środkowej (Pasek skali: 4 µm). Krok 1: Wybór i przesyłanie obrazu. Krok 2: Pierwszy etap segmentacji to detekcja linii reprezentujących zidentyfikowane gałęzie dendrytyczne. Krok 3: Drugi etap segmentacji to łączenie segmentów linii w poszczególnych gałęziach dendrytycznych na podstawie bliskości. Ustawienia wszystkich kroków mogą być modyfikowane. Skróty: SOA = analiza segmentacji i orientacji; GUI = graficzny interfejs użytkownika. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Otwórz obraz do analizy.

  1. W pasku menu SOA Viewer Upload | wybierz Choose File | wybierz obraz z plików komputerowych | kliknij go (tylko pliki .png .jpg .tif .bmp) | Open | sprawdź ścieżkę do pliku | Next.

3. Optymalizacja segmentacji

UWAGA: W pasku menu SOA Viewer Properties zmień wartości wybranych parametrów, aby dostosować ustawienia procesu segmentacji. Szczegółowy opis parametrów, takich jak Threshold, znajduje się w Supplemental Material.

  1. W sekcji Edges dostosuj próg wyświetlania, wybierając Threshold i wpisując odpowiednią liczbę.
    UWAGA: Im niższa wartość progu, tym więcej linii zostanie wykrytych. Próg jest liczbą z zakresu od 0 do 255. Wartość domyślna została ustawiona na 0.
  2. W sekcji Merge Lines:
    1. Dostosuj minimalną odległość scalania dla wyświetlania, wybierając Min distance to merge i wpisując liczbę.
      UWAGA: Min distance to merge mieści się w zakresie od 0 do 30 pikseli. Wartość domyślna jest ustawiona na 20.
    2. Dostosuj minimalny kąt scalania dla wyświetlania, wybierając Min angle to merge i wpisując liczbę.
      UWAGA: Min angle to merge mieści się w zakresie od 0 do 30°. Wartość domyślna jest ustawiona na 10.
  3. Kliknij Create Preview Segmentation Image.
    UWAGA: Zgodnie z zaktualizowanymi wartościami zostanie wyświetlony podgląd obrazu wyników segmentacji. Dodatkowo wyświetlona zostanie liczba linii przed scalaniem oraz liczba linii po scalaniu.
  4. Zmieniaj parametry, aby uzyskać maksymalną identyfikację segmentów. Jeśli zajdzie potrzeba zmiany właściwości, kliknij przycisk Close window i wykonaj kroki 3.1–3.4.

4. Utwórz pliki wyjściowe.

  1. Naciśnij OK, aby wyświetlić obrazy segmentacji oraz wykresy analityczne. W oknie, które się pojawi, wybierz lokalizację zapisu pliku .xlsx.
  2. Wpisz nazwę pliku | Wybierz Save | poczekaj na utworzenie i zapisanie pliku .xlsx z danymi.
    UWAGA: Oprócz pliku .xlsx automatycznie zostaną wyświetlone następujące pliki: plik z obrazem oryginalnym, obraz rozpoznawania linii, końcowy obraz segmentacji oraz trzy wykresy analizy.

5. Pasek narzędzi nawigacyjnych

UWAGA: We wszystkich oknach z rycunami znajduje się pasek nawigacyjny, który umożliwia poruszanie się po zestawie danych. Każdy z przycisków na dole paska nawigacyjnego został opisany poniżej.

  1. Aby przechodzić między wcześniej zdefiniowanymi widokami, należy użyć przycisków Forward (Dalej) i Back (Wstecz).
    UWAGA: Przyciski Home, Forward i Back działają podobnie jak sterowanie Home, Forward i Back w przeglądarce internetowej. Home powraca do ekranu domyślnego, czyli obrazu oryginalnego.
  2. Aby przesuwać i powiększać obraz, należy użyć przycisku Zoom . Aby aktywować funkcję panowania i powiększania, należy nacisnąć przycisk Zoom , a następnie przesunąć mysz w wybrane miejsce na obrazie.
    1. Aby przesunąć rysunek, należy nacisnąć i przytrzymać lewy przycisk myszy, przeciągając go w nową pozycję. Po zwolnieniu przycisku myszy wybrany punkt na obrazie pojawi się w nowej pozycji. Podczas panowania można przytrzymać klawisze x lub y, aby ograniczyć ruch odpowiednio do osi x lub y.
    2. Aby powiększyć lub pomniejszyć obraz, należy przytrzymać prawy przycisk myszy i przeciągnąć go w nowe miejsce. Przesunięcie w prawo powiększa obraz wzdłuż osi x, a w lewo go pomniejsza. Analogicznie działają ruchy w górę i w dół dla osi y. Podczas powiększania punkt znajdujący się pod kursorem myszy pozostaje nieruchomy, co pozwala na przybliżanie lub oddalanie obrazu wokół tego punktu. Można użyć klawiszy modyfikujących x, y lub CONTROL , aby ograniczyć powiększanie odpowiednio do osi x, y lub zachować proporcje obrazu.
  3. Aby aktywować tryb powiększania do prostokąta, należy kliknąć przycisk Zoom-to-rectangle. Należy umieścić kursor nad obrazem i nacisnąć lewy przycisk myszy. Przeciągając mysz przy wciśniętym przycisku, definiuje się obszar prostokątny.
    UWAGA: Zakresy widoku osi zostaną powiększone do zdefiniowanego obszaru po naciśnięciu lewego przycisku myszy. Zakresy widoku osi zostaną pomniejszone po naciśnięciu prawego przycisku myszy, co umieści oryginalne osie w zdefiniowanym obszarze.
  4. Do konfiguracji wyglądu wykresu pomocniczego należy użyć narzędzia Subplot-configuration.
    UWAGA: Lewą, prawą, górną i dolną krawędź wykresu pomocniczego, a także odstępy między wierszami i kolumnami, można rozciągać lub kompresować.
  5. Aby otworzyć okno zapisu pliku, należy kliknąć przycisk Save i zapisać plik w jednym z następujących formatów: .png, .ps, .eps, .svg lub .pdf.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadzono reprezentacyjną analizę obrazów sieci dendrytycznych w hodowli. Komórki wyizolowano zgodnie z opisem Baranes et al.16,17. W skrócie, komórki hipokampa wyizolowano z mózgów szczurów postnatalnych i hodowano na 2D szklanych kryszkach przez 1-2 tygodnie. Następnie hodowle utrwalono i barwiono metodą pośredniej immunofluorescencji z użyciem przeciwciała przeciwko markerowi białek dendrytycznych, białku MAP2 (microtubule-associated protein 2). ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pilnie potrzebne są skuteczne strategie wydobywania informacji morfologicznych z obrazów 2D, aby nadążyć za danymi z obrazowania biologicznego. Chociaż dane obrazowe mogą być generowane w ciągu kilku godzin, dogłębna analiza obrazów zajmuje dużo czasu. W rezultacie przetwarzanie obrazu stało się w oczywisty sposób poważną przeszkodą w wielu dziedzinach. Wynika to częściowo z dużej złożoności danych, zwłaszcza w przypadku próbek biologicznych. Ponadto, ponieważ wielu użytkowników nie ma specjalistycznych umiejętności prog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować dr Orly Weiss za przygotowanie obrazów kulturowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Matplotlib  2002 - 2012 John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom i zespół programistów Matplotlib; 2012 - 2021 Zespół programistów Matplotlib.3.4.2Biblioteka do kreślenia 2D w Pythonie
matplotlib-scalebarPhilippe Pinard0.7.2artysta dla matplotlib do wyświetlania paska skali
NumPySpołeczność NumPy.1.20.3podstawowy pakiet dla naukowej biblioteki obliczeniowej
OpenCVZespół OpenCV4.5.2.54Biblioteka wizji komputerowej Open
Source PyCharmJetBrains2020.3.1 (Community Edition) wersjaKompilacja #PC-203.6682.86, zbudowana 18 grudnia 2020 r. Wersja środowiska uruchomieniowego: 11.0.9.1+11-b1145.37 amd64. Maszyna wirtualna: 64-bitowa maszyna wirtualna serwera OpenJDK firmy JetBrains s.r.o. Okna 10 10.0. Pamięć: 978M, Rdzenie: 4
PyQt5Riverbank Computing5.15.4zarządzanie GUI
pythonPython Software Foundation License3.9 wersja
QtDesigner The QT Company Ltd.5.11.1 wersja
scipyCommunity library project1.6.3Oparty na Pythonie ekosystem oprogramowania open source dla matematyki, nauk ścisłych i inżynierii
SeabornMichael Waskom.0.11.1Biblioteka wizualizacji danych statystycznych w Pythonie.
Windows 10Microsoft
XlsxwriterJohn McNamara1.4.3Moduł Pythona do tworzenia plików Excel XLSX

Bibliografia

  1. Ferrante, M., Migliore, M., Ascoli, G. Functional impact of dendritic branch-point morphology. Journal of Neuroscience. 33 (5), 2156-2165 (2013).
  2. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 206-221 (2008).
  3. Chklovskii, D. Synaptic Connectivity and Neuronal Morphology: Two Sides of the Same Coin. Neuron. 43 (5), 609-617 (2004).
  4. Chapleau, C., Larimore, J., Theibert, A., Pozzo-Miller, L. Modulation of dendritic spine development and plasticity by BDNF and vesicular trafficking: fundamental roles in neurodevelopmental disorders associated with mental retardation and autism. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 1 (3), 185-196 (2009).
  5. Irwin, S. Dendritic Spine Structural Anomalies in Fragile-X Mental Retardation Syndrome. Cerebral Cortex. 10 (10), 1038-1044 (2000).
  6. Kaufmann, W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral Cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
  7. Pinchas, M., Baranes, D. Dendritic branch intersections are structurally regulated targets for efficient axonal wiring and synaptic clustering. PLoS ONE. 8 (12), 82083(2013).
  8. Cove, J., Blinder, P., Baranes, D. Contacts among non-sister dendritic branches at bifurcations shape neighboring dendritic branches and pattern their synaptic inputs. Brain Research. 1251, 30-41 (2009).
  9. Blinder, P., Cove, J., Foox, M., Baranes, D. Convergence among non-sister dendritic branches: An activity-controlled mean to strengthen network connectivity. PLoS ONE. 3 (11), 3782(2008).
  10. Glaser, J., Glaser, E. Neuron imaging with neurolucida - PC-based system for image combining microscopy. Computerized Medical Imaging and Graphics. 14 (5), 307-317 (1990).
  11. Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nature Protocols. 3 (5), 866-876 (2008).
  12. Torben-Nielsen, B. An efficient and extendable python library to analyze neuronal morphologies. Neuroinformatics. 12 (4), 619-622 (2014).
  13. Parekh, R., Ascoli, G. Neuronal morphology goes digital: A research hub for cellular and system neuroscience. Neuron. 78 (1), 206(2013).
  14. heng, J., Zhou, X., Sabatini, B. L., Wong, S. T. C. NeuronIQ: A novel computational approach for automatic dendrite SPINES detection and analysis. 2007 IEEE/NIH Life Science Systems and Applications Workshop. , 168-171 (2007).
  15. Image processing and analysis in Java. NIH. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2021).
  16. Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13, 461-472 (2007).
  17. Morad, T. I., Hendler, R. M., Weiss, O. E., Canji, E. A., Merfeld, I., Dubinsky, Z., Minnes, R., Francis, Y. I., Baranes, D. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Orientacja dendryt wmorfologia neuron wanaliza segmentacjiobrazowanie fluorescencyjner wnoleg y wzrost ga ziparametry morfologicznesieci neuronalneobliczeniowe narz dzie Pythonanaliza kierunku wzrostu

Powiązane artykuły