Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Summary

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Abstract

Frakcjonowanie polisomów przez wirowanie w gradionym gradimencie gęstości sacharozy jest potężnym narzędziem, które może być użyte do tworzenia profili rybosomów, identyfikacji konkretnych mRNA translowanych przez rybosomy i analizy czynników związanych z polisomami. Podczas gdy zautomatyzowane generatory gradientów i systemy frakcjonowania gradientowego są powszechnie stosowane w tej technice, systemy te są na ogół drogie i mogą być zbyt kosztowne dla laboratoriów, które mają ograniczone zasoby lub nie mogą uzasadnić wydatków ze względu na rzadką lub okazjonalną potrzebę wykonywania tej metody w swoich badaniach. W tym miejscu przedstawiono protokół umożliwiający powtarzalne generowanie profili polisomów przy użyciu standardowego sprzętu dostępnego w większości laboratoriów biologii molekularnej bez specjalistycznych przyrządów do frakcjonowania. Ponadto przedstawiono porównanie profili polisomów wygenerowanych z systemem frakcjonowania gradientowego i bez niego. Omówiono strategie optymalizacji i produkcji powtarzalnych profili polisomów. Saccharomyces cerevisiae jest wykorzystywany jako organizm modelowy w tym protokole. Jednak protokół ten można łatwo modyfikować i dostosowywać do generowania profili rybosomów dla wielu różnych organizmów i typów komórek.

Introduction

Rybosomy to mega-daltońskie kompleksy rybonukleoproteinowe, które przeprowadzają podstawowy proces przekształcania mRNA w białka. Rybosomy są odpowiedzialne za przeprowadzanie syntezy wszystkich białek w komórce. Rybosomy eukariotyczne składają się z dwóch podjednostek oznaczonych jako mała podjednostka rybosomalna (40S) i duża podjednostka rybosomalna (60S) zgodnie z ich współczynnikami sedymentacji. W pełni złożony rybosom jest oznaczony jako monosom 80S. Polisomy to grupy rybosomów biorących udział w translacji pojedynczej cząsteczki mRNA. Frakcjonowanie polisomów metodą wirowania w gradionym gradimencie gęstości sacharozy jest potężną metodą stosowaną do tworzenia....

Protocol

1. Przygotowanie gradientów sacharozy 7% - 47%

UWAGA: Liniowy zakres gradientu sacharozy może być zmodyfikowany w celu uzyskania lepszej separacji w zależności od użytego typu komórki. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem profili polisomów dla S. cerevisiae.

1. Przygotować roztwory podstawowe 7% i 47% sacharozy w buforze gradientu sacharozy (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl₂ i 1 mM DTT). Filtrować, sterylizować roztwory podstawowe sacharozy przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować 14 ml 17%, 27% i 37% roztworów sacharozy, dozując i mieszając 7% i 47% roztwo....

Results

Trzy reprezentatywne profile polisomów są pokazane w Rysunek 3. Wszystkie profile pochodzą z tego samego szczepu drożdży. Typowy profil polisomów będzie miał dobrze rozdzielone piki dla podjednostek rybosomalnych 40S, 60S i 80S, a także polisomów. Grzbiet każdej podjednostki rybosomalnej i piku polisomu będzie widoczny na każdym profilu (Rysunek 3). Reprezentatywny profil z automatycznego systemu frakcjonowania gęstości jest pokazany na Rysunek 3A

Discussion

W tym artykule opisano metodę tworzenia profili polisomowych bez użycia kosztownych zautomatyzowanych systemów frakcjonowania. Zaletą tej metody jest to, że umożliwia ona profilowanie polisomów laboratoriom, które nie mają zautomatyzowanych systemów frakcjonowania. Głównymi wadami tego protokołu są żmudne frakcjonowanie ręczne i zmniejszona czułość w porównaniu z dedykowanym systemem frakcjonowania gęstości.

Protokół ten pociąga za sobą staranne przygotowanie gradientów sacharozy z rozdzielczo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatyczny frakcjonator	Brandel
Clariostar Wielomodowy czytnik płytek	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Koraliki szklane, myte kwasem	Sigma Aldrich	G8772	425– 600 μ m
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Chlorek magnezu, 1 M	medyczna KD	CAC-5290
, 22 g, metalowa piasta	Hamilton Company	7748-08	niestandardowa długość 9 cali, styl punktowy 3
Optima XL-100K Ultrawirówka	Beckman Coulter
Polipropylenowe probówki wirówkowe	Beckman Coulter	331372
Polipropylenowy stojak na probówki	Fisher Scientific	14-810-54A
Chlorek potasu	Sigma Aldrich	P9541
Fluorometr Qubit 4	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Zestaw do oznaczania kubitowego RNA HS	Thermo Fisher Scientific	Q32855
Inhibitor RNAzy	Applied Biosystems	N8080119
Sacharoza	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Wahadłowy wirnik kubełkowy Pkg	Beckman Coulter	331336
strzykawka, 3 ml	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7,4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 dołków	Greiner Bio-One