Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Summary

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Abstract

Frakcjonowanie polisomów przez wirowanie w gradionym gradimencie gęstości sacharozy jest potężnym narzędziem, które może być użyte do tworzenia profili rybosomów, identyfikacji konkretnych mRNA translowanych przez rybosomy i analizy czynników związanych z polisomami. Podczas gdy zautomatyzowane generatory gradientów i systemy frakcjonowania gradientowego są powszechnie stosowane w tej technice, systemy te są na ogół drogie i mogą być zbyt kosztowne dla laboratoriów, które mają ograniczone zasoby lub nie mogą uzasadnić wydatków ze względu na rzadką lub okazjonalną potrzebę wykonywania tej metody w swoich badaniach. W tym miejscu przedstawiono protokół umożliwiający powtarzalne generowanie profili polisomów przy użyciu standardowego sprzętu dostępnego w większości laboratoriów biologii molekularnej bez specjalistycznych przyrządów do frakcjonowania. Ponadto przedstawiono porównanie profili polisomów wygenerowanych z systemem frakcjonowania gradientowego i bez niego. Omówiono strategie optymalizacji i produkcji powtarzalnych profili polisomów. Saccharomyces cerevisiae jest wykorzystywany jako organizm modelowy w tym protokole. Jednak protokół ten można łatwo modyfikować i dostosowywać do generowania profili rybosomów dla wielu różnych organizmów i typów komórek.

Introduction

Rybosomy to mega-daltońskie kompleksy rybonukleoproteinowe, które przeprowadzają podstawowy proces przekształcania mRNA w białka. Rybosomy są odpowiedzialne za przeprowadzanie syntezy wszystkich białek w komórce. Rybosomy eukariotyczne składają się z dwóch podjednostek oznaczonych jako mała podjednostka rybosomalna (40S) i duża podjednostka rybosomalna (60S) zgodnie z ich współczynnikami sedymentacji. W pełni złożony rybosom jest oznaczony jako monosom 80S. Polisomy to grupy rybosomów biorących udział w translacji pojedynczej cząsteczki mRNA. Frakcjonowanie polisomów metodą wirowania w gradionym gradimencie gęstości sacharozy jest potężną metodą stosowaną do tworzenia profili rybosomów, identyfikowania specyficznych mRNA związanych z translacją rybosomów i analizowania czynników związanych z wielosomami^{1,2,3,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13}. Technika ta jest często stosowana do oddzielania polisosomów od pojedynczych rybosomów, podjednostek rybosomalnych i informacyjnych cząstek rybonukleoproteiny. Profile uzyskane w wyniku frakcjonowania mogą dostarczyć cennych informacji na temat aktywności translacyjnej polisomów¹⁴ oraz statusu składania rybosomów^15,16,17.

Składanie rybosomów to bardzo złożony proces, który ułatwia grupa białek znanych jako czynniki składania rybosomów^18,19,20,21. Czynniki te pełnią szeroki zakres funkcji podczas biogenezy rybosomów poprzez interakcje z wieloma innymi białkami, w tym ATPazami, endo- i egzonukleazami, GTPazami, helikazami RNA i białkami wiążącymi RNA²². Frakcjonowanie polisomów jest potężnym narzędziem wykorzystywanym do badania roli tych czynników w składaniu rybosomów. Na przykład metoda ta została wykorzystana do pokazania, w jaki sposób mutacje w kinazie polinukleotydowej Grc3, czynniku przetwarzania pre-rRNA, mogą negatywnie wpływać na proces składania rybosomów^17,23. Profilowanie polisomów uwypukliło również i pokazało, w jaki sposób konserwatywne motywy w ATPazie Rix7 są niezbędne do produkcji rybosomów¹⁶.

Procedura frakcjonowania polisomów zaczyna się od wytworzenia rozpuszczalnych lizatów komórkowych z interesujących komórek. Lizat zawiera RNA, podjednostki rybosomalne i polisomy, a także inne rozpuszczalne składniki komórkowe. Ciągły, liniowy gradient sacharozy jest wytwarzany w probówce ultrawirówkowej. Rozpuszczalna frakcja lizatu komórkowego jest delikatnie ładowana na wierzch rurki gradientowej sacharozy. Załadowana rurka gradientowa jest następnie poddawana wirowaniu, które rozdziela składniki komórkowe według wielkości w gradiencie sacharozy pod wpływem siły grawitacji. Większe komponenty przemieszczają się dalej w głąb gradientu niż mniejsze komponenty. W górnej części gradientu znajdują się mniejsze, wolniej poruszające się składniki komórkowe, podczas gdy większe, szybciej poruszające się składniki komórkowe znajdują się na dole. Po odwirowaniu zawartość probówki zbiera się jako frakcje. Ta metoda skutecznie oddziela podjednostki rybosomalne, monosomy i polisomy. Gęstość optyczną każdej frakcji określa się następnie poprzez pomiar absorbancji widmowej przy długości fali 254 nm. Wykreślenie absorbancji w funkcji liczby frakcji daje profil polisomowy.

Liniowe gradienty gęstości sacharozy mogą być generowane za pomocą kreatora gradientów. Po odwirowaniu gradienty są często frakcjonowane, a absorbancje mierzone za pomocą automatycznego systemu frakcjonowania gęstości^3,7,13,24,25. Chociaż systemy te bardzo dobrze sprawdzają się w produkcji profili polisomowych, są drogie i mogą być zbyt kosztowne dla niektórych laboratoriów. W tym miejscu przedstawiono protokół generowania profili polisomowych bez użycia tych instrumentów. Zamiast tego protokół ten wykorzystuje sprzęt zwykle dostępny w większości laboratoriów biologii molekularnej.

Protocol

1. Przygotowanie gradientów sacharozy 7% - 47%

UWAGA: Liniowy zakres gradientu sacharozy może być zmodyfikowany w celu uzyskania lepszej separacji w zależności od użytego typu komórki. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem profili polisomów dla S. cerevisiae.

1. Przygotować roztwory podstawowe 7% i 47% sacharozy w buforze gradientu sacharozy (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl₂ i 1 mM DTT). Filtrować, sterylizować roztwory podstawowe sacharozy przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować 14 ml 17%, 27% i 37% roztworów sacharozy, dozując i mieszając 7% i 47% roztwory podstawowe sacharozy w sposób opisany w Tabeli 1.
3. Umieść sześć polipropylenowych probówek wirówkowych (14 x 89 mm) w stojaku na probówki z pełnym widokiem. Zapewnij wystarczająco dużo miejsca między rurkami, aby działania z jedną rurką nie przeszkadzały innym.
4. Podłącz długą igłę do strzykawki o pojemności 3 ml. Do tego protokołu użyj igły o średnicy 9 cali i pojemności 22 G z końcówką (Rysunek 1), ale wystarczy każda igła wystarczająco długa, aby dotrzeć do dna probówki wirówkowej.
   UWAGA: Przed ustawieniem gradientów należy wykonać próbne napełnianie i dozowanie, aby upewnić się, że strzykawka może utrzymać roztwór sacharozy bez kapania.
5. Dodaj 2 ml 7% sacharozy na dno każdej probówki wirówkowej.
6. Dodać 2 ml 17% sacharozy pod 7% roztworem, umieszczając końcówkę igły w bezpośrednim sąsiedztwie dna probówki i dozując roztwór powoli i ostrożnie.
7. Powtórzyć z 2 ml każdego z 27%, 37% i 47% roztworów sacharozy. Upewnij się, że każda warstwa jest odróżnialna od siebie linią oznaczającą separację gęstości (Rysunek 2).
   UWAGA: Jeśli gradienty nie zostaną użyte w ciągu 48 godzin, to w tym momencie, przed ich ustabilizowaniem się w ciągłym gradiencie, należy błyskawicznie zamrozić probówki z warstwowymi roztworami sacharozy w ciekłym azocie i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
8. Gradienty należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc, aby umożliwić im ustabilizowanie się w ciągłym, rosnącym procentowo zawartości sacharozy. Potrzeba 8-12 godzin, aby warstwowe roztwory sacharozy osiadły się w liniowym gradiencie sacharozy. Gradienty liniowe są stabilne do 48 godzin. Przechowywanie przez noc w temperaturze 4 °C zapewnia wystarczającą ilość czasu na rozmrożenie i osiadanie w liniowym gradiencie, aby można było użyć zamrożonych, warstwowych roztworów sacharozy. Użyj densytometru, aby ocenić jakość gradientu.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby przechowywać gradienty w stabilnym miejscu, w którym nie będą zakłócane, ponieważ wszelkie ruchy lub wibracje zakłócą gradient.

2. Przygotowanie ekstraktów z komórek drożdży

1. Zaszczepić interesujący szczep drożdży w 50 ml pożywki z dekstrozy peptonowej (YPD) z ekstraktem drożdżowym i rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem do fazy stacjonarnej.
   UWAGA: Temperatura może się różnić w zależności od wymagań szczepu drożdży.
2. Przenieść 10 ml kultury w fazie stacjonarnej do 1 l świeżej pożywki YPD. Inkubować komórki, energicznie wstrząsając w temperaturze 30 °C (lub innej odpowiedniej temperatury), aż kultura osiągnie średnią fazę wzrostu wykładniczego (OD₆₀₀ = 0,4-0,6).
3. W środkowej fazie wzrostu wykładniczego dodać cykloheksymid do kultury w końcowym stężeniu 0,1 mg/ml. Inkubować na lodzie przez 5 minut.
4. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: W tym momencie komórki można zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C.
5. Ponownie zawiesić komórki w schłodzonym 700 μl buforu do ekstrakcji polisomów (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,1 mg/ml cykloheksymidu, 0,2 mg/ml heparyny). Dodaj 100 jednostek inhibitora RNazy i przenieś go do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
6. Do probówki wirówkowej dodać ~400 μL wstępnie schłodzonych kulek szklanych o zakresie wielkości 425-600 μm. Rozdrobnić komórki drożdży przez energiczne mieszanie w ubijaku do kulek przez 5 minut.
7. Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
8. Oznaczyć stężenie RNA w oczyszczonym lizacie, mierząc absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru lub przy użyciu systemu wykrywania RNA opartego na fluorescencji.
   UWAGA: Aby uzyskać bardzo dokładne pomiary stężenia RNA, należy użyć zestawów do wykrywania RNA opartych na fluorescencji.
9. Upewnij się, że stężenie RNA wynosi 0,5-1 μg/μL. Jeśli stężenie RNA jest zbyt niskie, zmniejsz objętość buforu do ekstrakcji polisomów używanego do ponownego zawieszenia komórek w przyszłych eksperymentach.
   UWAGA: Załaduj lizat na gradienty natychmiast po lizie i ilościowym oznaczeniu RNA. W razie potrzeby błyskawiczne zamrożenie lizatów w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C przez kilka dni.

3. Wirowanie gradientów

1. Ostrożnie załaduj lizat na górną część gradientów. Przyłóż końcówkę pipety do wewnętrznej ścianki, w górnej części rurki polipropylenowej. Delikatnie ustaw rurkę pod kątem i powoli dozuj lizat na wierzch gradientu, dryblując przy ścianie. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zakłócić ani nie zakłócić gradientu podczas ładowania lizatu.
   UWAGA: Ilość załadowanego lizatu będzie się różnić w zależności od typu ogniwa. Zawartość RNA również będzie się różnić. Konieczne może być przeprowadzenie szeregu eksperymentów w celu określenia ilości lizatu potrzebnej do wygenerowania optymalnego profilu polisomowego. W przypadku drożdży 300 μg RNA jest dobrym punktem wyjścia do optymalizacji.
2. Delikatnie umieść rurki we wstępnie schłodzonych wiadrach wahliwego wirnika kubełkowego.
   UWAGA: Każda probówka wirówkowa z polipropylenu powinna mieć równe objętości gradientu i ilość załadowanego lizatu. Może się to różnić w zależności od rury. Upewnij się, że zmiana nie powoduje błędu niewyważenia podczas ultrawirowania.
3. Odwirować gradienty przy 260,110 x g przez 150 minut w temperaturze 4 °C.

4. Ułamek i zbieranie danych

1. Ostrożnie wyjmij probówki wirówkowe z wahliwego wirnika wiadra i umieść je w uchwycie na probówki.
2. Oznacz 96-dołkowe płytki do przechowywania frakcji i wstępnego schłodzenia na lodzie.
   UWAGA: Użyj 96-dołkowej płytki odpowiedniej dla spektrofotometru, który ma okno optyczne do 230 nm do oznaczania kwasów nukleinowych przy 260 nm/280 nm.
3. Zebrać frakcje o objętości 100 μl lub 200 μl, zaczynając od początku gradientu, ostrożnie wkładając końcówkę pipety w górną krawędź gradientu. Zbieraj ułamki, aż cały gradient zostanie podzielony na porcje. Liczba frakcji będzie zależeć od całkowitej objętości gradientu.
   UWAGA: Zbierz ułamki w sposób, który nie zakłóca reszty gradientu. Upewnij się, że wszystkie frakcje mają równą objętość. Oprócz ręcznego frakcjonowania, inną tanią metodą frakcjonowania jest użycie małej pompy perystaltycznej.
4. Przenieś każdą frakcję na płytkę 96-dołkową, aby dotrzeć do dna probówki wirówkowej. Zebrane frakcje należy zawsze utrzymywać na lodzie.
5. Zmierzyć absorbancję każdej frakcji przy długości fali 254 nm za pomocą spektrofotometru. Użyj 7% i 47% roztworów sacharozy jako półfabrykatów.
   UWAGA: Mierząc absorbancję frakcji należy pamiętać, że dla większości spektrometrów i kolorymetrów najbardziej efektywny zakres absorbancji wynosi 0,1-1. Jeśli pomiary absorbancji są poza zakresem (≥1,0), frakcje mają za dużo materiału. Rozcieńczyć próbkę, przypomnieć sobie dane, a następnie uwzględnić współczynnik rozcieńczenia podczas wykreślania profilu.
6. Utwórz profil polisomu, wykreślając liczbę frakcji w funkcji absorbancji.

Results

Trzy reprezentatywne profile polisomów są pokazane w Rysunek 3. Wszystkie profile pochodzą z tego samego szczepu drożdży. Typowy profil polisomów będzie miał dobrze rozdzielone piki dla podjednostek rybosomalnych 40S, 60S i 80S, a także polisomów. Grzbiet każdej podjednostki rybosomalnej i piku polisomu będzie widoczny na każdym profilu (Rysunek 3). Reprezentatywny profil z automatycznego systemu frakcjonowania gęstości jest pokazany na Rysunek 3A

Discussion

W tym artykule opisano metodę tworzenia profili polisomowych bez użycia kosztownych zautomatyzowanych systemów frakcjonowania. Zaletą tej metody jest to, że umożliwia ona profilowanie polisomów laboratoriom, które nie mają zautomatyzowanych systemów frakcjonowania. Głównymi wadami tego protokołu są żmudne frakcjonowanie ręczne i zmniejszona czułość w porównaniu z dedykowanym systemem frakcjonowania gęstości.

Protokół ten pociąga za sobą staranne przygotowanie gradientów sacharozy z rozdzielczo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatyczny frakcjonator	Brandel
Clariostar Wielomodowy czytnik płytek	BMG Labtech
Cycloheximide	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
Koraliki szklane, myte kwasem	Sigma Aldrich	G8772	425– 600 μ m
Heparin	Sigma Aldrich	H4784
Chlorek magnezu, 1 M	medyczna KD	CAC-5290
, 22 g, metalowa piasta	Hamilton Company	7748-08	niestandardowa długość 9 cali, styl punktowy 3
Optima XL-100K Ultrawirówka	Beckman Coulter
Polipropylenowe probówki wirówkowe	Beckman Coulter	331372
Polipropylenowy stojak na probówki	Fisher Scientific	14-810-54A
Chlorek potasu	Sigma Aldrich	P9541
Fluorometr Qubit 4	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Zestaw do oznaczania kubitowego RNA HS	Thermo Fisher Scientific	Q32855
Inhibitor RNAzy	Applied Biosystems	N8080119
Sacharoza	Sigma Aldrich	S0389
SW41 Wahadłowy wirnik kubełkowy Pkg	Beckman Coulter	331336
strzykawka, 3 ml	Coviden	888151394
Tris, 1 M,  pH 7,4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate, 96 dołków	Greiner Bio-One