31P NMR to potężne narzędzie do strukturalnego wyjaśniania polifenoli. Ta szybka, łatwa, precyzyjna, ilościowa i wysoce odtwarzalna procedura analityczna, która pozwala na kwantyfikację i różnicowanie różnych typów grup hydroksylowych, fenolowych i karboksylowych w ligninach i garbnikach, stała się obecnie rutynowym narzędziem analitycznym.
Artykuł metodologiczny
Ilościowa analiza 31P NMR ligniny i garbników
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozwój zrównoważonych produktów biorafineryjnych jest konfrontowany, między innymi, z wyzwaniem waloryzacji ligniny i taniny. Te obfite, odnawialne biopolimery aromatyczne nie były szeroko wykorzystywane ze względu na ich nieodłączną złożoność strukturalną oraz wysoki stopień zmienności i różnorodności gatunkowej. Brak zdefiniowanej struktury pierwszorzędowej dla tych polifenoli jest dodatkowo potęgowany złożonymi zmianami chemicznymi indukowanymi podczas przetwarzania, ostatecznie nadając dużą różnorodność cech strukturalnych o ogromnym znaczeniu dla dalszych wysiłków wykorzystania.
W związku z tym, protokół szybkiej, prostej i jednoznacznej identyfikacji i kwantyfikacji różnych grup funkcyjnych obecnych w naturalnych polifenolach, jest podstawowym warunkiem wstępnym dla zrozumienia i odpowiedniego dostosowania ich reaktywności i ostatecznej użyteczności.
Ilościowy 31P NMR oferuje możliwość szybkiej i niezawodnej identyfikacji niepodstawionych, o-mono podstawionych i o-dipodstawionych fenoli, alifatycznych OH i ugrupowań kwasu karboksylowego w ligninach i garbnikach o szerokim potencjale aplikacyjnym.
Metodologia składa się z procedury ilościowego znakowania ligniny lub taniny in situ przy użyciu odpowiedniej sondy zawierającej 31P, a następnie nabycia ilościowego widma 31P NMR w obecności wewnętrznego wzorca. Wysoka naturalna obfitość jądra 31P pozwala na uzyskanie niewielkich ilości próbki (~30 mg) i krótkich czasów akwizycji NMR (~30-120 min) z dobrze rozdzielonymi sygnałami 31P, które są silnie zależne od otaczającego środowiska chemicznego znakowanych grup OH.
Wprowadzenie
Procedura ta, która została niedawno opublikowana w Nature Protocols1, została przywołana ponad 3000 razy w literaturze archiwalnej i stała się rutynową metodą pomiarową w charakterystyce ligniny i tanin, ponieważ dostarcza kluczowych, szybkich i powtarzalnych informacji strukturalnych.
Lignina i taniny
Kiedy Paul T. Anastas i John C. Werner wprowadzili pojęcie zielonej chemii2,3, drastycznie zmieniło to ogólne postrzeganie chemii. W szczególności za kluczowy aspekt uznano znaczenie wykorzystania materiałów zrównoważonych zamiast surowców kopalnych, takich jak ropa naftowa i węgiel, jako punktu wyjścia2,3. Wśród różnych rodzajów biomasy lignina jest najliczniejszym aromatycznym biopolimerem i może być postrzegana jako potencjalne źródło surowców przemysłowych oraz produktów o wysokiej wartości dodanej4.
Lignina jest drugim pod względem zawartości składnikiem drewna (po celulozie i przed hemicelulozą). Jej zawartość w roślinach różni się w zależności od rodzaju rośliny: na przykład liściaste charakteryzują się niższą ilością ligniny w porównaniu do iglastych (20% ± 4% vs. 28% ± 4%). Ponadto rozkład ligniny w tkance roślinnej nie jest jednorodny: wyższą zawartość ligniny stwierdza się w ścianie komórkowej5,6. Lignina jest materiałem polifenolowym uzyskiwanym przemysłowo jako produkt uboczny przemysłu papierniczego i celulozowego7. Jest ona odzyskiwana z procesu miazgowania drewna, w którym wióry drewniane są przetwarzane głównie w obecności jonów OH- i/lub OH- + HS- w celu oddzielenia celulozy od hemicelulozy i ligniny (procesy sodowe i/lub Krafta)8,9.
Pierwsze próby badania ligniny zostały podjęte odpowiednio przez Payena i Schultze w 1838 i 1865 roku10. W 1977 roku Adler podsumował całą dostępną wówczas istotną wiedzę11. Obecnie przyjmuje się, że jednostkami budulcowymi ligniny są trzy jednostki fenylopropanoidowe: alkohole p-kumarowy, koniferylowy i sinapylowy. Monomery te, dzięki procesowi polimeryzacji rodnikowej, dają początek jednostkom p-hydroksyfenylowym, guajacylowym i sinapylowym, które ostatecznie w szerokim zakresie stanowią ligninę (Rysunek 1)12. Brak struktury pierwotnej w ligninach wiąże się z immanentną trudnością w ich charakterystyce strukturalnej. W związku z tym ocena rozkładu masy cząsteczkowej była zawsze w pewnym stopniu kontrowersyjna. Lignina z mielonego drewna, czyli lignina izolowana w łagodnych warunkach, która w przeważającej mierze odpowiada protoligninie10, składa się z oligomerów13, które silnie oddziałują ze sobą poprzez procesy agregacji supramolekularnej14,15.
Rycina 1: Reprezentatywny model ligniny z drewna miękkiego, w którym wyróżniono różne rodzaje wiązań. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Ligniny są powszechnie klasyfikowane w zależności od: (a) rodzaju drewna, z którego pochodzą (np. drewno liściaste i iglaste), (b) procesu zastosowanego do ich wyizolowania. Najważniejszymi przemysłowymi typami ligniny są lignina Kraft, lignosulfoniany oraz lignina Organosolv.
Struktura ligniny w dużym stopniu zależy od jej pochodzenia oraz zastosowanej chemii przetwarzania. Bardziej szczegółowo: gdy dość złożona i nieregularna budowa ligniny łączy się z jej naturalną różnorodnością i skomplikowanymi procesami chemicznymi, powstaje materiał o ogromnej zmienności, różnorodności i heterogeniczności, co ogranicza jego zastosowanie do produktów o niskiej wartości16. Podczas gdy ligniny z drewna iglastego zawierają głównie jednostki guajacylowe (G) z pomijalną ilością grup p-hydroksyfenylowych (lignina G), ligniny z drewna liściastego składają się z podjednostek guajacylowych i syringylowych (lignina GS) w różnych proporcjach, a ligniny traw są zbudowane z podjednostek guajacylowych, syringylowych i p-hydroksyfenylowych (lignina GSH). Metoda ekstrakcyjna stosowana do izolacji drastycznie wpływa na strukturę otrzymanej ligniny17. Rysunek 2 przedstawia trzy struktury ligniny, różniące się w zależności od zastosowanej metody izolacji. Można wyróżnić kilka uwag dotyczących wpływu metody ekstrakcji. Po pierwsze, lignina Kraft jest ligniną dealkilowaną, silnie pofragmentowaną i skondensowaną, podczas gdy lignina Organosolv ma strukturę podobną do ligniny z drewna mielonego (izolowanej metodą Bjorkmana)18,19,20. Wreszcie, lignosulfoniany charakteryzują się wysokim stopniem sulfonowania, zależnym od intensywności i warunków procesu sulfonowania ekstrakcyjnego.
Rysunek 2: Reprezentatywne struktury lignin technicznych. Na tym rysunku widoczne są różnice między poszczególnymi typami ligniny. (A) Lignina Kraft z drewna iglastego jest silnie skondensowana, (B) lignosulfoniany charakteryzują się obecnością grup sulfonowych przy nasyconych atomach węgla, a (C) lignina organosolv posiada strukturę zbliżoną do ligniny z mielonego drewna. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Podobnie jak ligniny, taniny są związkami polifenolowymi występującymi w roślinach. Niedawno Das i wsp.21 opublikowali aktualny przegląd metod ekstrakcji i zastosowań tanin. Znaczenie tanin w życiu codziennym można podkreślić na dwóch przykładach: nadają one smak i kolor winom22; ponadto ich polifenolowa struktura zapewnia właściwości antyoksydacyjne, co czyni je idealnymi do zastosowania w przemyśle garbarskim23. Taniny dzielą się na dwie klasy: hydrolizowalne i niehydrolizowalne. Taniny hydrolizowalne można uznać za polimer estrów kwasu galowego, digalowego i elagowego (Rycina 3). Estry te powstają w wyniku estryfikacji kwasów fenolowych z cząsteczkami cukrów (np. glukozą, ramnozą i arabinozą).
Rycina 3: Typowe garbniki hydrolizowalne: kwas taninowy, weskalgina. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Taniny niehydrolizowalne, znane również jako taniny skondensowane, to polimery i oligomery pochodzące z flawano-3-oli. Wśród flawano-3-oli najczęściej występują katechiny i gallokatechina. Są to bezbarwne związki krystaliczne (Rycina 4). Polimeryzacja prowadzi do powstania polimeru o strukturze helikoidalnej. Aromatyczne grupy hydroksylowe są skierowane na zewnątrz helisy, natomiast tleny pyranowe znajdują się w jej wnętrzu.
Rycina 4: Struktury proantocyjanidyn: R =H, OH, OCH3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Charakterystyka lignin i tanin z wykorzystaniem NMR
W charakteryzacji lignin lub tanin kluczowe są dwa rodzaje informacji: (a) struktura chemiczna (np. zawartość grup hydroksylowych, natura i częstotliwość wiązań międzyjednostkowych) oraz (b) masa cząsteczkowa i polidyspersyjność. Od czasu pierwszych badań nad ligniną, w celu osiągnięcia tych celów stosowano różne techniki, w wyniku czego wykształciły się dwie klasy metod: metody chemiczne i fizyczne.
W chemii ligniny historycznie szeroko stosowano metody chemiczne, takie jak alkaliczne utlenianie nitrobenzenem, derywatyzację z następującym po niej rozszczepieniem redukcyjnym, utlenianie nadmanganianem oraz tioacidolizę24,25,26,27,28,29. Jednakże, nawet jeśli protokoły analityczne zostały wdrożone i zoptymalizowane, są one czasochłonne, pracochłonne i wymagają rozległych umiejętności eksperymentalnych30. Alternatywnie, od początku analizy instrumentalnej do charakteryzacji ligniny i tanin wykorzystywane są metody fizyczne31. Techniki te pozwalają przezwyciężyć problemy metod klasycznych, ułatwiając charakteryzację struktury ligniny.
Wśród technik instrumentalnych rezonans magnetyczny jądra (NMR) pozwala na uzyskanie informacji o strukturze i składzie chemicznym ligniny. W szczególności dane z ilościowych jednowymiarowych widm 1H NMR oraz ilościowych widm 13C NMR mogą dostarczyć informacji o różnych typach wiązań międzyjednostkowych w ligninie32,33,34,35. Niestety, widma jednowymiarowe są obarczone nakładaniem się sygnałów, co może poważnie utrudnić próby całkowania sygnałów. W celu lepszego zrozumienia struktury ligniny stosowano ilościowe wersje HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence), czyli Q-HSQC (Quantitative - Heteronuclear Single Quantum Coherence), które dostarczają pomocnych informacji o wiązaniach wewnętrznych. Nie mogą one jednak zostać w pełni wykorzystane do ilościowego oznaczenia poszczególnych jednostek budulcowych13,36,37.
Aby przezwyciężyć problemy związane z jednowymiarowym i dwuwymiarowym NMR, rozważono derywatyzację substratów. Do zalet tego podejścia należy możliwość wprowadzenia specyficznych znaczników do złożonej makrocząsteczki oraz brak interferencji spektralnych ze strony rozpuszczalnika, w którym rozpuszczono znakowane substraty.1Verkade był pionierem w tej dziedzinie, przeprowadzając 31Analiza P NMR pochodnych fosforu, pochodnych węgla oraz związków pokrewnych38W publikacji tej przeprowadzono przesiew różnych odczynników zawierających fosfor (fosfolanów) oraz zarejestrowano przesunięcie chemiczne innych znakowanych związków. Zespół Argyropoulosa po raz pierwszy wprowadził derywatyzację do ilościowej i jakościowej analizy grup hydroksylowych w ligninie w 1991 roku.. Po zbadaniu pochodnych modelowych związków ligniny z wykorzystaniem odczynników zawierających fosfor, jego grupa utorowała drogę do jednej z najczęściej stosowanych technik w chemii ligniny, 31Analiza NMR P39,40,41,42,43Wśród przebadanych różnych fosfolanów Argyropoulos stwierdził, że 2-chloro-4,4,5,5-tetrametylu-1,3,2-dioksafosfolan (TMDP) jest najlepiej dostosowany do przeprowadzenia analizy ligniny.44TMDP reaguje selektywnie z grupami hydroksylowymi, powodując ilościowe tworzenie pochodnych zawierających fosfor, które charakteryzują się specyficznymi 31przesunięcia chemiczne w spektroskopii 31P NMR (Rysunek 5).
Rysunek 5: Chemia fosfitylowania ligniny i tanin. Znakowanie labilnych grup H ligniny i tanin odbywa się poprzez reakcję in situ. Znakowane polifenole charakteryzują się specyficznymi prążkami 31P NMR odpowiadającymi różnym rodzajom grup hydroksylowych. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Deratyzację próbek przeprowadza się w mieszaninie pirydyny i chloroformu (1,6:1); wybór ten jest wynikiem dokładnej oceny. Pirydyna oferuje dwie zalety. Po pierwsze, wybór rozpuszczalnika charakteryzującego się parametrem Hildebranda wynoszącym około 22,1 MPa1/2 upraszcza i zwiększa rozpuszczalność ligniny45. W związku z tym dodatek pirydyny jako rozpuszczalnika, której parametr Hildebranda wynosi 21,7, jest optymalny. Po drugie, reakcji TMDP z grupami hydroksylowymi towarzyszy powstawanie chlorowodoru (HCl) jako produktu ubocznego, co niesie ze sobą negatywne skutki dla łatwego tworzenia pochodnych ligniny-fosfolanu. Z tego powodu powstający HCl musi zostać zneutralizowany. Przy zastosowaniu znacznej nadwyżki zasadowość pirydyny w stosunku do TMDP pozwala na neutralizację HCl (poprzez tworzenie chlorowodorku pirydyny).
Zastosowanie zalecanego binarnego układu rozpuszczalników pirydyna/deuterowany chloroform wynika z trzech powodów. Po pierwsze, sprzyja on rozpuszczaniu próbki. Po drugie, ponieważ chlorek pirydyniowy jest rozpuszczalny w chloroformie, zapobiega to wytrącaniu osadu i pogorszeniu jakości końcowego widma. Po trzecie, deuterowany chloroform wybrano ze względu na jego charakterystyczny sygnał singletowy, co umożliwia stabilizację (locking) spektrometru NMR podczas procesu akwizycji. Deratyzacja próbki przeprowadzana jest w obecności standardu wewnętrznego. W ten sposób, po przeprowadzeniu deratyzacji próbki i standardu, porównanie całek piku próbki i standardu pozwala na ilościowe oznaczenie każdego z obecnych typów grup hydroksylowych. Rozważano różne związki jako standardy wewnętrzne. Związki te charakteryzują się obecnością pojedynczej grupy hydroksylowej w cząsteczce, co po deratyzacji daje pojedynczy ostry sygnał w widmie 31P NMR. Wybór standardu musi być dokonany starannie. Jego sygnał nie powinien nakładać się na sygnały zderatyzowanej próbki. W początkowym okresie powszechnie stosowano cholesterol. Jednakże częściowe nakładanie się sygnałów pochodzących z alifatycznych grup hydroksylowych ogranicza jego zastosowanie. Do rutynowych analiz preferowane są roztwory standardu wewnętrznego N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksymidu (NHND). Jednak ze względu na niestabilność NHND, jego roztwory standardowe można przechowywać jedynie przez kilka dni46.
Protokół
Poniższy schemat blokowy (Rysunek 6) przedstawia cały protokół eksperymentalny analizy 31P NMR lignin i tanin.
Rycina 6Procedura dla 31Analiza P NMR lignin i garbników. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
1. Obróbka wstępna próbek
- Wysuszyć alikwot (około 100 mg) analitytu (próbka ligniny lub tanin) przez noc w suszarce próżniowej ustawionej na 40 °C.
UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę na dobór temperatury, ponieważ temperatury przekraczające 40 °C mogą chemicznie zmienić wrażliwą strukturę badanych polifenoli. - Po wysuszeniu szybko przenieść próbkę do eksykatora z bezwodnym siarczanem wapnia, aż osiągnie ona temperaturę pokojową. Krok ten jest obowiązkowy, aby zapobiec pochłanianiu wilgoci z otoczenia przez próbkę.
2. Przygotowanie roztworu rozpuszczalnika
- Przygotować mieszaninę rozpuszczalników pirydyna/deuterowany chloroform w probówce do próbek o pojemności 20 mL, mieszając bezwodną pirydynę i deuterowany chloroform w stosunku 1,6/1 (v/v).
OSTRZEŻENIE: Należy zachować ostrożność podczas pracy z pirydyną i deuterowanym chloroformem. Związki te są łatwopalne, szkodliwe i toksyczne. Roztwór należy przygotować i stosować w dobrze wentylowanej komorze z wyciągiem (dygestorium), używając odpowiednich rękawic ochronnych. - Dodać 5-8 g dobrze wypłukanych i wysuszonych aktywowanych sit molekularnych 5A w postaci granulatu o średnicy 3,2 mm w celu usunięcia śladów wody. Ponadto, w celu zapobiegania kontaktowi z powietrzem i zanieczyszczeniu układu rozpuszczalników wilgocią, zdecydowanie zaleca się stosowanie nakrętek z septem. Przygotowany roztwór przechowywać w ciemności.
3. Przygotowanie roztworu standardu wewnętrznego (IS)
- W kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 mL przygotować 0,1 M roztwór acetylacetonianu chromu (III) (około 10 mg) i standardu wewnętrznego (około 35,8 mg NHND lub 77,3 mg cholesterolu) w wcześniej przygotowanym roztworze rozpuszczalnika.
OSTROŻNIE: Acetylacetonian chromu (III) jest szkodliwy; podczas pracy z nim należy używać odpowiednich rękawiczek. - Zanotować dokładną masę IS dodaną do roztworu IS.
- Przenieść roztwór IS do fiolki z zamkniętym nakrętką, zawierającej aktywne sita molekularne (patrz punkt 2.2), i przechowywać w ciemności w temperaturze 40 °C.
4. Przygotowanie roztworu próbki do NMR
- Odważyć dokładnie ~30 mg próbki do fiolki o pojemności 2 mL wyposażonej w mieszadło magnetyczne. Zamknąć fiolkę nakrętką z septem.
- Do fiolki z próbką dodać 0,5 mL roztworu układu rozpuszczalników.
- Za pomocą mikropipety przenieść 100 µL roztworu IS do fiolki z próbką. Mieszać magnetycznie otrzymaną dyspersję (500 rpm) aż do całkowitego rozpuszczenia ligniny lub tanin, aż do uzyskania klarownego roztworu.
UWAGA: Ponieważ całkowita solubilizacja próbki jest niezbędna, ten etap może potrwać do 12 h. - Przenieść 0,1 mL TMDP do roztworu próbki. Podać intensywne mieszanie magnetyczne. Roztwór próbki musi pozostać szczelnie zamknięty. TMDP należy stosować w dobrze wentylowanej dygestoriu, używając odpowiednich rękawic ochronnych.
OSTRZEŻENIE: TMDP oraz jego opary są żrące, szkodliwe i szybko reagują z wodą.
UWAGA: Powstanie żółtego osadu wynika z obecności śladów wody w próbce lub w roztworze pirydyna/chloroform. W takim przypadku procedurę należy powtórzyć, upewniając się, że uniknięto wszelkich możliwych zanieczyszczeń wilgocią. - Przenieść roztwór próbki do probówki NMR za pomocą pipety Pasteura.
5. Analiza NMR
- Wprowadź próbkę do spektrometru NMR. Spektrometr wykorzystywany do wykonania tej analizy musi być wyposażony w sondę szerokopasmową.
- Ustaw parametry eksperymentu zgodnie z wartościami przedstawionymi w Tabeli 11.
| PROGRAM IMPULSÓW | Impuls rozsprzęgający z odwróconą bramkowaniem (zgig) |
| JĄDRO KOMÓRKOWE | 31P |
| Szerokość widmowa | 100 p.p.m. |
| CZAS AKWIZYCJI | - 0,8 s |
| OPÓŹNIENIE RELAKSACJI | ≥ 10 s |
| LICZBA SKANÓW | 64 lub więcej |
| CENTRUM SPEKTRUM | 140 p.p.m. |
Tabela 1: Parametry eksperymentalne do odnotowania dla31 widm NMR P pochodnych lignin lub tanin.
- Ustaw częstotliwość spektrometru, korzystając z częstotliwości rezonansowej chloroformu deuterowanego, przeprowadź shimowanie próbki i dostrój spektrometr. Następnie rozpocznij akwizycję.
6. Przetwarzanie i analiza widm
- Przetwórz surowe dane 31P NMR za pomocą odpowiedniego standardowego oprogramowania zgodnie z poniższymi krokami.
- Wykonaj transformację Fouriera.
- Dostosuj fazę poprzez ręczną korekcję fazy (Processing | Phase Correction | Manual Correction).
- Skoryguj linię bazową ręcznie, ostrożnie ustawiając punkty zerowe (Processing | Baseline | Multipoint Baseline Correction).
- Kalibracja sygnału.
- Ustaw sygnał dla fosfitylowanej wody na wartość przesunięcia chemicznego 132,2 ppm (Analysis | Reference | Reference).
UWAGA: Obecność ostrego sygnału 31P przy 175 ppm wynika z nadmiaru TMDP. Jego obecność gwarantuje pełną derywatyzację próbki. Jeśli ten pik nie występuje, należy powtórzyć całą procedurę, zapewniając dokładne osuszenie próbki i rozpuszczalnika oraz dodając więcej TMDP. Po zapewnieniu tego stanu, powiększ widmo w zakresie spektralnym od 132 do około 150 ppm (Rycina 7).
- Ustaw sygnał dla fosfitylowanej wody na wartość przesunięcia chemicznego 132,2 ppm (Analysis | Reference | Reference).
Rysunek 7: Sprawdzenie obecności nadmiaru TMDP: jeśli jest on widoczny, derywatyzacja próbki jest zakończona. Następnie można przeanalizować widma. W tym celu należy powiększyć zakres spektralny między 155 a 132 ppm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
- Integracja
- Znormalizuj integrację, ustawiając standard wewnętrzny na 1,0 (kliknij Peak | Edit Integral | Normalized: 1,00). Wykonaj integrację widma zgodnie z przesunięciami chemicznymi podanymi w poniższych tabelach. Skorzystaj z Tabeli 2 dla lignin i Tabeli 3 dla tanin.
| GRUPA FUNKCYJNA | PRZESUNIĘCIE CHEMICZNE (ppm) |
| Alifatyczna grupa OH | 149.0-146.0 |
| Grupy OH fenolowe | 144.0-137.4 |
| podstawiona w pozycji C5 grupa OH fenolowa | 143.0-140.2 |
| 5-5’ fenolowy OH | 141.7-140.2 |
| Syringyl OH | 143.2-142.7 |
| 4-O-5’ OH | 142.8-141.7 |
| Guaiacyl OH | 140.2-138.8 |
| p-hydroksyfenyl OH | 138.8-137.4 |
| COOH | 136.0-133.6 |
| Trycyna | 137.0-136.0 |
Tabela 2: 31Przesunięcia chemiczne 31P NMR dla fosfitylowanych grup OH ligniny.
| GRUPA FUNKCYJNA | PRZESUNIĘCIE CHEMICZNE (ppm) |
| Pierścień A | |
| fenolowa o-niepodstawiona | 137.9–137.4 |
| fenolowa o-podstawiona | 138.8–137.9 |
| Pierścień B | |
| OH katecholowa | 140.2–138.8 |
| OH pirogallolowa | 144.0–140.2 |
| Pierścień C | |
| OH alifatyczna | 146.0–145.0 |
Tabela 3: 31Przesunięcie chemiczne w widmie 31P NMR dla fosfitylowanych grup OH tanin.
UWAGA: Przy użyciu standardowego oprogramowania do przetwarzania widm możliwe jest zdefiniowanie obszarów przesunięcia chemicznego przeznaczonych do całkowania. Jest to rozwiązanie korzystne w przypadku konieczności przetworzenia wielu widm.
7. Ilościowe oznaczenie grup funkcyjnych
- Oblicz stężenie roztworu IS.
- Oblicz równoważną ilość konkretnego sygnału:
Wyniki
Opisany protokół można zastosować zarówno do analizy lignin, jak i garbników. W chemii lignin metoda ta jest fundamentalna, ponieważ pozwala na wykrywanie i ilościowe oznaczenie różnych typów grup hydroksylowych. Rysunek 8A-D przedstawia przykłady widm 31P NMR lignin i garbników uzyskanych za pomocą spektrometrów pracujących przy różnych częstotliwościach. Widmo przedstawione na Rysunku 8A zostało zarejestrowane przy użyciu spektrometru NMR 300 MHz, natomiast Rysunek 8D został zarejestrowany za pomocą urządzenia NMR 700 MHz.
Rysunek 8: Ilościowe widmo 31P NMR (A) ligniny kraft z miękkiego drewna (widmo zarejestrowane spektrometrem 300 MHz dla 30,8 mg ligniny), (B) kwasu lignosulfonowego z miękkiego drewna (widmo zarejestrowane spektrometrem 300 MHz dla 30,1 mg ligniny po konwersji lignosulfonianu do kwasu lignosulfonowego), (C) tanin akacjowych (widmo zarejestrowane spektrometrem 300 MHz dla próbki 30,3 mg) oraz (D) ligniny kraft z miękkiego drewna (widmo zarejestrowane spektrometrem 700 MHz dla 7,2 mg ligniny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Widma te zostały starannie zarejestrowane i przetworzone ręcznie. Typowe sygnały dla grup hydroksylowych alifatycznych (150-145 ppm), aromatycznych (145-137 ppm) i karboksylowych (136-134 ppm) są bardzo dobrze rozdzielone, a co za tym idzie, łatwo poddają się całkowaniu. Po poszerzeniu okna spektralnego (od 95 do 190 ppm, Rysunek 8) widoczne są trzy ostre, silne piki (175, 144 i 132 ppm). Wynikają one odpowiednio z nadmiaru TMDP, standardu wewnętrznego (cholesterolu lub NHND) oraz hydroksylowanego TMDP (spowodowanego obecnością śladów wody).
W przeciwieństwie do ligniny kraftowej i organosolv, lignosulfoniany są nierozpuszczalne w mieszaninie pirydyny i chloroformu. Aby uzyskać wiarygodne widmo 31P NMR, niezbędna jest rozpuszczalność. Aby rozwiązać ten problem, lignosulfoniany można przekształcić w odpowiadające im kwasy lignosulfonowe przed przeprowadzeniem derywatyzacji. Traktowanie roztworów lignosulfonianów silnymi kwasami (np. kwasem siarkowym) lub żywicami wymiany kwasowej (np. Dowex 1H, silnie kwasową żywicą kationitową) prowadzi do przekształcenia wszystkich grup sulfonowych w ich formy kwasowe. Otrzymane produkty można usunąć z kwasowego roztworu za pomocą selektywnych żywic adsorpcyjnych (XAD-7, polarnego adsorbenta stosowanego do izolowania związków o masie cząsteczkowej do 60 000 u.m.a), analizowanych zgodnie z niniejszym protokołem. Rycina 8B przedstawia ilościowe widmo 31P NMR kwasu lignosulfonowego derywatyzowanego TMDP. Nawet w tym przypadku widoczne są różne sygnały grup hydroksylowych. Rycina 8C przedstawia typowe ilościowe widmo 31P NMR próbki tanin derywatyzowanej za pomocą TMDP. Wyraźnie widoczny jest charakterystyczny sygnał pochodzący z różnych alifatycznych grup OH (pierścień C), jednostek pirogallolu i katecholu w pierścieniu B oraz jednostek w pierścieniu A.
Dyskusja
Opisana metoda stanowi implementację i optymalizację protokołu analitycznego nakierowanego na jakościową i ilościową charakterystykę lignin, opracowanego przez Argyropoulosa37,38,39,40,41,42. W porównaniu z wieloma innymi technikami dostępnymi do badania struktury lignin, metoda ta została szeroko uznana za jedną z najprostszych, najszybszych i najbardziej powtarzalnych. Wiarygodność mokrych metod chemicznych (np. utleniania nitrobenzenem, nadmanganianem itp.) zależy od wysokich umiejętności eksperymentalnych operatora, co w praktyce ogranicza zastosowanie tych metod do niewielkiego grona specjalistów. Co więcej, w literaturze często spotyka się współczynniki korekcyjne dla mokrych metod chemicznych, mające na celu zniwelowanie ich licznych wad. Opisany protokół 31P NMR nie wymaga zaawansowanych umiejętności eksperymentalnych, co czyni go łatwym w zastosowaniu, przyjaznym dla użytkownika i powszechnie dostępnym. W porównaniu z innymi instrumentalnymi metodami analitycznymi, 31P NMR jest jedyną techniką zdolną do precyzyjnego wykrywania i ilościowego oznaczania różnych grup hydroksylowych w ligninach. Przykładowo, FTIR może być wykorzystywany do identyfikacji różnych grup hydroksylowych, podobnie jak 1H NMR. Obie te techniki są jednak ograniczone przez brak możliwości dostarczenia wiarygodnych danych ilościowych ze względu na rozległe nakładanie się sygnałów. Inna powszechnie stosowana technika to spektroskopia UV-Vis, po raz pierwszy opisana przez Goldschmida. Podejście to ogranicza się jednak do ogólnego oznaczenia grup hydroksylowych, ponieważ nie pozwala na skuteczne rozróżnienie między grupami OH alifatycznymi, aromatycznymi i karboksylowymi47.
Z punktu widzenia ekonomicznego jedynym ograniczeniem techniki 31P NMR jest cena TMDP, który jest stosunkowo drogim odczynnikiem. Kosztuje on około 190 USD za gram; w konsekwencji, gdyby koszt analizy przybliżyć jedynie do ceny TMDP, pomijając wydatki związane z mieszaniną pirydyna/chloroform oraz czas pracy operatora, wyniósłby on około 24 USD za analizę. Aby rozwiązać ten problem, wiele laboratoriów decyduje się na syntezę TMDP, co pozwala zredukować koszty odczynników. W tym celu pinakol i trójchlorek fosforu poddaje się reakcji w obecności trietyloaminy44. Technicznie reakcja ta jest stosunkowo prosta, jednak wymagana jest ostrożność podczas pracy z trójchlorkiem fosforu i podczas przetwarzania produktu, w tym podczas ściśle kontrolowanej destylacji próżniowej. Więcej szczegółów dotyczących syntezy TMDP może zostać udostępnionych na prośbę.
Pomimo że protokół ten jest jednym z najlepszych pod względem łatwości wykonania, powtarzalności i precyzji, należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych punktów. Po pierwsze, próbka musi być całkowicie rozpuszczalna w określonej mieszaninie pirydyny i chloroformu. Kwestia ta jest fundamentalna, ponieważ ilościowa reakcja fosfitylowania grup hydroksylowych musi zachodzić w warunkach całkowitej homogeniczności. Jeśli rozpuszczona zostanie tylko część próbki, wynikowa analiza będzie niedokładna. Po drugie, badana próbka musi być wolna od wilgoci i rozpuszczalników, ponieważ zmienne te negatywnie wpłyną na precyzję i ogólny sukces analizy. Ślady wilgoci będą reagować z TMDP, tworząc 2-hydroksy-4,4'-5,5'-tetrametyl-1,3,2-dioksafosfolan. Związek ten jest bladożółtą, flokulującą solą, nierozpuszczalną w mieszaninie rozpuszczalników pirydyna/chloroform, co powoduje niewłaściwe pozyskiwanie sygnałów NMR. Ponieważ wymagana jest tylko niewielka ilość próbki (~30 mg), musi być ona wolna od substancji lotnych, aby jej dokładna masa była precyzyjnie znana przed analizą.
Czasami problemy z solwatacją próbek można rozwiązać (zwłaszcza w przypadku próbek silnie utlenionych) poprzez dodanie niewielkich ilości rozpuszczalnika pomocniczego (np. dimetyloformamidu), co ułatwia rozpuszczanie próbki. W zasadzie każdy rozpuszczalnik, który nie wchodzi w reakcje z TMDP, może być użyty w celu wspomagania rozpuszczania próbki. Wybór rozpuszczalnika pomocniczego nie może obejmować substancji zawierających labilne grupy hydroksylowe lub aminowe, ponieważ reagują one z odczynnikiem, co prowadzi do błędnych widm końcowych. Warto zauważyć, że dimetylosulfotlenek również reaguje z TMDP, co wyklucza jego zastosowanie jako rozpuszczalnika pomocniczego. W przypadku problemów z rozpuszczalnością można zastosować ciecze jonowe na bazie pirydyny, takie jak chlorek 1-allylo-3-butylpirydyniowy; ciecz jonowa ta musi być jednak bezwodna48. W celu rozpuszczenia lignosulfonianów (rodzaju ligniny charakteryzującego się wysokim stopniem sulfonowania) pomocne okazało się zastosowanie wstępnej obróbki polegającej na przekształceniu grup zneutralizowanych w ich formę kwasową. Lignosulfoniany można wygodnie przekształcić w formę kwasową, stosując kwasowe żywice jonowymienne w środowisku wodnym. Powstałe kwasy lignosulfonowe izoluje się z roztworu poprzez adsorpcję na specyficznych żywicach (np. XAD-7) i desorpcję w etanolu. Odparowanie roztworów etanolowych pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze 40 °C pozwala na wyizolowanie kwasów lignosulfonowych. Ligniny te mogą być następnie charakteryzowane za pomocą 31P NMR, ponieważ są rozpuszczalne w mieszaninie pirydyny i chloroformu zaproponowanej w protokole.
Przedłużone suszenie próżniowe w łagodnych temperaturach skutecznie redukuje zawartość wilgoci i innych substancji lotnych w każdej próbce. Warto zauważyć, że niewielkie ilości wody nie wpływają na końcowe widmo, ponieważ TMDP jest dodawany z nadmiarem. Ponadto w niektórych przypadkach w wyniku wilgoci obecnej w rurce NMR lub fiolce z próbką może powstać niewielka ilość 2-hydroksy-4,4'-5,5'-tetrametylu-1,3,2-dioksafosfolanu. W takich sytuacjach mieszanie jest wystarczające, aby całkowicie rozpuścić powstały osad. Jeśli utworzy się duża ilość 2-hydroksy-4,4'-5,5'-tetrametylu-1,3,2-dioksafosfolanu, zaleca się powtórzyć przygotowanie próbki, usprawniając proces suszenia. Na przykład przed użyciem całe szkło laboratoryjne można krótko podgrzać opalarką.
Zakres widmowy wykorzystywany do rejestracji widma jest szeroki w porównaniu z obszarem zainteresowania dla sygnałów dotyczących różnych grup hydroksylowych. Jest to jednak niezbędne, aby ocenić, czy pochodnowanie próbki przebiegło pomyślnie. Potwierdzeniem pełnego pochodnowania próbki jest obecność silnego sygnału w okolicy 174 ppm. Ten ostry pik wynika z obecności nieprzereagowanego TMDP, a jego wystąpienie gwarantuje, że odczynnik był obecny w nadmiarze, a w konsekwencji wszystkie grupy hydroksylowe zostały poddane pochodnowaniu. Jeśli pik ten nie występuje, dwie najbardziej prawdopodobne przyczyny to: (1) ilość użytego TMDP była niewystarczająca do przeprowadzenia pełnego pochodnowania próbki lub (2) w próbce znajduje się duża ilość wody. W pierwszym przypadku zastosowanie większej ilości TMDP prawdopodobnie zapewni pełne pochodnowanie próbki i pojawi się sygnał przy 174 ppm. W drugim przypadku próbka powinna zostać dokładniej osuszona. Po upewnieniu się, że TMDP znajduje się w nadmiarze, można przystąpić do całkowania pików. Przed wykonaniem tej operacji należy przybliżyć widok do węższego okna (od 150 do 132 ppm), które obejmuje interesujące nas sygnały.
Ilość próbki (~30 mg) do analizy, podana w powyższym protokole doświadczalnym, została dobrana w celu uzyskania widm dobrej jakości dla spektrometru NMR o częstotliwości 300 MHz lub wyższej. Zaobserwowaliśmy jednak, że w przypadku zastosowania magnesu o polu 500 MHz lub wyższym możliwe jest zmniejszenie ilości próbki. Na przykład na Ryc. 8D przedstawiono widmo NMR (uzyskane za pomocą urządzenia 700 MHz) próbki przygotowanej z 7,2 mg ligniny. Integracja sygnałów tego widma daje takie same wyniki, jakie uzyskano przy zastosowaniu większych ilości ligniny. Fakt ten zwiększa przydatność niniejszego protokołu we wszystkich badaniach, w których dysponuje się niewielkimi ilościami produktów.
Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół eksperymentalny można zastosować w wielu zastosowaniach badawczych i rozwojowych, gdy wymagane jest zrozumienie pochodzenia i losów różnych grup hydroksylowych obecnych w ligninach i taninach. W szczególności, w połączeniu z danymi GPC i HSQC, uzyskane wyniki dają możliwość dalszego szczegółowego opisania i spekulowania na temat struktury ligniny lub taniny. W wielu przypadkach, gdy grupy hydroksylowe ligniny lub taniny poddawane są modyfikacjom chemicznym, ilościowe analizy 31P NMR mogą być niezwykle cenne w celu wykrycia, czy modyfikacje te wystąpiły i w jakim stopniu. Na przykład Rycina 9 przedstawia dwa widma NMR tej samej ligniny przed i po jej utlenieniu. Prosta ocena jakościowa wykazuje redukcję zarówno alifatycznych, jak i aromatycznych grup hydroksylowych po utlenieniu, dostarczając tym samym cennych informacji i wytycznych.
Rysunek 9: Ilościowe widma 31P NMR tej samej ligniny Organosolv poddanej derywatyzacji za pomocą TMDP (A) przed i (B) po jej utlenianiu. Widma zarejestrowano przy użyciu spektrometru NMR 300 MHz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Podsumowując, technika ta posiada wszystkie cechy, które czynią ją jednym z najistotniejszych i najpotężniejszych narzędzi w przypadku badań dotyczących ligniny polifenolowej zawierającej grupy OH oraz tanin (a nawet polimerów syntetycznych)49,50,51, prowadzonych w różnych dziedzinach – od chemii po inżynierię, od biologii po zastosowania polimerowe i farmaceutyczne.
Oświadczenia
Claudia Crestini i Dimitris S Argyropoulos zapewniają, że wszyscy autorzy (C.C., N.P. i D.S.A.) nie mają konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca przez lata była wspierana przez różne nagrody finansowe, które obejmowały organizacje takie jak Kanadyjski Instytut Badań Celulozowo-Papierniczych, McGill University Montreal, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, National Science Foundation USA, Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych oraz firma Solvay.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100 - 1000 &mikro; l Mikropipeta Eppendorf | VWR | 613-0866 | |
| 20 - 200 & mikro; l Mikropipeta Eppendorf | VWR | 613-0865 | |
| 2-chloro-4,4,5,5-tetrametylo-1,3-2-dioksafosfolan, 95% | Sigma-Aldrich | 447536 | |
| Waga analityczna (czułość ± 0,1 mg) | Precisa | LX220 A | |
| Spoiwo | VD53 | ||
| Certyfikowany zestaw fiolek, niska adsorpcja (LA), 2 mL, opakowanie 100 | Sigma-Aldrich | 29651-U | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823 | |
| Cholesterol, Sigma-Aldrich | C8667 | ||
| Sita molekularne, 4A | Sigma-Aldrich | 208604 | |
| N-hydroksy-5-norbornen-2,3-dikarboksyimid, spektrometr 97% | Sigma-Aldrich | 226378 | |
| NMR, 300 MHz | Bruker | ||
| Norell naturalny kwarc 3 mm NMR rurki | Sigma-Aldrich | NORS33007 | |
| Końcówki do pipet, 100-1000 i mikro; L UltraFine (niebieska) | VWR | 613-0342 | |
| Końcówki do pipet, 20-200 µ L Punkt ukosu (żółty) | VWR | 613-0239 | |
| Pirydyna, bezwodna, 99.8% | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| Mieszadła, mikro, długość 3 mm | VWR | 442-0360 | |
| Mieszadła mikro, długość 6 mm | VWR | 442-0362 | |
| Tlenek trifenylofosforyny, 97% | Sigma-Aldrich | T84603 | |
| Fiolki do analizy środowiskowej, WHEATON, 20,00 ml | DWK Nauki biologiczne | WHEAW224609 | |
| Papier wagowy, gatunek 531 | VWR | 516-0318P |
Bibliografia
- Meng, X., et al. Determination of hydroxyl groups in biorefinery resources via quantitative 31 P NMR spectroscopy. Nature Protocols. 14 (9), 2627-2647 (2019).
- Anastas, P. T., Williamson, T. C. Green chemistry: An overview. Green Chemistry. 626, 1-17 (1996).
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: Principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Collins, M. N., et al. Valorization of lignin in polymer and composite systems for advanced engineering applications - A review. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 828-849 (2019).
- De Gruyter. Biorefinery: From Biomass to Chemicals and Fuels. , (2012).
- Sannigrahi, P., Pu, Y., Ragauskas, A. Cellulosic biorefineries-unleashing lignin opportunities. Current Opinion in Environmental Sustainability. 2 (5), 383-393 (2010).
- Lange, H., Decina, S., Crestini, C. Oxidative upgrade of lignin - Recent routes reviewed. European Polymer Journal. 49 (6), 1151-1173 (2013).
- Glasser, W. G. Classification of lignin according to chemical and molecular structure. Lignin: Historical, Biological, and Materials Perspectives. 742, 216-238 (1999).
- Wiley. Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology, 2 Volume Set, 5th Edition. , Wiley. (2004).
- Lewis, N. G., Sarkanen, S. Preface. Lignin and Lignan Biosynthesis. 697, 9-11 (1998).
- Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11 (3), 169-218 (1977).
- Ragauskas, A. J., et al. Lignin valorization: Improving lignin processing in the biorefinery. Science. 344 (6185), (2014).
- Crestini, C., Melone, F., Sette, M., Saladino, R. Milled wood lignin: A linear oligomer. Biomacromolecules. 12 (11), 3928-3935 (2011).
- Guerra, A., et al. On the propensity of lignin to associate: A size exclusion chromatography study with lignin derivatives isolated from different plant species. Phytochemistry. 68 (20), 2570-2583 (2007).
- Contreras, S., Gaspar, A. R., Guerra, A., Lucia, L. A., Argyropoulos, D. S. Propensity of lignin to associate: Light scattering photometry study with native lignins. Biomacromolecules. 9 (12), 3362-3369 (2008).
- Gigli, M., Crestini, C. Fractionation of industrial lignins: opportunities and challenges. Green Chemistry. 22 (15), 4722-4746 (2020).
- Adler, E. Structural elements of lignin. Industrial & Engineering Chemistry. 49 (9), 1377-1383 (1957).
- Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 1. Extraction of lignin with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 477-485 (1956).
- Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 2. Extraction of lignin-carbohydrate compelexes with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 243-251 (1957).
- Bjorkman, A. Studied on finely divided wood. Part 5. The effect of milling. Svensk Pappersit. , 329-335 (1957).
- Das, A. K., Islam, N., Ashaduzzaman, F. O., Dungani, R. Review on tannins: Extraction processes, applications and possibilities. South African Journal of Botany. 135, 58-70 (2020).
- Laitila, J. E. Composition and evolution of oligomeric proanthocyanidin-malvidin glycoside adducts in commercial red wines. Food Chemistry. 340, 127905(2021).
- Covington, A. D., Wise, W. R. Tanning Chemistry. , RSC Publishing. (2019).
- Tarabanko, V. E., Tarabanko, N. Catalytic oxidation of lignins into the aromatic aldehydes: General process trends and development prospects. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2421(2017).
- Guerra, A., Mendonça, R., Ferraz, A., Lu, F., Ralph, J. Structural characterization of lignin during pinus taeda wood treatment with ceriporiopsis subvermispora. Applied and Environmental Microbiology. 70 (7), 4073-4078 (2004).
- Faix, O., Andersons, B., Zakis, G. Determination of carbonyl groups of six round robin lignins by modified oximation and FTIR spectroscopy. Holzforschung. 52 (3), 268-274 (1998).
- Santos, R. B., Capanema, E. A., Balakshin, M. Y., Chang, H., Jameel, H. Lignin structural variation in hardwood species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (19), 4923-4930 (2012).
- Bose, S. K., Wilson, K. L., Hausch, D. L., Francis, R. C. Lignin analysis by permanganate oxidation. II. Lignins in Acidic Organosolv Pulps. Holzforschung. 53 (6), 603-610 (1999).
- Harman-Ware, A. E., et al. A thioacidolysis method tailored for higher-throughput quantitative analysis of lignin monomers. Biotechnology Journal. 11 (10), 1268-1273 (2016).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
- Lin, S. Y., Carlton, W. D. Methods in Lignin Chemistry. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1992).
- Lundquist, K. Proton (1H) NMR Spectroscopy. Methods in Lignin Chemistry. , 242-249 (1992).
- Robert, D. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrometry. Methods in Lignin Chemistry. , 250-273 (1992).
- Li, S., Lundquist, K. A new method for the analysis of phenolic groups in lignins by 1H NMR spectrometry. Nordic Pulp & Paper Research Journal. 9 (3), 191-195 (1994).
- Hallac, B. B., Pu, Y., Ragauskas, A. J. Chemical transformations of buddleja davidii lignin during ethanol organosolv pretreatment. Energy & Fuels. 24 (4), 2723-2732 (2010).
- Sette, M., Wechselberger, R., Crestini, C. Elucidation of lignin structure by quantitative 2D NMR. Chemistry - A European Journal. 17 (34), 9529-9535 (2011).
- Sette, M., Lange, H., Crestini, C. Quantitative HSQC analyses of lignin: A practcal comparison. Computational and Structural Biotechnology Journal. 6 (7), 201303016(2013).
- Wroblewski, A. E., Lensink, C., Markuszewski, R., Verkade, J. G. Phosphorus-31 NMR spectroscopic analysis of coal pyrolysis condensates and extracts for heteroatom functionalities possessing labile hydrogen. Energy & Fuels. 2 (6), 765-774 (1988).
- Archipov, Y., Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part I. Model compounds. Journal of Wood Chemistry and Technology. 11 (2), 137-157 (1991).
- Argyropoulos, D. S., Heitner, C., Morin, F. G. P. NMR spectroscopy in wood chemistry - Part III. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores in mechanical pulp. Holzforschung - International Journal of the Biology, Chemistry, Physics and Technology of. 46 (3), 211-218 (2009).
- Argyropoulos, D. S., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part VI. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores and carboxylic acids present in mechanical pulps; a method for the quantitative determination of ortho-quinones. Holzforschung. 48 (1), 112-116 (1994).
- Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry part V. Qualitative analysis of lignin functional groups. Journal of Wood Chemistry and Technology. 13 (2), 187-212 (1993).
- Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part IV. Lignin models: Spin lattice relaxation times and solvent effects in 31P NMR. Holzforschung. 47 (1), 50-56 (1993).
- Granata, A., Argyropoulos, D. S. 2-Chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane, a reagent for the accurate determination of the uncondensed and condensed phenolic moieties in lignins. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 43 (6), 1538-1544 (1995).
- Duval, A., Vilaplana, F., Crestini, C., Lawoko, M. Solvent screening for the fractionation of industrial kraft lignin. Holzforschung. 70 (1), 11-20 (2016).
- Ben, H., Farrell, J. R. In-depth investigation on quantitative characterization of pyrolysis oil by 31P NMR. RSC Advances. 6 (21), 17567-17573 (2016).
- Goldschmid, O. Determination of phenolic hydroxyl content of lignin preparations by ultraviolet spectrophotometry. Analytical Chemistry. 26 (9), 1421-1423 (1954).
- Ben, H., et al. Characterization of whole biomasses in pyridine based ionic liquid at low temperature by 31P NMR: An approach to quantitatively measure hydroxyl groups in biomass as their original structures. Frontiers in Energy Research. 6, (2018).
- Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis of potentially biobased copolyesters based on adipic acid and butanediols: Kinetic study between 1,4- and 2,3-butanediol and their influence on crystallization and thermal properties. Polymer. 99, 204-213 (2016).
- Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis and characterization of biobased poly(butylene succinate-ran-butylene adipate). Analysis of the composition-dependent physicochemical properties. European Polymer Journal. 87, 84-98 (2017).
- Chan, K. P., Argyropoulos, D. S., White, D. M., Yeager, G. W., Hay, A. S. Facile quantitative analysis of hydroxyl end groups of Poly(2,6-dimethyl-1,4-phenylene oxide)s by 31P NMR spectroscopy. Macromolecules. 27 (22), 6371-6375 (1994).
Przedruki i uprawnienia
