Ten protokół demonstruje nowatorską metodę stosowania terapii genowych do subpopulacji komórek u noworodków szczurów w wieku postnatalnym 5-10 dni poprzez wstrzyknięcie następczego modyfikatora chemogenetycznego do kory somatomotorycznej i wstecznie transportowanej rekombinazy Cre do rdzenia kręgowego szyjnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Celowanie w korowo-rdzeniowy przewód moczowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Skuteczne pokonywanie przeszkód ograniczających badania na noworodkach szczurów jest ważne dla zbadania różnic w wynikach obserwowanych w urazach rdzenia kręgowego (SCI) u dzieci w porównaniu do dorosłych SCI. Ponadto niezawodne wprowadzanie terapii do komórek docelowych ośrodkowego układu nerwowego (OUN) może być trudne, a nieścisłości mogą zagrozić skuteczności badania lub terapii. Protokół ten łączy technologię wektorów wirusowych z nowatorską techniką chirurgiczną w celu dokładnego wprowadzenia terapii genowych u nowonarodzonych szczurów w 5. dniu po urodzeniu. W tym przypadku wirus zaprojektowany do transportu wstecznego (retroAAV2) Cre jest wprowadzany do zakończeń aksonów neuronów korowo-rdzeniowych w rdzeniu kręgowym, skąd jest następnie transportowany do ciał komórkowych. Podwójnie floksowany receptor odwróconej orientacji (DIO) aktywowany wyłącznie przez wirusa DREADD (Designer Drugs) jest następnie wstrzykiwany do kory somatoruchowej mózgu. Ta technika podwójnej infekcji sprzyja ekspresji DREADD tylko w współzakażonych neuronach dróg korowo-rdzeniowych (CST). Tak więc jednoczesne jednoczesne wstrzyknięcie kory somatoruchowej i końców CST szyjki macicy jest ważną metodą badania chemogenetycznej modulacji powrotu do zdrowia po modelach SCI szyjki macicy u noworodków szczurów.
Wprowadzenie
Chociaż SCI jest stosunkowo rzadkim zjawiskiem w populacji pediatrycznej, jest szczególnie traumatyczne i powoduje trwałe niepełnosprawność, wymagającą ogromnej logistycznej dalekowzroczności. Co więcej, większy odsetek dziecięcych SCI jest klasyfikowany jako szyjki macicy i kompletny w porównaniu z populacją dorosłych1,2. Cechą charakterystyczną wszystkich gatunków ssaków jest to, że noworodki znacznie lepiej wracają do zdrowia po SCI niż dorosłe, co daje możliwość oceny mechanizmów napędzających powrót do zdrowia w młodszych populacjach3,4,5. Mimo to istnieje mniej badań multimodalnych zajmujących się badaniami nad noworodkami i niemowlętami gryzoniami, częściowo ze względu na dodatkową trudność w dokładnym celowaniu w wybrane populacje neuronów w znacznie ciaśniejszych anatomicznych punktach orientacyjnych młodszych zwierząt6. Niniejszy artykuł koncentruje się na bezpośrednim wstrzyknięciu wysoce wydajnych następczych i wstecznych wektorów związanych z adenowirusem do rdzenia kręgowego szczura w celu modulacji głównych szlaków motorycznych za pomocą DREADDów zależnych od Cre, rozszerzając zasięg badań nad regeneracją multimodalną.
Wektory wirusowe są ważnymi narzędziami biologicznymi o szerokim zastosowaniu, w tym wprowadzaniu materiału genetycznego w celu zastąpienia docelowych genów, zwiększenia wzrostu białek i śledzenia anatomicznego krajobrazu CNS7,8,9. Wiele szczegółów anatomicznych ścieżek motorycznych kręgosłupa zostało zbadanych przy użyciu klasycznych znaczników, tj. biotynylowanej aminy dekstranu. Podczas gdy tradycyjne znaczniki odegrały zasadniczą rolę w odkrywaniu neuroanatomii, nie są pozbawione wad: bezkrytycznie oznaczają ścieżki, nawet jeśli zostaną prawidłowo wstrzyknięte, a badania wykazały, że są one pobierane przez uszkodzone aksony10,11,12. W konsekwencji może to prowadzić do błędnych interpretacji w badaniach nad regeneracją, w których odcięte aksony mogą być mylone z regenerującymi się włóknami.
Poniższa metoda wykorzystuje system dwóch wektorów wirusowych, ostatnio spopularyzowany w badaniach modulacji, z dwoma różnymi wektorami wirusowymi w dwóch oddzielnych obszarach tego samego neuronu13,14. Pierwszym z nich jest wektor, który miejscowo infekuje ciała komórkowe neuronów projekcyjnych. Drugi to wektor wsteczny transportowany z zakończeń aksonów neuronów projekcyjnych (Rysunek 1). Wektor wsteczny przenosi rekombinazę Cre, a wektor lokalny zawiera sekwencję podwójnie floksowaną "Cre-On", w której kodowane jest białko fluorescencyjne (mCherry). Natywny transgen wyrażający zarówno hM3Dq, jak i mCherry jest odwrócony względem promotora i otoczony dwoma miejscami LoxP (Rysunek 2). Tak więc mCherry ulega ekspresji tylko w podwójnie transdukowanych neuronach projekcyjnych, w których rekombinaza Cre indukuje zdarzenie rekombinacji między miejscami LoxP, zmieniając orientację transgenu w odpowiednią ramkę odczytu i umożliwiając ekspresję zarówno białka DREADD, jak i fluorescencyjnego. Gdy transgen wirusa znajdzie się we właściwej orientacji i, w stosownych przypadkach, DREADD mogą przejściowo indukować neuromodulację poprzez oddzielnie wstrzykiwany ligand, tj. N-tlenek klozapiny. Protokół został opracowany w celu uwierzytelnienia badań nad indukowalną neuromodulacją u noworodków, w których DREADDS są wstrzykiwane w celu selektywnego modulowania CST. System dwóch wirusów działa jak polisa ubezpieczeniowa, zapewniając, że każda komórka DREADD-dodatnia jest identyfikowalna pod wpływem fluorescencji z wysoką wiernością w celu walidacji wstrzyknięć.
Ta metoda pomaga również wypełnić lukę w badaniach nad noworodkami. Uraz kręgosłupa u dzieci wiąże się z wyzwaniami, a badania analizujące regenerację, kiełkowanie lub plastyczność powinny podkreślić różnice między noworodkami a dorosłymi3,15,16,17. Optymalizując procedurę chirurgiczną i przeprowadzając wcześniejsze badania anatomiczne z barwieniem Nissl, zwalidowano współrzędne zarówno dla iniekcji czaszkowych, jak i rdzeniowych. Celem było opracowanie metody podwójnych wstrzyknięć nowonarodzonemu szczurowi z większą wiernością i szansą na przeżycie.
Dla obecnego modelu, wektor następczy został wstrzyknięty do ciał komórkowych kory somatomotorycznej przy użyciu bregma jako odniesienia18,19. Jeśli chodzi o zastrzyki rdzeniowe, wektor wsteczny został wstrzyknięty do blaszek V-VII, gdzie znajdują się zakończenia aksonów CST20,21. Istnieje wiele fundamentalnych pytań dotyczących tego, w jaki sposób niektóre modele zmian wpływają na młodsze zwierzęta w różny sposób i w jaki sposób późniejsza rekonwalescencja różni się od starszej hodowli. Badanie to demonstruje solidny sposób badania urazów szyjki macicy i możliwości odzyskania funkcji kończyn przednich u noworodków gryzoni. Natomiast większość wcześniejszych badań dotyczyła odzyskiwania lokomocji po urazach odcinka lędźwiowego lub klatki piersiowej5,22,23,24. Łącząc podwójny wektor wirusowy z nową techniką wstrzykiwania opisaną tutaj, protokół ten pomaga złagodzić pewne problemy (tj. przeżywalność), które mogą nękać badania noworodków na gryzoniach. Ta metoda jest solidna, praktyczna i wszechstronna: niewielkie różnice w technice pozwolą na celowanie w różne ścieżki, tj. CST brzuszne, CST grzbietowe i wznoszące się ścieżki grzbietowe.
Dla tego systemu, jeden lokalnie działający wirus (np. AAV2) jest wstrzykiwany w obszar komórek nerwowych będących przedmiotem zainteresowania. Drugi wirus transportowany wstecznie, który kontroluje ekspresję lokalnego wirusa, jest wstrzykiwany na zakończenia aksonów dla tej populacji neuronów. Tak więc, z definicji, tylko neurony korowo-rdzeniowe są znakowane. Wirus retroAAV-Cre został wybrany z konstytutywnie aktywnym promotorem CMV, ponieważ plazmid wahadłowy jest używany do generowania kilku serotypów AAV dla ekspresji zależnej od Cre w kilku typach komórek. Do iniekcji korowych wybrano AAV2 z transgenem napędzanym przez promotor synapsyny-1, aby ograniczyć ekspresję do neuronów. Ponieważ układ 2-wirusowy opiera się bardziej na pochodzeniu i zakończeniu populacji neuronów będących przedmiotem zainteresowania, można zastosować kilka różnych promotorów, jeśli mogą one sterować ekspresją genów będących przedmiotem zainteresowania w populacji neuronów będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład pobudzający promotor neuronalny, CamKII, może zostać zastąpiony synapsyną-1. Oprócz zastosowania tych serotypów AAV, transport wsteczny do niedojrzałych i w znacznie mniejszym stopniu dorosłych korowo-rdzeniowych neuronów ruchowych można również osiągnąć za pomocą wysoce wstecznie transportowalnego lentiwirusa (HiRet)25. lentiwirusy HiRet wykorzystują chimeryczną glikoproteinę wścieklizny/VSV do ukierunkowania na wychwyt w synapsie w celu transportu wstecznego. W połączeniu z promotorem Tet-On, ten 2-wirusowy system wspiera indukowaną ekspresję w sposób zależny od retrogradacji26,27.
Wsteczne wirusy wprowadzają wektory do przestrzeni synaptycznej docelowego neuronu, pozwalając na przejęcie ich przez akson komórki i przetransportowanie do ciała komórki. Podczas gdy wektory lentiwirusowe odniosły wcześniej ogromny sukces, zapewniając długoterminową ekspresję w badaniach nad terapią genową, ta metoda skierowała się w stronę wektorów wirusowych związanych z adenowirusem z kilku prostych powodów26,28: AAV jest bardziej ekonomiczny, podobnie skuteczny i stanowi mniejsze obciążenie logistyczne, biorąc pod uwagę, że ma niższy poziom bezpieczeństwa biologicznego oznaczenie29,30,31,32. Podczas gdy AAV2, najczęściej używany serotyp, wykazuje solidną transfekcję aksonów CST, przyszli badacze mogą zauważyć, że AAV1 oferuje pewną wszechstronność, ponieważ znakuje transynaptycznie, przedstawiając w ten sposób kilka możliwych iteracji w przyszłych badaniach33. Ostatnią adaptacją jest zakodowanie wstecznego wirusa za pomocą rekombinazy Cre, tak aby można było wprowadzić jednocześnie wiele wektorów następczych, zmniejszając w ten sposób niepotrzebne wewnętrzne odpady wirusowe i maksymalizując prawdopodobieństwo ekspresji DREADD we właściwej orientacji.
Ostatecznie, ten protokół demonstruje jednoczesne wstrzykiwanie do kory mózgowej i odcinka szyjnego kręgosłupa, szczególnie celując odpowiednio w ciała komórkowe i zakończenia aksonów drogi korowo-rdzeniowej. Transfekcja o wysokiej wierności jest widoczna w korze mózgowej i rdzeniu kręgowym. Chociaż opisany protokół został udoskonalony dla szczurów Sprague Dawley w wieku 5 dni, nadaje się na 4-10 dni po porodzie z niewielkimi korektami znieczulenia i współrzędnych stereotaktycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie poniższe procedury chirurgiczne i opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Temple. Opisany protokół jest operacją z przeżyciem, a zwierzęta zostały ostatecznie uśpione poprzez podanie dootrzewnowe 100 mg/kg pentobarbitalu sodowego po zakończeniu wyznaczonych punktów czasowych.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
- Przygotuj co najmniej dwie dociągane igły szklane do iniekcji wirusowej, używając szklanych pipet kapilarnych o objętości 3,5 nL; jedną igłę dla DREADD i jedną dla rCre. W ramach środków ostrożności przygotuj 4-5 igieł na wypadek ich złamania podczas operacji.
- Za pomocą mikronozyciók odetnij 1-2 mm nadmiaru szkła z igły.
- Każdą igłę ustaw pod kątem 30°, a następnie za pomocą ścięcia mikropipet użyj go do utworzenia końcówki o aperturze 30-40 µm i kącie ścięcia 45°.
- Przechowuj igły w przykrytej szalce Petriego, a następnie wysterylizuj je, umieszczając szalkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza pod światłem UV przez 15 min.
- Przygotuj niezbędne wirusy, wyjmując odpowiednią objętość z zamrażarki -80 °C przed procedurą, pamiętając, że każde zwierzę będzie wymagało 3 µL każdego wirusa.
UWAGA: Transportuj i przechowuj wirusa w lodu, gdy nie jest używany. Protokół ten opracowano przy użyciu AAV2-hM3Dq-mCherry oraz AAV2-retroCre w celu wstrzyknięcia 3 µL każdego wirusa na zwierzę. Do wytworzenia antegradycznego AAV2 o mianie wirusa 1,54 × 1012 kopii genomu (GC)/mL użyto plazmidu DREADD, pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (patrz: Tabela Materiałów). Do wytworzenia retrogradycznego AAV2 o mianie wirusa 4,27 × 1012 GC/mL użyto plazmidu Cre, pAAV-CMV-scCre. - Podłącz injektor do mikropompy i umieść go w mikromanipulatorze z noniuszem.
- Aby ułatwić wizualne potwierdzenie obecności lub braku wirusa w igle, napełnij igłę barwnikiem, np. czerwoną oliwą. Unikaj pęcherzyków powietrza w igle.
- Wsuń szklaną igłę do injektora, upewniając się, że igła pasuje prawidłowo.
- Jeśli to możliwe, powtórz cały proces z oddzielną pompą iniekcyjną dla każdego wirusa. Jeśli dostępna jest tylko jedna pompa iniekcyjna, przygotuj dwie oddzielne igły i wymień używaną igłę w momencie zmiany wirusów.
2. Znieczulenie i przygotowanie pola operacyjnego
- Zważ zwierzę na wadze cyfrowej. Zapisz masę przedoperacyjną, aby określić wymaganą objętość środka znieczulającego.
UWAGA: W ramach niniejszego protokołu stwierdzono, że najskuteczniejszą techniką znieczulania zapewniającą satysfakcjonującą głębokość anestezji przez cały czas trwania operacji jest połączenie ketaminy i hipotermii. Sama ketamina jest niewystarczająca do zapewnienia znieczulenia, a jej uzupełnienie ksylazyną wiąże się z wąskim zakresem dawkowania przed wzrostem śmiertelności śródoperacyjnej. Sama hipotermia nie jest wystarczająca przy długotrwałych zabiegach (podwójna operacja kręgosłupa i mózgu wymaga prawdopodobnie >1 h stabilnej anestezji). - Znieczul szczeniaka, wstrzykując rozcieńczoną ketaminę (10 mg/mL) podskórnie między łopatki, tak aby zwierzę otrzymało dawkę 100 mg/kg ketaminy; odczekaj 5 min.
UWAGA: Na przykład w 5. dobie po urodzeniu szczenię szczura waży 10 g i otrzymuje 0,1 mL rozcieńczonego roztworu ketaminy (10 mg/mL). - Umieść szczeniaka na kruszonym lodzie na 6-8 min. Chroń zwierzę przed odmrożeniem, umieszczając je w lateksowej rękawiczce lub owijając parafilmem, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z lodem.
- Mocno uciśnij stopę kleszczykami, aby potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia. Jeśli wystąpi odruch cofania, pozostaw zwierzę na lodzie na dodatkowe 2 min przed kontynuowaniem procedury.
- Szeroko zastosuj środek antyseptyczny na obszar głowy i grzbietu zwierzęcia, używając sterylnej gazy nasączonej 5% roztworem jodu. Następnie wysterylizuj obszar gazą nasączoną 70% etanolem. Zastosuj chusteczki antyseptyczne trzykrotnie, naprzemiennie nasączając gazę jodem i etanolem.
UWAGA: Nie ma potrzeby pielęgnacji oczu, ponieważ młode szczeniaki otwierają oczy dopiero w 14. dniu życia. - Jeśli zwierzę ma przejść podwójny zabieg chirurgiczny (mózg + kręgosłup), podaj przed operacją bolus soli fizjologicznej (0,02 mL/g) podskórnie między łopatkami.
UWAGA: Jeśli zwierzę odzyska reaktywność w trakcie operacji i wymagane będzie dalsze znieczulenie, należy ponownie umieścić zwierzę na lodzie na 5 min.
3. Przygotowanie pola operacyjnego i instrumentarium
- Autoklawuj narzędzia chirurgiczne, w tym uchwyt do skalpela, kleszczyki kostne, kleszczyki hemostatyczne, zakrzywione pęsety średnie oraz haki
- Przygotuj mikroskop i zamontuj adapter stereotaktyczny dla szczurów noworodkowych, aby stabilnie osadzić go w uchwycie stereotaktycznym dla osobników dorosłych.
- Przeprowadź zabieg w sterylnych rękawiczkach. Otwórz opakowanie sterylnych rękawiczek chirurgicznych i rozłóż opakowanie na stole, wykorzystując je jako dodatkową powierzchnię do odkładania używanych narzędzi.
UWAGA: Należy przestrzegać zasad dobrej praktyki chirurgicznej i zachować sterylność przez cały czas trwania procedury. - Zamocuj ostrze nr 11 w uchwycie do skalpela. Przygotuj sterylną sól fizjologiczną, nici chirurgiczne z katgutu chromowanego 4.0, nici jedwabne 4.0 oraz materiały do tamowania krwawienia, np. sterylną gazę, sterylne aplikatory z bawełnianym końcem i tampony trójkątne.
- Przygotuj dwa pola operacyjne zgodnie z powyższym opisem: jedno przeznaczone do kraniotomii, a drugie do laminektomii szyjnej.
- Wyjmij zwierzę i zamocuj je w adapterze stereotaktycznym: ponieważ noworodki mają bardzo chrzęstną strukturę, mocuj je delikatnie, kierując pręty uszne szeroko w stronę stawów żuchwy. Po ustabilizowaniu poziomo, delikatnie wprowadź zgryz przedni.
UWAGA: Nieformalną zasadą pozwalającą uzyskać „płaski” obszar operacyjny jest mocowanie prętów usznych na tej samej wysokości, a zgryzu około 2-3 poziomy niżej.
4. Wykonanie kraniotomii i odsłonięcie kory somatomotorycznej
- Zlokalizuj miejsce nacięcia, naciskając pęsetą w linii środkowej na górnej części czaszki i wyczuwając szew strzałkowy. Wykonaj nacięcie o długości 1 cm wzdłuż płaszczyzny szwu strzałkowego, zaczynając bezpośrednio nad linią oczu. Naciągnij skórę, aby zapewnić czyste, proste i precyzyjne nacięcie.
- Zlokalizuj bregma (punkt zbiegu szwów wieńcowego i strzałkowego), delikatnie przesuwając pęsetą po powierzchni czaszki i zwracając szczególną uwagę na linie szwów oraz wszelkie wgłębienia powstające podczas przesuwania pęsety wzdłuż kości ciemieniowych i czołowej.
- Utrzymaj otwarcie, stosując haki obciążone po interesującej stronie. Należy pamiętać, że iniekcja rdzeniowa jest wykonywana po stronie prawej, a iniekcja czaszkowa po stronie lewej.
- Oczyść rozcięgno, używając patyczków bawełnianych i mikronożyczek, aby maksymalnie odsłonić bregma i zwiększyć dokładność. Upewnij się, że szew wieńcowy jest wyraźnie widoczny wystarczająco daleko bocznie, aby stanowił orientacyjny szablon dla kolejnych iniekcji.
- Za pomocą mikronożyczek wytnij fragment lewej kości czołowej o wymiarach około 3 x 2 mm, bezpośrednio przylegający do bregma.
UWAGA: Po ostrożnym usunięciu płata kostnego powinno powstać przejrzyste okno z odsłoniętą tkanką mózgową gotową do iniekcji. Pozostałe linie szwów po przeciwnej stronie mózgu będą służyć jako pomoc wizualna w utrzymaniu dokładności wzdłuż osi przednio-tylnej (AP). - Usuń wszelkie zanieczyszczenia, płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i krew za pomocą patyczków bawełnianych.
UWAGA: Krew lub płyn mózgowo-rdzeniowy mogą nieznacznie ograniczać widoczność, dlatego zaleca się regularne oczyszczanie obszaru patyczkami bawełnianymi.
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie współrzędnych wstrzyknięć do czaszki (mm) w stosunku do bregmy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
5. Załadunek wirusa i pozycjonowanie injektora
- Załaduj wirusa do iniektora, pipetując ~5 µL na kawałek parafilmu, a następnie ustaw igłę tak, aby jej końcówka spoczywała na kropli wirusa.
- Upewnij się, że do iniektora załadowano nadmiar wirusa, aby zapewnić płynny przebieg iniekcji. Na przykład, przy iniekcji łącznie 3 µL (1 µL na każde miejsce wstrzyknięcia), pobierz 4 µL wirusa z prędkością 250 nL/s za pomocą mikropompy.
- Usuń nadmiar wirusa za pomocą chusteczki laboratoryjnej.
- Ustaw mikromanipulator tak, aby skala noniusa była widoczna, a następnie umieść igłę nad szwem strzałkowym.
- Obniż igłę tuż nad obszar odpowiadający bregma (Rysunek 3) i zanotuj współrzędne AP oraz przyśrodkowo-boczne (ML).
- Ponieważ iniekcje będą wykonywane po lewej stronie, wyznacz współrzędne docelowe, odejmując 1, 1,5 i 2,0 mm (ML: -1,0, -1,5, -2,0) od współrzędnych ML dla bregma.
UWAGA: Pozycja AP dla wszystkich trzech iniekcji będzie wynosić +0,5 mm od bregma. - Przesuń igłę w pozycję dla pierwszej iniekcji. AP: +0,5, ML: -1,0
- Obniż igłę do odsłoniętego mózgu, aż zacznie ona uciskać zewnętrzną korę. Zanotuj wysokość igły, a następnie wprowadź ją w odpowiednią pozycję, odejmując 0,6 mm od wysokości powierzchni mózgu. Głębokość iniekcji: powierzchnia kory -0,6 mm.
UWAGA: Ważne jest odnotowanie głębokości powierzchni dla każdej iniekcji, ponieważ może dojść do niewielkich przesunięć w ułożeniu szczura.
6. Wstrzykiwanie wirusa do kory somatomotorycznej
- Po umieszczeniu igły zaprogramuj injektor tak, aby wstrzyknął 1 µL z szybkością 250 nL/min.
- Po zakończeniu wstrzykiwania pozostaw igłę w korze na 3 min.
- Powtórz wstrzykiwania dla pozostałych współrzędnych: łącznie wykonaj 3 wstrzyknięcia wzdłuż kory w odniesieniu do bregma, wszystkie na głębokości -0.6 mm: 1) AP: +0.5 mm, ML: -1.0 mm 2) AP: +0.5 mm, ML: -1.5 mm 3) AP: +0.5 mm, ML: -2.0 mm.
- Po zakończeniu wstrzykiwań przejdź do sekcji 9 w celu nałożenia szwów, a następnie przenieś zwierzę na drugi stół operacyjny w celu wykonania laminektomii szyjnej.
7. Wykonanie okna kręgowego do precyzyjnych iniekcji w rdzeń kręgowy
- Zidentyfikuj miejsce nacięcia, badając palcami podstawę czaszki. W linii środkowej wykonaj nacięcie 1-2 mm za podstawą czaszki za pomocą ostrza nr 11, a następnie przedłuż nacięcie o 1 cm w kierunku tylnym, aby odsłonić mięśnie powierzchowne. Naciągnij skórę kciukiem i palcem wskazującym, aby zapewnić czyste cięcie.
- Za pomocą ostrej końcówki ostrza delikatnie wykonaj serię cięć wzdłuż linii środkowej mięśnia powierzchownego, aby odsłonić jamę kręgową i głębokie mięśnie grzbietowe. Użyj pęsety do rozszerzenia mięśni i uwidocznienia okna chirurgicznego.
UWAGA: Mięsień powierzchowny ma kolor jasnoróżowy, natomiast głębokie mięśnie grzbietowe są jasnoszaro-białe. - Po odsłonięciu głębokich mięśni grzbietowych wprowadź rozieracze do okna chirurgicznego. W razie potrzeby użyj pęsety, aby chwycić boczny fragment skóry i mięśni i rozciągnąć je wokół zębów rozieraczy. Rozszerz okno chirurgiczne do szerokości 7-8 mm, aby uzyskać niezakłócony widok na kręgosłup.
- Zidentyfikuj drugi kręg szyjny (C2 lub obrót) po charakterystycznym wyrostku kolczastym skierowanym grzbietowo oraz otoczeniu przez 커duży, kopułowaty mięsień. Użyj pęsety lub tępym zgłębnikiem, aby zlokalizować i zidentyfikować ten wyrostek, który będzie służył jako punkt orientacyjny.
UWAGA: Sąsiedni kręg C3 jest często częściowo przesłonięty przez duży mięsień C2; dlatego delikatna dyssekcja mięśnia na poziomie C3 za pomocą pęsety lub skrobaka do kości pomaga w zdefiniowaniu kręgu i ułatwia liczenie poziomów kręgowych. - Używając płaskiej krawędzi skrobaka do kości, odsłoń kręgi C3-C7, delikatnie odsuwając głębokie mięśnie grzbietowe na boki. Zacznij od strony przyśrodkowej i skrob w kierunku bocznym, równolegle do łuków kręgowych, aby zapewnić właściłą ekspozycję, co pozwoli na wyraźne odróżnienie łuków kręgowych. Ewentualne krwawienie tamuj za pomocą patyczków bawełnianych.
- Za pomocą mikronożyczek ostrożnie przetnij boczne krawędzie chrzęstnych łuków kręgowych na poziomach C6 i C7. Jako punkt odniesienia przy liczeniu poziomów kręgowych przyjmij C2.
- Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie usuń wypreparowany fragment łuku, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Upewnij się, że okno kręgowe jest wystarczająco duże, aby pomieścić wybrany punkt wstrzyknięcia. Usuń wszelkie ostre lub poszarpane fragmenty kości, które mogłyby uszkodzić rdzeń kręgowy, używając mikronożyczek i pęsety zgodnie z powyższym opisem.
- Umieść zwierzę w stereotaksyjnym uchwycie czaszkowym zgodnie z opisem w sekcji 3.6. Dodatkowo pod tułów zwierzęcia włóż zwinięty kawałek gazy, aby unieść tylną część ciała.
UWAGA: Uniesienie tylnej części ciała zwierzęcia skutecznie odrywa klatkę piersiową od powierzchni uchwytu, co zapobiega wpływowi ruchów oddechowych na pozycję igły podczas wstrzykiwania. - Przed rozpoczęciem wstrzykiwania oczyść okno kręgowe z krwi lub płynu mózgowo-rdzeniowego, delikatnie przykładając patyczki bawełniane i trójkąty Sugi do tego obszaru, uważając, aby nie uszkodzić rdzenia kręgowego. Następnie stwórz barierę wokół obwodu okna, aby zapobiec zasłonięciu miejsca wstrzyknięcia przez ciągłe krwawienie lub wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego. W tym celu umieść mały kawałek wchłanialnej waty w bocznych częściach okna kręgowego.
8. Bezpośrednie wstrzyknięcia do rdzenia kręgowego celowane w zakończenia aksonalne
- Używając końcówki szklanej igły do iniekcji, wyznacz linię środkową rdzenia kręgowego, identyfikując tętnicę rdzeniową. Jeśli jednak tętnica rdzeniowa jest wyraźnie przesunięta względem centrum lub w jakikolwiek sposób odchylona, wyznacz linię środkową, opierając się na położeniu wyrostka kolczystego C2 i ekstrapolując tę pozycję wzdłuż kręgosłupa.
UWAGA: Instrukcje dotyczące ładowania wirusa znajdują się w sekcji 5.1. - Po zidentyfikowaniu, umieść igłę bezpośrednio za blaszką łukową C5 w przybliżonej linii środkowej i przyjmij ten punkt jako punkt odniesienia. Następnie, używając mikromanipulatora, przesuń igłę bocznie w prawo o 0.3 mm. Obniżaj igłę, aż dotknie powierzchni rdzenia kręgowego; z tej głębokości wprowadź igłę na 0.6 mm do wnętrza rdzenia kręgowego. W razie potrzeby kontynuuj wprowadzanie igły, aż przebije ona rdzeń kręgowy, a następnie wycofaj ją lub obniż do odpowiedniej głębokości.
- Wstrzyknij 1 µL retroAAV2-scCre z prędkością 250 nL/min. Po zakończeniu iniekcji odczekaj 2 min, aby wirus mógł rozprzestrzenić się w rdzeniu kręgowym, przed powolnym wycofaniem igły. Powtórz iniekcje, stosując te same współrzędne boczne i głębokość w dwóch kolejnych miejscach w obrębie okna rdzeniowego: jednym w punkcie środkowym i ostatnim bezpośrednio przed blaszką łukową T1.
9. Zamknięcie rany i opieka pooperacyjna
- Wyjmij zwierzę z uchwytu stereotaktycznego i usuń retraktory lub haki. Oczyść obszar rany kilkoma kroplami sterylnej soli fizjologicznej.
- Zszyj skórę głowy nicią jedwabną 4.0, wykonując łącznie dwa lub trzy szwy.
- Podczas zszywania otworu szyjnego użyj nici katgut chromowany 4.0, aby ściśle połączyć warstwy mięśniowe (powinny wystarczyć 2 szwy). Zszyj otwór w skórze szyi nicią jedwabną 4.0 (przewiduje się 4 szwy).
- Po zamknięciu ran ostrożnie nałóż płynny opatrunek na szwy.
- Umieść zwierzę pod lampą grzewczą i ściśle monitoruj je do pełnego wybudzenia. Gdy zwierzę będzie już rozbudzone, zacznie się poruszać i będzie suche, delikatnie oczyść rany sterylną gazą. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez nadzoru, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję grzbietową.
- Przenieś zwierzę do klatki macierzystej do matki. Zadbaj o to, aby zapobiec zaniedbaniu i kanibalizacji młodych przez matkę:
- W celu oswojenia matki przed operacją, badacze powinni delikatnie manipulować zwierzęciem (5-10 min) dwa razy dziennie, zaczynając tydzień przed zabiegiem.
- Zwróć młode do klatki macierzystej razem, aby ograniczyć stres matki.
- W dniu operacji wstrzyknij matce podskórnie acepromazynę w dawce 1.5 mg/kg co 12 h.
UWAGA: Leczenie przeciwbólowe służy podwójnemu celowi: zapewnieniu analgezji młodym oraz zachęceniu do szybszego powrotu do aktywności, co sprzyja reintegracji z matką. - Wstrzyknij buprenorfinę w dawce 0.05 mg/kg podskórnie co 8 h, zaczynając po operacji, przez łącznie 3 dni (dni pooperacyjne 0, 1, 2).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pomyślne wstrzyknięcie i transport wektora wirusowego powinno prowadzić do transdukcji jednostronnych neuronów w rdzeniu kręgowym oraz w korze ruchowej. Rysunek 4 przedstawia znakowanie neuronów CST warstwy V w korze ruchowej na przekroju wieńczastym mózgu, wykazujących ekspresję Cre-dependent-DREADDs-mCherry po jednoczesnym wstrzyknięciu rCre do przeciwległej strony rdzenia kręgowego. Przekroje zabarwiono przeciwciałem anty-dsRed.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Indukowalna genetyczna modulacja aktywności mózgu za pomocą wstrzykiwanych modyfikatorów chemogenetycznych jest potężnym narzędziem w badaniu różnych mechanizmów, które leżą u podstaw powrotu do zdrowia po SCI. Dokładność celowania w indukowalne receptory sprzężone z białkiem G (DREADD) jest jeszcze większa, jeśli weźmie się pod uwagę, że śledzenie fluorescencyjne potwierdza anatomiczną precyzję w histologii. W artykule omówiono wiarygodną metodę badania, czy hamowanie lub stymulowanie wybranych ścieżek neuronalnych (za ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana z grantu stypendialnego od Shriners Hospitals for Children SHC-84706.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| #11 ostrza skalpela | Roboz | RS-9801-11 | Do użytku ze skalpelem. |
| #10 Ostrza skalpela | Roboz | RS-9801-10 | Do użytku ze skalpelem. |
| Strzykawki 1 ml | Becton, Dickinson and Company | 309659 | Do znieczulenia wstrzyknięciem SC i bolusem płynnym |
| 4.0 jedwabny szew | Ethicon | 771-683G | Do zamykania skóry |
| 4.0 Chromowy szew katgutowy | DemeTECH | NN374-16 | Aby ponownie związać mięśnie podczas zamykania. |
| 48000 Beveler do mikropipet | World Precision Instruments | 32416 | Służy do ukosowania końcówek ciągniętych szklanych rurek kapilarnych w celu utworzenia funkcjonalnych szklanych igieł. |
| 5% roztwór jodu Purdue | Products L.P. | L01020-08 | Do stosowania w sterylizacji pola operacyjnego. |
| 70% Etanol | N/A | N/A | Do sterylizacji nowo przygotowanych igieł szklanych, modeli zwierzęcych podczas przygotowania chirurgicznego |
| Ketamina (Ketaset) | Zoetis | 240048 | Do utrzymywania zwierzęcia we właściwej płaszczyźnie świadomości podczas operacji. |
| Sterylizator koralików | CellPoint | 5-1450 | Do sterylizacji na gorąco narzędzi chirurgicznych. |
| Waga cyfrowa | Okaus | REV.005 | Do ważenia zwierzęcia podczas przygotowania chirurgicznego. |
| Elastyczna nasadka do igieł | World Precision Instruments | MF34G-5 | Do czyszczenia szklanych igieł i ładowania czerwonego oleju do szklanych igieł. |
| Szklane rurki kapilarne | World Precision Instruments | 4878 | Do ciągniętych szklanych igieł - powinny być przeznaczone do wtryskiwaczy nanolitrowych. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | Do ogólnego użytku w chirurgii. |
| Kleszczyki zakrzywione średniego punktu | Roboz | RS-5136 | Do ogólnego użytku w chirurgii. |
| Mikromanipulator ze skalą noniuszową | Kanetec | N/A | Do precyzyjnego celowania podczas operacji. |
| Mikronożyczki | Roboz | RS-5621 | Do wycinania szklanych szeptów ze świeżo wyciągniętych szklanych rurek kapilarnych. |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51600 | Do trzymania uchwytu sterotaktycznego noworodka na miejscu |
| Lab Standard z myszą i Adapter dla noworodków | 51615 | Do mocowania czaszki noworodka podczas operacji czaszki i zastrzyków rdzeniowych Mikroskop | |
| ze skalą światła i noniusza Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Służy do wizualizacji i pomiaru ukosowania ciągniętych szklanych rurek kapilarnych w funkcjonalne szklane igły. |
| Sterownik pompy mikrostrzykawkowej | World Precision Instruments | 62403 | Do kontrolowania szybkości wtrysku. |
| Nanolitr 2000 Pompa Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | Do ładowania i wstrzykiwania wirusa w kontrolowany sposób. |
| Ściągacz igieł | Narishige | PC-100 | Do podgrzewania i rozsuwania szklanych kapilar w celu uformowania szklanych igieł. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu lab | Plazmid Cre | |
| pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plazmid #44361) | Bryan Roth' s laboratorium za pośrednictwem | plazmidu | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Aby pomóc w ładowaniu wirusa do nanowtryskiwacza. |
| Igły PrecisionGlide (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Do stosowania ze strzykawkami 1 ml i 10 ml, aby umożliwić wstrzyknięcie modelu zwierzęcego. |
| Kleszczyki do zębów szczurów | Roboz | RS-5152 | Do chwytania wyrostków kolczystych. |
| Red Oil | N/A | N/A | Aby zapewnić front do wizualizacji wirusa wnikającego do tkanki podczas wstrzyknięcia. |
| Retraktory | Roboz | RS-6510 | Do utrzymywania otwartej rany pooperacyjnej. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Do usuwania mięśni z kręgosłupa podczas operacji. |
| Rękojeść ostrza skalpela | Roboz | RS-9843 | Do rozcinania skóry i poduszeczki tłuszczowej modelu zwierzęcego podczas operacji. |
| Nożyczki | Roboz | RS-5980 | Do ogólnego użytku w chirurgii. |
| Kleszcze do usuwania zszywek | Kent Scientific INS750347 | Aby usunąć zszywki, jeśli zostały nałożone nieprawidłowo. | |
| Sterylna tkanina | Phenix Research Products | BP-989 | Aby zapewnić sterylną powierzchnię do operacji. |
| Sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką | Puritan | 806-WC | Do wchłaniania krwi w ranie pooperacyjnej przy jednoczesnym zachowaniu sterylności. |
| Sterylna gaza | Covidien | 2146 | Do czyszczenia obszaru operacyjnego i narzędzi chirurgicznych przy zachowaniu sterylności. |
| Sterylna sól fizjologiczna | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | Do stosowania w oczyszczaniu krwi i do uzupełniania płynów po operacji. |
| Rękawice chirurgiczne | N/A | N/A | Do użytku przez chirurga w celu utrzymania sterylnego pola podczas operacji. |
| Chirurgiczna poduszka grzewcza | N/A | N/A | Do utrzymywania temperatury ciała modelu zwierzęcego podczas operacji. |
| Mikroskop chirurgiczny | N/A | N/A | Dla lepszej wizualizacji rany pooperacyjnej. |
| Zszywacz chirurgiczny | Kent Scientific | INS750546 | Do nakładania zszywek. |
| Podkładka do podgrzewania konwekcji wodnej | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | Do stosowania w obszarze rekonwalescencji pooperacyjnej w celu utrzymania temperatury ciała nieprzytomnego zwierzęcia. |
| Haki obciążeniowe | N/A | N/A | Do utrzymywania otwartej rany pooperacyjnej. |
| Bandaż w płynie | NewSkin | 985838 | Do stosowania wzdłuż szwów po operacji i wspomagania gojenia się ran |
| Lampa druciana | klatkowa ZooMed | LF10EC | Aby pomóc zwierzętom odzyskać siły po znieczuleniu i naturalnie utrzymać ciepłą temperaturę ciała |
Bibliografia
- Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature. Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
- Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000. Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).
- Bregman, B. S., Goldberger, M. E. Anatomical plasticity and sparing of function after spinal cord damage in neonatal cats. Science. 217 (4559), 553-555 (1982).
- Castro, A. J. Ipsilateral corticospinal projections after large lesions of the cerebral hemisphere in neonatal rats. Experimental Neurology. 46 (1), 1-8 (1975).
- Commissiong, J. W., Toffano, G. Complete spinal cord transection at different postnatal ages: Recovery of motor coordination correlated with spinal cord catecholamines. Experimental Brain Research. 78 (3), 597-603 (1989).
- Yuan, Q., Su, H., Chiu, K., Wu, W., Lin, Z. Contrasting neuropathology and functional recovery after spinal cord injury in developing and adult rats. Neuroscience Bulletin. 29 (4), 509-516 (2013).
- Kim, J., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualizing and manipulating neuronal circuits in vivo. The European Journal of Neuroscience. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Atasoy, D., Sternson, S. M. Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology. Physiological Reviews. 98 (1), 391-418 (2018).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Reiner, A., et al. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Oguchi, M., et al. Double virus vector infection to the prefrontal network of the macaque brain. PloS One. 10 (7), 0132825(2015).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Bernstein, D. R., Stelzner, D. J. Plasticity of the corticospinal tract following midthoracic spinal injury in the postnatal rat. The Journal of Comparative Neurology. 221 (4), 382-400 (1983).
- Brown, K., Wolfe, B., Wrathall, J. Rapid functional recovery after spinal cord injury in young rats. Journal of Neurotrauma. 22, 559-574 (2005).
- Tillakaratne, N. J. K., et al. Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site. Neuroscience. 166 (1), 23-33 (2010).
- Kartje-Tillotson, G., Neafsey, E. J., Castro, A. J. Electrophysiological analysis of motor cortical plasticity after cortical lesions in newborn rats. Brain Research. 332 (1), 103-111 (1985).
- Gennaro, M., et al. Focal stroke in the developing rat motor cortex induces age- and experience-dependent maladaptive plasticity of corticospinal system. Frontiers in Neural Circuits. 11, 47(2017).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Paxinos, G. 2, Academic Press. New York. 294-309 (1985).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: From pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Takeoka, A., Arber, S. Functional local proprioceptive feedback circuits initiate and maintain locomotor recovery after spinal cord injury. Cell Reports. 27 (1), 71-85 (2019).
- Flynn, J. R., Graham, B. A., Galea, M. P., Callister, R. J. The role of propriospinal interneurons in recovery from spinal cord injury. Neuropharmacology. 60 (5), 809-822 (2011).
- Ohne, H., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration in rats with cervical spinal cord hemisection-neuroanatomical validation. IBRO Reports. 7, 10-25 (2019).
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Sheikh, I. S., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60(2018).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487, 235-238 (2012).
- Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59160(2019).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yáñez-Muñoz, R. J., Moon, L. D. F. Corticospinal tract transduction: A comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Therapy. 19 (1), 49-60 (2012).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. Plos One. 9 (2), 87447(2014).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: Comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2006).
- Zingg, B., Peng, B., Huang, J., Tao, H. W., Zhang, L. I. Synaptic specificity and application of anterograde transsynaptic AAV for probing neural circuitry. The Journal of Neuroscience. 40 (16), 3250-3267 (2020).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Hasegawa, A., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration after cervical spinal cord hemisection in rats: A comparison of juveniles and adults. Behavioural Neurology. 2016, 1035473(2016).
- Alstermark, B., Isa, T. Circuits for skilled reaching and grasping. Annual Review of Neuroscience. 35, 559-578 (2012).
- García-Alías, G., Truong, K., Shah, P. K., Roy, R. R., Edgerton, V. R. Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries. Experimental Neurology. 266, 112-119 (2015).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Z'Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion. Journal of Neuroscience. 20 (17), 6561-6569 (2000).
- Ueno, M., et al. Corticospinal circuits from the sensory and motor cortices differentially regulate skilled movements through distinct spinal interneurons. Cell Reports. 23 (5), 1286-1300 (2018).
- Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863(2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
