Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62700

⸱

20 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, 2DZHK (German Center for Cardiovascular Research) partner site, Goettingen, 3Cluster of Excellence “Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells” (MBExC), University of Goettingen, 4Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Fraunhofer Institute for Translational Medicine and Pharmacology (ITMP)

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Streszczenie

Fibroblasty to fenotypowo dynamiczne komórki, które szybko różnicują się w miofibroblasty w odpowiedzi na bodźce biochemiczne i biomechaniczne. Obecna wiedza na temat procesów zwłóknieniowych, w tym zwłóknienia serca, pozostaje słaba, co utrudnia rozwój nowych terapii przeciwfibrotycznych. Kontrolowane i niezawodne systemy modelowania człowieka mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia patologii zwłóknienia. Jest to wysoce powtarzalny i skalowalny protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych (ECT) w 48-dołkowej płytce odlewniczej, aby ułatwić badania fibroblastów i patofizjologii tkanki zwłóknieniowej w środowisku trójwymiarowym (3D). Elektrowstrząsy są generowane wokół biegunów ze sztywnością przestrajaną, co pozwala na badania pod określonym obciążeniem biomechanicznym. W określonych warunkach obciążenia można badać adaptacje fenotypowe kontrolowane przez interakcje komórka-macierz. Równoległe testowanie jest możliwe w formacie 48-dołkowym z możliwością analizy przebiegu w czasie wielu parametrów, takich jak zagęszczenie tkanek i kurczenie się w stosunku do obciążenia. Na podstawie tych parametrów można badać właściwości biomechaniczne, takie jak sztywność i elastyczność tkanki.

Wprowadzenie

Główną przeszkodą w badaniu chorób zwłóknieniowych jest brak reprezentatywnych modeli 3D tkanek ludzkich, które dostarczają wglądu w zachowanie fibroblastów i ich patologicznych pochodnych. Aby badać procesy zwłóknieniowe, standardowe systemy hodowli 2D są nieoptymalne, ponieważ izolowane fibroblasty szybko różnicują się w miofibroblasty wykazujące ekspresję aktyny α mięśni gładkich (SMA), gdy są hodowane na niezgodnych substratach 2D1,2,3. Tak więc fibroblasty w standardowej hodowli 2D nie odzwierciedlają regularnego "zdrowego" fenotypu tkanki3,4,5,6. Hodowle na giętkich podłożach zostały wprowadzone w celu symulacji środowisk tkanek niezwłóknistych (10 kPa) i zwłóknieniowych (35 kPa)7, ale brakuje im trzeciego wymiaru, który jest bardzo ważny w odniesieniu do patofizjologii. Inżynieria tkankowa daje możliwość przezwyciężenia tego ograniczenia, umożliwiając hodowlę fibroblastów w zdefiniowanym i eksperymentalnie przestrajalnym kontekście macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), na przykład poprzez zmiany w komórkowości, składzie ECM i stężeniu ECM, z których wszystkie mogą determinować biomechanikę tkanki.

Różne modele 3D zostały wygenerowane przy użyciu fibroblastów. Pływające dyski i mikrosfery były jednymi z pierwszych i pokazują, że kolagen jest przebudowywany i zagęszczany w sposób zależny od czasu. Fibroblasty wywierają siły trakcyjne na włókienka kolagenowe, proces ten można ułatwić poprzez dodanie czynników pro-fibrotycznych, takich jak transformujący czynnik wzrostu-beta 1 (TGF-β1)8,9,10,11,12,13,14,15,16. Jednak swobodnie pływające kultury nie pozwalają na kontrolowane obciążenie zewnętrzne i dlatego stanowią modele stale kurczące się lub zagęszczające. Tkanki inżynieryjne przypominające arkusze otworzyły możliwość badania homeostatycznej regulacji właściwości biomechanicznych tkanek, a mianowicie poprzez jedno-, dwu-, wieloosiowe lub cykliczne testowanie szczepów17,18,19,20. Modele te zostały wykorzystane m.in. do wykazania wpływu liczby komórek na sztywność tkanki, która okazała się pozytywnie korelować z integralnością cytoszkieletu i kurczliwością cytoszkieletu aktomiozyny18,19. Należy jednak pamiętać, że konwersja siły na odkształcenie jest skomplikowana przez nierównomierne odkształcenie tkanki wokół punktów zacisku przetworników siły i punktów kotwiczenia. To nieodłączne ograniczenie można ominąć za pomocą tkanek w kształcie psiej kości lub pierścienia, oferując pewne wzmocnienie tkanek w punktach kotwiczenia21,22,23. Tkanki w kształcie pierścienia można przygotować, rozprowadzając hydrożel kolagenu komórkowego w foremkach w kształcie pierścienia. Gdy hydrożel zagęszcza się, wokół nieściśliwego wewnętrznego pręta formy tworzy się tkanka, która zapewnia opór dla dalszego kurczenia się tkanki24,25,26,27. Po początkowym i zazwyczaj maksymalnym zagęszczeniu, tkanki mogą być również przenoszone do regulowanych przekładek, aby jeszcze bardziej ograniczyć okrężny ECT na określonej długości tkanki3,24,25,26,27,28,29,30. Właściwości biofizyczne można oceniać w standardowych poziomych lub pionowych urządzeniach do odkształcania i naprężeń z odpowiednimi czujnikami wagowymi w ramach jednokierunkowego lub dynamicznego odkształcenia3. Ponieważ tkanki mają w dużej mierze jednolitą strukturę kołową i mogą być utrzymywane na prętach/hakach (punktach kotwiczenia i/lub przetwornikach siły), chociaż mogą one nadal otaczać obszary kompresji wokół prętów obciążających, ten format pozwala na bardziej jednolitą zmienność odkształcenia w porównaniu do zaciskania3. Co więcej, zakotwiczone tkanki wywołują dwubiegunowy kształt komórki, a komórki dostosowują się do sił tkankowych poprzez wydłużanie wzdłuż linii sił sprzyjających trakcji anizotropowej31,32,33,34,35,36. Wcześniej zastosowaliśmy elektrowstrząsy w kształcie pierścienia z fibroblastów serca (CF) szczurów i ludzi wokół pojedynczego sztywnego bieguna w eksperymentach funkcjonalnych ze szczepem stresu i przeprowadziliśmy badania nad zyskiem i utratą funkcji przy użyciu fibroblastów transdukowanych wirusem24,25,26 i badania farmakologiczne37. Co więcej, udało nam się zidentyfikować różnice płci w zwłóknieniu wywołanym przez mukowiscydozę w modelu ECT27.

Poniższy protokół generowania ludzkiego ECT, zilustrowany pierwotnym ludzkim CF uzyskanym jako kriokonserwowany CF od komercyjnych dostawców (zobacz Tabelę Materiałów), łączy zalety tkanek w kształcie pierścienia z łatwym i szybkim sposobem wytwarzania makroskopowych tkanek dla 48-dołkowej platformy przeznaczonej do równoległych testów o wysokiej zawartości.

Co ważne, model ECT nie jest ograniczony do konkretnego typu fibroblastów, z udokumentowanym zastosowaniem w badaniu innych fibroblastów, np. fibroblastów skóry38,39. Co więcej, fibroblasty z biopsji pacjenta działają równie dobrze, a wybór fibroblastów ostatecznie zależy od pytania naukowego, którym należy się zająć.

Platforma używana do generowania ECT opisana w tym protokole to dostępna na rynku 48-dołkowa płytka do hodowli komórek/tkanek 3D (Rysunek 1A). Opisano metody przygotowania, hodowli i monitorowania powstawania i funkcjonowania ECT przy określonej geometrii i obciążeniu mechanicznym za pomocą płytki 48-dołkowej. Uformowane ECT są utrzymywane przez zintegrowane elastyczne tyczki, a obciążenie mechaniczne można precyzyjnie dostroić zgodnie z ostatecznym przeznaczeniem za pomocą tyczek o różnej twardości (wartość Shore A 36-89), co wpływa na ich sztywność zginania. Zalecane są słupy o wartości A w skali Shore'a 46. Protokół jest ponadto kompatybilny z wcześniej opisaną niestandardową okrągłą formą, w której ECT jest utrzymywany wokół pojedynczego sztywnego pręta37. Wymiary tej formy podane są w Rysunek 1B.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie form odlewniczych. (A) Rysunek techniczny i wymiary formy odlewniczej z dwoma elastycznymi biegunami. Forma składa się z wewnętrznego obwodu ograniczonego krótką ścianką, na której znajdują się podwójne słupki mocujące przy głównym korpusie formy. Elastyczne słupy mają swobodną odległość poziomą od siebie i są połączone u podstawy. Forma pozwala na uzyskanie objętości odlewu 180 μL. Studzienka każdej formy pozwala na objętość co najmniej 600 μl pożywki hodowlanej. Do produkcji słupów o określonej sztywności można stosować różne składy materiałowe (np. TM5MED-TM9MED). (B) Rysunek techniczny i wymiary pierścieniowej formy z pojedynczym sztywnym prętem. Jest to alternatywna forma o odrębnej geometrii i środowisku mechanicznym, która może być używana z protokołem odlewania ECT37. Metoda montażu formy w kształcie pierścienia została zaadaptowana z opublikowanych większych formatów28,41. Krótko mówiąc, metoda obejmuje (1) odciśnięcie przekładek formujących z politetrafluoroetylenu (PTFE) (średnica 8 mm) w polidimetylosiloksanie (PDMS, silikon) wlanych do szklanych naczyń (średnica 60 mm) oraz (2) zamocowanie uchwytu tyczki PDMS (średnica 1,5 mm) koncentrycznie wewnątrz uformowanej pustej wnęki, która służy do (3) przytrzymania zdejmowanego drążka (rurka silikonowa o średnicy 4 mm). Powstała pusta przestrzeń pozwala na uzyskanie 180 μl objętości odlewu. Każde szklane naczynie może pomieścić wiele drukowanych form (przykładowo pokazanych z 5 formami) i ma pojemność do 5 ml pożywki hodowlanej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie kroki muszą być wykonane w kapturach bezpieczeństwa biologicznego klasy II zainstalowanych w laboratoriach pod poziomem hermetyczności 1. W zależności od lokalnych przepisów i rodzaju manipulacji, które mają być wykonane, takich jak transfer genów za pośrednictwem wirusa, poziom hermetyczności musi zostać zwiększony do poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 lub 3. Wszystkie kultury utrzymuje się w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych z nawilżoną atmosferą o stężeniu 5 % CO2 w powietrzu. Należy zauważyć, że objętości (kroki 1 i 2) są przeznaczone dla kolby do hodowli komórkowych T75. Dostosuj objętości do różnych formatów hodowli zgodnie ze standardowymi zaleceniami dotyczącymi hodowli komórkowych.

1. Rozmrażanie i wstępne powlekanie pierwotnego fibroblastu serca (CF) do hodowli jednowarstwowej (5-12 dni)

UWAGA: Jako alternatywa, komórki HFF-1 mogą być używane zgodnie ze standardowym protokołem subhodowli, zgodnie z zaleceniami dostawcy.

  1. Przygotuj pożywkę wzrostową fibroblastów (FGM) zgodnie z instrukcjami producenta. Opcjonalnie dodaj antybiotyki, takie jak 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Pozostawić do całkowitego wymieszania wszystkich składników przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 14 dni.
  2. Podgrzej FGM do 20-25 °C.
  3. Rozmrażać kriokonserwowany CF (najlepiej zawierający 1 x 106 do 2 x 106/ml komórek na kriowial) w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez około 2 minuty, aż w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu.
  4. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml przenieś zawiesinę komórek kroplami do odpowiedniej sterylnej probówki wirówkowej zawierającej 10 ml FGM. Aby uzyskać optymalne pobranie komórek, przepłucz kriowial 1 ml FGM i przenieś go do probówki wirówkowej. Ponieważ na tym etapie komórki są bardzo wrażliwe, należy je ponownie zawiesić za pomocą pipety serologicznej z końcówką z otworem, aby zminimalizować uszkodzenia komórek przez naprężenia ścinające.
    UWAGA: Jeśli podłoże do krioprezerwacji zawiera wysoki procent DMSO, upewnij się, że po ponownym zawieszeniu komórek w FGM zawartość DMSO jest mniejsza niż 1 %. Alternatywnie, odwirować zawieszone komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 20-25 °C w celu wymiany pożywki. Następnie ostrożnie odessać supernatant, zakręcić rurką, aby usunąć granulowane komórki i ponownie zawiesić je w żądanej objętości FGM do wysiewu.
  5. Zasiać 0,5 x 106 komórek w 12 ml FGM do kolby do hodowli komórek T75. Jeśli używany jest inny sprzęt laboratoryjny, dostosuj liczbę komórek, aby utrzymać gęstość wysiewu 6,7 x 103/cm2.
  6. Wymieniaj FGM co drugi dzień przez 5 dni lub do momentu, gdy komórki osiągną 80% konfluencji.
    UWAGA: Wydajność komórek po ekspansji zależy głównie od wielkości komórki i szybkości proliferacji, które mogą się różnić w zależności od dawcy komórek. Zazwyczaj ta standardowa procedura hodowli pozwala na pobranie 4 x 106 do 5 x 106 CF z kolby do hodowli komórkowej T75 po 5 dniach hodowli.

2. Enzymatyczna dyspersja ludzkiego mukowiscydozy (10-20 min)

UWAGA: Ten krok ma na celu stworzenie jednokomórkowego zawiesiny ludzkiej mukowiscydozy zarówno dla podhodowli komórek jednowarstwowych, jak i przygotowania ECT. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem ludzkich kultur jednowarstwowych mukowiscydozy w przejściach 3-4. W celu optymalnej standaryzacji zaleca się podhodowlę mukowiscydozy w jednej warstwie, co najmniej raz przed przygotowaniem ECT. Protokół ten musi być zoptymalizowany pod kątem fibroblastów pochodzących od różnych dawców i dostawców. Alternatywne protokoły odłączania mogą polegać na zastąpieniu rekombinowanych odczynników dysocjacyjnych opartych na proteazie serynowej np. tymi zawierającymi enzymy proteolityczne i kolagenolityczne.

  1. Ciepłe FGM, PBS (wolne od Ca2 + / Mg2 +) i odczynnik do dysocjacji komórek do 20-25 °C.
  2. Odessać pożywkę z hodowanych komórek.
  3. Umyj komórki 6 ml PBS i aspiratu.
  4. Dodać 6 ml odczynnika do dysocjacji komórek do komórek i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 20-25 °C, aż komórki zaczną się widocznie odłączać.
    UWAGA: W zależności od źródła CF może to potrwać kilka minut dłużej. Alternatywnie, jeśli komórki nie odłączają się w temperaturze pokojowej, należy je inkubować w temperaturze 37 °C, aby poprawić aktywność enzymów. Aby zapewnić optymalną żywotność komórek, monitoruj ich odklejanie pod mikroskopem.
  5. Zneutralizuj aktywność enzymatyczną, dodając 6-12 ml FGM do usuniętych komórek w odczynniku dysocjacji komórek. Delikatnie pipetować w górę i w dół 4-8 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, aby zapewnić zawieszenie pojedynczej komórki i przenieść je do świeżej probówki zbiorczej o pojemności 50 ml. Sprawdź wydajność za pomocą mikroskopu i hemocytometru lub automatycznego licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 20-25 °C.
    UWAGA: Aby osiągnąć wydajność komórek wystarczającą do wytworzenia pożądanej ilości ECT, komórki mogą być hodowane w rozcieńczeniu do 1:6 w celu dalszej ekspansji. Pozwól komórkom rosnąć aż do osiągnięcia 80% zbiegu (około 5-6 dni), zmieniając pożywkę co drugi dzień. Następnie powtórzyć dyspersję enzymatyczną i przejść do kroku 2.7. , aby kontynuować przygotowanie do EW.
  7. Zassać supernatant i przesunąć probówkę, aby usunąć osad. Ponownie zawiesić komórki w FGM w temperaturze 20-25 °C, aby uzyskać zawiesinę komórek ≥ 15 x 106/ml (około 40 % więcej komórek niż jest to wymagane dla kroku 3.3.). Odpowiada to za utratę komórek spowodowaną naprężeniem w następnym kroku.
  8. Przecedzić zawiesinę komórkową przez siatkowy sitko o wielkości 40 μm.
    UWAGA: Aglomeraty komórkowe są szkodliwe dla optymalnego tworzenia ECT. W przypadku stosowania dyspersji enzymatycznej protokołu ludzkiej mukowiscydozy do bezpośredniego odlewania ECT, naprężanie zawiesiny komórkowej zapewnia brak głównych grudek komórkowych, które zakłócają tworzenie jednorodnych tkanek. Niejednorodność zagrozi wiarygodności analiz naprężeniowo-odkształceniowych.
  9. Ponownie przeliczyć liczbę komórek i ocenić ich żywotność, aby zapewnić wiarygodną liczbę komórek w zawiesinie o ≥80 % żywotności, aby można było przystąpić do przygotowania elektrowstrząsów.
    1. Użyj automatycznego licznika komórek, aby ocenić liczbę komórek i żywotność na podstawie wykluczenia prądu elektrycznego.
    2. Alternatywnie, należy zastosować test wykluczenia barwnika z użyciem błękitu trypanowego (czynnik rakotwórczy, kategoria zagrożenia 2 – należy podjąć środki ostrożności) za pomocą mikroskopu i hemocytometru do bezpośredniej identyfikacji i liczenia żywych (nienaruszone błony komórkowe, które wykluczają barwnik) i martwych (uszkodzone błony komórkowe, które umożliwiają wiązanie barwnika z białkami wewnątrzkomórkowymi) komórek.
  10. Zarezerwować probówkę z zawiesiną komórek w temperaturze 20-25 °C i natychmiast przejść do kroku 3.

3. Przygotowanie do ECT (1 h)

UWAGA: Schematyczny przegląd generacji ECT jest opisany w Rysunek 2.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schematyczny przegląd generacji ECT. Fibroblasty są namnażane w hodowli 2D przed użyciem w generowaniu ECT. Po 5-10 dniach komórki są dyspersjonowane enzymatycznie, a zawiesina komórkowa jest odtwarzana w buforowanej mieszaninie zawierającej kolagen bydlęcy typu 1. Mieszanina hydrożelu komórkowego i kolagenu jest pipetowana do indywidualnych studzienek na 48-dołkowej płytce w celu hodowli tkanek inżynierii 3D, zaprojektowanej jako formy odlewnicze z dwoma elastycznymi biegunami, aby umożliwić zawieszenie ECT na określonej długości i obciążeniu. ECT są zwykle hodowane przez 1 do 20 dni przed pomiarami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przygotować 10-krotny roztwór podstawowy DMEM, rozpuszczając proszek DMEM w ddH2O (134 mg/ml dla preparatu określonego w Tabeli Materiałów) pod stałą rotacją w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Sterylizować przez filtrację. Stado jest stabilne do 14 dni w temperaturze 4 °C lub -20 °C przez okres do 12 miesięcy.
  2. Świeżo przygotować 2x DMEM, rozcieńczając 10x roztwór podstawowy DMEM i dodając 20% (v/v) FCS w sterylnym ddH2O. Opcjonalnie należy użyć antybiotyków, takich jak 200 U/ml penicyliny i 200 mg/ml streptomycyny. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z objętościami pipetowania. Stado jest stabilne do 14 dni w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Wykonaj kroki 3.1. oraz 3.2. przed rozpoczęciem enzymatycznego dyspersji komórek (etap 2.) w celu przygotowania ECT.
pkt. pkt.
OdczynnikStężenie końcoweObjętość (ml)
10× DMEMN/acyfra arabska
Fcs20 % (v/v)cyfra arabska
penicylina200 U/ml0,2
Streptomycyny200 mg/ml0,2
ddH2ON/a5,6
łącznyN/a10

Tabela 1: Skład 2x DMEM.

UWAGA: Wszystkie składniki mieszaniny hydrożelu komórkowego i kolagenu oraz probówek wirówkowych muszą być przechowywane na lodzie przed użyciem. Pomoże to zapobiec samoorganizacji kolagenu przed rozprowadzeniem mieszaniny hydrożelu komórkowo-kolagenowego w formach odlewniczych.

  1. Na podstawie Tabeli 2 dostosuj zawiesinę komórek do gęstości 8,88 x 106 komórek/ml, dodając FGM w temperaturze 20-25 °C do zawiesiny komórek z kroku 2.10. Następnie przesunąć probówkę zbiorczą z zawiesiną komórek do lodu.
  2. Aby przygotować mieszaninę hydrożelu ECT, należy wstępnie schłodzić probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na lodzie i dodać do niej różne składniki wymienione w tabeli 2 w następującej kolejności, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Maksymalna liczba ECT, którą należy przygotować, zależy od całkowitej liczby komórek określonej w kroku 2.9. Użyj 0,3 mg kolagenu na ECT, uzyskanego z roztworu podstawowego zawierającego 6-7 mg/ml. Stężenie roztworu podstawowego kolagenu określa objętość potrzebną do uzyskania optymalnej zawartości kolagenu ECT. Objętości pozostałych składników hydrożelu ECT muszą być odpowiednio dostosowane. Patrz Tabela 2 w celu zapoznania się z dostosowanymi objętościami w zależności od podstawowego roztworu kolagenu 6,49 mg/ml. Tomy opisane w tabeli 2 są używane w niniejszym protokole jako przykładowe wytyczne.
    1. Odpipetować hydrożel z rozpuszczalnym w kwasach kolagenem typu 1 za pomocą pipety serologicznej z końcówką o szerokim otworze.
    2. Dostosuj zawartość soli w roztworze kolagenu, dodając 2x DMEM, delikatnie mieszając, obracając probówkę.
    3. Zneutralizować pH, dodając 0,2 M NaOH, delikatnie mieszając, obracając probówkę. Wskaźnik czerwieni fenolowej zmieni kolor z żółtego na czerwony.
      UWAGA: Objętość NaOH należy miareczkować dla każdej pojedynczej partii kolagenu w celu optymalnej neutralizacji pH. Neutralizacja zależy od takich czynników, jak rodzaj i przygotowanie buforu, a także bezwzględne stężenie kolagenu i wpływa na tworzenie macierzy kolagenowej i żywotność komórek23,40. Gdy zawartość jonów zostanie zwiększona przez dodanie DMEM, a pH zostanie zneutralizowane, następuje samoorganizacja kolagenu i nie może zostać zakłócona. Dlatego wykonuj następujące czynności szybko i bez przerw.
    4. Dodawać zawiesinę komórkową (z kroku 3.3) kroplami, delikatnie mieszając, obracając probówkę.
pkt. TGL TGL pkt. TGL TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. TGL
Numer ECT:1624Rozdział 48
w tym 10 % nadwyżki
Składniki hydrożelu kolagenu komórkowego:(μl)(μl)(μl)(μl)
Zapas kolagenu (6,49 mg/ml)46,2305.11220,22440.4
2× DMEM46,2305.11220,22440.4
0.2 M NaOH3.120,581,8163,7
Mieszanka komórek w FGM (8.88×106 komórek/ml)84,5557,42229.74459,5 pkt.
Całkowita objętość (μL)180,0 pkt.1188,04752.09504.0
To jest przykładowa tabela do przygotowania objętości odlewu 180 μL na ECT, zawierającej łącznie 750 000 komórek i 0,3 mg kolagenu na ECT.

Tabela 2: Przygotowanie hydrożelu ECT (w tym 10% nadwyżki uwzględniającej błędy pipetowania).

  1. Wymieszać całą zawiesinę, delikatnie pipetując w górę i w dół tylko raz, używając pipety serologicznej z końcówką o szerokim otworze, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i zminimalizować naprężenia ścinające. Zapewnić kompletną mieszaninę, delikatnie obracając probówkę 10 razy i trzymać probówkę wirówkową o pojemności 50 ml zawierającą mieszaninę hydrożelu ECT na lodzie przez cały proces odlewania.
  2. Wstępnie zwilż końcówkę pipety o pojemności 1 ml mieszaniną hydrożelu ECT i równomiernie rozprowadź 180 μl w każdej formie 48-dołkowej płytki odlewniczej, unikając nadmiernych sił ścinających, które mogą wpływać na integralność zespołu matrycy kolagenowej i zapewniając, że cała płytka jest gotowa w ciągu 15-20 minut.
    UWAGA: Zalecana objętość odlewu to 180 μL, ale można ją zwiększyć do 200 μL38. W związku z tym, jeśli jest to preferowane, objętości w tabeli 2 można dostosować do 200 μl w sposób, który zachowuje te same stężenia i stosunek między komórkami a kolagenem.
    1. Upewnij się, że w formie uformowana jest pełna pętla (Rysunek 3A). Jeśli mieszanina hydrożelu ECT jest stosowana w sposób nieciągły, uniemożliwi to pełne utworzenie pierścienia ECT (Rysunek 3B).
    2. Należy unikać pipetowania do studzienki wewnętrznej (Rysunek 3C) oraz tworzenia się pęcherzyków podczas pipetowania (Rysunek 3D), aby zapewnić jednorodne i funkcjonalne tworzenie tkanki.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Odlewanie, tworzenie hydrożelu i kondensacja ECT w formacie wielodołkowym. Górne panele ilustrują wygląd ECT bezpośrednio po odlewaniu. Środkowe panele ilustrują pojawienie się elektrowstrząsów po inkubacji przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Dolne panele ilustrują stan zagęszczenia ECT 24 h po przygotowaniu, usuniętym z słupów. (A) Prawidłowe tworzenie ECT między dwoma biegunami w ciągu pierwszych 24 godzin. (B-D) Przykłady błędów pipetowania, które uniemożliwiają prawidłowe tworzenie ECT. Białe i czarne strzałki wskazują na wady konstrukcyjne ECT spowodowane niewłaściwym odlewem. Podziałka: 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Ostrożnie umieścić 48-dołkową płytkę odlewniczą w inkubatorze do hodowli komórkowych i pozostawić mieszaninę hydrożelu ECT na rozpuszczenie przez 15-30 minut. Po inkubacji będzie wyglądał jak żel i będzie nieprzezroczysty (Rysunek 3, środkowy panel).
  2. Dodać 600 μl ciepłego FGM w temperaturze 37 °C do dołka, bez pipetowania pożywki hodowlanej bezpośrednio na tworzący ECT, ponieważ może to spowodować rozerwanie tkanek. Delikatnie dodaj pożywkę hodowlaną wzdłuż ścianki studzienki, ponieważ w tym momencie ECT również nie może być odłączony od dna (Rysunek 4).

figure-protocol-3
Rysunek 4: Prawidłowe i niewłaściwe dodanie pożywki hodowlanej do świeżo odlanego ECT. (A) Podczas dodawania pożywki hodowlanej po wstępnym zestaleniu ECT (20 minut po wylaniu), kondensacyjny ECT musi pozostać nienaruszony na dnie studzienki. W ciągu najbliższych 24 godzin, zagęszczenie matrycy sterowane komórkami sprawi, że ECT zsunie się po rampie. Końcowa pozycja ECT jest kontrolowana przez wklęsłe wgłębienia na określonej wysokości tyczki; gwarantuje to, że wszystkie ECT osiadają się w tej samej pozycji, aby umożliwić porównanie aktywności zginania tyczek w równoległej hodowli ECT. (B) Tworzenie ECT oderwane od dna podczas zbyt szybkiego dodawania pożywki hodowlanej. Pływające ECT zagęszcza się na górnym poziomie pożywki hodowlanej. Siły kontraktowe słupów nie będą bezpośrednio porównywalne, jeśli ECT będzie rozliczany na różnych pozycjach. Podziałka: 2 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Inkubować przez 24 godziny.
  2. Następnie należy wymieniać pożywkę codziennie na 500 μl FGM do czasu analizy.
    UWAGA: Po początkowej fazie żelowania niezależnego od komórki, ludzki mukowiscydoza zaczyna dalej zagęszczać mieszaninę hydrożelu ECT. W ciągu 24 godzin ECT powinien wydawać się wyraźnie zagęszczony i podniesiony do poziomu, na którym jest utrzymywany na elastycznych biegunach (Rysunek 3 i Rysunek 4A).

4. Ocena zagęszczenia ECT poprzez pomiar pola przekroju poprzecznego (CSA) (5 min na ECT).

UWAGA: Zagęszczenie tkanek rozpoczyna się natychmiast po złożeniu kolagenu i jest szczególnie istotne w pierwszych godzinach. Zagęszczenie opisuje zmiany wywołane głównie przez kompresję macierzy sterowaną przez komórkę prostopadle do długiej osi tkanki. Parametr ten ocenia się poprzez określenie pola przekroju poprzecznego (CSA) TKE.

  1. W żądanych punktach czasowych użyj mikroskopu stereoskopowego, aby zarejestrować makroskopowe obrazy widoków z góry i z boku ECT (Rysunek 5C).
    UWAGA: ECT można obrazować wewnątrz dołków hodowlanych 48-dołkowej płytki odlewniczej. Alternatywnie, należy przenieść ECT na przezroczystą dolną płytkę wielodołkową w celu obrazowania. Zaleca się zobrazowanie elektrowstrząsów na słupach, ponieważ ich usunięcie prowadzi do utraty napięcia wstępnego, a w konsekwencji w krótkim czasie tkanka może się dalej kurczyć z ewentualnym skrętem z powodu zwolnienia napięcia, co może utrudnić prawidłowe obrazowanie do analiz wymiarów.
  2. Użyj programu do przetwarzania obrazu, aby przeprowadzić analizę skanowania liniowego. Ustaw skalę i użyj narzędzia Linia prosta, aby prześledzić i zmierzyć średnice ECT w co najmniej 6 pozycjach na ramię w każdej płaszczyźnie obrazowania (Rysunek 5B,C).
  3. Oblicz średnią średnicę od płaszczyzny widoku z góry i z boku i oblicz CSA zgodnie z równaniem pola eliptycznego:
    figure-protocol-4

figure-protocol-5
Rysunek 5: Monitorowanie zagęszczenia ECT w czasie za pomocą analizy pola przekroju (CSA). Elektrowstrząsy wykorzystano przy użyciu ludzkiego mukowiscydozy i kolagenu typu I, a następnie hodowano wokół dwóch elastycznych biegunów przez 5 dni. (A) Przedstawiono reprezentatywne obrazy kontrolnych ECT umieszczonych w elastycznych formach w czasie 5 dni. Podziałka = 5 mm. Takie obrazy w jasnym polu mogą być również wykorzystane do określenia zmienności ugięcia bieguna w celu oszacowania skurczu tkanki. (B) Schematyczne przedstawienie pola przekroju poprzecznego ECT (średnica widoku z góry na zielono i średnica widoku z boku na różowo). (C) Makroskopowe obrazy widoków z góry i z boku ECT uzyskane za pomocą mikroskopu stereoskopowego i odpowiadający im przykład analizy liniowej średnic tkanek przy użyciu programu do przetwarzania obrazu. Podziałka = 2 mm. Uśrednione średnice są obliczane na podstawie średniej wszystkich długości linii zmierzonych na każdym rzucie widoku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Monitorowanie skurczu ECT za pomocą analizy ugięcia tyczki (15 min na 48-dołkową płytę odlewniczą).

UWAGA: Posiew ECT jest zazwyczaj wykonywany przez 5 dni, ale może być dalej przedłużony przynajmniej do 20 dni. Ugięcie bieguna następuje w wyniku skurczu tkanki napędzanego siłą skurczu komórki w kierunku napięcia wzdłuż długiej osi tkanki. Ocenę skurczu ECT można przeprowadzić za pomocą obrazowania w dowolnym dniu podczas posiewu.

  1. Wyobraź sobie 48-dołkową płytkę odlewniczą pod urządzeniem rejestrującym ze zintegrowaną kamerą do skanowania obszaru umieszczoną w stałej odległości, wyposażoną w monochromatyczny przetwornik obrazu o wysokiej rozdzielczości (≥ 5 megapikseli).
    1. Użyj źródła światła o bliskim UV (~390 nm), aby zmaksymalizować kontrast, a tym samym ułatwić automatyczne wykrywanie końcówek słupów, ponieważ zawierają one barwnik fluorescencyjny (Rysunek 6A,C). Jeśli to możliwe, do obrazowania zalecane są obiektywy telecentryczne, ponieważ minimalizują one zniekształcenia obrazu.
      UWAGA: Alternatywnie, do analizy można wykorzystać makroskopowe obrazy jasnego pola z pojedynczych studzienek lub całej płytki wraz z paskiem skali (Rysunek 5A).
  2. Zmierz odległość między biegunami od dziennych zapisów (Rysunek 6C,D) za pomocą programu do przetwarzania obrazu lub automatycznej analizy, uruchamiając zarejestrowane obrazy w oprogramowaniu zdolnym do wykrywania jasnych pikseli o wysokim kontraście na ciemnym tle.
  3. Oblicz ugięcie tyczki poprzez zmianę odległości biegunów w porównaniu z odległością początkową w dniu zero.

figure-protocol-6
Rysunek 6: Schematyczny przegląd oceny skurczu tkanek na podstawie ugięcia tyczki. (A) Przykładowy zapis w wysokiej rozdzielczości słupów fluorescencyjnych w 48-dołkowej płycie odlewniczej pod wpływem wzbudzenia światłem bliskim UV. Ta metoda jest preferowana w stosunku do zdjęć w jasnym polu w celu bardziej precyzyjnego automatycznego śledzenia końcówek tyczek. (B) Schematyczne rysunki pokazują, w jaki sposób zagęszczenie i kurczenie się ECT prowadzi do wygięcia biegunów. (C) Przykładowy rząd tej samej płyty zapisuje się w dniu 0 i dniu 5 po odlewaniu. D. Zbliżenie pokazuje, jak zmierzyć odległość (różowa linia) między słupami za pomocą programu do przetwarzania obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Weź pod uwagę, że ugięcie tyczki mierzone jasnym obrazem końcówki jest tylko oszacowaniem skurczu tkanki ze względu na różnicę w płaszczyznach obrazowania. Należy również pamiętać, że stosowanie substancji pro-zwłóknieniowych, takich jak TGF-β1 podczas hodowli tkankowej, zwiększa zagęszczenie i skurcz ECT i może ostatecznie prowadzić do wczesnego uszkodzenia tkanek.

6. Ocena sztywności i innych właściwości biomechanicznych ECT za pomocą niszczącego pomiaru rozciągania i analizy naprężenie-odkształcenie (20 min na ECT)

UWAGA: Optymalna krzywa naprężenie-odkształcenie może wyświetlać trzy obszary: obszar palca, obszar elastyczny i obszar plastyczny. Przykład krzywej naprężenie-odkształcenie ECT jest pokazany w Rysunek 7. Analiza krzywej naprężenie-odkształcenie pozwala na wyodrębnienie ważnych parametrów biomechanicznych tkanki, takich jak np. sztywność, maksymalna wytrzymałość, elastyczność, plastyczność, rozciągliwość, sprężystość i wytrzymałość.

  1. Zbierz ECT, najpierw wyciągając nosze, w tym ECT, ze studni za pomocą kleszczy. Nosze można następnie przytrzymać na podstawie, a elektrowstrząs elektrowstrząsowy nasuwa się na końcówki noszy za pomocą cienkiego haczyka lub końcówki do pipety.
  2. Przenieś ECT na dwa haki zaciśnięte na ramieniu stacjonarnym i ramieniu przetwornika reometru do rozszerzalnej dynamicznej analizy mechanicznej (DMA) wyposażonego w podgrzewaną narządową kąpiel w temperaturze 37 °C (wykonaną na zamówienie) wypełnioną PBS (Rysunek 7A).

figure-protocol-7
Rysunek 7: Analiza niszczącego pomiaru rozciągania ECT. (A) Reologiczny niszczący pomiar rozciągania na reometrze do dynamicznej analizy mechanicznej (DMA). Górny widok dużej mocy: ECT po zamontowaniu w L0 w komorze środowiskowej i podłączeniu do górnego i dolnego bieguna w celu analizy naprężeniowo-odkształceniowej. Dolny widok dużej mocy: ECT naprężony ze stałą prędkością 0,03 mm/s aż do punktu uszkodzenia przy ostatecznym odkształceniu. Podziałka = 5 mm. (B) Wykres naprężenie-odkształcenie ECT pokazujący główne mierzone parametry. Górna granica obszaru sprężystego odpowiada granicy plastyczności, a obszar plastyczny znajduje się między granicą plastyczności a granicą uszkodzenia (ciągliwość). Nachylenie fazy liniowej obszaru sprężystego odpowiada modułowi Younga odzwierciedlającemu sztywność tkanki. Maksymalna wytrzymałość odpowiada maksymalnemu naprężeniu rozciągającemu, jakie może wytrzymać tkanka. Ze względu na mikropęknięcie włókien naprężenie zmniejsza się, aż tkanka osiągnie punkt uszkodzenia. Dzieje się tak przy ostatecznym odkształceniu (rozciągliwości), gdzie obserwuje się nagły spadek naprężeń z powodu pęknięcia tkanki. Sprężystość odpowiada energii (kJ/m3) pochłoniętej przez tkankę przed trwałym odkształceniem (do granicy plastyczności) i jest określona przez obszar pod krzywą (AUC) do odkształcenia granicy plastyczności. Wytrzymałość odpowiada całkowitej energii (kJ/m3), którą tkanka może wchłonąć aż do pęknięcia i jest podawana przez AUC aż do ostatecznego odkształcenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Ustawić reometr tak, aby wywierał jednoosiowe naprężenie ze stałą szybkością liniową wynoszącą około 1 % początkowej odległości między hakami na sekundę. Stała szybkość rozciągania 0,03 mm/s może być stosowana przy typowych wymiarach ECT. Wytaruj przetwornik, rozpocznij rozciąganie i nagrywaj aż do punktu pęknięcia ECT.
    UWAGA: Makroskopowe obrazy elektrowstrząsów (krok 4.1.) muszą być zarejestrowane przed próbą rozciągania, ponieważ CSA jest wymagany do normalizacji danych.
    UWAGA: Analiza naprężenie-odkształcenie, w tym obliczenia CSA, może być przetwarzana później w czasie podczas próby rozciągania. Do analizy danych użyj arkusza kalkulacyjnego i oprogramowania do analizy statystycznej.
  2. Znormalizuj zmierzone wartości siły (mN) na ECT przez jego CSA (mm2), aby uzyskać wartości naprężeń (kPa).
  3. Wykreślić wartości naprężeń w funkcji odkształcenia (geometryczna miara odkształcenia tkanki wyrażona przez względną odległość między górnym i dolnym hakiem) na wykresie XY.
    UWAGA: Początkowa długość tkanki (odległość między górnym i dolnym haczykiem) bezpośrednio przed rozciągnięciem, L0, musi być ręcznie dostosowana i odpowiada początkowi obszaru palca (obszar palca może być nieobecny w zależności od właściwości tkanki). Każda wartość punktu odkształcenia musi być obliczona zgodnie z równaniem, w którymsuma L jest całkowitą szczeliną w każdym punkcie pomiarowym:
    figure-protocol-8
    Podczas wykreślania danych należy użyć wartości naprężenia w wybranym L0 do odejmowania tła.
  4. Wyznacz różne parametry biomechaniczne na podstawie krzywej naprężenie-odkształcenie (użyj Rysunek 7B jako przykład).
    UWAGA: Krzywa naprężenie-odkształcenie może wyświetlać trzy obszary: obszary zbieżne, elastyczne i plastyczne. Górna granica obszaru elastycznego, zanim tkanka zacznie mikropękać, odpowiada granicy plastyczności, a jej odkształcenie jest miarą elastyczności tkanki. Obszar plastyczny znajduje się między granicą plastyczności a granicą uszkodzenia. Drugi punkt odpowiada nagłemu spadkowi naprężeń spowodowanemu pęknięciem tkanki, definiując ostateczne zabarwienie, które jest miarą rozciągliwości tkanki. Trzeci punkt pomiarowy odpowiada maksymalnej wytrzymałości, która jest definiowana przez największe naprężenie, jakie tkanka może wytrzymać bez pękania podczas rozciągania. Sprężystość i wytrzymałość, określone przez obszar pod krzywą, odpowiadają energii pochłoniętej przez tkankę odpowiednio do granicy plastyczności i do punktu uszkodzenia. Dla każdej uzyskanej krzywej nachylenie liniowej części obszaru sprężystego odpowiada modułowi Younga, znanemu również jako moduł sprężystości, i jest właściwością mechaniczną, która mierzy sztywność tkanki.
    1. Wyodrębnij z każdej krzywej wartości XY (odpowiednio odkształcenie i naprężenie) granicy plastyczności, punktu uszkodzenia i punktu maksymalnego naprężenia.
    2. Oceń moduł Younga (sztywność w kPa = mN·mm-2) każdego ECT od nachylenia części liniowej obszaru sprężystego, wykreślając regresję liniową tego obszaru.
    3. Użyj programu statystycznego, aby obliczyć obszar pod krzywą (AUC) w celu określenia zarówno sprężystości, jak i udarności, odpowiednio do granicy plastyczności i punktu uszkodzenia. Oblicz AUC metodą trapezową. Ustawić linię bazową na zero i uwzględniać tylko szczyty powyżej linii bazowej, które stanowią co najmniej 10 % odległości od wartości minimalnej do maksymalnej na osi Y.
      UWAGA: Moduły sprężystości i udarności są określone przez σ × ε, gdzie σ to naprężenie (kPa), a ε to odkształcenie (L/ΔL, mm/mm). Zatem sprężystość i wytrzymałość to energia w kJ/m3 (kPa = kN·m-2 = kN·m·m-3 = kJ/m·m·m-3 = kJ/m3) pochłonięta przez tkankę odpowiednio przed trwałym odkształceniem i do pęknięcia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

ECT osiąga około 95% zagęszczenia w porównaniu do początkowej objętości hydrożelu komórkowego kolagenu w ciągu pierwszych 24 godzin. Zagęszczenie i kurczenie się tkanek w warunkach kontrolnych i w obecności FCS następuje kilka godzin po odlaniu i znacznie wzrasta do 5 dnia (Rysunek 5A). Ugięcie tyczki może się jeszcze zwiększyć w ciągu kolejnych 15 dni (najdłuższy czas testowany był przez 20 dni). Wielkość ugięcia bieguna zależy od typu komórki, stanu komórki oraz warunków hodowli komórek i tkanek. Za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Prezentowany protokół opisuje wytwarzanie elektrowstrząsów z pierwotnego mukowiscydozy człowieka, co pozwala na badanie mechanicznego wpływu tych komórek na środowisko ich macierzy zewnątrzkomórkowej i odwrotnie.

Fibroblasty muszą zostać rozprężone, aby uzyskać wystarczającą ilość komórek do planowanych eksperymentów ECT (0,75 x 106 komórek/ECT). W celu uzyskania najlepszej odtwarzalności zaleca się wstępną hodowlę fibroblastów zamrożonych lub pochodzących z tkanek w jednowarstwowej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

GLS i SL sporządziły projekt manuskryptu. Wszyscy autorzy przyczynili się do opracowania protokołu i zredagowali manuskrypt. TM, MT i WHZ są doradcami naukowymi myriamed GmbH. WHZ jest założycielem i udziałowcem myriamed GmbH.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Niemieckie Towarzystwo Kardiologiczne (DGK Research Fellowship for GLS) oraz przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG poprzez projekt IRTG 1816 for GLS and AD; DFG 417880571 i DFG TI 956/1-1 dla MT; SFB 1002 TP C04 dla MT i WHZ; SFB 1002 TP S01 dla WHZ; i EXC 2067/1-390729940J dla WHZ). WHZ jest wspierany przez niemieckie Federalne Ministerstwo Nauki i Edukacji (BMBF w ramach projektu IndiHEART) oraz Fundację Leducq (20CVD04). MT, WHZ i SL są wspierane przez Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (DZHK).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki do hodowli komórkowych:
Roztwór Accutase MerkMilliporeSCR005
Odczynnik dysocjacyjny – TrypLE ExpressGibco12604013
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w proszku, o wysokiej zawartości glukozyGibco12100061
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS), pH 7,2, -Ca2+, -Mg2+Gibco14190144
FGM-2 Pożywka do wzrostu fibroblastów-2 BulletKitLonzaCC-3132
FBM  Fibroblast Growth Basal MediumLonzaCC-3131
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots,  Suplementy i czynniki wzrostuLonzaCC-4126
Pożywka wzrostowa fibroblastów 3 ZESTAWPromoCellC-23130
Fibroblast Basal Medium 3PromoCellC-23230
Pożywka wzrostowa 3 Pakiet suplementówPromoCellC-39350
Penicylina (10000 U/ml)/ Streptomycyna (10000 μ L / ml)Gibco15140122
Roztwór wodorotlenku sodu (NaOH) 1,0 NSigma-AldrichS2770-100ML
Źródła komórek:
Normalne ludzkie fibroblasty serca z komory (NHCF-V)LonzaCC-2904
Ludzkie fibroblasty serca (HCF-c)PromoCellC-12375
Ludzkie fibroblasty serca ( HCF-p)PromoCellC-12377
Pierwotne ludzkie fibroblasty napletka-1 (HFF-1)ATCCSCRC-1041
Zasoby kolagenu:
Kolagen typu I (bydlęcy) w 0,01 M HClLLC Collagen SolutionsFS220246-7 mg / ml
Kolagen typu I (ogon szczura) w 0,02 M HClCorning354236~ 4 mg / ml
Leki:
Latrunculin-A (Lat-A)Enzo Life SciencesBML-T119-0100
Wyroby z tworzyw sztucznych:
Wyroby z tworzyw sztucznych do hodowli komórkowychSarstedt i Starlab
Siatkowy sitko komórkowe (nylon, wielkość porów 40 i mu; m)Falcon352340
myrPlate-uniformmyriamed GmbHTM5 med
Pipety serologiczne o szerokim otworze, sterylne (10 mL)Corning07-200-619
Specyficzne instrumenty:
Bi-telecentryczna soczewka CORE do detektorów 1/2″OptoEngineeringTCCR12096
Kamera do skanowania obszaru Basler ace acA4024Basler107404

Bibliografia

  1. Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
  2. Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells on the polymer substrates with different stiffness: an atomic force microscopy study. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (16), 7540-7545 (2011).
  3. Elson, E. L., Genin, G. M. Tissue constructs: platforms for basic research and drug discovery. Interface Focus. 6 (1), 20150095(2016).
  4. Cho, N., Razipour, S. E., McCain, M. L. TGF-beta1 dominates extracellular matrix rigidity for inducing differentiation of human cardiac fibroblasts to myofibroblasts. Experimental Biology and Medicine. 243 (7), Maywood. 601-612 (2018).
  5. Cucoranu, I., et al. NAD(P)H oxidase 4 mediates transforming growth factor-beta1-induced differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts. Circulation Research. 97 (9), 900-907 (2005).
  6. Peng, H., Carretero, O. A., Peterson, E. L., Rhaleb, N. E. Ac-SDKP inhibits transforming growth factor-beta1-induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), 1357-1364 (2010).
  7. Ribeiro, A. J., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  8. Tranquillo, R. T., Durrani, M. A., Moon, A. G. Tissue engineering science: consequences of cell traction force. Cytotechnology. 10 (3), 225-250 (1992).
  9. Barocas, V. H., Moon, A. G., Tranquillo, R. T. The fibroblast-populated collagen microsphere assay of cell traction force--Part 2: Measurement of the cell traction parameter. Journal of Biomechanical Engineering. 117 (2), 161-170 (1995).
  10. Lijnen, P., Petrov, V., Rumilla, K., Fagard, R. Stimulation of collagen gel contraction by angiotensin II and III in cardiac fibroblasts. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 3 (3), 160-166 (2002).
  11. Baxter, S. C., Morales, M. O., Goldsmith, E. C. Adaptive changes in cardiac fibroblast morphology and collagen organization as a result of mechanical environment. Cell Biochemistry and Biophysics. 51 (1), 33-44 (2008).
  12. Zhou, Y., et al. Inhibition of mechanosensitive signaling in myofibroblasts ameliorates experimental pulmonary fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1096-1108 (2013).
  13. Lijnen, P., Petrov, V., Fagard, R. In vitro assay of collagen gel contraction by cardiac fibroblasts in serum-free conditions. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 23 (7), 377-382 (2001).
  14. Burgess, M. L., et al. Integrin-mediated collagen gel contraction by cardiac fibroblasts. Effects of angiotensin II. Circulation Research. 74 (2), 291-298 (1994).
  15. Nunohiro, T., Ashizawa, N., Graf, K., Hsueh, W. A., Yano, K. Angiotensin II promotes integrin-mediated collagen gel contraction by adult rat cardiac fibroblasts. Japanese Heart Journal. 40 (4), 461-469 (1999).
  16. Ngu, J. M., et al. Human cardiac fibroblast extracellular matrix remodeling: Dual effects of tissue inhibitor of metalloproteinase-2. Cardiovascular Pathology. 23 (6), 335-343 (2014).
  17. Knezevic, V., Sim, A. J., Borg, T. K., Holmes, J. W. Isotonic biaxial loading of fibroblast-populated collagen gels: a versatile, low-cost system for the study of mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 1 (1), 59-67 (2002).
  18. Delvoye, P., Wiliquet, P., Leveque, J. L., Nusgens, B. V., Lapiere, C. M. Measurement of mechanical forces generated by skin fibroblasts embedded in a three-dimensional collagen gel. Journal of Investigative Dermatology. 97 (5), 898-902 (1991).
  19. Kolodney, M. S., Elson, E. L. Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (32), 23850-23855 (1993).
  20. Bell, B. J., Nauman, E., Voytik-Harbin, S. L. Multiscale strain analysis of tissue equivalents using a custom-designed biaxial testing device. Biophysical Journal. 102 (6), 1303-1312 (2012).
  21. Wakatsuki, T., Kolodney, M. S., Zahalak, G. I., Elson, E. L. Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophysical Journal. 79 (5), 2353-2368 (2000).
  22. Thomopoulos, S., et al. Fibrocartilage tissue engineering: The role of the stress environment on cell morphology and matrix expression. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 1039-1053 (2011).
  23. Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (2), 214-222 (2002).
  24. Ongherth, A., et al. p63RhoGEF regulates auto- and paracrine signaling in cardiac fibroblasts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 88, 39-54 (2015).
  25. Vettel, C., et al. PDE2-mediated cAMP hydrolysis accelerates cardiac fibroblast to myofibroblast conversion and is antagonized by exogenous activation of cGMP signaling pathways. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (8), 1246-1252 (2014).
  26. Jatho, A., et al. RhoA Ambivalently Controls Prominent Myofibroblast Characteritics by Involving Distinct Signaling Routes. PLoS One. 10 (10), 0137519(2015).
  27. Dworatzek, E., et al. Sex-specific regulation of collagen I and III expression by 17beta-Estradiol in cardiac fibroblasts: role of estrogen receptors. Cardiovascular Research. 115 (2), 315-327 (2019).
  28. Tiburcy, M., Meyer, T., Soong, P. L., Zimmermann, W. H. Collagen-based engineered heart muscle. Methods in Molecular Biology. 1181, 167-176 (2014).
  29. Schlick, S. F., et al. Agonistic and antagonistic roles of fibroblasts and cardiomyocytes on viscoelastic stiffening of engineered human myocardium. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 51-60 (2019).
  30. Wille, J. J., Elson, E. L., Okamoto, R. J. Cellular and matrix mechanics of bioartificial tissues during continuous cyclic stretch. Annals of Biomedical Engineering. 34 (11), 1678-1690 (2006).
  31. Berry, C. C., Shelton, J. C., Bader, D. L., Lee, D. A. Influence of external uniaxial cyclic strain on oriented fibroblast-seeded collagen gels. Tissue Engineering. 9 (4), 613-624 (2003).
  32. Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Developmental Biology. 90 (2), 383-398 (1982).
  33. Bellows, C. G., Melcher, A. H., Aubin, J. E. Association between tension and orientation of periodontal ligament fibroblasts and exogenous collagen fibres in collagen gels in vitro. Journal of Cell Science. 58 (1), 125-138 (1982).
  34. Tranquillo, R. T. Self-organization of tissue-equivalents: the nature and role of contact guidance. Biochemical Society Symposia. 65, 27-42 (1999).
  35. Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of Biomechanical Engineering. 119 (2), 137-145 (1997).
  36. Yip, A. K., et al. Anisotropic traction stresses and focal adhesion polarization mediates topography-induced cell elongation. Biomaterials. 181, 103-112 (2018).
  37. Santos, G. L., Hartmann, S., Zimmermann, W. H., Ridley, A., Lutz, S. Inhibition of Rho-associated kinases suppresses cardiac myofibroblast function in engineered connective and heart muscle tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 134, 13-28 (2019).
  38. Kittana, N., et al. Modulating the biomechanical properties of engineered connective tissues by chitosan-coated multiwall carbon nanotubes. International Journal of Nanomedicine. 16, 989-1000 (2021).
  39. Kittana, N., et al. Enhancement of wound healing by single-wall/multi-wall carbon nanotubes complexed with chitosan. International Journal of Nanomedicine. 13, 7195-7206 (2018).
  40. Antoine, E. E., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (6), 683-696 (2014).
  41. Holder, A. J., et al. Control of collagen gel mechanical properties through manipulation of gelation conditions near the sol-gel transition. Soft Matter. 14 (4), 574-580 (2018).
  42. Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura fibroblastówwłóknienie mięśnia sercowegosztywność tkanki3D kultura komórekhydrożel kolagenowytesty biomechanicznekompakcja tkankipolimeryzacja aktynymoduł Younga
Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.