Artykuł metodologiczny

Humanizowany test uwalniania mediatora jako odczyt siły działania alergenów

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62702

⸱

29 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences, University of Salzburg

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy test uwalniania mediatora, wykorzystujący linię komórkową białaczki bazofilowej szczura transfekowaną ludzkim receptorem IgE, aby symulować degranulację komórek efektorowych zwykle obserwowaną w reakcjach alergicznych typu 1. Metoda ta bada aktywność biologiczną alergenów w sposób wysoce czuły, powtarzalny i dostosowany do potrzeb.

Streszczenie

Testy uwalniania mediatorów analizują in vitro degranulację i wydzielanie mediatorów za pośrednictwem immunoglobuliny E (IgE) oraz wydzielanie mediatorów przez komórki efektorowe, takie jak komórki tuczne i bazofile, po stymulacji seryjnymi rozcieńczeniami przypuszczalnych alergenów. Dlatego testy te stanowią niezbędne narzędzie, które naśladuje proces degranulacji in vivo, który zachodzi po ekspozycji na alergen u uczulonych pacjentów lub w punktowych testach skórnych. Ponadto testy te są zwykle stosowane do badania potencjału alergizującego białek i reaktywności surowic pacjentów. W tym miejscu opisujemy prosty 2-dniowy protokół wykorzystujący nieśmiertelnioną linię komórkową białaczki bazofilowej szczura transfekowaną i humanizowaną ludzkim receptorem błony plazmatycznej IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI). Ten wariant testu uwalniania mediatora jest solidnym, czułym i powtarzalnym systemem opartym na komórkach in vitro bez konieczności unieruchamiania antygenu do stałych matryc. Protokół składa się z następujących etapów: (1) inaktywacja ludzkich surowic dopełniacza, (2) zbieranie, siew i bierne uwrażliwienie komórek, (3) stymulacja antygenem w celu spowodowania uwalniania mediatora oraz (4) pomiar aktywności β-heksozaminidazy jako substytutu uwolnionych mediatorów stanu zapalnego, takich jak histamina. Test stanowi użyteczne narzędzie do oceny zdolności sieciowania alergenu-IgE do wyzwalania degranulacji komórek i może być stosowany do standaryzacji ekstraktów alergenowych, porównywania reaktywności pacjentów na mniejsze lub główne alergeny oraz na ekstrakty alergizujące (pyłek, sierść kotów itp.), w celu zbadania siły działania homologów alergenów, izoform i wariantów fałdowych (np. hipoalergiczności), a także wpływu ligandów na aktywność alergizującą. Nowsze zastosowanie obejmuje zastosowanie testu do monitorowania skuteczności leczenia w przebiegu immunoterapii alergenowej.

Wprowadzenie

Reakcje nadwrażliwości typu I, charakteryzujące się produkcją immunoglobuliny E (IgE) specyficzną dla danego antygenu, dotykają prawie jednej trzeciej światowej populacji. Reakcje te są związane z kilkoma objawami alergicznymi, takimi jak astma i zapalenie błony śluzowej nosa i spojówek, a nawet mogą prowadzić do ogólnoustrojowych reakcji zagrażających życiu1. W przeciwieństwie do testów in vivo, podejścia immunochemiczne, takie jak test immunoenzymatyczny (ELISA), nadają się wyłącznie do badania docelowego wiązania przeciwciał, ale nie zajmują się funkcjonalnym aspektem białek, które mogą powodować natychmiastowe reakcje nadwrażliwości. Unieruchomienie alergenów na solidnych podłożach (np. płytkach ELISA) może spowodować zmiany w ich integralności strukturalnej i zniszczenie epitopów istotnych dla alergii2. Nawet punktowe testy skórne (SPT), najpowszechniejsze narzędzie do potwierdzania uczulenia na niektóre alergeny, mają swoje ograniczenia w wykrywaniu objawowej alergii pokarmowej IgE-zależnej lub dostępności alergenów3,4. W celu znalezienia etycznej, wysoce specyficznej, czułej i opłacalnej metody badania biologicznej siły działania alergenów w wywoływaniu reakcji nadwrażliwości typu I, ustalono tzw. testy uwalniania mediatorowego.

Zasada tych testów opiera się na zdarzeniach następujących po fazie uczulenia i towarzyszącej im zdolności IgE do wiązania się z łańcuchem α receptorów o wysokim powinowactwie wyrażanych na powierzchni komórek efektorowych, takich jak komórki tuczne i bazofile. IgE jest wytwarzana głównie przez komórki plazmatyczne w tkance limfatycznej związanej z błoną śluzową. Chociaż jest to najmniej obfita immunoglobulina (około 0,05% u osób nieatopowych) we krwi, posiada niezwykle wysoką aktywność biologiczną, która jest główną przyczyną objawów alergicznych. Okres półtrwania IgE może wzrosnąć z 2-3 dni do kilku tygodni, a nawet miesięcy, gdy jest związany z jego receptorami na komórkach efektorowych. Późniejsze wiązanie antygenu ze zmiennym regionem dwóch cząsteczek IgE związanych z receptorem prowadzi do ich usieciowania, a następnie indukcji kaskady sygnałowej w komórce efektorowej, co prowadzi do degranulacji i uwolnienia kilku mediatorów prozapalnych powodujących rozszerzenie naczyń krwionośnych, takich jak histamina, proteazy serynowe (np. tryptaza) i prostaglandyny5,6,7. Wydzielanie cytokin, takich jak interleukina 4 (IL-4) i IL-13, jest odpowiedzialne za utrzymanie odpowiedzi zapalnego T helper 2 (Th2) i przełączanie klas limfocytów B na komórki plazmatyczne wytwarzające IgE5,8,9. Z drugiej strony, uwolniony tromboksan powoduje zwężenie oskrzeli, a leukotrieny stymulują skurcz mięśni gładkich, a także nieszczelność naczyniową i odgrywają kluczową rolę w zapaleniu dróg oddechowych prowadzącym do astmy lub alergicznego nieżytu nosa10,11.

Narzędzia badawcze do analizy większości wyżej wymienionych mediatorów zostały już stworzone, choć z pewnymi poważnymi wadami. Testy tryptazy są odpowiednimi metodami klinicznymi do pomiaru ogólnoustrojowej anafilaksji poprzez aktywację komórek tucznych, ale ich czułość i swoistość w diagnostyce alergii jest zbyt niedokładna w porównaniu z metodami złotego standardu, takimi jak SPT. Z drugiej strony, testy leukotrienów cysteinylowych nie są w stanie zdiagnozować alergii na β-laktamy lub niesteroidowe leki przeciwzapalne12. Protokoły pomiaru histaminy jako głównego mediatora uwalnianego w reakcjach alergicznych zostały opracowane już w latach 60. Po uwolnieniu do krwi obwodowej histamina jest natychmiast rozkładana przez metylotransferazy histaminowe, co skutkuje okresem półtrwania osocza wynoszącym zaledwie kilka minut, co sprawia, że jej analiza jest dość trudna13. Oprócz jej niestabilności, wykazano, że monitorowanie histaminy ma niską swoistość i czułość w przypadku alergii na leki, a także komercyjnych białek spożywczych i jadów os12.

Modele in vitro z efektorowymi liniami komórkowymi zostały wprowadzone jako alternatywa dla pracochłonnych procedur izolacji i hodowli bazofili od pacjentów alergicznych w celu przeprowadzenia testów uwalniania. W związku z tym ustanowiono test oparty na białaczce bazofilowej szczurów (RBL) z wykorzystaniem linii komórkowej RBL-2H33. Ponieważ ta linia komórkowa nie jest zdolna do wiązania ludzkiej IgE, najpierw została transfekowana łańcuchem α, β i γ ludzkiego receptora błony plazmatycznej IgE (FcεRI). Wygenerowano i przetestowano kilka klonów pod kątem poziomów ekspresji i jednorodności ludzkiego łańcucha α, z których klon RBL-30/25 okazał się najbardziej obiecującym kandydatem do testów in vitro. Kaskada sygnalizacyjna indukowana po aktywacji receptora transfekowanego klonu została przetestowana za pomocą testów mobilizacji wapnia. Jako wskaźnik degranulacji i substytut uwalniania histaminy zmierzono enzym lizosomalny β-heksosaminidazę, który ma istotną zaletę w postaci wyższej stabilności14. Uwalnianie mediatora za pomocą komórek RBL-30/25 sięga nawet 100% i dlatego służy do badania surowic pochodzących od pacjentów alergicznych. Test został przetestowany pod kątem uwalniania mediatora po wyzwaniu uwrażliwionych komórek dostępnymi w handlu ekstraktami alergenowymi. Doprowadziło to do stwierdzenia, że istnieje ogromna różnica w składzie (nawet 60-krotna w odniesieniu do całkowitej zawartości białka) ekstraktów alergenowych pochodzących od różnych producentów i stosowanych w diagnostyce (np. SPT) lub podejściach terapeutycznych3,15,16.

Niniejszym podajemy szczegółowy opis protokołu RBL do przeprowadzenia testu uwalniania mediatora przy użyciu surowicy od alergicznych dawców. Podczas biernego uczulenia IgE w surowicy jest wychwytywane przez receptor FcεR1 o wysokim powinowactwie wyrażany na powierzchni komórek zasadochłonnych. Po stymulacji antygenem związane IgE specyficzne dla antygenu są sieciowane, wywołując degranulację komórek i uwalnianie mediatora β-heksozaminidazy. Aktywność β-heksozaminidazy jest następnie mierzona przy użyciu odpowiedniego substratu. Do testu użyto komórek huRBL-2H3, które w poniższym protokole określono jako huRBL. Protokół opisuje standardową serię rozcieńczeń antygenu z 8 krokami rozcieńczonymi w stosunku 1:10 w zakresie od 1 μg/ml do 0,1 pg/ml alergenu.

Protokół

Etyczne zatwierdzenie stosowania surowic pochodzących od pacjentów uczulonych na pyłki brzozy zostało uzyskane od holenderskiego komitetu etyki (numer zatwierdzenia: NL65758.018.18).

1. Procedury bezpieczeństwa

  1. Praca w sterylnych warunkach przy użyciu stołu warsztatowego klasy bezpieczeństwa biologicznego 2 podczas pierwszego dnia eksperymentu (poziom bezpieczeństwa biologicznego 2). Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi bezpieczeństwa stosowania surowicy ludzkiej.

2. Inaktywacja dopełniacza w surowicy ludzkiej

  1. Zebrać gęstą kulturę komórek P3X63Ag8.653 (zwanych dalej komórkami Ag8) z kolby do hodowli komórkowych i przenieść je do probówki wirówkowej.
    1. Dla tych komórek należy użyć następującej pożywki hodowlanej: Modified Eagles's Minimum Essential Medium o obniżonym stężeniu w surowicy, 1% penicylina-streptomycyna (100 jednostek Pen., 0,1 mg/ml Strep), 5% inaktywowana termicznie płodowa surowica cielęca/bydlęca (FCSi).
  2. Odwirować komórki Ag8 przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze pokojowej.
  3. Ponownie zawiesić osad komórkowy do końcowego stężenia około 1 x 106 komórek/ml w pożywce huRBL (Minimum Essential Medium Eagle z modyfikacją alfa, 4 mM L-glutamina, 5% FCSi, 1% G418 (100% zapasu: 10 g/125 mL dH2O).
    UWAGA: Utrzymuj komórki Ag8 poprzez pasażowanie również do wykorzystania w przyszłości.
  4. Rozcieńczyć surowice ludzkie w stosunku 1:10 w zawiesinie komórek Ag8. Końcowe rozcieńczenie surowicy w teście wyniesie 1:20,
    UWAGA: W przypadku surowic o niskiej swoistej IgE można zastosować rozcieńczenie końcowe 1:5 (1:10).
  5. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5%-7% CO2 .

3. Zbieranie i wysiewanie komórek huRBL

  1. Ostrożnie odessać pożywkę z kolby do hodowli komórek T-75, nie dotykając komórek huRBL (komórki huRBL przylegają). Upewnij się, że komórki są w około 50%-90% zlewne.
    UWAGA: W zależności od konfluencji komórek, zawartość komórek w gęstej kolbie do hodowli komórek T-75 jest zwykle wystarczająca na jedną do dwóch 96-dołkowych płytek.
  2. Umyj komórki dwukrotnie, dodając 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Dodać DPBS po przeciwnej stronie kolby, a nie bezpośrednio na komórki.
  3. Odessać DPBS i dodać 5 ml wstępnie podgrzanej 1x trypsyny-EDTA (0,05%/0,02% EDTA rozcieńczonego w DPBS) w celu oddzielenia komórek.
  4. Inkubować kolbę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Odłączyć komórki, ostrożnie stukając w kolbę.
  6. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i napełnij pożywką huRBL lub DPBS w celu rozcieńczenia trypsyny-EDTA.
  7. Odwirować komórki przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki huRBL w celu zliczenia komórek.
  9. Policz komórki i rozcieńcz je w pożywce huRBL, aby uzyskać końcowe stężenie 2 x 106 komórek/ml.
  10. Użyj sterylnej 96-dołkowej płytki i dodaj 50 μl zawiesiny komórek huRBL na studzienkę, co odpowiada 1 x 105 komórek/basenik.

4. Pasywne uczulenie komórek huRBL

  1. Odwirować wstępnie inkubowaną zawiesinę Ag8/surowicy przez 5 minut przy 250 x g.
  2. Przenieść 50 μl odwirowanej zawiesiny Ag8/surowicy do każdej studzienki zawierającej komórki huRBL, nie naruszając osadu komórek Ag8.
    1. Uwzględnij kontrolę bez antygenu, które są uwrażliwionymi, ale niestymulowanymi komórkami (nie dodawaj antygenu), służąc jako wskazanie dla dolnego plateau sygnałowego / tła. Studzienki kontrolne tła i maksymalnej lizy nie muszą być uwrażliwiane surowicą. Zamiast tego dodaj 50 μl pożywki huRBL do studzienek kontrolnych.
  3. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C i 5%-7% CO2 .

5. Degranulacja stymulowana antygenem i uwalnianie mediatora

  1. Przygotować wcześniej rozcieńczenie antygenu w 1x buforze Tyrode'a (9,5 g/l soli Tyrode'a, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 g/l wodorowęglanu sodu (NaHCO3) w dH2O). Potrzebna jest końcowa ilość 100 μl na studzienkę.
    UWAGA: Nie każdy alergen, zarówno oczyszczony z naturalnych źródeł, jak i wyprodukowany rekombinacyjnie, może być stabilny w buforze 1x Tyrode. Dlatego przed procedurą testową należy przeprowadzić testy stabilności w buforze 1x Tyrode. Alternatywnie, rozcieńczyć 1x bufor Tyrode'a w tlenku deuteru (D2O), aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu w teście.
  2. Wykonać 8 rozcieńczeń interesującego antygenu z serii rozcieńczeń 1:10 w probówkach reakcyjnych, zaczynając od 10 lub 1 μg/ml białka.
    UWAGA: Zawsze należy wcześniej przetestować serię rozcieńczeń. Alternatywnie można dostosować serię rozcieńczeń 1:10 (np. 1:5, 1:20 lub 1:30) w celu pokrycia pełnej krzywej uwalniania. Ponadto stężenie początkowe może się różnić w zależności od konfiguracji eksperymentalnej.
  3. Aby umyć komórki huRBL posiane na płytce 96-dołkowej, należy najpierw usunąć pożywkę komórkową zawierającą surowice, ostrożnie zasyszając, odwracając i stukając płytką w papier chłonny.
  4. Przemyć komórki 200 μl 1x buforu Tyrodesa na studzienkę. Traktuj wszystkie studzienki podobnie.
    UWAGA: Powoli dodawaj roztwór myjący do komórek, aby im nie przeszkadzać.
  5. Pozostaw na około 30 s i powtórz krok prania w sumie trzy razy.
  6. Po dodaniu roztworu myjącego po raz ostatni, pozostaw roztwór w studzienkach, aż będzie gotowy do dalszego dodawania rozcieńczania antygenu.
    UWAGA: Unikaj wystawiania komórek na działanie powietrza zbyt długo.
  7. Przenieść 100 μl roztworu antygenu do każdej studzienki zawierającej wstępnie uczulone komórki huRBL.
    UWAGA: W przypadku analizowania kilku różnych parametrów należy przenieść poszczególne próbki z serii rozcieńczeń na dodatkową niewiążącą płytkę 96-dołkową (użyć tego samego układu, co na płytce huRBL), a następnie przenieść je za pomocą pipety wielokanałowej bezpośrednio na płytkę kuwety huRBL. W ten sposób można uniknąć zbyt długiego wystawiania komórek na działanie powietrza, co może skutkować słabą wydajnością testu (niższy sygnał / jego brak).
  8. Przykryj studzienki kontrolne (maksymalna liza i nieuczulone komórki tła) 100 μl 1x buforu Tyrode. Nie należy stymulować tych studzienek kontrolnych antygenem.
    1. Dodatkowo dodać 100 μl buforu 1x Tyrode do uczulonych studzienek bez antygenu z serii rozcieńczeń, co jest potrzebne do uwzględnienia niezależnego od antygenu spontanicznego uwalniania uczulonych komórek podczas analizy danych.
  9. Inkubować komórki huRBL przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5%-7% CO2 .

6. Pomiar fluorescencji aktywności β-heksozaminidazy

  1. Studzienki o maksymalnej kontroli lizy należy potraktować 10 μl 10% Triton X-100 na studzienkę i odpowiednio wymieszać, aby całkowicie zlizować komórki i uzyskać 100% uwolnienie β-heksosaminidazy.
  2. Dodać 50 μl roztworu substratu do nowej, niewiążącej płytki 96-dołkowej. Roztwór substratu dla jednej płytki 96-dołkowej: 5 ml 0,1 M buforu do oznaczania cytrynowego, pH 4,5; i 80 μl 10 mM N-acetylo-β-D-glukozaminidu 4-metyloumbelirylu.
  3. Przenieść 50 μl supernatantu komórkowego ze wszystkich studzienek na nową płytkę zawierającą roztwór substratu.
    UWAGA: Ostrożnie odpipetować supernatant z płytki huRBL, aby nie zakłócić działania komórek huRBL.
  4. Inkubować płytkę z roztworem substratu i supernatantem komórkowym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić konwersję substratu fluorogenicznego.
    UWAGA: Zachowaj płytkę huRBL do testu żywotności komórek.
  5. Dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (15 g/l glicyny, 11,7 g/l NaCl rozpuszczony wdH2O, pH 10,7) do dołka.
  6. Zmierzyć fluorescencję przy wzbudzeniu 360 nm i emisji 465 nm za pomocą czytnika płytkowego.

7. Analiza danych

  1. Do podstawowych obliczeń zwolnienia procentowego użyj dowolnego arkusza kalkulacyjnego.
  2. W przypadku odejmowania tła/usuwania linii bazowej odejmij średnią studzienek tła od wszystkich innych studzienek.
  3. Obliczyć średnią z maksymalnych studzienek do lizy i wyrazić dane serii rozcieńczeń w procentach. W ten sposób można wyrazić dane jako procent uwalniania komórek znormalizowany do maksymalnego uwalniania enzymu spowodowanego lizą komórki.
  4. Pełne krzywe uwalniania mediatora dawka-odpowiedź są najlepiej przedstawione jako wykresy XY ze stężeniem antygenu na logarytmie na osi X i procentem uwalniania mediatora na osi Y.
  5. Dodaj wartości kontroli bez antygenu jako linię przerywaną, aby wskazać tło lub dolny płaskowyż.
    UWAGA: Kilka podobnie traktowanych surowic można porównać przy użyciu tej strategii normalizacji. Dla bezpośredniego porównania zaleca się ponadto obliczenie połowy maksymalnego uwolnienia, które jest stężeniem antygenu (w ng/ml) niezbędnym do połowy maksymalnego uwolnienia, zdefiniowanego jako średnia maksymalnych i minimalnych wartości na krzywą. Stężenie antygenu w celu stymulacji połowy maksymalnego uwalniania oblicza się przez interpolację połowy maksymalnej wartości uwalniania do linii regresji logarytmicznej.

Wyniki

Test uwalniania mediatora, oparty na komórkach huRBL (Rysunek 1A i B), daje w wyniku krzywą dawka-odpowiedź w kształcie dzwonu (Rysunek 1C). Dla uproszczonej reprezentacji danych, stężenie antygenu niezbędne do połowy maksymalnego uwolnienia mediatora można obliczyć za pomocą regresji liniowej (Rysunek 1D). Test żywotności komórek przeprowadza się w celu wykluczenia efektów cytotoksycznych pochodzących z surowicy uczulającej lub antygenu użytego do stymulacji (Rysunek 1E). Test może być stosowany do badania reaktywności różnych surowic na określony antygen. W naszym przypadku 4 z 5 surowic, pochodzących od pacjentów z alergią na pyłek brzozy, zareagowało na stymulację Bet v 1. Surowica #1 wykazała najwyższe uwalnianie mediatora (Ryc. 2). Surowica #5 nie reagowała na stymulację Bet v 1 i tym samym może reagować na inne alergeny pyłku brzozy (np. Bet v 2, profilina). Dane te wskazują, że Bet v 1 jest silnym alergenem odpowiedzialnym za objawy alergiczne IgE-zależne. Za pomocą testu huRBL można ocenić reaktywność krzyżową IgE do alergenów homologicznych (Rysunek 3). W tym przypadku obaj pacjenci uczuleni na pyłek brzozy dobrze zareagowali na Bet v 1, podczas gdy tylko pacjent #2 zareagował również na Cor a 1, homologiczny alergen pokarmowy Bet v 1 znajdujący się w orzechach laskowych. Opierając się na tych danych, pacjent #2 najprawdopodobniej ma wyższy poziom IgE Cor a 1-reaktywnego krzyżowo niż pacjent #1, co skutkuje objawami alergii jamy ustnej po spożyciu orzechów laskowych. Nawet ocena hipoalergicznego charakteru zmutowanych wariantów alergenów (zmniejszona siła działania) może być analizowana i porównywana z ich odpowiednikiem typu dzikiego (Ryc. 4). W podanym przykładzie krzywa uwalniania wariantu fałdowego przesunęła się w kierunku wyższego stężenia antygenu w porównaniu z alergenem typu dzikiego, co skutkowało znacznie wyższym stężeniem antygenu niezbędnym do sprowokowania połowy maksymalnego uwolnienia (Figura 4B). Dane te sugerują, że wygenerowany wariant zmutowany/fałdowy jest mniej alergizujący w porównaniu z białkiem typu dzikiego. Ta zmniejszona siła wyzwalania degranulacji IgE-zależnej podkreśla hipoalergiczny charakter wariantu fałdowego. Opierając się na tym teście, wariant fałdowy jest interesującym kandydatem do immunoterapii swoistej dla alergenu, ponieważ może powodować zmniejszenie skutków ubocznych związanych z IgE podczas leczenia.

figure-results-1
Rysunek 1: Humanizowane komórki RBL i reprezentatywna krzywa w kształcie dzwonu indukowanej sieciowaniem β-heksosaminidazy IgE-alergenów. Komórki RBL przylegają do kolb hodowlanych, co nadaje im kształt przypominający pręcik, gdy próbują się przyczepić (A). Idealny poziom konfluencji dla komórek, które mają zostać pobrane, wynosi nie więcej niż 90% (B). Komórki są pokazane w powiększeniu odpowiednio 40x i 10x. Komórki, które uczulono ludzką surowicą osoby uczulonej na pyłek brzozy, reagującej na prowokację rekombinowanym Bet v 1 (rBet v 1), głównym alergenem pyłku brzozy (C). Jako substytut uwalniania mediatora, aktywność β-heksozaminidazy mierzy się w supernatantach komórkowych. Krzywa dzwonowa wynika z monowalentnego zajęcia epitopów antygenu na IgE z powodu nadmiaru alergenu, który konkurencyjnie hamuje sieciowanie alergenu-IgE przy wysokich stężeniach antygenu. Innym wyjaśnieniem niskiego uwalniania przy wysokich stężeniach alergenów jest hamowanie szlaków wewnątrzkomórkowych w obecności nadmiaru antygenu. Do wyznaczenia stężenia alergenu niezbędnego do uzyskania połowy maksymalnego uwalniania wykorzystano linię regresji logarytmicznej opartą na wartościach doświadczalnych reprezentujących liniową część nachylenia krzywej uwalniania mediatora (D). Czerwona linia przerywana reprezentuje linię regresji logarytmicznej używaną do obliczeń. Wzór linii regresji jest pokazany na czerwono. Połowa maksymalnego zwolnienia jest zdefiniowana jako: połowa maksymalnego zwolnienia = (minimalna wartość zwolnienia + maksymalna wartość zwolnienia)/2. W tym przykładzie obliczone połowy maksymalnego zwolnienia wyniosło 20,6%. Reprezentatywna surowica ludzka użyta w tym eksperymencie została rozcieńczona w stosunku 1:20 do inkubacji z komórkami huRBL, a stężenie antygenu użyte do stymulacji wahało się od 100 μg / ml do 0,004 pg / ml Bet v 1. Test żywotności komórek, w tym przypadku test MTT, przeprowadzono na pozostałych komórkach po stymulacji antygenem w celu oceny wpływu surowicy uczulającej, a także rozcieńczenia antygenu na żywotność komórek i liczbę komórek (E). Nieleczone komórki tła i komórki poddane lizie (maksymalna liza) są pokazane jako linia przerywana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne krzywe procentowego uwalniania β-heksosaminidazy z pięciu różnych ludzkich surowic. Ten sam zakres stężenia antygenu rBet v 1 inkubowano z komórkami huRBL, które uczulono surowicami różnych osób uczulonych na pyłek brzozy. Istnieje wyraźna różnica w procentowym uwalnianiu między różnymi pacjentami, odpowiadająca nasileniu ich objawów. Zauważ, że pacjent #5 nie reaguje na główny alergen pyłku brzozy Bet v 1. Wszystkie pięć ludzkich surowic użytych do uzyskania tych krzywych uwalniania mediatorów rozcieńczono równomiernie w stosunku 1:20 do inkubacji z komórkami huRBL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reaktywność krzyżowa IgE pochodzącej z surowicy pyłku brzozy uwrażliwiła pacjentów na homologiczny alergen orzechów laskowych Bet v 1 Cor a 1. Dwie reprezentatywne surowice pacjentów uczulonych na pyłek brzozy silnie reagują na Bet v 1, a także w mniejszym stopniu na homologiczny alergen Cor a 1. Pacjent 2 wykazuje znaczącą reakcję na Cor a 1, a zatem prawdopodobnie będzie wykazywał objawy alergii jamy ustnej po spożyciu orzechów laskowych, w porównaniu z pacjentem 1, u którego uwalnianie mediatora jest prawie znikome. Linia przerywana reprezentuje kontrolę bez antygenu, która jest komórkami uwrażliwionymi na surowice ludzkie, ale nie stymulowanymi alergenem, a zatem służy jako wskazanie dla dolnego plateau sygnałowego / tła. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Porównanie procentowego uwalniania między rBet v 1 dzikim typem a hipoalergicznym wariantem składanym. Ta sama surowica osobnika uwrażliwionego na pyłek brzozy inkubowano z rBet v 1 typu dzikiego (wt) i hipoalergicznym wariantem fałdowym głównego alergenu pyłku brzozy (A). Mimo że uwalnianie mediatora jest widoczne w obu antygenach, istnieje wyraźna zmiana w kierunku wyższych stężeń antygenu, gdy porównamy wariant fałdowy z dzikim typem rBet v 1 dla tego samego procentu uwolnienia. Standardowym sposobem porównywania różnicy w procentowym uwalnianiu różnych antygenów jest obliczanie stężenia antygenu potrzebnego do osiągnięcia połowy maksymalnego uwalniania (B). Zwykle przeprowadza się to w replikach biologicznych (testowanie tego samego zakresu antygenów dla każdego alergenu w różnych surowicach ludzkich). Zazwyczaj, w celu wyciągnięcia istotnych wniosków, uwalnianie mediatora przeprowadza się za pomocą surowic od co najmniej 8 do 10 różnych pacjentów. Tutaj wyniki czterech różnych surowic są wykreślone jako przykład. Do analizy statystycznej wykorzystano sparowany test t. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; p ≤ 0,001; p ≤ 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Potencjalne pytania i rozwiązywanie problemówrozwiązanie
Zmienność między testami wynikająca ze zmienionej reakcji komórekUpewnij się, że liczba cykli pasaży komórkowych nie przekracza 20 do 30 pasaży. Zrób zamrożone zapasy we wczesnych przejściach do przyszłych eksperymentów.
Polegaj raczej na replikach biologicznych (użyciu różnych surowic) niż na technicznych.
Surowice zawierają niski poziom swoistych IgEZamiast 1:20 można zastosować niższe końcowe rozcieńczenie surowicy (tj. 1:10). I odwrotnie, surowice zawierające wysokie poziomy swoistych IgE można dodatkowo rozcieńczyć (1:30 lub 1:40).
Za mało komórek do wykonania testuUpewnij się, że zbieg w kolbie T-75 wynosi około 50-90%. Przejście więcej kolb.
Cytotoksyczne działanie surowic, tj. spowodowane niepełną inaktywacją dopełniaczaWykonaj test żywotności komórek oprócz testu uwalniania mediatora. Zwiększ stężenie Ag8, aby uniknąć niepełnej inaktywacji dopełniacza.
Słaby sygnałPopraw stosunek sygnału do szumu w teście poprzez rozcieńczenie 1x buforu Tyrode'a w tlenku deuteru (D2O) zamiast dH2O lub poprzez użycie surowicy o wyższych poziomach swoistej IgE dla alergenu będącego przedmiotem zainteresowania.
Alergen nie jest stabilny w buforze Tyrode'a (np. opady) Wykonaj testy stabilności w buforze 1x Tyrode przed procedurą testową. Nie zaleca się zastępowania bufora Tyrode.
Problemy ze znalezieniem odpowiedniego stężenia początkowego dla danego alergenuDostosowanie serii rozcieńczeń w celu pokrycia pełnej krzywej uwalniania (więcej etapów rozcieńczania, rozcieńczenie 1:20 zamiast 1:10).
Słaba wydajność testu wskazywana przez niski/brak sygnałuNależy unikać działania cytotoksycznego spowodowanego stymulacją surowicami lub antygenami (np. alergenami enzymatycznymi). Ostrożnie umyj i namocz komórki. Unikaj zbyt długiej ekspozycji na powietrze i zapobiegaj wysychaniu komórek.
Skąd mam wiedzieć, czy osiągnięto dolny plateau sygnałowy?Dodaj kontrolki "bez antygenu" do swojego talerza. Są to komórki uwrażliwione, które zostały pobudzone tylko buforem 1x Tyrode, ale bez alergenu.
Czy oprócz studzienek do maksymalnej lizy potrzebna jest kontrola pozytywna?Jako dodatkową kontrolę pozytywną można zastosować kombinację surowicy i antygenu, o której wiadomo, że powoduje degranulację, lub przeciwciało anty-FcεR1.
Ile studzienek potrzebuję?To zależy od serii miareczkowania, liczby antygenów i surowic, które chcesz przeanalizować. Zaplanuj układ 96-dołkowych płytek w zależności od tego, ile surowic/antygenów zamierzasz przetestować. Nie zapomnij dodać "kontroli bez antygenu", komórek tła (nieuczulonych, niestymulowanych), a także studzienek o maksymalnej lizie.
Ile surowic należy przebadać? I czy potrzebuję replikatów? Chociaż test jest dość solidny, istnieje pewna zmienność między testami ze względu na zmienioną reakcję komórki. W związku z tym zaleca się raczej poleganie na kontrpróbach biologicznych (przy użyciu różnych surowic) niż na kontrpróbach technicznych. Do analizy alergenów wystarczy co najmniej osiem różnych surowic. Jednak, jak pokazano na ryc. 4B, znaczące wyniki można już uzyskać przy użyciu mniejszej ilości surowicy.

Tabela 1: Rozwiązywanie problemów.

Dyskusja

Opisany tutaj test uwalniania mediatorów oparty na komórkach huRBL jest solidną metodą, którą można łatwo wykonać i wdrożyć w każdym laboratorium. Jedynym wymogiem jest to, że komórki muszą być hodowane w sterylnych warunkach. Test służy do oceny prawdopodobieństwa, że alergen lub źródło alergenne wywoła u pacjentów sieciowanie IgE i degranulację bazofili17. Test można łatwo dostosować do dowolnego alergenu lub źródła alergenów, o ile dostępna jest surowica pacjenta o wysokim poziomie swoistej IgE, rozpoznająca alergen będący przedmiotem zainteresowania. Zaleca się wykonanie testu żywotności komórek oprócz testu uwalniania mediatora w celu uwzględnienia wszelkich potencjalnych skutków cytotoksycznych, które mogą skutkować słabą wydajnością testu. Może to być spowodowane niepełną inaktywacją surowicy przez dopełniacz lub innymi efektami cytotoksycznymi pochodzącymi z surowicy. Nawet sam antygen, na przykład, ze względu na aktywność proteolityczną / enzymatyczną, może uszkodzić komórki huRBL. Zwykle używamy testu żywotności komórek z MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy) w celu oceny potencjalnych skutków cytotoksycznych. Test można łatwo przeprowadzić na komórkach huRBL pozostałych po pobraniu i przeniesieniu supernatantu komórkowego (patrz krok 6.3 protokołu). W porównaniu z innymi metodami immunochemicznymi, takimi jak ELISA i western blot, do określania potencjału alergicznego pojedynczych alergenów lub złożonych ekstraktów opartych na wiązaniu alergen-IgE, test ten może nie tylko wykryć wiązanie IgE z alergenem, ale może również zmierzyć funkcjonalność zarówno ludzkiej IgE, jak i alergenu, w celu sprowokowania degranulacji bazofili za pośrednictwem IgE18. W związku z tym może pomóc w badaniu nasilenia objawów alergicznych ex vivo przy użyciu surowic pacjentów. Zgłasza się, że test jest bardziej spójny i skuteczny niż klasyczne pasywne testy anafilaksji skórnej, ponieważ test wykorzystuje komórki RBL-2H3, które są stosunkowo łatwe w obsłudze i dają mniejszą zmienność wyników w porównaniu z komórkami pierwotnymi, takimi jak komórki tuczne lub ludzkie bazofile19,20. Oprócz tego test zapewnia dobre odwzorowanie aktywności biologicznej alergenów i może dokładnie oszacować całkowitą zawartość alergenów w danej złożonej próbce3. Aby zapoznać się z niektórymi krokami w protokole, zapoznaj się z Tabelą 1.

Jeśli chodzi o możliwość zastosowania tej wersji testu uwalniania mediatora, była ona wykorzystywana głównie do celów badawczych, ale także do standaryzacji ekstraktów alergizujących na podstawie ich aktywności biologicznej. Obejmuje to analizę różnych partii roztworów SPT, roztworu testu prowokacyjnego, a także ekstraktów stosowanych w immunoterapii swoistej dla alergenu; Jak pokazano dla pyłku, sierści kotów, roztoczy kurzu domowego i ekstraktów z orzeszków ziemnych, a także jadu pszczelego 3,17,21. Technika ta może być stosowana zwłaszcza w diagnostyce alergii pokarmowych, ponieważ może wykryć nawet minimalne ilości składników alergizujących w złożonych produktach spożywczych, takich jak orzeszki ziemne, mleko, pszenicai jaja. Pod tym względem stwierdzono również, że jest to cenne narzędzie do oceny alergenności alergenów pokarmowych pochodzenia zwierzęcego, takich jak tropomiozyny, i może pomóc w odróżnieniu silnych alergenów od niealergenów23. Jako narzędzie badawcze test służy do badania wpływu przetwarzania żywności, a także do oceny wpływu wiązania ligandów z alergenami i jego wpływu na alergenność24,25. Na przykład wykazano, że wiązanie Bet v 1 z ligandami nie wpływa na sieciowanie alergenu-IgE, chociaż spowodowało wzrost jego stabilności termicznej i proteolitycznej25. Test można wykorzystać do porównania reaktywności pacjenta na mniejsze i główne alergeny, a także do zbadania reaktywności krzyżowej homologów i izoform alergenów, jak pokazano w naszym przykładzie przy użyciu Bet v 1 i homologicznego alergenu pokarmowego Cor a 1 (ryc. 3). Jeśli chodzi o izoformy alergenów, test uwalniania mediatora zastosowano w celu zidentyfikowania głównego alergenu Amb a 1.01 jako najsilniejszej izoformy IgE-reaktywnej w pyłku ambrozji (Ambrosia artemisiifolia). Dla porównania, pozostałe dwie zidentyfikowane izoformy w ekstraktach z pyłku ambrozji, Amb a 1,02 i Amb a 1,03, wykazały zmniejszoną reaktywność na IgE26 pacjentów.

W ostatnich latach test został zastosowany do badania potencjalnych związków przeciwalergicznych i nowych hipoalergicznych wariantów alergenów, pomagając w identyfikacji odpowiednich kandydatów do immunoterapii swoistej dla alergenu27,28. Innym nowatorskim podejściem jest wykorzystanie testu do monitorowania skuteczności leczenia w trakcie immunoterapii swoistej dla alergenu. W związku z tym nasza grupa badawcza opracowała system hamowania testu huRBL, który dobrze korelował z obniżeniem skali objawów pacjenta podczas immunoterapii swoistej dla alergenu29. Test zaproponowano również do zbadania immunosupresyjnego wpływu TGFβ1 na indukowaną alergenem degranulację IgE-zapośredniczoną30.

Ograniczenia testu polegają na tym, że chociaż komórki huRBL mają pewne cechy komórek tucznych lub bazofili, nie naśladują one całkowicie naturalnej funkcji tych komórek efektorowych. Na przykład komórki tuczne szeroko eksprymują receptor rozpoznawania wzorców Toll-like receptor 4 (TLR4), niezbędny do rozpoznawania patogenów, podczas gdy jest on całkowicie niewystarczający w komórkach RBL-2H331. Ze względu na tę różnicę w funkcjonalności test nie odwzorowuje w pełni rzeczywistej sytuacji, o czym należy pamiętać podczas interpretacji danych. Ponadto, ponieważ komórki huRBL są rakowymi komórkami zasadochłonnymi, zmiany warunków hodowli i przedłużona hodowla mogą prowadzić do różnic fenotypowych prowadzących do zmienionych wyników między różnymi laboratoriami20. Kolejnym aspektem jest wybór stężenia alergenu, który należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu tej metody, ponieważ wysokie stężenia alergenów mogą powodować degranulację bez pośrednictwa IgE ze względu na obecność dużych ilości proteaz lub endotoksyn18. Inne ograniczenia to zależność od surowic ludzkich o stosunkowo wysokich swoistych poziomach IgE (klasa RAST 5-6) oraz potrzeba systemów hodowli komórkowych, co pozostaje przeszkodą, którą należy pokonać, aby wdrożyć tę technikę do codziennej rutyny klinicznej.

Oprócz tych ograniczeń, test huRBL stanowi cenne narzędzie badawcze w diagnostyce i leczeniu chorób alergicznych i może być stosowany w szerokim zakresie zastosowań.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Dr. Stefanowi Viethsowi z Zakładu Alergologii Molekularnej, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Niemcy, za dostarczenie humanizowanych/transfekowanych FcεRI komórek RBL i za wyrażenie zgody na napisanie tej pracy badawczej. Pragniemy podziękować prof. dr Fatimie Ferreirze za doskonałe informacje zwrotne. Chcielibyśmy również podziękować prof. dr Ronaldowi van Ree i dr Jaapowi Akkerdaasowi z Zakładu Immunologii Eksperymentalnej Centrów Medycznych Uniwersytetu w Amsterdamie, lokalizacja AMC, Amsterdam, Holandia, za wyrażenie zgody na publikację reprezentatywnych danych zawartych w tej pracy, które zostały wygenerowane w ramach projektu BM4SIT - innowacje dla alergii (www.BM4SIT.eu). Prace autorów były wspierane przez Austriacki Fundusz Naukowy (projekt P32189), przez program priorytetowy Uniwersytetu w Salzburgu Allergy-Cancer-BioNano Research Centre, przez program doktorancki Immunity in Cancer and Allergy-ICA finansowany przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF W01213) oraz przez projekt BM4SIT (grant nr 601763) z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej 7PR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-metylombelliliferyl N-acetylo-β-D-glukozaminidSigmaM2133
96-dołkowa płytka do komórek huRBL (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, mikropłytka z płaskim dnem)ThermoFisher Scientific167008
96-dołkowa płytka do roztworu substratu i supernatantu komórkowego (Greiner Bio-One niepoddane obróbce 96-dołkowe mikropłytki)Fisher Scientific655101
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma10735078001
Kwas cytrynowyApplichem131018
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS bez wapnia i magnezu)SigmaD8537
G418SigmaA1720
GlycineApplichemA3707
Inaktywowana termicznie płodowa surowica cielęca/bydlęca (FCSi)SigmaF0804
L-Glutamina (200 mM)SigmaG7513
Minimum Essential Medium Eagle z modyfikacją alfa, z rybonukleozydami, dezoksyrybonukleozydami i wodorowęglanem sodu, bez L-glutaminy, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowychSigmaM8042
Opti-MEM zredukowana pożywka surowicy, suplement GlutaMAXGibco/ThermoFisher Scientific
Penicylina-Streptomycyna (10 tys. jednostek Pen.  10 mg/ml Strep.)SigmaP4333
Chlorek sodu (NaCl)ApplichemA2942
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Applichem131638
Triton X-100SigmaX100
Trypsyna-EDTASigma59418C
Tyrode' s sólSigmaT2145
51985034

Bibliografia

  1. Curin, M., et al. Next-generation of allergen-specific immunotherapies: molecular approaches. Current Allergy and Asthma Reports. 18 (7), 39(2018).
  2. Okamoto-Uchida, Y., et al. Different results of IgE binding- and crosslinking-Based allergy tests caused by allergen immobilization. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 39 (10), 1662-1666 (2016).
  3. Vogel, L., Lüttkopf, D., Hatahet, L., Haustein, D., Vieths, S. Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system. Allergy. 60 (8), 1021-1028 (2005).
  4. Ocmant, A., et al. Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children. Clinical and Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).
  5. Platts-Mills, T. A. The role of immunoglobulin E in allergy and asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (8), Pt 2 1-5 (2001).
  6. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693-704 (2012).
  7. Lawrence, M. G., et al. Half-life of IgE in serum and skin: Consequences for anti-IgE therapy in patients with allergic disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (2), 422-428 (2017).
  8. Draber, P., Halova, I., Polakovicova, I., Kawakami, T. Signal transduction and chemotaxis in mast cells. European Journal of Pharmacology. 778, 11-23 (2016).
  9. Peebles, R. S. Prostaglandins in asthma and allergic diseases. Pharmacology & Therapeutics. 193, 1-19 (2019).
  10. Cyphert, J. M., et al. Allergic inflammation induces a persistent mechanistic switch in thromboxane-mediated airway constriction in the mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (1), 140-151 (2012).
  11. Méndez-Enríquez, E., Hallgren, J. Mast cells and their progenitors in allergic asthma. Frontiers Immunology. 10, 821(2019).
  12. Demoly, P., Lebel, B., Arnoux, B. Allergen-induced mediator release tests. Allergy. 58 (7), 553-558 (2003).
  13. Yamaga, S., et al. Decreased intracellular histamine concentration and basophil activation in anaphylaxis. Allergology International. 69 (1), 78-83 (2020).
  14. Huang, L., et al. A rapid and sensitive assay based on particle analysis for cell degranulation detection in basophils and mast cells. Pharmacological Research. 111, 374-383 (2016).
  15. González-Pérez, R., Poza-Guedes, P., Barrios Del Pino, Y., Matheu, V., Sánchez-Machín, I. Evaluation of major mite allergens from European standardized commercial extracts for in vivo diagnosis: addressing the need for precision medicine. Clinical and Translational Allergy. 9, 14(2019).
  16. Focke, M., Marth, K., Valenta, R. Molecular composition and biological activity of commercial birch pollen allergen extracts. European Journal of Clinical Investigation. 39 (5), 429-436 (2009).
  17. Hoffmann, A., Vieths, S., Haustein, D. Biologic allergen assay for in vivo test allergens with an in vitro model of the murine type I reaction. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (2), 227-232 (1997).
  18. Sun, N., Zhou, C., Zhou, X., Sun, L., Che, H. Use of a rat basophil leukemia (RBL) cell-based immunological assay for allergen identification, clinical diagnosis of allergy, and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy. Journal of Immunotoxicology. 12 (2), 199-205 (2015).
  19. Kaul, S., Hoffmann, A. Mediator release assay of rat basophil leukemia cells as alternative for passive cutaneous anaphylaxis testing (PCA) in laboratory animals. Altex. 18 (1), 55-58 (2001).
  20. Passante, E., Frankish, N. The RBL-2H3 cell line: its provenance and suitability as a model for the mast cell. Inflammation Research. 58 (11), 737-745 (2009).
  21. Kaul, S., et al. Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergen standardization. Clinical and Experimental Allergy. 37 (1), 141-150 (2007).
  22. Huang, J., et al. Application of in vitro and in vivo models in the study of food allergy. Food Science and Human Wellness. 7 (4), 235-243 (2018).
  23. Klueber, J., et al. Homologous tropomyosins from vertebrate and invertebrate: Recombinant calibrator proteins in functional biological assays for tropomyosin allergenicity assessment of novel animal foods. Clinical and Experimental Allergy. 50 (1), 105-116 (2020).
  24. Zhang, T., et al. Different thermal processing effects on peanut allergenicity. Journal of the Science of Food and Agriculture. 99 (5), 2321-2328 (2019).
  25. Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy. 74 (12), 2382-2393 (2019).
  26. Wolf, M., et al. Amb a 1 isoforms: Unequal siblings with distinct immunological features. Allergy. 72 (12), 1874-1882 (2017).
  27. Eichhorn, S., et al. Rational design, structure-activity relationship, and immunogenicity of hypoallergenic Pru p 3 variants. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (18), 1900336(2019).
  28. Abd Rani, N. Z., et al. Mechanistic studies of the antiallergic activity of phyllanthus amarus Schum. and Thonn. and its compounds. Molecules. 26 (3), (2021).
  29. Huber, S., et al. Does clinical outcome of birch pollen immunotherapy relate to induction of blocking antibodies preventing IgE from allergen binding? A pilot study monitoring responses during first year of AIT. Clinical and Translational Allergy. 8 (1), 39(2018).
  30. Araujo, G. R., et al. TGFβ1 mimetic peptide modulates immune response to grass pollen allergens in mice. Allergy. 75 (4), 882-891 (2020).
  31. Passante, E., Frankish, N. Deficiencies in elements involved in TLR4-receptor signalling in RBL-2H3 cells. Inflammation Research. 59, Suppl 2 185-186 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Degranulacja IgEhumanistyczne kom rki RBLaktywno beta heksamidazysieciowanie alergenuimmunoterapia alergenowaaktywacja bazofil wstandaryzacja ekstrakt w alergenowychkrzy owo reaktywne IgE

Powiązane artykuły