Artykuł metodologiczny

Humanizowany test uwalniania mediatora jako odczyt siły działania alergenów

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62702

⸱

29 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences, University of Salzburg

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy test uwalniania mediatora, wykorzystujący linię komórkową białaczki bazofilowej szczura transfekowaną ludzkim receptorem IgE, aby symulować degranulację komórek efektorowych zwykle obserwowaną w reakcjach alergicznych typu 1. Metoda ta bada aktywność biologiczną alergenów w sposób wysoce czuły, powtarzalny i dostosowany do potrzeb.

Streszczenie

Testy uwalniania mediatorów analizują in vitro degranulację i wydzielanie mediatorów za pośrednictwem immunoglobuliny E (IgE) oraz wydzielanie mediatorów przez komórki efektorowe, takie jak komórki tuczne i bazofile, po stymulacji seryjnymi rozcieńczeniami przypuszczalnych alergenów. Dlatego testy te stanowią niezbędne narzędzie, które naśladuje proces degranulacji in vivo, który zachodzi po ekspozycji na alergen u uczulonych pacjentów lub w punktowych testach skórnych. Ponadto testy te są zwykle stosowane do badania potencjału alergizującego białek i reaktywności surowic pacjentów. W tym miejscu opisujemy prosty 2-dniowy protokół wykorzystujący nieśmiertelnioną linię komórkową białaczki bazofilowej szczura transfekowaną i humanizowaną ludzkim receptorem błony plazmatycznej IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI). Ten wariant testu uwalniania mediatora jest solidnym, czułym i powtarzalnym systemem opartym na komórkach in vitro bez konieczności unieruchamiania antygenu do stałych matryc. Protokół składa się z następujących etapów: (1) inaktywacja ludzkich surowic dopełniacza, (2) zbieranie, siew i bierne uwrażliwienie komórek, (3) stymulacja antygenem w celu spowodowania uwalniania mediatora oraz (4) pomiar aktywności β-heksozaminidazy jako substytutu uwolnionych mediatorów stanu zapalnego, takich jak histamina. Test stanowi użyteczne narzędzie do oceny zdolności sieciowania alergenu-IgE do wyzwalania degranulacji komórek i może być stosowany do standaryzacji ekstraktów alergenowych, porównywania reaktywności pacjentów na mniejsze lub główne alergeny oraz na ekstrakty alergizujące (pyłek, sierść kotów itp.), w celu zbadania siły działania homologów alergenów, izoform i wariantów fałdowych (np. hipoalergiczności), a także wpływu ligandów na aktywność alergizującą. Nowsze zastosowanie obejmuje zastosowanie testu do monitorowania skuteczności leczenia w przebiegu immunoterapii alergenowej.

Wprowadzenie

Reakcje nadwrażliwości typu I, charakteryzujące się produkcją immunoglobuliny E (IgE) specyficzną dla danego antygenu, dotykają prawie jednej trzeciej światowej populacji. Reakcje te są związane z kilkoma objawami alergicznymi, takimi jak astma i zapalenie błony śluzowej nosa i spojówek, a nawet mogą prowadzić do ogólnoustrojowych reakcji zagrażających życiu1. W przeciwieństwie do testów in vivo, podejścia immunochemiczne, takie jak test immunoenzymatyczny (ELISA), nadają się wyłącznie do badania docelowego wiązania przeciwciał, ale nie zajmują się funkcjonalnym aspektem białek, które mogą powodować natychmiastowe reakcje nadwrażliwości. Unieruchomienie alergenów na solidnych podłożach (np. płytkach ELISA) może spowodować zmiany w ich integralności strukturalnej i zniszczenie epitopów istotnych dla alergii2. Nawet punktowe testy skórne (SPT), najpowszechniejsze narzędzie do potwierdzania uczulenia na niektóre alergeny, mają swoje ograniczenia w wykrywaniu objawowej alergii pokarmowej IgE-zależnej lub dostępności alergenów3,4. W celu znalezienia etycznej, wysoce specyficznej, czułej i opłacalnej metody badania biologicznej siły działania alergenów w wywoływaniu reakcji nadwrażliwości typu I, ustalono tzw. testy uwalniania mediatorowego.

Zasada tych testów opiera się na zdarzeniach następujących po fazie uczulenia i towarzyszącej im zdolności IgE do wiązania się z łańcuchem α receptorów o wysokim powinowactwie wyrażanych na powierzchni komórek efektorowych, takich jak komórki tuczne i bazofile. IgE jest wytwarzana głównie przez komórki plazmatyczne w tkance limfatycznej związanej z błoną śluzową. Chociaż jest to najmniej obfita immunoglobulina (około 0,05% u osób nieatopowych) we krwi, posiada niezwykle wysoką aktywność biologiczną, która jest główną przyczyną objawów alergicznych. Okres półtrwania IgE może wzrosnąć z 2-3 dni do kilku tygodni, a nawet miesięcy, gdy jest związany z jego receptorami na komórkach efektorowych. Późniejsze wiązanie antygenu ze zmiennym regionem dwóch cząsteczek IgE związanych z receptorem prowadzi do ich usieciowania, a następnie indukcji kaskady sygnałowej w komórce efektorowej, co prowadzi do degranulacji i uwolnienia kilku mediatorów prozapalnych powodujących rozszerzenie naczyń krwionośnych, takich jak histamina, proteazy serynowe (np. tryptaza) i prostaglandyny5,6,7. Wydzielanie cytokin, takich jak interleukina 4 (IL-4) i IL-13, jest odpowiedzialne za utrzymanie odpowiedzi zapalnego T helper 2 (Th2) i przełączanie klas limfocytów B na komórki plazmatyczne wytwarzające IgE5,8,9. Z drugiej strony, uwolniony tromboksan powoduje zwężenie oskrzeli, a leukotrieny stymulują skurcz mięśni gładkich, a także nieszczelność naczyniową i odgrywają kluczową rolę w zapaleniu dróg oddechowych prowadzącym do astmy lub alergicznego nieżytu nosa10,11.

Narzędzia badawcze do analizy większości wyżej wymienionych mediatorów zostały już stworzone, choć z pewnymi poważnymi wadami. Testy tryptazy są odpowiednimi metodami klinicznymi do pomiaru ogólnoustrojowej anafilaksji poprzez aktywację komórek tucznych, ale ich czułość i swoistość w diagnostyce alergii jest zbyt niedokładna w porównaniu z metodami złotego standardu, takimi jak SPT. Z drugiej strony, testy leukotrienów cysteinylowych nie są w stanie zdiagnozować alergii na β-laktamy lub niesteroidowe leki przeciwzapalne12. Protokoły pomiaru histaminy jako głównego mediatora uwalnianego w reakcjach alergicznych zostały opracowane już w latach 60. Po uwolnieniu do krwi obwodowej histamina jest natychmiast rozkładana przez metylotransferazy histaminowe, co skutkuje okresem półtrwania osocza wynoszącym zaledwie kilka minut, co sprawia, że jej analiza jest dość trudna13. Oprócz jej niestabilności, wykazano, że monitorowanie histaminy ma niską swoistość i czułość w przypadku alergii na leki, a także komercyjnych białek spożywczych i jadów os12.

Modele in vitro z efektorowymi liniami komórkowymi zostały wprowadzone jako alternatywa dla pracochłonnych procedur izolacji i hodowli bazofili od pacjentów alergicznych w celu przeprowadzenia testów uwalniania. W związku z tym ustanowiono test oparty na białaczce bazofilowej szczurów (RBL) z wykorzystaniem linii komórkowej RBL-2H33. Ponieważ ta linia komórkowa nie jest zdolna do wiązania ludzkiej IgE, najpierw została transfekowana łańcuchem α, β i γ ludzkiego receptora błony plazmatycznej IgE (FcεRI). Wygenerowano i przetestowano kilka klonów pod kątem poziomów ekspresji i jednorodności ludzkiego łańcucha α, z których klon RBL-30/25 okazał się najbardziej obiecującym kandydatem do testów in vitro. Kaskada sygnalizacyjna indukowana po aktywacji receptora transfekowanego klonu została przetestowana za pomocą testów mobilizacji wapnia. Jako wskaźnik degranulacji i substytut uwalniania histaminy zmierzono enzym lizosomalny β-heksosaminidazę, który ma istotną zaletę w postaci wyższej stabilności14. Uwalnianie mediatora za pomocą komórek RBL-30/25 sięga nawet 100% i dlatego służy do badania surowic pochodzących od pacjentów alergicznych. Test został przetestowany pod kątem uwalniania mediatora po wyzwaniu uwrażliwionych komórek dostępnymi w handlu ekstraktami alergenowymi. Doprowadziło to do stwierdzenia, że istnieje ogromna różnica w składzie (nawet 60-krotna w odniesieniu do całkowitej zawartości białka) ekstraktów alergenowych pochodzących od różnych producentów i stosowanych w diagnostyce (np. SPT) lub podejściach terapeutycznych3,15,16.

Niniejszym podajemy szczegółowy opis protokołu RBL do przeprowadzenia testu uwalniania mediatora przy użyciu surowicy od alergicznych dawców. Podczas biernego uczulenia IgE w surowicy jest wychwytywane przez receptor FcεR1 o wysokim powinowactwie wyrażany na powierzchni komórek zasadochłonnych. Po stymulacji antygenem związane IgE specyficzne dla antygenu są sieciowane, wywołując degranulację komórek i uwalnianie mediatora β-heksozaminidazy. Aktywność β-heksozaminidazy jest następnie mierzona przy użyciu odpowiedniego substratu. Do testu użyto komórek huRBL-2H3, które w poniższym protokole określono jako huRBL. Protokół opisuje standardową serię rozcieńczeń antygenu z 8 krokami rozcieńczonymi w stosunku 1:10 w zakresie od 1 μg/ml do 0,1 pg/ml alergenu.

Protokół

Etyczne zatwierdzenie stosowania surowic pochodzących od pacjentów uczulonych na pyłki brzozy zostało uzyskane od holenderskiego komitetu etyki (numer zatwierdzenia: NL65758.018.18).

1. Procedury bezpieczeństwa

  1. Praca w sterylnych warunkach przy użyciu stołu warsztatowego klasy bezpieczeństwa biologicznego 2 podczas pierwszego dnia eksperymentu (poziom bezpieczeństwa biologicznego 2). Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi bezpieczeństwa stosowania surowicy ludzkiej.

2. Inaktywacja dopełniacza w surowicy ludzkiej

  1. Zebrać gęstą kulturę komórek P3X63Ag8.653 (zwanych dalej komórkami Ag8) z kolby do hodowli komórkowych i przenieść je do probówki wirówkowej.
    1. Dla tych komórek należy użyć następującej pożywki hodowlanej: Modified Eagles's Minimum Essential Medium o obniżonym stężeniu w surowicy, 1% penicylina-streptomycyna (100 jednostek Pen., 0,1 mg/ml Strep), 5% inaktywowana termicznie płodowa surowica cielęca/bydlęca (FCSi).
  2. Odwirować komórki Ag8 przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze pokojowej.
  3. Ponownie zawiesić osad komórkowy do końcowego stężenia około 1 x 106 komórek/ml w pożywce huRBL (Minimum Essential Medium Eagle z modyfikacją alfa, 4 mM L-glutamina, 5% FCSi, 1% G418 (100% zapasu: 10 g/125 mL dH2O).
    UWAGA: Utrzymuj komórki Ag8 poprzez pasażowanie również do wykorzystania w przyszłości.
  4. Rozcieńczyć surowice ludzkie w stosunku 1:10 w zawiesinie komórek Ag8. Końcowe rozcieńczenie surowicy w teście wyniesie 1:20,
    UWAGA: W przypadku surowic o niskiej swoistej IgE można zastosować rozcieńczenie końcowe 1:5 (1:10).
  5. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5%-7% CO2 .

3. Zbieranie i wysiewanie komórek huRBL

  1. Ostrożnie odessać pożywkę z kolby do hodowli komórek T-75, nie dotykając komórek huRBL (komórki huRBL przylegają). Upewnij się, że komórki są w około 50%-90% zlewne.
    UWAGA: W zależności od konfluencji komórek, zawartość komórek w gęstej kolbie do hodowli komórek T-75 jest zwykle wystarczająca na jedną do dwóch 96-dołkowych płytek.
  2. Umyj komórki dwukrotnie, dodając 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Dodać DPBS po przeciwnej stronie kolby, a nie bezpośrednio na komórki.
  3. Odessać DPBS i dodać 5 ml wstępnie podgrzanej 1x trypsyny-EDTA (0,05%/0,02% EDTA rozcieńczonego w DPBS) w celu oddzielenia komórek.
  4. Inkubować kolbę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Odłączyć komórki, ostrożnie stukając w kolbę.
  6. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i napełnij pożywką huRBL lub DPBS w celu rozcieńczenia trypsyny-EDTA.
  7. Odwirować komórki przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki huRBL w celu zliczenia komórek.
  9. Policz komórki i rozcieńcz je w pożywce huRBL, aby uzyskać końcowe stężenie 2 x 106 komórek/ml.
  10. Użyj sterylnej 96-dołkowej płytki i dodaj 50 μl zawiesiny komórek huRBL na studzienkę, co odpowiada 1 x 105 komórek/basenik.

4. Pasywne uczulenie komórek huRBL

  1. Odwirować wstępnie inkubowaną zawiesinę Ag8/surowicy przez 5 minut przy 250 x g.
  2. Przenieść 50 μl odwirowanej zawiesiny Ag8/surowicy do każdej studzienki zawierającej komórki huRBL, nie naruszając osadu komórek Ag8.
    1. Uwzględnij kontrolę bez antygenu, które są uwrażliwionymi, ale niestymulowanymi komórkami (nie dodawaj antygenu), służąc jako wskazanie dla dolnego plateau sygnałowego / tła. Studzienki kontrolne tła i maksymalnej lizy nie muszą być uwrażliwiane surowicą. Zamiast tego dodaj 50 μl pożywki huRBL do studzienek kontrolnych.
  3. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C i 5%-7% CO2 .

5. Degranulacja stymulowana antygenem i uwalnianie mediatora

  1. Przygotować wcześniej rozcieńczenie antygenu w 1x buforze Tyrode'a (9,5 g/l soli Tyrode'a, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 g/l wodorowęglanu sodu (NaHCO3) w dH2O). Potrzebna jest końcowa ilość 100 μl na studzienkę.
    UWAGA: Nie każdy alergen, zarówno oczyszczony z naturalnych źródeł, jak i wyprodukowany rekombinacyjnie, może być stabilny w buforze 1x Tyrode. Dlatego przed procedurą testową należy przeprowadzić testy stabilności w buforze 1x Tyrode. Alternatywnie, rozcieńczyć 1x bufor Tyrode'a w tlenku deuteru (D2O), aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu w teście.
  2. Wykonać 8 rozcieńczeń interesującego antygenu z serii rozcieńczeń 1:10 w probówkach reakcyjnych, zaczynając od 10 lub 1 μg/ml białka.
    UWAGA: Zawsze należy wcześniej przetestować serię rozcieńczeń. Alternatywnie można dostosować serię rozcieńczeń 1:10 (np. 1:5, 1:20 lub 1:30) w celu pokrycia pełnej krzywej uwalniania. Ponadto stężenie początkowe może się różnić w zależności od konfiguracji eksperymentalnej.
  3. Aby umyć komórki huRBL posiane na płytce 96-dołkowej, należy najpierw usunąć pożywkę komórkową zawierającą surowice, ostrożnie zasyszając, odwracając i stukając płytką w papier chłonny.
  4. Przemyć komórki 200 μl 1x buforu Tyrodesa na studzienkę. Traktuj wszystkie studzienki podobnie.
    UWAGA: Powoli dodawaj roztwór myjący do komórek, aby im nie przeszkadzać.
  5. Pozostaw na około 30 s i powtórz krok prania w sumie trzy razy.
  6. Po dodaniu roztworu myjącego po raz ostatni, pozostaw roztwór w studzienkach, aż będzie gotowy do dalszego dodawania rozcieńczania antygenu.
    UWAGA: Unikaj wystawiania komórek na działanie powietrza zbyt długo.
  7. Przenieść 100 μl roztworu antygenu do każdej studzienki zawierającej wstępnie uczulone komórki huRBL.
    UWAGA: W przypadku analizowania kilku różnych parametrów należy przenieść poszczególne próbki z serii rozcieńczeń na dodatkową niewiążącą płytkę 96-dołkową (użyć tego samego układu, co na płytce huRBL), a następnie przenieść je za pomocą pipety wielokanałowej bezpośrednio na płytkę kuwety huRBL. W ten sposób można uniknąć zbyt długiego wystawiania komórek na działanie powietrza, co może skutkować słabą wydajnością testu (niższy sygnał / jego brak).
  8. Przykryj studzienki kontrolne (maksymalna liza i nieuczulone komórki tła) 100 μl 1x buforu Tyrode. Nie należy stymulować tych studzienek kontrolnych antygenem.
    1. Dodatkowo dodać 100 μl buforu 1x Tyrode do uczulonych studzienek bez antygenu z serii rozcieńczeń, co jest potrzebne do uwzględnienia niezależnego od antygenu spontanicznego uwalniania uczulonych komórek podczas analizy danych.
  9. Inkubować komórki huRBL przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5%-7% CO2 .

6. Pomiar fluorescencji aktywności β-heksozaminidazy

  1. Studzienki o maksymalnej kontroli lizy należy potraktować 10 μl 10% Triton X-100 na studzienkę i odpowiednio wymieszać, aby całkowicie zlizować komórki i uzyskać 100% uwolnienie β-heksosaminidazy.
  2. Dodać 50 μl roztworu substratu do nowej, niewiążącej płytki 96-dołkowej. Roztwór substratu dla jednej płytki 96-dołkowej: 5 ml 0,1 M buforu do oznaczania cytrynowego, pH 4,5; i 80 μl 10 mM N-acetylo-β-D-glukozaminidu 4-metyloumbelirylu.
  3. Przenieść 50 μl supernatantu komórkowego ze wszystkich studzienek na nową płytkę zawierającą roztwór substratu.
    UWAGA: Ostrożnie odpipetować supernatant z płytki huRBL, aby nie zakłócić działania komórek huRBL.
  4. Inkubować płytkę z roztworem substratu i supernatantem komórkowym przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić konwersję substratu fluorogenicznego.
    UWAGA: Zachowaj płytkę huRBL do testu żywotności komórek.
  5. Dodać 100 μl roztworu zatrzymującego (15 g/l glicyny, 11,7 g/l NaCl rozpuszczony wdH2O, pH 10,7) do dołka.
  6. Zmierzyć fluorescencję przy wzbudzeniu 360 nm i emisji 465 nm za pomocą czytnika płytkowego.

7. Analiza danych

  1. Do podstawowych obliczeń zwolnienia procentowego użyj dowolnego arkusza kalkulacyjnego.
  2. W przypadku odejmowania tła/usuwania linii bazowej odejmij średnią studzienek tła od wszystkich innych studzienek.
  3. Obliczyć średnią z maksymalnych studzienek do lizy i wyrazić dane serii rozcieńczeń w procentach. W ten sposób można wyrazić dane jako procent uwalniania komórek znormalizowany do maksymalnego uwalniania enzymu spowodowanego lizą komórki.
  4. Pełne krzywe uwalniania mediatora dawka-odpowiedź są najlepiej przedstawione jako wykresy XY ze stężeniem antygenu na logarytmie na osi X i procentem uwalniania mediatora na osi Y.
  5. Dodaj wartości kontroli bez antygenu jako linię przerywaną, aby wskazać tło lub dolny płaskowyż.
    UWAGA: Kilka podobnie traktowanych surowic można porównać przy użyciu tej strategii normalizacji. Dla bezpośredniego porównania zaleca się ponadto obliczenie połowy maksymalnego uwolnienia, które jest stężeniem antygenu (w ng/ml) niezbędnym do połowy maksymalnego uwolnienia, zdefiniowanego jako średnia maksymalnych i minimalnych wartości na krzywą. Stężenie antygenu w celu stymulacji połowy maksymalnego uwalniania oblicza się przez interpolację połowy maksymalnej wartości uwalniania do linii regresji logarytmicznej.

Wyniki

Test uwalniania mediatorów, oparty na komórkach huRBL (Rysunek 1A oraz B), co skutkuje dzwonokształtną krzywą zależności efektu od dawki (Rysunek 1C). W celu uproszczonej reprezentacji danych, stężenie antygenu niezbędne do uzyskania połowy maksymalnego uwalniania mediatorów można obliczyć przy użyciu regresji liniowej (Rysunek 1D). Przeprowadza się test żywotności komórek, aby wykluczyć efekty cytotoksyczne wynikające z zastosowania serum uczulającego lub antygenu użytego do stymulacji (Rycina 1E). Analizę tę można wykorzystać do badania reaktywności różnych surowic na określony antygen. W naszym przypadku 4 z 5 surowic pochodzących od pacjentów z alergią na pyłek brzozy zareagowały na stymulację Bet v 1. W surowicy nr 1 odnotowano najwyższe uwalnianie mediatorów (Rycina 2). Surowica nr 5 nie wykazała odpowiedzi na stymulację Bet v 1, w związku z czym może ona reagować na inne alergeny pyłku brzozy (np. Bet v 2, profilinę). Dane te wskazują, że Bet v 1 jest silnym alergenem odpowiedzialnym za objawy alergiczne zapśredniczone przez IgE. Dzięki zastosowaniu testu huRBL można ocenić reaktywność krzyżową IgE wobec homologicznych alergenów (Rycina 3). W tym przypadku oboje pacjenci z alergią na pyłek brzozy zareagowali prawidłowo na Bet v 1, podczas gdy tylko pacjent nr 2 zareagował również na Cor a 1, homologiczny do Bet v 1 alergen pokarmowy występujący w orzechach laskowych. Na podstawie tych danych można przypuszczać, że pacjent nr 2 posiada wyższy poziom przeciwciał IgE wykazujących reaktywność krzyżową z Cor a 1 niż pacjent nr 1, co skutkuje występowaniem objawów alergii jamy ustnej po spożyciu orzechów laskowych. Analizie i porównaniu z ich odpowiednikami typu dzikiego może zostać poddana również ocena hipoalergiczności wariantów mutantów alergenów (zmniejszona aktywność) (Rysunek 4). W przedstawionym przykładzie krzywa uwalniania wariantu sfałdowanego przesunęła się w stronę wyższego stężenia antygenu w porównaniu z alergenem typu dzikiego, co skutkowało znacznie wyższym stężeniem antygenu niezbędnym do wywołania połowy maksymalnego uwalniania (Rycina 4B). Dane te sugerują, że wygenerowany wariant mutant/fold jest mniej alergenny w porównaniu z białkiem typu dzikiego. Zmniejszona zdolność do wywoływania degranulacji zależnej od IgE podkreśla hipoalergiczny charakter wariantu fold. Na podstawie tego testu wariant fold stanowi interesującego kandydata do immunoterapii specyficznej dla alergenów, ponieważ może on powodować ograniczenie działań niepożądanych związanych z IgE podczas leczenia.

Obrazy z mikroskopii i wykresy wpływu stężenia Bet v1 na uwalnianie mediatorów i żywotność komórek.
Rysunek 1: Humanizowane komórki RBL i reprezentatywna krzywa dzwonowata uwalniania β-heksaminidazy indukowanego przez sieciowanie IgE-alergen. Komórki RBL przylegają do kolb hodowlanych, co nadaje im kształt pręcikowaty podczas próby przytwierdzenia (A). Optymalny poziom konfluencji dla zbioru komórek nie powinien przekraczać 90% (B). Komórki przedstawiono odpowiednio przy powiększeniu 40x i 10x. Komórki uczulone ludzkim surowicą osoby z alergią na pyłek brzozy, reagujące na stymulację rekombinowanym Bet v 1 (rBet v 1), głównym alergenem pyłku brzozy (C). Jako wskaźnik uwalniania mediatorów mierzono aktywność β-heksaminidazy w supernatantach komórkowych. Krzywa dzwonowata wynika z monowalentnego zajęcia epitopów antygenowych na IgE z powodu nadmiaru alergenu, co konkurencyjnie hamuje sieciowanie alergen-IgE przy wysokich stężeniach antygenu. Innym wyjaśnieniem niskiego uwalniania przy wysokich stężeniach alergenu jest hamowanie szlaków wewnątrzkomórkowych w obecności nadmiaru antygenu. Aby wyznaczyć stężenie alergenu niezbędne do uzyskania połowy maksymalnego uwalniania, zastosowano linię regresji logarytmicznej opartą na wartościach eksperymentalnych reprezentujących liniową część nachylenia krzywej uwalniania mediatorów (D). Czerwona przerywana linia przedstawia linię regresji logarytmicznej wykorzystaną do obliczeń. Wzór linii regresji przedstawiono na czerwono. Połowa maksymalnego uwalniania jest definiowana jako: połowa maksymalnego uwalniania = (minimalna wartość uwalniania + maksymalna wartość uwalniania)/2. W tym przykładzie obliczona połowa maksymalnego uwalniania wyniosła 20,6%. Reprezentatywna ludzka surowica użyta w tym eksperymencie została rozcieńczona 1:20 do inkubacji z komórkami huRBL, a stężenie antygenu użyte do stymulacji wynosiło od 100 µg/mL do 0,004 pg/mL Bet v 1. Test żywotności komórek, w tym przypadku test MTT, przeprowadzono na pozostałych komórkach po stymulacji antygenem, aby ocenić wpływ surowicy uczulającej oraz rozcieńczenia antygenu na żywotność i liczbę komórek (E). Niepoddane działaniu komórki tła oraz komórki lizowane (maksymalna liza) przedstawiono jako linie przerywane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres uwalniania mediatorów w zależności od stężenia Bet v 1; pięć krzywych odpowiedzi surowiczej; wyniki testu alergicznego.
Rysunek 2: Reprezentatywne krzywe procentowego uwalniania β-heksaminidazy dla pięciu różnych surowic ludzkich. Ten sam zakres stężeń antygenu rBet v 1 inkubowano z komórkami huRBL uczulonymi surowicami osób z różnym stopniem uczulenia na pyłek brzozy. Widoczna jest wyraźna różnica w procencie uwalniania między poszczególnymi pacjentami, co odpowiada nasileniu ich objawów. Należy zauważyć, że pacjent nr 5 nie wykazuje reaktywności na główny alergen pyłku brzozy Bet v 1. Wszystkie pięć użytych surowic ludzkich do uzyskania tych krzywych uwalniania mediatorów zostało rozcieńczonych identycznie w stosunku 1:20 przed inkubacją z komórkami huRBL. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres uwalniania mediatora w zależności od stężenia antygenu; odpowiedź alergiczna Bet v 1, Cor a 1 u pacjentów.
Rycina 3: Reaktywność krzyżowa IgE pochodzących z surowic pacjentów uczulonych na pyłek brzozy z homologicznym alergenem laskowego Cor a 1, homologiem Bet v 1. Dwie reprezentatywne surowice pacjentów uczulonych na pyłek brzozy wykazują silną reakcję na Bet v 1, a w mniejszym stopniu na homologiczny alergen Cor a 1. Pacjent 2 wykazuje znaczącą reakcję na Cor a 1, a zatem prawdopodobnie wystąpią u niego objawy alergii jamy ustnej po spożyciu orzechów laskowych, w porównaniu z pacjentem 1, u którego uwalnianie mediatora jest niemal pomijalne. Linia przerywana reprezentuje kontrolę bez antygenu, czyli komórki uczulone surowicami ludzkimi, ale niestymulowane alergenem, i tym samym służy jako wskazanie dolnego plateau sygnału/tła. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres i wykres pudełkowy uwalniania mediatorów w funkcji stężenia antygenu; wyniki badań rBet v 1.
Rysunek 4: Porównanie procentowego uwalniania między typem dzikim rBet v 1 a hipoalergennym wariantem z innym sfałdowaniem. To samo surowica osobnika uczulonego na pyłki brzozy była inkubowana z typem dzikim (wt) rBet v 1 oraz hipoalergennym wariantem z innym sfałdowaniem głównego alergenu pyłku brzozy (A). Mimo że uwalnianie mediatorów obserwuje się w przypadku obu antygenów, widoczne jest wyraźne przesunięcie w stronę wyższych stężeń antygenu przy porównaniu wariantu z innym sfałdowaniem do typu dzikiego rBet v 1 dla tego samego procentu uwalniania. Standardowym sposobem porównywania różnic w procentowym uwalnianiu różnych antygenów jest obliczenie stężenia antygenu potrzebnego do osiągnięcia połowy maksymalnego uwalniania (B). Jest to zazwyczaj przeprowadzane w powtórzeniach biologicznych (testowanie tego samego zakresu antygenów dla każdego alergenu w różnych surowicach ludzkich). Zazwyczaj, aby wyciągnąć jakiekolwiek istotne wnioski, badanie uwalniania mediatorów przeprowadza się z surowic pochodzących od co najmniej 8 do 10 różnych pacjentów. Tutaj wyniki z czterech różnych surowic przedstawiono jako przykład. Do analizy statystycznej zastosowano test t dla prób zależnych. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Potencjalne pytania i rozwiązywanie problemówRozwiązanie
Zmienność międzyanalizowa wynikająca ze zmiennej responsywności komórekNależy dopilnować, aby liczba przejść komórkowych nie przekroczyła 20–30 pasaży. Należy przygotować zamrożone zapasy z wczesnych pasaży do przyszłych eksperymentów. 
Należy opierać się na powtórzeniach biologicznych (wykorzystanie różnych surowic) zamiast na powtórzeniach technicznych.
Surowice zawierają niskie poziomy swoistego IgEMożna zastosować mniejsze końcowe rozcieńczenie surowicy (np. 1:10) zamiast 1:20. I odwrotnie, surowice zawierające wysokie poziomy swoistych przeciwciał IgE można rozcieńczyć w stopniu większym (1:30 lub 1:40).
Niewystarczająca liczba komórek do przeprowadzenia analizyUpewnij się, że stopień konfluencji w kolbie T-75 wynosi około 50-90%. Przelej więcej kolb.
Efekty cytotoksyczne surowic, t. j. wynikające z niepełnej inaktywacji dopełniaczaNależy przeprowadzić analizę żywotności komórek dodatkowo do analizy uwalniania mediatorów. Należy zwiększyć stężenie Ag8, aby uniknąć niepełnej inaktywacji dopełniacza. 
Słaby sygnałPopraw stosunek sygnału do szumu w analizie poprzez rozcieńczenie 1x buforu Tyroidea w tlenku deuteru (D2O) zamiast dH2LUB poprzez zastosowanie surowicy o wyższym poziomie swoistych przeciwciał IgE przeciwko badanemu alergenowi.
Alergen nie jest stabilny w buforze Tyrode'a (np. ulega wytrąceniu) Przed przystąpieniem do procedury analizy należy przeprowadzić testy stabilności w 1x buforze Tyrode'a. Nie zaleca się stosowania zamienników buforu Tyrode'a. 
Problemy z doborem odpowiedniego stężenia początkowego dla poszczególnych alergenówDostosowanie szeregu rozcieńczeń w celu objęcia pełnej krzywej uwalniania (zwiększenie liczby stopni rozcieńczenia, rozcieńczenie 1:20 zamiast 1:10).
Słaba wydajność analizy objawiająca się niskim lub brakiem sygnałuNależy unikać efektów cytotoksycznych wynikających zarówno z zastosowania surowic, jak i stymulacji antygenowej (np. alergenami enzymatycznymi). Komórki należy starannie przemyć i namoczyć. Należy unikać zbyt długiego narażenia na powietrze i zapobiegać wysychaniu komórek. 
W jaki sposób stwierdzić, że osiągnięto dolne plateau sygnału?Dodaj do płytki kontrolki „bez antygenu”. Są to uwrażliwione komórki, które zostały stymulowane wyłącznie buforem Tyrode’a (1x), bez dodatku alergenu.
Czy w dodatku do studzienek z maksymalną lizą potrzebna jest kontrola pozytywna?Jako dodatkową kontrolę pozytywną można zastosować kombinację surowicy i antygenu o znanym działaniu wywołującym degranulację lub przeciwciało anty-FcεR1.
Ilu dołków potrzebuję?Zależy to od serii miareczkowania oraz liczby antygenów i surowic, które chcą Państwo przeanalizować. Należy zaplanować układ płytek 96-dołkowych w zależności od liczby testowanych surowic/antygenów. Należy pamiętać o dodaniu kontroli „bez antygenu”, komórek tła (niesensybilizowanych, niestymulowanych) oraz dołków z maksymalną lizą.
Ile próbek surowicy należy przetestować? I czy wymagane są powtórzenia? Mimo że test jest dość powtarzalny, występuje pewna zmienność między poszczególnymi analizami ze względu na różną reaktywność komórek. Dlatego zaleca się poleganie na powtórzeniach biologicznych (z wykorzystaniem różnych surowic) zamiast na powtórzeniach technicznych. Do analizy alergenów wystarczy minimum osiem różnych surowic. Jednak, jak pokazano na Ryc. 4B, istotne wyniki można uzyskać już przy użyciu mniejszej liczby surowic.

Tabela 1: Rozwiązywanie problemów.

Dyskusja

Opisany tutaj test uwalniania mediatorów oparty na komórkach huRBL jest solidną metodą, którą można łatwo wykonać i wdrożyć w każdym laboratorium. Jedynym wymogiem jest to, że komórki muszą być hodowane w sterylnych warunkach. Test służy do oceny prawdopodobieństwa, że alergen lub źródło alergenne wywoła u pacjentów sieciowanie IgE i degranulację bazofili17. Test można łatwo dostosować do dowolnego alergenu lub źródła alergenów, o ile dostępna jest surowica pacjenta o wysokim poziomie swoistej IgE, rozpoznająca alergen będący przedmiotem zainteresowania. Zaleca się wykonanie testu żywotności komórek oprócz testu uwalniania mediatora w celu uwzględnienia wszelkich potencjalnych skutków cytotoksycznych, które mogą skutkować słabą wydajnością testu. Może to być spowodowane niepełną inaktywacją surowicy przez dopełniacz lub innymi efektami cytotoksycznymi pochodzącymi z surowicy. Nawet sam antygen, na przykład, ze względu na aktywność proteolityczną / enzymatyczną, może uszkodzić komórki huRBL. Zwykle używamy testu żywotności komórek z MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy) w celu oceny potencjalnych skutków cytotoksycznych. Test można łatwo przeprowadzić na komórkach huRBL pozostałych po pobraniu i przeniesieniu supernatantu komórkowego (patrz krok 6.3 protokołu). W porównaniu z innymi metodami immunochemicznymi, takimi jak ELISA i western blot, do określania potencjału alergicznego pojedynczych alergenów lub złożonych ekstraktów opartych na wiązaniu alergen-IgE, test ten może nie tylko wykryć wiązanie IgE z alergenem, ale może również zmierzyć funkcjonalność zarówno ludzkiej IgE, jak i alergenu, w celu sprowokowania degranulacji bazofili za pośrednictwem IgE18. W związku z tym może pomóc w badaniu nasilenia objawów alergicznych ex vivo przy użyciu surowic pacjentów. Zgłasza się, że test jest bardziej spójny i skuteczny niż klasyczne pasywne testy anafilaksji skórnej, ponieważ test wykorzystuje komórki RBL-2H3, które są stosunkowo łatwe w obsłudze i dają mniejszą zmienność wyników w porównaniu z komórkami pierwotnymi, takimi jak komórki tuczne lub ludzkie bazofile19,20. Oprócz tego test zapewnia dobre odwzorowanie aktywności biologicznej alergenów i może dokładnie oszacować całkowitą zawartość alergenów w danej złożonej próbce3. Aby zapoznać się z niektórymi krokami w protokole, zapoznaj się z Tabelą 1.

Jeśli chodzi o możliwość zastosowania tej wersji testu uwalniania mediatora, była ona wykorzystywana głównie do celów badawczych, ale także do standaryzacji ekstraktów alergizujących na podstawie ich aktywności biologicznej. Obejmuje to analizę różnych partii roztworów SPT, roztworu testu prowokacyjnego, a także ekstraktów stosowanych w immunoterapii swoistej dla alergenu; Jak pokazano dla pyłku, sierści kotów, roztoczy kurzu domowego i ekstraktów z orzeszków ziemnych, a także jadu pszczelego 3,17,21. Technika ta może być stosowana zwłaszcza w diagnostyce alergii pokarmowych, ponieważ może wykryć nawet minimalne ilości składników alergizujących w złożonych produktach spożywczych, takich jak orzeszki ziemne, mleko, pszenicai jaja. Pod tym względem stwierdzono również, że jest to cenne narzędzie do oceny alergenności alergenów pokarmowych pochodzenia zwierzęcego, takich jak tropomiozyny, i może pomóc w odróżnieniu silnych alergenów od niealergenów23. Jako narzędzie badawcze test służy do badania wpływu przetwarzania żywności, a także do oceny wpływu wiązania ligandów z alergenami i jego wpływu na alergenność24,25. Na przykład wykazano, że wiązanie Bet v 1 z ligandami nie wpływa na sieciowanie alergenu-IgE, chociaż spowodowało wzrost jego stabilności termicznej i proteolitycznej25. Test można wykorzystać do porównania reaktywności pacjenta na mniejsze i główne alergeny, a także do zbadania reaktywności krzyżowej homologów i izoform alergenów, jak pokazano w naszym przykładzie przy użyciu Bet v 1 i homologicznego alergenu pokarmowego Cor a 1 (ryc. 3). Jeśli chodzi o izoformy alergenów, test uwalniania mediatora zastosowano w celu zidentyfikowania głównego alergenu Amb a 1.01 jako najsilniejszej izoformy IgE-reaktywnej w pyłku ambrozji (Ambrosia artemisiifolia). Dla porównania, pozostałe dwie zidentyfikowane izoformy w ekstraktach z pyłku ambrozji, Amb a 1,02 i Amb a 1,03, wykazały zmniejszoną reaktywność na IgE26 pacjentów.

W ostatnich latach test został zastosowany do badania potencjalnych związków przeciwalergicznych i nowych hipoalergicznych wariantów alergenów, pomagając w identyfikacji odpowiednich kandydatów do immunoterapii swoistej dla alergenu27,28. Innym nowatorskim podejściem jest wykorzystanie testu do monitorowania skuteczności leczenia w trakcie immunoterapii swoistej dla alergenu. W związku z tym nasza grupa badawcza opracowała system hamowania testu huRBL, który dobrze korelował z obniżeniem skali objawów pacjenta podczas immunoterapii swoistej dla alergenu29. Test zaproponowano również do zbadania immunosupresyjnego wpływu TGFβ1 na indukowaną alergenem degranulację IgE-zapośredniczoną30.

Ograniczenia testu polegają na tym, że chociaż komórki huRBL mają pewne cechy komórek tucznych lub bazofili, nie naśladują one całkowicie naturalnej funkcji tych komórek efektorowych. Na przykład komórki tuczne szeroko eksprymują receptor rozpoznawania wzorców Toll-like receptor 4 (TLR4), niezbędny do rozpoznawania patogenów, podczas gdy jest on całkowicie niewystarczający w komórkach RBL-2H331. Ze względu na tę różnicę w funkcjonalności test nie odwzorowuje w pełni rzeczywistej sytuacji, o czym należy pamiętać podczas interpretacji danych. Ponadto, ponieważ komórki huRBL są rakowymi komórkami zasadochłonnymi, zmiany warunków hodowli i przedłużona hodowla mogą prowadzić do różnic fenotypowych prowadzących do zmienionych wyników między różnymi laboratoriami20. Kolejnym aspektem jest wybór stężenia alergenu, który należy wziąć pod uwagę przy stosowaniu tej metody, ponieważ wysokie stężenia alergenów mogą powodować degranulację bez pośrednictwa IgE ze względu na obecność dużych ilości proteaz lub endotoksyn18. Inne ograniczenia to zależność od surowic ludzkich o stosunkowo wysokich swoistych poziomach IgE (klasa RAST 5-6) oraz potrzeba systemów hodowli komórkowych, co pozostaje przeszkodą, którą należy pokonać, aby wdrożyć tę technikę do codziennej rutyny klinicznej.

Oprócz tych ograniczeń, test huRBL stanowi cenne narzędzie badawcze w diagnostyce i leczeniu chorób alergicznych i może być stosowany w szerokim zakresie zastosowań.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Dr. Stefanowi Viethsowi z Zakładu Alergologii Molekularnej, Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Niemcy, za dostarczenie humanizowanych/transfekowanych FcεRI komórek RBL i za wyrażenie zgody na napisanie tej pracy badawczej. Pragniemy podziękować prof. dr Fatimie Ferreirze za doskonałe informacje zwrotne. Chcielibyśmy również podziękować prof. dr Ronaldowi van Ree i dr Jaapowi Akkerdaasowi z Zakładu Immunologii Eksperymentalnej Centrów Medycznych Uniwersytetu w Amsterdamie, lokalizacja AMC, Amsterdam, Holandia, za wyrażenie zgody na publikację reprezentatywnych danych zawartych w tej pracy, które zostały wygenerowane w ramach projektu BM4SIT - innowacje dla alergii (www.BM4SIT.eu). Prace autorów były wspierane przez Austriacki Fundusz Naukowy (projekt P32189), przez program priorytetowy Uniwersytetu w Salzburgu Allergy-Cancer-BioNano Research Centre, przez program doktorancki Immunity in Cancer and Allergy-ICA finansowany przez Austriacki Fundusz Naukowy (FWF W01213) oraz przez projekt BM4SIT (grant nr 601763) z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej 7PR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-metylombelliliferyl N-acetylo-β-D-glukozaminidSigmaM2133
96-dołkowa płytka do komórek huRBL (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, mikropłytka z płaskim dnem)ThermoFisher Scientific167008
96-dołkowa płytka do roztworu substratu i supernatantu komórkowego (Greiner Bio-One niepoddane obróbce 96-dołkowe mikropłytki)Fisher Scientific655101
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma10735078001
Kwas cytrynowyApplichem131018
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS bez wapnia i magnezu)SigmaD8537
G418SigmaA1720
GlycineApplichemA3707
Inaktywowana termicznie płodowa surowica cielęca/bydlęca (FCSi)SigmaF0804
L-Glutamina (200 mM)SigmaG7513
Minimum Essential Medium Eagle z modyfikacją alfa, z rybonukleozydami, dezoksyrybonukleozydami i wodorowęglanem sodu, bez L-glutaminy, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowychSigmaM8042
Opti-MEM zredukowana pożywka surowicy, suplement GlutaMAXGibco/ThermoFisher Scientific
Penicylina-Streptomycyna (10 tys. jednostek Pen.  10 mg/ml Strep.)SigmaP4333
Chlorek sodu (NaCl)ApplichemA2942
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Applichem131638
Triton X-100SigmaX100
Trypsyna-EDTASigma59418C
Tyrode' s sólSigmaT2145
51985034

Bibliografia

  1. Curin, M., et al. Next-generation of allergen-specific immunotherapies: molecular approaches. Current Allergy and Asthma Reports. 18 (7), 39(2018).
  2. Okamoto-Uchida, Y., et al. Different results of IgE binding- and crosslinking-Based allergy tests caused by allergen immobilization. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 39 (10), 1662-1666 (2016).
  3. Vogel, L., Lüttkopf, D., Hatahet, L., Haustein, D., Vieths, S. Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system. Allergy. 60 (8), 1021-1028 (2005).
  4. Ocmant, A., et al. Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children. Clinical and Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).
  5. Platts-Mills, T. A. The role of immunoglobulin E in allergy and asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (8), Pt 2 1-5 (2001).
  6. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693-704 (2012).
  7. Lawrence, M. G., et al. Half-life of IgE in serum and skin: Consequences for anti-IgE therapy in patients with allergic disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (2), 422-428 (2017).
  8. Draber, P., Halova, I., Polakovicova, I., Kawakami, T. Signal transduction and chemotaxis in mast cells. European Journal of Pharmacology. 778, 11-23 (2016).
  9. Peebles, R. S. Prostaglandins in asthma and allergic diseases. Pharmacology & Therapeutics. 193, 1-19 (2019).
  10. Cyphert, J. M., et al. Allergic inflammation induces a persistent mechanistic switch in thromboxane-mediated airway constriction in the mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (1), 140-151 (2012).
  11. Méndez-Enríquez, E., Hallgren, J. Mast cells and their progenitors in allergic asthma. Frontiers Immunology. 10, 821(2019).
  12. Demoly, P., Lebel, B., Arnoux, B. Allergen-induced mediator release tests. Allergy. 58 (7), 553-558 (2003).
  13. Yamaga, S., et al. Decreased intracellular histamine concentration and basophil activation in anaphylaxis. Allergology International. 69 (1), 78-83 (2020).
  14. Huang, L., et al. A rapid and sensitive assay based on particle analysis for cell degranulation detection in basophils and mast cells. Pharmacological Research. 111, 374-383 (2016).
  15. González-Pérez, R., Poza-Guedes, P., Barrios Del Pino, Y., Matheu, V., Sánchez-Machín, I. Evaluation of major mite allergens from European standardized commercial extracts for in vivo diagnosis: addressing the need for precision medicine. Clinical and Translational Allergy. 9, 14(2019).
  16. Focke, M., Marth, K., Valenta, R. Molecular composition and biological activity of commercial birch pollen allergen extracts. European Journal of Clinical Investigation. 39 (5), 429-436 (2009).
  17. Hoffmann, A., Vieths, S., Haustein, D. Biologic allergen assay for in vivo test allergens with an in vitro model of the murine type I reaction. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (2), 227-232 (1997).
  18. Sun, N., Zhou, C., Zhou, X., Sun, L., Che, H. Use of a rat basophil leukemia (RBL) cell-based immunological assay for allergen identification, clinical diagnosis of allergy, and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy. Journal of Immunotoxicology. 12 (2), 199-205 (2015).
  19. Kaul, S., Hoffmann, A. Mediator release assay of rat basophil leukemia cells as alternative for passive cutaneous anaphylaxis testing (PCA) in laboratory animals. Altex. 18 (1), 55-58 (2001).
  20. Passante, E., Frankish, N. The RBL-2H3 cell line: its provenance and suitability as a model for the mast cell. Inflammation Research. 58 (11), 737-745 (2009).
  21. Kaul, S., et al. Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergen standardization. Clinical and Experimental Allergy. 37 (1), 141-150 (2007).
  22. Huang, J., et al. Application of in vitro and in vivo models in the study of food allergy. Food Science and Human Wellness. 7 (4), 235-243 (2018).
  23. Klueber, J., et al. Homologous tropomyosins from vertebrate and invertebrate: Recombinant calibrator proteins in functional biological assays for tropomyosin allergenicity assessment of novel animal foods. Clinical and Experimental Allergy. 50 (1), 105-116 (2020).
  24. Zhang, T., et al. Different thermal processing effects on peanut allergenicity. Journal of the Science of Food and Agriculture. 99 (5), 2321-2328 (2019).
  25. Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy. 74 (12), 2382-2393 (2019).
  26. Wolf, M., et al. Amb a 1 isoforms: Unequal siblings with distinct immunological features. Allergy. 72 (12), 1874-1882 (2017).
  27. Eichhorn, S., et al. Rational design, structure-activity relationship, and immunogenicity of hypoallergenic Pru p 3 variants. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (18), 1900336(2019).
  28. Abd Rani, N. Z., et al. Mechanistic studies of the antiallergic activity of phyllanthus amarus Schum. and Thonn. and its compounds. Molecules. 26 (3), (2021).
  29. Huber, S., et al. Does clinical outcome of birch pollen immunotherapy relate to induction of blocking antibodies preventing IgE from allergen binding? A pilot study monitoring responses during first year of AIT. Clinical and Translational Allergy. 8 (1), 39(2018).
  30. Araujo, G. R., et al. TGFβ1 mimetic peptide modulates immune response to grass pollen allergens in mice. Allergy. 75 (4), 882-891 (2020).
  31. Passante, E., Frankish, N. Deficiencies in elements involved in TLR4-receptor signalling in RBL-2H3 cells. Inflammation Research. 59, Suppl 2 185-186 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Degranulacja IgEhumanistyczne komórki RBLaktywność beta-heksamidazysieciowanie alergenuimmunoterapia alergenowaaktywacja bazofilówstandaryzacja ekstraktów alergenowychkrzyżowo reaktywne IgE
Humanizowany test uwalniania mediatora jako odczyt siły działania alergenów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.