Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy transportu jądrowego w permeabilizowanych neuronach korowych myszy

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62710

⸱

9 lipca 2021

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins School of Medicine, 2Whiting School of Engineering, Johns Hopkins University

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy niezawodną metodę selektywnej przenikania błony plazmatycznej pierwotnych mysich neuronów korowych do automatycznej analizy transportu nukleocytoplazmatycznego neuronów o wysokiej zawartości.

Streszczenie

Zakłócenie transportu nukleocytoplazmatycznego jest coraz częściej związane z patogenezą chorób neurodegeneracyjnych. Co więcej, coraz częściej dostrzega się specyficzne dla komórek różnice w strukturze kompleksu porów jądrowych, co powoduje potrzebę dostosowania metod transportu jądrowego do użytku w neuronach. Testy komórek przepuszczalnych, w których błona plazmatyczna jest selektywnie perforowana przez digitoninę, są szeroko stosowane do badania biernego i aktywnego transportu jądrowego w unieśmiertelnionych liniach komórkowych, ale nie zostały zastosowane do kultur neuronalnych. W naszych początkowych próbach zaobserwowaliśmy szybką utratę integralności błony jądrowej w pierwotnych neuronach korowych myszy wystawionych na działanie nawet niskich stężeń digitoniny. Postawiliśmy hipotezę, że błony jądrowe neuronów mogą być wyjątkowo podatne na utratę wsparcia cytoplazmatycznego. Po przetestowaniu wielu podejść mających na celu poprawę stabilności jądrowej, zaobserwowaliśmy optymalną integralność jądrową po hipotonicznej lizie w obecności skoncentrowanej poduszki albuminowej surowicy bydlęcej. Jądra neuronalne przygotowane w ten sposób niezawodnie importują rekombinowany ładunek fluorescencyjny w sposób zależny od energii, ułatwiając analizę importu jądrowego za pomocą mikroskopii o wysokiej zawartości z automatyczną analizą. Przewidujemy, że metoda ta znajdzie szerokie zastosowanie w badaniach pasywnego i aktywnego transportu jądrowego w neuronach pierwotnych.

Wprowadzenie

Zakłócenie transportu nukleocytoplazmatycznego, regulowanego transportu białek i RNA między jądrem a cytoplazmą, jest coraz częściej związane z patogenezą chorób neurodegeneracyjnych (ostatnio przeglądane1). My i inni opisaliśmy strukturalne i funkcjonalne zakłócenie nukleocytoplazmatycznego aparatu transportowego w pośmiertnych modelach tkankowych i zwierzęcych stwardnienia zanikowego bocznego C9orf72 (ALS) i otępienia czołowo-skroniowego (FTD), choroby Alzheimera i choroby Huntingtona2,3,4,5. Mechanizmy i funkcjonalne konsekwencje zakłócenia transportu nukleocytoplazmatycznego w neurodegeneracji oraz podejścia do ratownictwa terapeutycznego są obszarami trwających badań.

Pory jądrowe to duże kompleksy transbłonowe ~30 białek nukleoporynowych, które umożliwiają dyfuzję małych cząsteczek przez błonę jądrową, ale coraz bardziej ograniczają przepływ ładunków >40 kD przez barierę przepuszczalności nukleoporyn bogatych w fenyloalaninę-glicynę (FG) w kanale centralnym6. Większe ładunki zawierające sekwencje sygnału lokalizacji jądrowej (NLS) lub sygnału eksportu jądrowego (NES) są poddawane aktywnemu transportowi za pośrednictwem receptora przez pory za pośrednictwem receptorów transportu jądrowego (importyny i eksportyny) oraz stromemu gradientowi małej GTPazy Ran przez błonę jądrową (ostatnio przeglądane7). Opracowano szeroki wachlarz metod analizy dynamiki transportu jądrowego w hodowanych komórkach, w tym transportu ładunków endogennych i oznakowanych konstruktów reporterowych, które służą jako substraty dla głównych podklas receptorów transportowych. Takie podejścia zostały łatwo zaadaptowane do neuronów2,5,8 i zapewniają odczyt perturbacji transportu jądrowego w kontekście nienaruszonej, żywej komórki. Jednak w testach na żywych komórkach możliwość bezpośredniego manipulowania reakcjami transportu jądrowego lub badania ich w izolacji od innych procesów komórkowych jest ograniczona.

W testach komórek przepuszczalnych, błona plazmatyczna jest selektywnie perforowana, a cytoplazma jest uwalniana, pozostawiając nienaruszoną otoczkę jądrową i kompleksy porów jądrowych i zdolne do przeprowadzenia pasywnego lub zależnego od energii transportu dwukierunkowego9,10. Takie reakcje transportu można łatwo odtworzyć poprzez dodanie lizatów całokomórkowych, frakcji cytoplazmatycznych lub oczyszczonych rekombinowanych białek transportu jądrowego i ich ładunków. W związku z tym testy komórek przepuszczalnych pozwalają na szeroki zakres badań biochemicznych lub biofizycznych, w tym dostarczanie rekombinowanych lub syntetycznych białek i RNA istotnych dla badania chorób neurodegeneracyjnych.

Biorąc pod uwagę doniesienia o specyficznych dla komórek różnicach w strukturze kompleksu porów jądrowych i dynamice transportu11,12, naszym celem było dostosowanie testu komórek permeabilizowanych do stosowania w pierwotnych kulturach neuronalnych. Chociaż jest szeroko stosowany do analizy transportu jądrowego w unieśmiertelnionych liniach komórkowych, pomimo wyczerpujących poszukiwań w literaturze, nie znaleźliśmy żadnych opublikowanych doniesień na temat przenikania błony komórkowej neuronów, które potwierdzałyby zachowanie integralności błony jądrowej. Większość protokołów opiera się na digitoninie, detergencie, który celuje w unikalny skład cholesterolu błony plazmatycznej, aby perforować błonę jądrową, pozostawiając błonę jądrową nienaruszoną13. Nasze początkowe próby użycia digitoniny w pierwotnych neuronach korowych myszy wykazały natychmiastową utratę integralności błony jądrowej, o czym świadczy dyfuzja fluorescencyjnego dekstranu o masie 70 kD do jądra. Postawiliśmy hipotezę, że pęknięcie otoczki jądrowej może być spowodowane mechanicznymi zaburzeniami spowodowanymi utratą wsparcia cytoplazmatycznego i przetestowaliśmy wiele metod optymalizacji, w tym stłoczenie molekularne, stabilizację cytoszkieletu i alternatywne metody lizy komórek. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodę szybkiej hipotonicznej przepuszczalności przy użyciu skoncentrowanej poduszki albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w celu ochrony jąder neuronalnych i ułatwienia dalszej analizy importu jądra neuronalnego. Niedawno zastosowaliśmy tę metodę do oceny mechanizmu rozerwania białka powtórzeń dipeptydowych w C9orf72-ALS/FTD14 i przewidujemy, że będzie ona miała szerokie zastosowanie w przyszłych badaniach pasywnego i aktywnego transportu jądrowego w neuronach pierwotnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Po pierwsze, protokół opisuje generowanie pierwotnych kultur neuronalnych (krok 1) i przygotowanie materiałów do testu transportu (krok 2), następnie sam test transportu (kroki 3-4) oraz akwizycję i analizę obrazu (krok 5). Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (ACUC) Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.

1. Pierwotne hodowle neuronów korowych myszy

  1. Przygotować roztwory podstawowe.
    1. Bufor rozwarstwiający: Połącz 50 ml 10x HBSS, 15 ml 1 M glukozy (w dH2O), 5 ml 1 M HEPES, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu i 5 ml 100x penicyliny-streptomycyny. Doprowadzić objętość do 500 ml za pomocą dH2O. Sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Papaina: Rozcieńczyć papainę do 30 mg/ml za pomocą buforu rozwarstwiającego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. DNaza: Rozcieńczyć DNazę I do 10 mg/ml za pomocą buforu rozwarstwiającego. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Pożywka posiewowa: Dodać 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2% B-27, 1% Glutamax i 1% penicyliny-streptomycyny do podłoża neuropodstawnego. Sterylny filtr i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Pożywka: Dodaj 2% B-27, 1% Glutamax i 1% penicyliny-streptomycyny do pożywki Neurobasel. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Pokryj talerze.
    1. Pokryć 96-dołkowe płytki ze szkłem optycznym poli-D-lizyną (20 μg/ml) i lamininą (1:100) w sterylnym dH2O. Umieść płytkę w inkubatorze na noc.
    2. W dniu sekcji przepłukać studzienki trzykrotnie sterylnym dH2O i zastąpić pożywką Neurobasel. Utrzymuj równowagę w inkubatorze przez co najmniej 30 minut.
  3. Rozkrój i strawij korę.
    UWAGA: Przeprowadź sekcję na czystej ławce przy użyciu autoklawowanych narzędzi, aby zapobiec zanieczyszczeniu kultury.
    1. Poddaj eutanazji ciężarną kobietę E15-16 C57BL/6J przez zwichnięcie szyjki macicy. Spryskaj brzuch 70% etanolem. Pracuj szybko. Za pomocą nożyczek i kleszczy zębatych wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej, wytnij macicę, a następnie przenieś zarodki z worka owodniowego na szalkę Petriego. Odetnij głowy zarodkom nożyczkami i zbierz głowy na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą bufor preparacyjny.
    2. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczy, aby usunąć czaszkę i oderwać opony mózgowe. Przenieść całe mózgi na świeżą 10 cm szalkę Petriego zawierającą bufor do preparacji. Oddziel półkule i usuń struktury podkorowe.
    3. Posiekaj korę mózgową sterylną żyletką i przenieś ją do stożkowej probówki zawierającej 5 ml buforu do preparacji. Dodać 100 μl papainy (zapas 30 mg/ml, końcowe stężenie 0,6 mg/ml) i 50 μl DNazy (zapas 10 mg/ml, końcowe stężenie 0,1 mg/ml). Trawić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 min.
      UWAGA: Trawienie trwające dłużej niż 10 minut jest szkodliwe dla przeżycia komórek.
    4. Usunąć sklarowany osad i przemyć dwukrotnie 10 ml podłoża galwanicznego, aby zatrzymać trawienie. Pozwól chusteczce osiąść grawitacyjnie pomiędzy każdym praniem.
    5. Delikatnie rozcierać w pożywce galwanicznej o pojemności 2 ml za pomocą pipety P1000, aż duże kawałki tkanki znikną (około 20 razy). Dodać kolejne 8 ml pożywki galwanicznej, aby zwiększyć objętość do około 10 ml i przepuścić zawiesinę komórek przez sitko do komórek o wielkości 40 μm.
  4. Płytka i utrzymanie neuronów.
    1. Wirować przy 200 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w podgrzanym pożywce galwanicznej. Policz komórki i rozcieńcz do 500 000 komórek/ml w podłożu galwanicznym. Delikatnie odwróć, aby wymieszać i przenieść do sterylnego zbiornika wielokanałowego.
    2. Odessać pożywkę neuropodstawową z dołków i natychmiast dodać 100 μl komórek do dołka za pomocą pipety wielokanałowej (50 000 komórek/studzienkę). Nie dopuścić do wyschnięcia powlekanych studzienek.
    3. Po 24 godzinach preparacji należy zamienić 50% pożywki na pożywkę. Kontynuuj 50% zmianę pożywki co drugi dzień do 5-7 dnia, aby wykonać testy in vitro.

2. Przygotowanie komponentów testu transportu jądrowego

  1. Bufor transportowy (TRB, zaadaptowany z15)
    1. Aby przygotować 5x TRB, rozpuść 100 mM HEPES, 550 mM KOAc, 10 mM Mg(OAc)2, 25 mM NaOAc, 2,5 mM EGTA i 1,25 M sacharozy wdH2O. Dostosuj pH do 7,3 i przechowuj bufor w temperaturze 4 °C.
    2. W dniu eksperymentu transportowego przygotuj 1x TRB-BSA. Rozcieńczyć 5x TRB w dH2O, dodać koktajl inhibitorów proteazy wolny od EDTA, 2 mM DTT i 50 mg/ml BSA.
  2. Miks odzyskiwania energii (ERM, na podstawie 9,16)
    1. Aby przygotować 20x ERM, rozpuść 2mM soli litowej ATP, 2 mM soli litowej GTP, 80 mM fosforanu kreatyny i 400 U/ml kinazy kreatynowej w 1x TRB.
    2. Zamrażać podwielokrotności jednorazowego użytku w temperaturze -20 °C.
  3. Preparat ekstraktu z całych komórek (WCE, źródło receptorów transportowych i białek cyklu Ran).
    UWAGA: Można użyć ekstraktu cytoplazmatycznego lub ekstraktu z całych komórek (WCE), w zależności od celów eksperymentalnych. W tym miejscu przygotowanie WCE jest opisane jako używane w początkowych testach transportu neuronów10.
    1. Wyhoduj HEK293T komórek do konfluencji w piętnastu 150-milimetrowych szalkach hodowlanych. Odłączyć za pomocą trypsyny-EDTA, ponownie zawiesić w pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej w celu zahamowania trypsyny i komórek osadu w dawce 200 x g przez 5 min. Ponownie zawieś komórki w 10 ml lodowatego 1x TRB ze świeżo dodanym koktajlem inhibitorów proteazy.
    2. Sonikacja na lodzie, 3 x 10 impulsów, za pomocą ręcznego sonikatora z sondą. Klarować przez odwirowanie w temperaturze 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Zmierzyć stężenie białka (docelowo 8–10 mg/ml) i błyskawicznie zamrozić porcje jednorazowego użytku w ciekłym azocie przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.
  4. Rekombinowany ładunek jądrowy importowany
    UWAGA: Protokół transportowy w krokach 3-5 może zostać dostosowany do każdego fluorescencyjnego ładunku do transportu jądrowego, w celu zbadania aktywnej lub pasywnej ścieżki transportu jądrowego, która jest przedmiotem zainteresowania. W tym miejscu protokół opisuje ekspresję i import jądrowy Rango (regulowany przez Ran-regulowany importin β cargo), który składa się z domeny wiążącej importynę β importyny α1 otoczonej białkami fluorescencyjnymi CyPet i YPet14,17. Rango to wszechstronny czujnik, który może być używany zarówno do testów FRET, jak i importu jądrowego, gdzie działa jako bezpośredni import β ładunku.
    1. Przekształć komórki E. coli BL21 (DE3) w plazmid Rango (zawierający N-końcowy znacznik 6-He) przez szok cieplny w następujący sposób. Rozmrozić 50 μl podwielokrotności komórek BL21(DE3) na lodzie. Połącz z plazmidem 100-200 ng. Wymieszać, stukając w probówkę 4-5 razy, a następnie inkubować na lodzie przez 30 minut przed umieszczeniem na płytce o temperaturze 42 °C na 40 sekund. Natychmiast przenieś z powrotem na lód na kolejne 2-5 minut.
    2. Dodać 900 μl pożywki SOC w temperaturze pokojowej i inkubować na wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przed rozprowadzeniem komórek na wstępnie podgrzanej płytce agarowej (1,5% agar, pożywka LB, 100 μg/ml ampicyliny). Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia lub natychmiast zużyć do produkcji białka.
    3. Rozpocznij produkcję białka od zaszczepienia trzech 25 ml kultur starterowych w probówkach o pojemności 50 ml z rosnącą liczbą kolonii (~ 3-10) z płytki BL21 (DE3). Po inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C na wytrząsarce, wybrać kultury o średnicy od600 nm < 1,0 w celu zaszczepienia kultury o pojemności 1 litra w pożywce LB przy użyciu kolby Fernbacha o pojemności 2,8 l bez przegrody. Rosnąć w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia OD600 nm = 0,1-0,3,
      UWAGA: Użycie starszych płytek agarowych BL21(DE3) LB lub kultury starterowe o dużej gęstości (OD600 nm >1,0) może zmniejszyć wydajność i czystość preparatu białkowego.
    4. Schłodzić do temperatury pokojowej (22-25 °C) umieszczając na lodzie. Indukować ekspresję białka za pomocą 0,3 mM IPTG (stężenie końcowe) i inkubować na wytrząsarce (80-120 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 12-14 godzin.
    5. Zebrać komórki przez odwirowanie (6 000 x g, 15 min, 4 °C) i ponownie zawiesić w 30 ml lodowatego 10 mM imidazolu w PBS (pH 7,4), uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy bez EDTA. Liza po dwóch przejściach przez lodowatą francuską komorę ciśnieniową i sklaczenie lizatu przez odwirowanie (16 000 x g, 40 min, 4 °C).
    6. Inkubować lizat z wysokoprzepływową żywicą agarozową o powinowactwie do niklu (30-60 min, 4 °C), używając 1 ml żywicy na 1 l kultury E. coli. Umieścić żywicę w kolumnach chromatograficznych, przemyć 10-20 objętościami lodowatego 10 mM imidazolu/PBS (pH 7,4). Elute Rango z przyrostem 25 mM imidazolu/PBS (25-200 mM, pH 7,4), przy użyciu 5-krotnej objętości złoża w każdym etapie.
    7. Użyj SDS-PAGE, aby wybrać i połączyć partie o najwyższej czystości.
    8. Przygotować bufor XB, rozpuszczając 10 mM HEPES, 100 mM KCl, 10 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 i 50 mM sacharozy wdH2O. Dostosować pH do 7,7.
    9. Białko w buforze XB należy dializować i zagęszczać przez odwirowanie (7500 x g, 4 °C) na urządzeniu do ultrafiltracji z granicą masy cząsteczkowej 30 kD.
    10. Zmierzyć stężenie białka metodą Bradforda lub inną preferowaną metodą, a przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C zamrozić podwielokrotności jednorazowego użytku w ciekłym azocie.

3. Określenie optymalnych warunków przepuszczalności błony plazmatycznej

UWAGA: Ze względu na różnice między każdą partią neuronów, optymalizuj warunki przepuszczalności dla każdej partii neuronów. Należy to zrobić tego samego dnia przed wykonaniem testów transportu jądrowego.

  1. Na plastikowej 96-dołkowej płytce do stopniowania przygotować seryjne rozcieńczenie Tris-HCl pH 7,5 (w celu wywołania pęcznienia osmotycznego), przy 0 μM, 10 μM, 20 μM i 40 μM w każdym z trzech stężeń BSA: 50 mg/mL, 100 mg/ml i 150 mg/ml (w celu stłoczenia molekularnego/wsparcia mechanicznego). Podgrzej roztwory do temperatury 37 °C.
  2. Opłucz neurony raz w podgrzanym PBS. Wyjąć PBS i przenieść Tris/BSA z płytki pomostowej. Powrót do inkubatora na 4 minuty.
  3. Wyjąć z inkubatora i umieścić płytkę hodowlaną na lodzie. Płukać 2 x 5 min w 1x TRB-BSA (jak przygotowany w kroku 2.1.2).
  4. Po ostatnim płukaniu dodaj 70 kD dekstranu znakowanego Texas Red (0,6 mg/ml) i Hoechst (1:10 000) w 1x TRB-BSA. Pozostaw talerz na stole w temperaturze pokojowej na 15 minut, chroniony przed światłem.
  5. Obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego w celu identyfikacji buforu i stężenia BSA, w którym procent przepuszczalności błony plazmatycznej jest najwyższy, ale błona jądrowa nadal ogranicza wnikanie dekstranu 70 kD (docelowo ≥ 80%). Użyj tych warunków w kolejnych eksperymentach.

4. Test importu jądrowego

  1. Przygotuj reakcje transportowe
    UWAGA: Aby umożliwić jednoczesne rozpoczęcie wszystkich reakcji w płytce, przygotuj mieszaninę reakcyjną na plastikowej 96-dołkowej płytce przejściowej na lodzie, przed przenikaniem neuronów. Należy przeprowadzić co najmniej dwie replikacje techniczne dla każdego warunku. Dołącz elementy sterujące na każdej płycie.
    1. Przygotować podstawową mieszaninę reakcyjną składającą się z 2,5 mg/ml WCE, 1x ERM, ładunek fluorescencyjny (200 nM Rango) i Hoechst 33342 (10 mg / ml, 1:10 000) w 1x TRB-BSA, wystarczająca na 50 μl na studzienkę. OPCJA: Dołącz 70 kD dekstranu Texas oznaczonego na czerwono, aby umożliwić monitorowanie integralności porów jądrowych podczas całej reakcji transportu, pamiętając, że do zobrazowania wykluczenia dekstranu jądrowego potrzebna jest mikroskopia konfokalna.
      UWAGA: Podane stężenie WCE jest rozsądnym punktem wyjścia do optymalizacji testu. Przeprowadzenie badań empirycznych każdej partii WCE w celu określenia optymalnego stężenia wymaganego do efektywnego importu jądrowego pożądanego ładunku. Należy unikać łączenia danych z replik przygotowanych z różnymi partiami WCE, ponieważ wydajność importu może się różnić.
    2. Przygotuj kontrole, w tym (1) sam ładunek: Rango, ale bez WCE lub ERM oraz (2) inhibitor: ładunek fluorescencyjny, ERM, WCE i importazol 100 μM (IPZ, małocząsteczkowy inhibitor importyny β18). Jako alternatywny inhibitor należy użyć 0,8 mg/ml aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA)19,
      UWAGA: Zrównoważyć inhibitory w mieszaninie testowej zawierającej WCE przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem transportu. W celu maksymalnego zahamowania, etapy płukania po przepuszczalności w odpowiednich studzienkach powinny również obejmować inhibitor.
  2. Przepuszczalność i płukanie neuronów
    1. Przepuszczalność neuronów zgodnie z optymalnym, specyficznym dla partii protokołem określonym w kroku 3.
    2. Wyjąć płytkę hodowlaną z inkubatora i natychmiast umieścić ją na lodzie. Płukać 2x przez 5 min w 1x TRB-BSA. Dołącz inhibitor do płukania wyznaczonych studzienek.
  3. Uruchom reakcję transportu.
    1. Po ostatnim płukaniu usuń 1x TRB-BSA. Pracując szybko, użyj pipety wielokanałowej (50 μl/dołek), aby przenieść wstępnie zmieszane reakcje transportu na przepuszczalne komórki.
    2. Natychmiast załaduj płytkę do mikroskopu o wysokiej zawartości w temperaturze pokojowej, aby rozpocząć obrazowanie poklatkowe (patrz krok 4.4) lub umieść płytkę na stole, chroniąc ją przed światłem i pozwól, aby reakcja postępowała przez żądany okres czasu (np. 30-120 minut) przed utrwaleniem i obrazowaniem.
    3. W razie potrzeby utrwalić 4% paraformaldehydu/PBS przez 15 minut, płukać 2x przez 5 minut w PBS i przenieść do 50% glicerolu/PBS w celu późniejszego obrazowania. Płytki należy chronić przed światłem w temperaturze 4 °C (stabilne do 1 tygodnia lub dłużej).
  4. Obrazowanie na żywo
    UWAGA: Na tym etapie należy zastosować dowolną preferowaną metodę pozyskiwania i analizy obrazu.
    1. Załaduj płytkę do mikroskopu o wysokiej zawartości. Uruchom wstępną płytkę testową, aby zoptymalizować i zapisać parametry obrazowania, w tym powiększenie, ostrość, czasy ekspozycji (Hoechst i FITC) oraz interwały przed uruchomieniem próbek eksperymentalnych. Zapisz parametry, aby przeładować z każdą kolejną płytą.
      UWAGA: W przypadku analizy ilościowej należy ustawić czas ekspozycji dla fluorescencyjnego ładunku importowanego (FITC) znacznie poniżej nasycenia w stanie ustalonym lub w ostatnim punkcie czasowym, który ma być użyty. Ustal to za pomocą płytki testowej, dążąc do połowy maksymalnego nasycenia, aby umożliwić zmiany intensywności w różnych warunkach eksperymentalnych. Zbierz obrazy Hoechsta dla każdej klatki i punktu czasowego, aby umożliwić identyfikację jądrową podczas późniejszej automatycznej analizy.
    2. W razie potrzeby wyreguluj przesunięcie ostrości, używając Hoechst jako długości fali ostrości i uruchom protokół obrazowania. Zbieraj obrazy co 5 minut przez 30 minut. Dostosuj interwał i czas reakcji zgodnie z potrzebami w oparciu o szybkość obrazowania i kinetykę interesującej nas reakcji importu.

5. Analiza obrazu

  1. W oknie dialogowym Płytka przeglądowa mikroskopu otwórz obrazy Hoechst i FITC z reprezentatywnej ramki. Na karcie Uruchom analizę wybierz opcję Moduł rozszerzony o translokację i skonfiguruj ustawienia. Ustaw Hoechst jako obraz przedziału i FITC jako obraz sondy translokacyjnej.
  2. Pod przedziałami dostosuj przybliżoną szerokość jądra, intensywność powyżej lokalnego tła oraz minimalny/maksymalny obszar. Aktywuj automatycznie oddzielane przedziały dotykowe, gdy neurony mają tendencję do grupowania się. Wyświetl wyniki, wybierając pozycję Przebieg testowy. Dostosuj ustawienia, aby zmaksymalizować dokładność identyfikacji jąder neuronalnych, jednocześnie ograniczając błędne włączenie jąder lub szczątków nieneuronalnych.
    UWAGA: Zanieczyszczenie glejowe, jeśli występuje, można zazwyczaj wykluczyć na tym etapie na podstawie wielkości jądra. Określenie optymalnych ustawień identyfikacji kompartmentów jest kompromisem między dokładnością a liczbą komórek i musi być ustawione empirycznie w zależności od testu, typu komórki i gęstości hodowli. Rygorystyczne parametry pominą wiele komórek, ale będą zawierać mniej błędów, podczas gdy parametry liberalne będą bardziej inkluzywne, ale będą zawierać więcej błędów. Jeśli uwzględniono różne populacje komórek (np. mutanty choroby) lub zabiegi, które mogą wpływać na wielkość jądra, zalecamy ustawienie parametrów wielkości/intensywności, które są wystarczająco szerokie, aby uwzględnić wszystkie warunki, aby uniknąć konieczności stosowania wielu zestawów parametrów w eksperymencie.
  3. Aby uniknąć artefaktów z krawędzi jądrowej, zdefiniuj obszary pomiaru kilka pikseli wewnątrz i na zewnątrz krawędzi przedziału zdefiniowanej przez barwienie Hoechsta. W zależności od powiększenia i łączenia w kategoryzację ustaw 2-4 piksele dla odległości regionu wewnętrznego i 1-2 piksele dla odległości regionu zewnętrznego. Dostosuj szerokość regionu zewnętrznego (1-2 piksele).
  4. Wybierz żądaną metodę szacowania tła (zalecana jest domyślna opcja Auto Constant). W polu Konfiguruj dziennik danych wybierz żądane parametry wyjściowe, w tym średnią intensywność wewnętrzną, średnią intensywność zewnętrzną oraz średnią intensywność wewnętrzną/zewnętrzną (stosunek jądra do cytoplazmy (N/C)). Zapisz parametry analizy.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się włączenie wewnętrznych kontroli pozytywnych i ujemnych do każdego eksperymentu, aby zapewnić, że parametry maksymalizują czułość w wykrywaniu zdarzenia biologicznego, które jest przedmiotem zainteresowania.
  5. Użyj okna dialogowego Narzędzia do płyt, aby uruchomić analizę na żądanej płycie (płytach) przy użyciu zapisanych parametrów i wyeksportować pomiary.
  6. Przejrzyj i podsumuj dane według stanu leczenia. OPCJA: Zastosuj filtry, aby usunąć dane niefizjologiczne, takie jak intensywność sondy = 0 i skrajne proporcje N/C (tj. <0,1 i >100). Jednakowo stosuj dowolne filtry we wszystkich warunkach i eksperymentach.
  7. Jako dodatkową poprawkę na fluorescencję wyjściową, znormalizuj dane do studzienek kontrolnych, w których pominięto lizat i ER. Aby ułatwić porównania między replikami biologicznymi (tj. niezależnymi preparatami kultur neuronalnych), należy wyrazić końcowe dane dotyczące importu jądrowego jako procent czasu 0.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Selektywna permeabilizacja błony plazmatycznej (Rysunek 1A) jest najistotniejszym krokiem protokołu i musi zostać zweryfikowana przed przystąpieniem do analizy importu jądrowego. Ze względu na różnice między poszczególnymi preparatami hodowli, rutynowo wykonuje się wstępną płytkę miareczkową w celu ustalenia optymalnych, specyficznych dla danej partii stężeń hipotonicznego buforu Tris-HCl oraz poduszki BSA, zgodnie z opisem w kroku 3. Komórki niedostatecznie lub nadmiernie permeabilizowane s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół opisany powyżej zapewnia wiarygodną i powtarzalną metodę selektywnej przenikania błony plazmatycznej pierwotnych neuronów korowych myszy do analizy importu jądrowego. W tym miejscu pokazano zastosowanie metody analizy importu jądrowego ładunku z bezpośrednim importem β ładunku (Rango), ale to samo podejście można zastosować do analizy biernego i aktywnego importu szerokiej gamy ładunków fluorescencyjnych. Permeabilizacja umożliwia precyzyjną manipulację reakcją transportu w sposób, który nie jest możliwy do zrea...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NINDS K08NS104273 (do L.R.H.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 M HEPESGibco15630-080
10x HBSSGibco14185-052
32% paraformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences15714-S
96-dołkowe szklane płytki optyczneCellVisP96-1.5H-N
ATP sól litowaMillipore Sigma11140965001
B27Gibco17504-044
Zestaw do oznaczania białek Bio-Rad IIBio-Rad5000002
BL21(DE3) E. coliNEBC2527H
Surowica bydlęca frakcja albuminy V, szok cieplny, bez kwasów tłuszczowychSigma-Aldrich3117057001
Kolumny chromatograficzneBio-Rad7311550
Kinaza kreatynowaMillipore Sigma 10127566001
Fosforan kreatynyMillipore Sigma10621722001
Dextran, Texas Red, 70 000 MWThermo FisherD1864
DNase ISigma-AldrichDN25
E15-16 w ciąży w ciąży C57BL/6J samice myszyJackson Laboratory000664
ExcelMicrosoftN/A
Surowica bydlęca płoduHycloneSH30070.03
GlutamaxGibco35050-061
GlicerolThermo Fisher15514011
GTP sól litowaMillipore Sigma11140957001
HALT (100x)Thermo Fisher78439
HEK293T komórkiATCCCRL-3216
HIS-Select HF Żel powinowactwa do nikluSigma-AldrichHO537
Hoechst 33342Thermo FisherH1399
ImageExpress Micro Confocal High-content Imaging SystemUrządzenia molekularneNie dotyczyUżywany do obrazowania poklatkowego
ImidazolMilliporeI3386
ImportazoleSigma-AldrichSML0341
IPTGCorning46-102-RF
LamininSigma-AldrichL2020
LB bulionGrainger31FZ62
LSM800 mikroskop konfokalnyZeissN/AUżywany do obrazowania dekstranu
Oprogramowanie do analizy obrazu o wysokiej zawartości MetaXpressUrządzenia molekularneNie dotyczy
Podłoże neuropodstawoweGibco21103
PapainaWorthingtonLS003126
Penicylina-streptomycynaGibco15140-122
Poli-D-LizynaSigma-AldrichP6407
Koktajl inhibitorów proteazyMillipore Plazmid Sigma11873580001
Rango (pRSET Rango2/a1 + łączniki)N/AN/ApK44, zawierający N-końcowy 6-His tag
SOC (super optymalny bulion z represją katabolitu) JakośćBiologiczna340-031-671
Pirogronian soduGibco11360-070
Koncentratory Spin-X UF (30K MWCO)CorningCLS431484
Trypsyna-EDTA (0,05%)Gibco25300054
Inhibitor proteazy

Bibliografia

  1. Hutten, S., Dormann, D. Nucleocytoplasmic transport defects in neurodegeneration - Cause or consequence. Seminars in Cell & Developmental Biology. 5, 151-162 (2019).
  2. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  3. Grima, J. C., et al. Mutant Huntingtin disrupts the nuclear pore complex. Neuron. 94 (1), 93-96 (2017).
  4. Eftekharzadeh, B., et al. Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer's disease. Neuron. 99 (5), 925-927 (2018).
  5. Coyne, A. N., et al. G4C2 repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD. Neuron. 107 (6), 1124-1140 (2020).
  6. Timney, B. L., et al. Simple rules for passive diffusion through the nuclear pore complex. The Journal of Cell Biology. 215 (1), 57-76 (2016).
  7. Paci, G., Caria, J., Lemke, E. A. Cargo transport through the nuclear pore complex at a glance. Journal of Cell Science. 134 (2), 247874(2021).
  8. Ding, B., Akter, M., Zhang, C. -L. Differential Influence of Sample Sex and Neuronal Maturation on mRNA and Protein Transport in Induced Human Neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 46(2020).
  9. Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. The Journal of Cell Biology. 111 (3), 807-816 (1990).
  10. Brownawell, A. M., Holaska, J. M., Macara, I. G., Paschal, B. M. The use of permeabilized cell systems to study nuclear transport. Methods in Molecular Biology. 189, Clifton, N. J. 209-229 (2002).
  11. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (11), 687-699 (2012).
  12. Ori, A., et al. Cell type-specific nuclear pores: a case in point for context-dependent stoichiometry of molecular machines. Molecular Systems Biology. 9, 648(2013).
  13. Colbeau, A., Nachbaur, J., Vignais, P. M. Enzymic characterization and lipid composition of rat liver subcellular membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 249 (2), 462-492 (1971).
  14. Hayes, L. R., Duan, L., Bowen, K., Kalab, P., Rothstein, J. D. C9orf72 arginine-rich dipeptide repeat proteins disrupt karyopherin-mediated nuclear import. eLife. 9, 51685(2020).
  15. Grote, P., Ferrando-May, E. In vitro assay for the quantitation of apoptosis-induced alterations of nuclear envelope permeability. Nature Protocols. 1 (6), 3034-3040 (2006).
  16. Lowe, A. R., et al. Importin-β modulates the permeability of the nuclear pore complex in a Ran-dependent manner. eLife. 4, 04052(2015).
  17. Kalab, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells. Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).
  18. Soderholm, J. F., et al. Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β. ACS Chemical Biology. 6 (7), 700-708 (2011).
  19. Newmeyer, D. D., Forbes, D. J. Nuclear import can be separated into distinct steps in vitro: nuclear pore binding and translocation. Cell. 52 (5), 641-653 (1988).
  20. Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351 (6269), 173-176 (2016).
  21. Khosravi, B., et al. Cytoplasmic poly-GA aggregates impair nuclear import of TDP-43 in C9orf72 ALS/FTLD. Human Molecular Genetics. 26 (4), 790-800 (2016).
  22. Chou, C. -C., et al. TDP-43 pathology disrupts nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in ALS/FTD. Nature Neuroscience. 21 (2), 228-239 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

permeabilizowane neuronyimport j drowytransport nukleocytoplazmatycznykompleks porowy j dra kom rkowegoliza hipotonicznaalbumina surowicy bydl cejimport fluorescencyjnego adunkumikroskopia wysokoprzepustowa

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.