Method Article

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

DOI:

10.3791/62712

⸱

October 2nd, 2021

 ,  ,  , 
1Laboratory of Imaging Tissue Structure and Function, Nencki Institute of Experimental Biology of Polish Academy of Sciences, 2Laboratory of Molecular Basis of Behavior, Nencki Institute of Experimental Biology of Polish Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) jest stosowana do obrazowania i analizy kolców dendrytycznych w mysim hipokampie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowa mikroskopia elektronowa (3D EM) daje możliwość analizy parametrów morfologicznych kolców dendrytycznych z rozdzielczością nanoskali. Ponadto niektóre cechy kolców dendrytycznych, takie jak objętość kręgosłupa i gęstość postsynaptyczna (PSD) (reprezentująca postsynaptyczną część synapsy), obecność zakończenia presynaptycznego i gładkiej retikulum endoplazmatycznego lub nietypową postać PSD (np. kolce wielounerwione), można zaobserwować tylko za pomocą 3D EM. Dzięki zastosowaniu seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBEM) możliwe jest uzyskanie danych 3D EM w łatwiejszy i bardziej powtarzalny sposób niż w przypadku wykonywania tradycyjnego cięcia seryjnego. Tutaj pokazujemy, jak przygotować próbki hipokampa myszy do analizy SBEM i jak ten protokół można połączyć z badaniem immunofluorescencyjnym kolców dendrytycznych. Łagodna perfuzja fiksacji pozwala nam na wykonanie badań immunofluorescencyjnych z mikroskopią świetlną na jednej połowie mózgu, podczas gdy druga połowa została przygotowana do SBEM. Takie podejście zmniejsza liczbę zwierząt, które mają być wykorzystane do badania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość synaps pobudzających w ośrodkowym układzie nerwowym znajduje się na kolcach dendrytycznych - małych wypukłościach błony neuronalnej. Wypukłości te tworzą zamknięte przedziały biochemiczne, które kontrolują wewnątrzkomórkową transdukcję sygnału. Plastyczność strukturalna kolców dendrytycznych i synaps jest ściśle związana z funkcjonalnymi zmianami w skuteczności synaptycznej, które leżą u podstaw tak ważnych procesów, jak uczenie się i pamięć1,2. Należy zauważyć, że mikroskopia elektronowa (EM) jest jedyną techniką, która pozwala określić, czy kolce dendrytyczne mają wejście presynaptyczne. Rozdzielczość EM jest również potrzebna do badania szczegółów ultrastrukturalnych, takich jak kształt gęstości postsynaptycznej (PSD), reprezentującej postsynaptyczną część synapsy, lub wymiary kręgosłupa dendrytycznego, a także rozmiar i kształt bulonu aksonalnego. Dodatkowo za pomocą EM możliwa jest wizualizacja synaps i ich otoczenia.

Dzięki postępowi w technologiach obrazowania i obliczeń możliwe jest zrekonstruowanie całych obwodów neuronowych. Techniki tomowej mikroskopii elektronowej, takie jak transmisyjna mikroskopia elektronowa o przekroju szeregowym (ssTEM), skaningowa mikroskopia elektronowa z szeregową powierzchnią blokową (SBEM) i skaningowa mikroskopia elektronowa ze skupioną wiązką jonów (FIB-SEM) są powszechnie stosowane do rekonstrukcji obwodów neuronalnych3.

W naszych badaniach, metoda SBEM jest z powodzeniem stosowana do badania strukturalnej plastyczności kolców dendrytycznych i PSD w próbkach mysiego hipokampa i organotypowych wycinków mózgu 4,5. SBEM opiera się na instalacji miniaturowego ultramikrotomu w komorze skaningowego mikroskopu elektronowego6,7,8,9. Górna część bloku próbki jest obrazowana, a następnie próbka jest cięta na określoną głębokość przez ultramikrotom, odsłaniając nową powierzchnię bloku, która jest ponownie obrazowana, a następnie proces jest powtarzany8. W rezultacie, pozostaje tylko obraz powierzchni bloku, podczas gdy wycinek, który został przecięty, jest tracony jako gruz. Dlatego SBEM nazywany jest techniką destrukcyjną, co oznacza, że nie jest możliwe ponowne zobrazowanie tego samego miejsca. Jednak zaletą destrukcyjnych metod on-block jest to, że nie cierpią one z powodu problemów z wypaczaniem i utratą sekcji, które mogą znacząco wpłynąć na jakość danych i analizę danych3. Co więcej, SBEM daje możliwość obrazowania stosunkowo dużego pola widzenia ( > 0,5 mm × 0,5 mm) w wysokiej rozdzielczości3.

Aby zastosować SBEM, próbki muszą być przygotowane zgodnie z dedykowanym, wysoce kontrastowym protokołem ze względu na detektor elektronów wstecznie rozproszonych używany do pozyskiwania obrazów. Pokazujemy tutaj, jak przeprowadzić przygotowanie próbki zgodnie z protokołem opartym na procedurze opracowanej przez Deerinck10 (metoda National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR)) przy użyciu zredukowanych barwników osmowo-tiokarbohydrazydowo-osmowych (rOTO) opracowanych w latach 19808,11. Ponadto wprowadzamy dwuetapowe podejście fiksacyjne, z łagodną perfuzją fiksacyjną, która pozwala na wykorzystanie tego samego mózgu zarówno do badań immunofluorescencyjnych z mikroskopią świetlną, jak i SBEM.

W protokole mózg myszy jest najpierw utrwalany za pomocą łagodnego utrwalacza, a następnie cięty na połówki, a jedna półkula jest postfiksowana i przygotowana do immunofluorescencji (IF), podczas gdy druga do badań EM (Rysunek 1).

figure-introduction-1
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie procesu przygotowania kolców dendrytycznych do analizy za pomocą SBEM. Myszy zostały uśmiercone i poddane perfuzji łagodnym pierwotnym utrwalaczem. Mózg przecięto na połowy, a jedną półkulę założono utrwalaczem dedykowanym immunofluorescencji (IF), kriochronionym, pokrojono za pomocą kriostatu i przetworzono do badań IF, podczas gdy druga półkula została pokryta utrwalaczem EM, krojona wibratomem i przygotowywana do badań EM. Wycinki mózgu do badań SBEM zostały skontrastowane, płasko osadzone w żywicy, a następnie obszar CA1 hipokampa został zamontowany na szpilce i zobrazowany za pomocą SBEM (Rysunek 1). Część protokołu zaznaczona w żółtym polu została przedstawiona w filmie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytutu Nenckiego i zgodą Lokalnej Komisji Etycznej. Badania zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24 listopada 1986 r. (86/609/EWG), Ustawą o ochronie zwierząt i zatwierdzone przez pierwszą Lokalną Komisję Etyczną w Warszawie. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt i ich cierpienie.

UWAGA: Wszystkie procedury opisane poniżej muszą być wykonywane w laboratoryjnym dygestorium. Ze względu na niebezpieczny charakter stosowanych odczynników. Wymagane są środki bezpieczeństwa osobistego, takie jak rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i maska na twarz.

1. Przygotowanie utrwalacza do perfuzji (2% wag/obj. paraformaldehydu (PFA) i 0,5% obj. aldehydu glutarowego (GA) w 0,1 M buforze fosforanowym (PB), pH 7,4)

UWAGA: Przygotuj roztwór utrwalający tego samego dnia, w którym zostanie użyty i nie przechowuj go dłużej niż przez 3 godziny. W przypadku braku czasu należy przygotować 2% PFA w 0,1 M PB dzień wcześniej, przechowywać w temperaturze 4 °C i dodać świeży GA na krótko przed perfuzją.

  1. Weź 400 ml sterylnej wody podwójnie destylowanej (ddH2O) i podgrzej ją do 60 °C za pomocą mieszającej płyty grzejnej. Następnie dodaj 20 g PFA. Dodawać krople 1 M NaOH aż do całkowitego rozpuszczenia PFA i pozostawić mieszaninę do ostygnięcia.
  2. Dodać 500 ml 0,2 M PB (pH 7,4).
  3. Przefiltrować roztwór, aby usunąć wszelkie osady i schłodzić go do temperatury 4 °C.
  4. Tuż przed perfuzją dodać 20 ml 25% GA do roztworu, a następnie uzupełnić objętość ddH2O do 1 L.

2. Przygotowanie utrwalacza po perfuzji dla SBEM (2% wag./vol PFA i 2.5% vol/vol GA w 0.1 M PB, pH 7.4)

  1. Weź 50 ml utrwalacza do perfuzji (2% PFA i 0,5% GA w 0,1 M PB).
  2. Dodaj 5 ml 25% GA.

3. Przygotowanie utrwalacza po perfuzji do barwienia IF (4% PFA w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS))

  1. Rozpuść tabletkę 1x PBS (pH 7,4) w oczyszczonej i dejonizowanej wodzie (H2O) zgodnie z instrukcją producenta.
  2. Za pomocą mieszającej płyty grzejnej podgrzej roztwór do 60 °C i dodaj 40 g PFA.
  3. Dodawać krople 1 M NaOH, aż PFA całkowicie się rozpuści i pozostawić mieszaninę do ostygnięcia.
  4. Doprowadzić pH roztworu do 7,5 za pomocą 1 M HCl, a następnie uzupełnić objętość za pomocąH2Odo 1 L.
  5. Przefiltruj roztwór, aby usunąć wszelkie osady.

4. Perfuzja przezsercowa zwierząt

UWAGA: Wszystkie odpady PFA i GA muszą być zbierane i przechowywane do utylizacji zgodnie z lokalnymi przepisami. Znieczulenie i perfuzja powinny być zgodne z lokalnymi przepisami. W opisanym protokole wykorzystano dorosłe 3-miesięczne i 20±1-miesięczne samice myszy Thy1-GFP(M) (Thy1-GFP +/-)12 eksprymujące białko zielonej fluorescencji (GFP) w słabo rozmieszczonej populacji neuronów glutaminergicznym, ale można również użyć dowolnego innego. Zwierzęta były hodowane jako heterozygoty o pochodzeniu C57BL/6J w Zwierzętarniach Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego.

  1. Przed perfuzją znieczulić mysz przez podanie mieszaniny ketaminy / ksylazyny (do 90 mg / kg masy ciała ketaminy i 10 mg / kg masy ciała ksylazyny) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (igła o rozmiarze 27).
    1. Oceń, czy głębokość znieczulenia jest wystarczająca, sprawdzając odruch na bodźce bólowe (szczypanie) i odruch rogówkowy (mrużenie oczu).
  2. Po 20 minutach wykonać iniekcję dootrzewnową (igła o rozmiarze 27) pentobarbitalu sodu (50 mg/kg masy ciała).
  3. Wykonaj perfuzję myszy zgodnie z protokołem chirurgii perfuzyjnej opisanym przez Gage et al.13 (patrz punkt 4; Rysunek 5-6). Za pomocą pompy perfuzyjnej zacznij od 0,1 M buforu fosforanowego o pH 7,4 (30 ml) przez 3 minuty i kontynuuj z 2% PFA i 0,5% GA w 0,1 M PB, pH 7,4 przez 6 minut (80 ml).
    1. Delikatnie wypreparuj mózg z czaszki i podziel go na pół (patrz Rysunek 9-10 w Gage et al., 201213). Umieścić jedną część w fiolce zawierającej utrwalacz SBEM, a drugą w fiolce z 4% PFA/PBS do barwienia IF.
    2. Utrzymuj półkule w utrwalaczu w temperaturze 4 °C przez noc.

5. Przygotowanie wycinków mózgu do mikroskopii elektronowej

  1. Wybierz ustawienia wibracji (prędkość przesuwu ostrza: 0,075 mm/s, częstotliwość cięcia: 80 Hz).
  2. Umieść komorę na plastry w uchwycie, przymocuj ją do wibratomu i otocz lodem. Następnie umieść żyletkę w uchwycie ostrza wibratomowego.
  3. Użyj łyżki lub podobnego przedmiotu i umieść schłodzony mózg (powierzchnią grzbietową do góry) na twardej powierzchni tnącej (np. szklanej pokrywce szalki Petriego). Aby przygotować wycinek koronalny hipokampa, wykonaj prostopadłe cięcie między półkulą mózgową a móżdżkiem za pomocą żyletki lub skalpela, usuwając w ten sposób móżdżek. Opuszkę węchową można również usunąć.
  4. Nałóż klej cyjanoakrylowy na suchą platformę wibratomu.
  5. Podnieś mózg kleszczami i ostrożnie osusz go na bibule filtracyjnej.
  6. Przyklej półkulę do platformy w pobliżu ostrza tnącego końcówką rostralną do góry. Przymocuj platformę do uchwytu i natychmiast napełnij ją lodowatym 0,1 m PB, pH 7,4. Jeśli prostopadłe cięcie zostanie wykonane prawidłowo, półkula stanie prosto do góry, zapewniając kąt 90° wymagany do wykonania symetrycznego cięcia koronalnego zawierającego hipokamp. Upewnij się, że mózg jest pokryty PB.
  7. Umieść ostrze wibratomu przed półkulą i opuść je na koronalną stronę półkuli. Obniż ostrze do 400 μm dalej w kierunku ogonowym i rozpocznij krojenie. Kontynuuj krojenie, aż pierwsze dwa plasterki zostaną całkowicie oddzielone od bloku tkanki.
  8. Schowaj ostrze i opuść o kolejne 100 μm, a następnie ponownie pokrój.
  9. Kiedy hipokamp staje się widoczny (użyj atlasu mózgu myszy Paxinos i Franklin, 200414), zbierz plastry małym pędzlem lub poszerzoną plastikową pipetą Pasteura.
  10. Przenieś plastry do 12-dołkowej płytki wypełnionej zimnym 0,1 M PB o pH 7,4.
  11. Wypreparuj hipokamp na szklanej szalce Petriego wypełnionej 0,1 M PB, pH 7,4 za pomocą żyletki lub skalpela i umieść go w szklanych fiolkach z tym samym buforem fosforanowym.
    UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania plastrów uzupełnić 0,1 M PB 0,05% azydkiem sodu (NaN3).

6. Przygotowanie próbki mózgu do barwienia immunologicznego

  1. Po utrwaleniu przez noc w 4% roztworze PFA/PBS w dygestorium, tkankę mózgową należy umieścić w roztworze do kriokonserwacji (30% sacharozy w PBS z 0,05% NaN3) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 dni (do momentu zatonięcia).
  2. Przygotować roztwór przeciw zamarzaniu (15% sacharozy/30% glikolu etylenowego/0,05% NaN3/PBS).
  3. Ustaw temperaturę w komorze kriostatu na -19 °C i upewnij się, że temperatura została osiągnięta, zanim przejdziesz dalej. Podczas cięcia należy upewnić się, że temperatura szafy utrzymuje się w zakresie od -18 °C do -20 °C.
  4. Użyj łyżki lub podobnego przedmiotu i umieść schłodzony mózg (powierzchnią grzbietową do góry) na twardej powierzchni tnącej (np. szklanej pokrywce szalki Petriego). Aby przygotować wycinek koronalny hipokampa, wykonaj prostopadłe cięcie między półkulą mózgową a móżdżkiem za pomocą żyletki lub skalpela, usuwając w ten sposób móżdżek.
  5. Wybierz wstępnie schłodzony krążek próbki, przykryj go podłożem do zamrażania na wolnej półce i za pomocą kleszczy przymocuj półkulę do dysku końcówką rostralną do góry i poczekaj, aż próbka zostanie całkowicie zamrożona. Włóż krążek z próbką do głowicy próbki.
  6. Zamontuj ostrze w uchwycie ostrza wewnątrz komory kriogenicznej i pokrój plastry o grubości 40 μm.
  7. Przenieś plastry małym pędzlem na 96-dołkową płytkę wypełnioną zimnym roztworem przeciw zamarzaniu i delikatnie rozwiń kawałki (zbierz plasterek po każdej rundzie krojenia, aby zapobiec ich zgubieniu się w komorze krojenia).
    UWAGA: Mózgi lub skrawki można przechowywać w roztworze niezamarzającym w temperaturze -20 °C przez długi czas.

7. Barwienie immunologiczne wycinków mózgu

UWAGA: Wszystkie etapy barwienia zostały wykonane na 24-dołkowej płytce na platformie wytrząsarkowej.

  1. Umyj plastry PBS trzy razy, za każdym razem przez 6 minut.
  2. Inkubować plastry w 300 μl roztworu blokującego (5% normalnej surowicy osła (NDS)/0,3% Triton X-100) przez 1 godzinę, delikatnie potrząsając rotatorem.
  3. Inkubować plastry z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko PSD-95 rozcieńczonym w stosunku 1:500 w 5% NDS/0,3% Triton X-100/PBS (300 μL na studzienkę) przez noc w temperaturze 4 °C. Końcowe stężenie przeciwciała pierwszorzędowego wynosi 2 μg/ml.
  4. Umyj plastry 0,3% Triton X-100/PBS w temperaturze pokojowej (RT) trzy razy, za każdym razem przez 6 minut.
  5. Inkubować plastry z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:500 w 300 μl 0,3% Triton X-100/PBS przez 90 minut. Końcowe stężenie przeciwciała drugorzędowego wynosi 4 μg /ml.
  6. Umyj plastry PBS trzy razy, za każdym razem przez 6 minut.
  7. Zamontuj plastry na szkiełkach za pomocą podłoża montażowego, a następnie zamknij je szkiełkiem zakrywającym.
  8. Zbadaj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego (obiektyw olejowy 63 ×, NA 1,4, rozmiar piksela 0,13 μm × 0,13 μm).
    UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania: próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić je przed światłem.

8. Przygotowanie próbki SBEM

UWAGA: Ze względu na niebezpieczny charakter używanych odczynników, wszystkie opisane poniżej procedury muszą być przeprowadzone w laboratoryjnym dygestorium. Przed użyciem tych chemikaliów należy uważnie zapoznać się z kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych dostarczonymi przez producentów i zapytać specjalistę ds. bezpieczeństwa o lokalne przepisy zapewniające bezpieczne obchodzenie się z odpadami i ich utylizację.

  1. Próbka kontrastująca
    UWAGA: Mycie plastrów i inkubację w temperaturze pokojowej należy przeprowadzać z łagodnym wstrząsaniem (np. na wytrząsarce platformowej). Użyto wody odgazowanej w autoklawie.
    1. Plastry umyć zimnym 0,1 M PB, pH 7,4 pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty.
    2. Przygotować mieszaninę 1:1 4% wodnego tetratlenku osmu i 3% żelazocyjanku potasu (1:1 obj.). Produkt końcowy zmieni kolor na brązowy. Zanurz próbki w tej mieszaninie, umieść je na lodzie i od tego etapu ważne jest, aby chronić je przed światłem. Inkubuj je, delikatnie potrząsając przez 1 godzinę.
    3. W międzyczasie przygotuj roztwór tiokarbohydrazydu (TCH). Wymieszać 10 ml podwójnie destylowanegoH2O(ddH2O) i 0,1 g TCH i umieścić w piekarniku nastawionym na 60 °C na 1 godzinę. Ważne jest, aby od czasu do czasu mieszać roztwór (np. co 10 minut). Gdy będzie gotowy, schłodzić do temperatury pokojowej.
    4. Umyj plastry ddH2O pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty.
    5. Przefiltrować roztwór TCH za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm i zanurzyć próbkę w przefiltrowanym roztworze. Plastry zmienią kolor na. Inkubuj je przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Przemyć próbki ddH2O pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty.
    7. Próbki inkubować w 2% wodnym roztworze OsO4 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Przemyć próbki ddH2O pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty.
    9. Umieścić próbki w przefiltrowanym 1% wodnym octanie uranylu i inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc. Do filtracji należy użyć filtra strzykawkowego 0,22 μm.
    10. Przygotuj roztwór kwasu L-asparaginowego, mieszając 0,4 g kwasu L-asparaginowego i 80 ml ddH2O, dostosuj pH do 3,8 dla łatwiejszego rozpuszczenia, a następnie uzupełnij wodą do 100 ml.
    11. Następnego dnia zacznij od przygotowania Waltona z ołowiu asparaginian15. Zmieszać 0,066 g azotanu ołowiu z 10 ml roztworu kwasu L-asparaginowego (pkt 8.1.10) podgrzanego do temperatury 60 °C i dostosować pH do 5,5 (mierzone w temperaturze 60 °C) z 1 M NaOH. Zamknąć fiolkę z asparaginianem ołowiu i pozostawić w temperaturze 60 °C na 30 minut w łaźni wodnej. Rozwiązanie powinno być jasne. Jeśli stanie się mętny, należy go wyrzucić i przygotować nowy.
    12. W międzyczasie przemyć próbki odgazowanym ddH2O pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty. Następnie przechowuj je w piekarniku nastawionym na 60 °C przez 30 minut.
    13. Zanurzyć próbki w świeżo przygotowanym roztworze asparaginianu ołowiu i inkubować je w piecu nastawionym na 60 °C przez 20 minut.
    14. Przemyć próbki odgazowanym ddH2O pięć razy, za każdym razem przez 3 minuty.
  2. Odwodnienie i zatapianie żywicy
    1. Przygotuj żywicę epoksydową. Zważyć składniki (33,3 g składnika A/M, 33,3 g składnika B i 1 g składnika D) i dobrze wymieszać żywicę (np. wstrząsnąć nią na wytrząsarce obrotowej w probówce o pojemności 15 ml) przez co najmniej 30 minut przed dodaniem 16 kropli przyspieszacza DMP 30. Mieszaj ponownie przez kolejne 10 minut.
      UWAGA: Zważyć składniki pod wyciągiem. Taka ilość składników daje około 60 ml żywicy, co wystarcza na 15 fiolek z próbkami. Możesz przygotować mniej żywicy lub przechowywać resztę żywicy w strzykawce w temperaturze 4 °C i zużyć ją następnego dnia. Należy pamiętać o uszczelnieniu końcówki strzykawki.
    2. Przygotować fiolki ze stopniowanymi rozcieńczeniami etanolu (30%, 50%, 70%, 90%, 100%, 100% etanolu w wodzie i 100% wysuszonego na sicie molekularnym).
    3. Wymieszaj żywicę ze 100% etanolem w proporcji 1:1, aby uzyskać 50% żywicy. Dobrze wymieszaj.
    4. Odwadniać próbki przez 5 minut w każdym rozcieńczeniu etanolu, zaczynając od 30%, a kończąc na 100% bezwodnym etanolu suszonym na sicie molekularnym. Należy pamiętać, że próbki nigdy nie mogą całkowicie wyschnąć.
    5. Infiltruj próbki najpierw w 50% żywicy przez 30 minut, następnie w 100% żywicy przez godzinę, a następnie ponownie w 100% żywicy przez noc. Wykonuj wszystkie etapy infiltracji ze stałym, powolnym potrząsaniem.
    6. Następnego dnia umieść próbki w świeżej 100% żywicy na godzinę, a następnie zanurz je między arkuszami do zatapiania fluoropolimeru. Odtłuścić kawałki arkusza do zatapiania etanolem i płasko zatopić próbki między dwiema jego warstwami, używając dwóch szkiełek jako podpory. Staraj się unikać pęcherzyków powietrza w żywicy na próbce lub w jej pobliżu.
    7. Próbki utwardzać w piecu w temperaturze 70 °C przez co najmniej 48 godzin.
  3. Przycinanie i montaż
    1. Oddziel arkusze do zatapiania i odetnij kawałek osadzonej próbki (około 1 mm x 1 mm) za pomocą żyletki. Przenieś go do parafilmu. Zminimalizuje to niebezpieczeństwo utraty próbki z powodu elektrostatyki.
    2. Weź aluminiową szpilkę, która została odtłuszczona etanolem. Dobrze wymieszaj przewodzącą żywicę epoksydową i użyj jej niewielkiej ilości do zamontowania próbki na szpilce. Utwardzać przewodzącą żywicę epoksydową w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
    3. Przytnij każdą stronę bloku próbki nożem diamentowym, a następnie wypoleruj powierzchnię bloku, aż tkanka zostanie odsłonięta.
      UWAGA: Na tym etapie potwierdź obecność interesującego Cię obszaru, zbierając kilka skrawków i wykonując barwienie na niebiesko toluidyną16 lub sprawdzając pod mikroskopem elektronowym.
    4. Zmniejsz rozmiar próbki tak bardzo, jak to możliwe. Następnie zmielić próbkę na szpilce farbą przewodzącą i utwardzić (przez 24 godziny w temperaturze pokojowej lub w piecu w temperaturze 65 °C przez 40 minut).
    5. Aby zminimalizować artefakty ładowania, napylaj próbki cienką warstwą złota lub złota/palladu.

9. Obrazowanie SBEM

  1. Umieść szpilkę z próbką w komorze seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego z powierzchnią czołową. Wyrównaj próbkę z nożem. Zamknij komorę i ustaw parametry.
  2. Zbierz stos obrazów o żądanym powiększeniu, rozmiarze piksela, grubości warstwy, przyspieszonym napięciu (EHT), przysłonie, ciśnieniu itp.
    UWAGA: Parametry zależą od próbki i celu eksperymentu. Przykładowe początkowe ustawienia obrazowania znajdują się w tabeli materiałów.

10. 3D rekonstrukcje

UWAGA: Do poniższych kroków używamy oprogramowania o otwartym dostępie, np. FijiJ17 (ImageJ version 1.49b), Microscopy Image Browser (MIB)18 i Reconstruct19, ale można zastosować różne inne programy.

  1. Konwertuj pliki mikrografów cyfrowych (dm) na format TIFF. Najpierw zaimportuj sekwencję obrazów (w FidżiJ: Plik > Importuj > Sekwencja obrazów > Wybierz format 8-bitowy), a następnie zapisz jako TIFF (w FidżiJ: Plik > Zapisz jako sekwencję obrazów > > Wybierz Tiff).
  2. Dostosuj jasność i kontrast stosu obrazów (w FijiJ: Image > Dostosuj > Jasność/Kontrast) i, jeśli to konieczne, odszum go (użyj wtyczki DenoisEM dla FijJ20 : Plugins > DenoiseEM > Denoise).
  3. Wyrównaj stos (w FijiJ: Plugins > StagReg lub MIB: Dataset > Alignment Tools).
  4. Segmentowanie kolców dendrytycznych i synaps (w oprogramowaniu MIB lub Reconstruct dostępne są obszerne samouczki (szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z metody opisanej powyżej, można uzyskać obrazy tkanki mózgowej myszy w dobrej rozdzielczości. Duże pole widzenia, jakie zapewnia technika SBEM, ułatwia precyzyjny wybór interesującego nas obszaru. Duży obraz obszaru CA1 hipokampa został wykonany w celu zmierzenia długości warstwy promienistej (SR) (Ryc. 2A) i precyzyjnego ustawienia obrazowania w środku (Ryc. 2B). Następnie pozyskano stos obrazów, a obiekty zainteresowania, takie jak dendryty, kolce dendrytycz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje wiele odmian podstawowej metody NCMIR opisanej przez Deerincka w 2010 roku10. Podstawowe zasady pozostają takie same, ale w zależności od rodzaju badanego materiału wprowadzane są niewielkie zmiany. Opisano wcześniej, że różne żywice mogą być używane do osadzania próbek SBEM i na przykład w przypadku roślin, żywica Spurra jest preferowana ze względu na jej niską lepkość, która umożliwia lepszą infiltrację przez ściany komórkowe22,23

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SBEM obrazowanie, obrazowanie mikroskopem świetlnym i przygotowanie próbek do mikroskopii elektronowej zostały wykonane przy użyciu sprzętu Laboratorium Obrazowania Tkanek i Funkcji, które służy jako główny ośrodek obrazowania w Instytucie Biologii Doświadczalnej Menckiego.

Do przygotowania rysunku 1 użyto obrazu myszy (Souris_02) oraz fiolki z https://smart.servier.com/.

Ta praca została wsparta przez Narodowe Centrum Nauki (Polska) Grant Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) przyznany KR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< silny> znieczulający: < / silny>
mieszanina ketaminy / ksylazyny (Ketamina / Sedazyna)Biowet Puławy, Puławy, Polska
Pentobarbital sodu (Morbital)Biowet Puławy, Puławy, Polska
< silny>Utrwalacze:< / silny>
aldehyd glutarowy (GA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAG5882Klasa I, 25% w H2O, specjalnie oczyszczony do stosowania jako utrwalacz do mikroskopii elektronowej
Kwas solny (HCl)POCH, Gliwice, Polska575283115czysty rocznie
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA441244bryłki, 95%
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAP4417-50TAB
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAS5881, figure-materials-198%, granulki ( bezwodny)
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAS3264
Fosforan sodu jednozasadowy (NaH2PO4)Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAS3139
Perfuzja: < / silny>
Duży / zakrzywiony nożyczki (~14,5 cm)Fine Science Tools, Foster City, CA, USA14519-14
Mikroszpatułka (podwójne płaskie końce 2", jedna zaokrąglona, jedna zwężająca się do 1/8")Fine Science Tools, Foster City, CA, USA10091-12
Końcówka igły, 15 GA, (igła perfuzyjna)KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, NiemcyKD-FINE 9004131,80 x 40 mm
Para cienkich (Graefe) pęsetFine Science Tools, Foster City, Kalifornia, Stany Zjednoczone11050-10
Pompa perfuzyjnaPłyn ołowiowyBQ80S
Fiolki plastikoweProfilab, Warszawa, Polska534.02Fiolki plastikowe z niebieską nakrętką do przechowywania tkanek, 20 ml, 31 x 48 mm
Nożyczki do prostych tęczówek (~9 cm)Fine Science Tools, Foster City, CA, USA14058-11
Przygotowanie plastrów mózgu do EM: strong>
12-dołkowa płytkaNEST, Rahway, NJ, Stany Zjednoczone712001
Klej cyjanoakrylowyFenedur, Montevideo, Urugwaj
Fiolki szklaneMikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA7263220 ml Fiolka scyntylacyjna, opakowanie 100
pipet PasteuraVWR, Radnor, PA, USA612-4545LDPE, jednorazowe, 7,5 ml
ŻyletkaWilkinson Sword, Londyn, Wielka BrytaniaKlasyczne maszynki do golenia z podwójną krawędzią
Ostrze skalpelaSwann-Morton, Sheffield, Wielka BrytaniaNr 20
VibratomeLeica Microsystems, Wiedeń, AustriaLeica VT1000 S
Przygotowanie plastrów mózgu do IF:
96-well plateNEST, Rahway, NJ, Stany Zjednoczone701101
CriostatLeica Microsystems, Wiedeń, AustriaLeica CM 1950
Glikol etylenowyBioshop, Burlington, KanadaETH001
Niskoprofilowe ostrze jednorazowe 819Leica Biosystems Inc., Stany 14035838925
Ostrze skalpelaSwann-Morton, Sheffield, Wielka BrytaniaNr 20
Azydek sodu (NaN3)POCH, Gliwice, Polska792770426
SacharozaPOCH, Gliwice, Polska772090110
Zamrażarka tkanek do kriosekcji, OCTLeica Biosystems, Szwajcaria14020108926
Immunostaining:
-well plateNEST, Rahway, NJ, USA702001
Przeciwciało anty-post Synaptic Density Protein 95Merck-Millipore, Burlington, MA, USAMAB1598
Mikroskop konfokalnyZeiss, Gö ttingen, NiemcyMikroskop Zeiss Spinning Disc (63 i razy; obiektyw olejowy, NA 1.4, rozmiar piksela 0.13 i mikro; m i razy; 0,13 &mikro; m)
Szkiełko osłonoweMenzel Glaser, Brunszwik, NiemcyB-123124 x 60 mm
Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej Przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 555Invitrogen, Carlsbad, CA, USAA31570
Podłoże montażowe Fluoromount-G, z DAPIInvitrogen, Carlsbad, CA, USA00-4959-52
Szkiełko mikroskopoweThermo Scientific, Waltham, MA, USAAGAA00008SuperFrost
Normalna surowica osła (NDS)Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA017-000-121
ShakerJWElectronic, Warszawa, PolskaKL-942
TritonT X-100 ReagentGrade Bioshop, Burlington, KanadaTRX506
Przygotowanie próbki z mikrosokopy elektronowej
Trójwodzian heksacyjanożelazianu(II) potasuPOCH, Gliwice, Polska746980113
Aclar 33C FilmElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA50425Arkusz do zatapiania folii fluoropolimerowej
DMP-30, 2,4,6-tris(dimetyloaminometylo)fenolSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAT58203Akcelerator podłoża epoksydowego
Durcupan ACM jednoskładnikowy A, MSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA44611Durcupan ACM jednoskładnikowy A, M żywica epoksydowa
Durcupan ACM jednoskładnikowa BSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA44612Durcupan ACM jednoskładnikowy B, utwardzacz 964
Durcupan ACM jednoskładnikowy DSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA44614Durcupan ACM jednoskładnikowy D, plastyfikator
Alkohol etylowy bezwzględnyPOCH, Gliwice, Polska64-17-5Alkohol etylowy absolutny 99,8 % czystości P.A.-BASIC
Piec laboratoryjny GenlabWolflabs, York, Wielka BrytaniaPiekarnik Mino/18/SSGenlab MINO/18/SS pojemność 18l, bez cyrkulacji wentylatora, bez wyświetlacza cyfrowego, standardowy gradient temperatury, standardowy współczynnik odzysku, bez timera, 250° C maksymalna temperatura, zasilanie elektryczne 240 V
Kwas L-asparaginowySigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAKlasa odczynnika A-9256, figure-materials-298% (HPLC)
Azotan ołowiu (II)Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA467790figure-materials-399.95% metali śladowych podstawa
Tetratlenek osmuSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA75632do mikroskopii elektronowej, 4% w pH2O
pHmetron, Zabrze, PolskaCP-5-5
RotatorBioSan, Jó zefó w, PolskaMulti Bio RS-24rotator Multi Bio RS-24
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAS5881, figure-materials-498%, granulki (bezwodne)
Mini shaker słonecznikowyGrant bio, Shepreth,Wielka BrytaniaPD-3D
Millipore, Burlington, MA, USASLGP033NB0,22 &mikro; m wielkość porów
TiokarbohydrazydSigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA88535purum p.a., do mikroskopii elektronowej, figure-materials-599.0% Octan
uranyluServa, Heidelberg, Niemcy77870Octan uranylu· 2H2O, klasa badawcza
Kąpiel wodnaWSL, Świętochlowice, PolskaLWT
Mocowanie próbki do płytki hodowlanej SBEM
96-wellVWR, Radnor, PA, USA734-2782Płytki 96-dołkowe, okrągłe dno, nieobrobione
AM Gatan 3Zobacz pęsetę do obsługi króćcówMicro to Nano, Haarlem, Holandia
Holandia		50-001521
LornetkaOPTA-TECH, Warszawa, PolskaX2000
Klej przewodzącyChemtronics, Gruzja, USACW2400przewodzący eopxy
Gatan 3Zobacz przykładowe odcinki pinówMicro to Nano, Haarlem, Holandia
Holandia		10-006003
ParafilmSigma-Aldrich, St. Louis, MI, USAP7793Rozmiar rolki 20  w. &czasy; 50  ft
Pelco przewodząca srebrna farbaTed Pella, Redding, CA, USA16062-15PELCO®   Przewodząca srebrna farba, 15g
Żyletki z podwójną krawędziąMikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA72000"PTFE". Marka PERSONNA .004" gruby, pakowany pojedynczo, 250 ostrzy w pudełku.
Skaningowy mikroskop elektronowyZeiss, Oberkochen, NiemcySigma VP z komorą Gatan 3View2, napięcie przyspieszenia 2,5 kV, zmienne ciśnienie 5 Pa, apertura 20 µ m, czas przebywania 6 i mikro; s, grubość warstwy 60 nm, powiększenie 15 000 x, rozdzielczość obrazu 2048 x 2048 pikseli, rozmiar piksela 7,3 nm
wykończenie 90° nóż diamentowyDiatome Ltd., Nidau, SzwajcariaDTB90
UltramicrotomeLeica Microsystems, Wiedeń, Austria
Fidżijhttps://fiji.sc/
Przeglądarka obrazów mikroskopowychhttp://mib.helsinki.fi/http://mib.helsinki.fi/tutorials.html
Rekonstruujhttps://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)
Zwierzęta
Myszy Dorosłe 3-miesięczne i  20± 1  miesiąc  Kobieta  Myszy Thy1-GFP(M) (Thy1-GFP +/-) (Feng i wsp., 2000), które wyrażają GFP w słabo rozmieszczonej populacji neuronów glutaminergicznym. Zwierzęta były hodowane jako heterozygoty o pochodzeniu C57BL/6J w Zwierzętarniach Instytutu Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego.
Klasa odczynnika Klasa odczynnika Filtr strzykawkowy Powlekane stalą nierdzewną Samouczki na stronie internetowej oprogramowania Leica ultracutR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
  2. Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
  3. Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience. Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).
  4. Śliwińska, M. A., et al. Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of αCaMKII. Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).
  5. Borczyk, M., Śliwińska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density. Scientific Reports. 9 (1), 1693(2019).
  6. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
  7. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).
  8. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).
  9. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  10. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).
  11. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  12. Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Acad. Press. San Diego, Calif. (2004).
  15. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  16. Mercer, E. H. a scheme for section staining in electron microscopy. Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340(2016).
  19. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).
  20. Roels, J., et al. An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 771(2020).
  21. Radwanska, K., et al. Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).
  22. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  23. Fendrych, M., et al. Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis. Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).
  24. Russell, M. R. G., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  25. Płachno, B. J., Świątek, P., Jobson, R. W., Małota, K., Brutkowski, W. Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae). Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).
  26. Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy. Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).
  27. Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).
  28. Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella. Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).
  29. Starborg, T., et al. Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization. Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).
  30. Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).
  31. Bojko, A., et al. Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084(2020).
  32. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).
  33. Glauert, A. M., Lewis, P. R. Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , Princeton University Press. Princeton. (2014).
  34. Genoud, C. Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice. Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Serial Block Face MicroscopyDendritic SpinesThree Dimensional Electron MicroscopySynaptic PlasticityHippocampal TissueImmunofluorescence StudyPost Synaptic DensitySample PreparationTissue SegmentationSynaptic Vesicles

Related Articles